專利名稱：小分子生物活性肽及其制法、組合物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性肽領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種小分子生物活性肽及其制法、組合物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肽是由兩個(gè)以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物。生物活性肽是指能夠調(diào)節(jié)生物機(jī)體的生命活動(dòng)或具有某些生理活性作用的一類肽的總稱。生物活性肽對(duì)人的機(jī)體生理作用可以表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面①調(diào)節(jié)激素的分泌；②調(diào)節(jié)免疫能力；③抗菌；④抗癌；⑤呈味；⑥結(jié)合礦物質(zhì)和促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收；⑦抗氧化；⑧抗高血壓。由于小分子活性肽具有上述生理功能，因此，其在醫(yī)學(xué)、食品及動(dòng)物飼料等領(lǐng)域越來越受到廣泛的重視。
由于肽是涉及生物體內(nèi)多種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。生物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并定性了幾百種多肽，它們是機(jī)體完成各種復(fù)雜的生理活動(dòng)所必不可少的參與者。在自然界所有細(xì)胞都能合成多肽物質(zhì)，其細(xì)胞功能活動(dòng)也受多肽的調(diào)節(jié)控制。例如，物質(zhì)代謝、激素分泌、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)及繁殖等所有生命活動(dòng)的領(lǐng)域，其主要作用機(jī)制是調(diào)節(jié)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)器官及細(xì)胞的各類生命活動(dòng)，調(diào)節(jié)激活體內(nèi)的有關(guān)酶類，保障代謝途徑的暢通，或通過控制DNA的轉(zhuǎn)錄或通過控制蛋白質(zhì)的翻譯而影響特殊功能的蛋白質(zhì)合成，最終產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)或發(fā)揮其藥理作用。
生物活性肽種類繁多，來源廣泛。主要有機(jī)體內(nèi)源性生物活性肽和天然外源性生物活性肽以及化學(xué)合成的外源性生物活性肽三大類。
天然外源性生物活性肽主要是由食物中酶解產(chǎn)生。目前研究應(yīng)用的天然外源性生物活性肽主要有乳品肽、大豆肽、小麥肽、玉米肽、動(dòng)物性膠原肽、蛋清肽、畜血肽、水產(chǎn)肽及其他來源的肽。他們的共同的特點(diǎn)都是由生物酶降解大分子蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的小分子多肽。來源不同、處理方式不同、分子量大小、結(jié)構(gòu)不同的多肽其各自生理活性功能均有較大的差異。
除了天然的外源性生物活性肽外，人們目前還通過化學(xué)合成方式合成了一些外源性生物活性肽，例如，生長(zhǎng)抑制素類物質(zhì)，澳曲肽和蘭瑞肽分別用于神經(jīng)內(nèi)分泌病和胃腸功能失調(diào)的診斷和治療，伐普肽用于治療囊體瘤、胃泌素瘤和某些腺瘤。胸腺素32肽、28肽、5肽用于免疫調(diào)節(jié)。尤其近年來國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和合成了許多用于臨床診斷、治療、預(yù)防各類嚴(yán)重危害人類健康的各種疾病的多肽。
目前國(guó)內(nèi)外制備生物活性肽的方法主要有以下方法第一、從動(dòng)植物組織器官中提取，由于原料來源有限和提取難度大，產(chǎn)品成本較高，只局限于生產(chǎn)某些有特殊療效的肽類藥物。
第二、通過化學(xué)方法(液相法或固相法)合成，可以按人們的意愿任意合成活性肽，但這種方法存在成本高、副反應(yīng)物多等問題，嚴(yán)重制約著其發(fā)展，目前化學(xué)合成法只限于某些肽類藥物和某些生物活性肽理論方面的研究。
第三、水解法生產(chǎn)活性肽方法。主要有堿水解法、酸水解法及酶水解法。堿水解法由于產(chǎn)物有異味，食品工業(yè)中通常不采用；酸水解法能使蛋白質(zhì)變性生成有毒物質(zhì)，也很少采用；酶水解法是選擇合適的蛋白酶水解各種蛋白質(zhì)來獲得活性肽。
綜上所述，現(xiàn)有的生物活性肽原料主要采用單一的乳源蛋白、大豆蛋白或蛋清蛋白等，所形成多肽結(jié)構(gòu)相對(duì)比較單一，功能也相對(duì)較為簡(jiǎn)單。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)具有多種功能的生物活性肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種具有多種功能的生物活性肽，尤其是提供具有提高免疫力、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合和增強(qiáng)體能的功能的生物活性肽。
本發(fā)明的目的就是提供所述生物活性肽的制法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種小分子生物活性肽，所述的生物活性肽來源于含大豆蛋白、乳清蛋白、雞蛋和牛奶的混合物，所述小分子生物活性肽中90％以上活性肽的分子量小于5KDa。所述的小分子生物活性肽的平均分子量為0.1-5KDa，較佳地為0.2-4KDa，更佳地為0.3-3KDa。并且所述的生物活性肽具有提高免疫力、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合和增強(qiáng)體能的活性，其中所述的混合物含有以下成分大豆蛋白40-70重量份；
乳清蛋白5-30重量份；雞蛋5-20重量份；牛奶10-30重量份。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的混合物含有以下成分大豆蛋白50-65重量份；乳清蛋白20-30重量份；雞蛋10-20重量份；牛奶15-25重量份。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，分子量為0.1-3kDa的小分子生物活性肽占全部小分子生物活性肽的重量百分比為40-90％。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，50％以上的活性肽集中在0.1～1.5KDa(Mass/charge)范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的小分子生物活性肽是用以下方法制備的(a)在40-90℃，用蛋白酶對(duì)混合物酶解3-8小時(shí)，酶解的pH值為6.0-9.0，其中，所述的混合物含有以下成分大豆蛋白40-70重量份；乳清蛋白5-30重量份；雞蛋5-20重量份；牛奶10-30重量份；所述的蛋白酶的用量為混合物重量的0.1-3％，并且所述的蛋白酶選自下組中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其組合；(b)分離平均分子量為0.1-5KDa的肽，獲得小分子生物活性肽。
在一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選例中，所述的酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的組合。
在本發(fā)明的第二方面，提供了所述的小分子生物活性肽的制備方法，其包含以下步驟(a)在40-90℃，用蛋白酶對(duì)混合物酶解3-8小時(shí)，酶解的pH值為6.0-9.0，其中，所述的混合物含有以下成分大豆蛋白40-70重量份；
乳清蛋白5-30重量份；雞蛋5-20重量份；牛奶10-30重量份；所述的蛋白酶的用量為混合物重量的0.1-3％，并且所述的蛋白酶選自下組中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其組合；(b)分離平均分子量為0.1-5KDa的肽，獲得小分子生物活性肽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的組合。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，含有0.001-99.99wt％(較佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)所述的小分子生物活性肽，以及藥學(xué)上或食品上可接受的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種所述的生物活性肽在制備提高機(jī)體免疫功能、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合、或增強(qiáng)體能的制品方面的用途。
進(jìn)一步的，所述的制品可以是藥物組合物、飲食補(bǔ)充劑、保健品、或食品組合物。
進(jìn)一步的，所述的制品可以是片劑、顆粒劑、懸浮劑、膠囊、口服液、或糖漿。在本發(fā)明一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，所述的制品是膠囊。
本發(fā)明的小分子生物活性肽由于含有多種小分子肽，因此具有多種多樣的功效。在提高機(jī)體免疫功能、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合(包括皮膚潰瘍、皮膚割傷、胃潰瘍、燙傷等)、抗疲勞、促消化等方面具有顯著的效果。


圖1不同蛋白原料的配比的水解曲線，其中，縱坐標(biāo)表示水解率(DH)，橫坐標(biāo)表示水解時(shí)間。
圖2原料酶解前后凝膠電泳結(jié)果對(duì)比，其中，泳道1為樣品1酶解前的電泳狀況，泳道2為樣品1酶解后的電泳狀況，泳道3為樣品2酶解前的電泳狀況，泳道4為樣品2酶解后的電泳狀況，泳道5為蛋白標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)將乳清蛋白，大豆蛋白，雞蛋和牛奶作為混合蛋白原料，用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆獬?KDa以下的具有生物活性的小分子肽，可明顯提高免疫力、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合和增強(qiáng)體能，基于該發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。其中，采用的蛋白酶較佳的為胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶及凝乳蛋白酶。
本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。
本發(fā)明中，“藥學(xué)上或食品上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。
本發(fā)明中，“藥學(xué)上或食品上可接受的載體”是用于將小分子生物活性肽傳送給動(dòng)物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。
為了得到具有多種生物活性的多肽，最好的方法是選擇多種原料，并根據(jù)原料的特點(diǎn)性質(zhì)選擇適宜的復(fù)合蛋白酶。本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)，確定了以乳清蛋白，大豆蛋白，雞蛋，牛奶作為混合蛋白原料，并確定了其各自的含量比例。根據(jù)原料性質(zhì)，本發(fā)明人選擇了胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶及凝乳蛋白酶作為水解酶，并通過正交實(shí)驗(yàn)確定各種酶的含量比例，及復(fù)合酶作用的最佳工藝條件。本發(fā)明利用多種不同的食物源蛋白質(zhì)，通過不同生物酶的工藝處理，使酶分解產(chǎn)物中的多肽組分、分子量大小分布、多肽的功能更趨于合理。
自然界中存在的蛋白質(zhì)種類很多，不同蛋白質(zhì)原料水解產(chǎn)生的活性肽由于氨基酸組成、結(jié)構(gòu)有差異，其功能也有很大差異?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的各種原料中活性肽的功能如表1所示。
表1各種原料所具有的某些功能

在本發(fā)明中，采用大豆蛋白、乳清蛋白、雞蛋、牛奶作為底物原料。其中，從乳清蛋白原料獲得的活性肽功能為促消化吸收，促雙歧桿菌增殖，抗病原菌感染；從大豆蛋白原料獲得的活性肽功能為促消化吸收，降膽固醇，降血壓，增強(qiáng)免疫，抗肥胖，降血糖，抗氧化，抗疲勞，低過敏，促進(jìn)微生物發(fā)育；從雞蛋蛋白原料中獲得的活性肽功能主要為促消化吸收，抗氧化，低過敏等；從牛奶蛋白原料中獲得的活性肽功能為促消化，抗疲勞，促鐵吸收，改善關(guān)節(jié)炎，脂質(zhì)代謝改善，抗氧化。不同來源的蛋白原料經(jīng)水解獲得的多肽的功能是多樣化的，從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度來看，機(jī)體對(duì)合適比例的動(dòng)、植物源復(fù)合蛋白的吸收及利用，也是優(yōu)于單一蛋白來源的。
蛋白酶的作用是水解蛋白質(zhì)中的肽鍵，將大分子長(zhǎng)鏈蛋白質(zhì)變成長(zhǎng)短不一的肽段和氨基酸。不同的蛋白酶不僅對(duì)肽鏈兩端的氨基酸有特異性的要求，而且組成蛋白質(zhì)的氨基酸還必須是L型的。由于不同蛋白酶酶解位點(diǎn)不同，因此，同樣的蛋白質(zhì)在不同酶作用下可產(chǎn)生不同的多肽片段。
蛋白酶按其來源有植物蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶和微生物蛋白酶，這些酶活性部位和化學(xué)性質(zhì)各不相同，能在一定的PH、溫度下內(nèi)切或端切蛋白質(zhì)形成多肽鏈，常用的蛋白酶及其來源，作用特異性如表2所示。
表2常用蛋白酶及其特性表

不同的蛋白酶對(duì)底物的水解作用位點(diǎn)不同，其產(chǎn)生的多肽結(jié)構(gòu)和功能有較大的差異。在本發(fā)明中，可使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或其組合作為水解酶。其中，凝乳蛋白酶能夠水解蛋白、酰胺及脂，特別是連接L-型芳香族氨基酸羥基的鍵；木瓜蛋白酶能夠水解蛋白、酰胺及脂中連接堿性氨基酸Leu、Gly的鏈；中性蛋白酶幾乎沒有生成氨基酸的能力，其作用為內(nèi)肽酶分解蛋白質(zhì)生成多肽的水溶性蛋白質(zhì)及生產(chǎn)極微含量的氨基酸；胰蛋白酶則專一性水解Lys或Arg殘基，其較多用于動(dòng)物源蛋白質(zhì)原料水解。
可將本發(fā)明的酶解獲得的小分子生物活性肽與適當(dāng)?shù)妮d體一起，制備成組合物的形式。本發(fā)明的小分子生物活性肽的組合物可以以多種劑型存在。小分子生物活性肽一般與藥學(xué)上或食品上可接受的載體混合。載體可以是固態(tài)的或液態(tài)的，一般根據(jù)所用的給予方式而選擇類型。小分子生物活性肽可以以片劑或膠囊形式(作為附聚的粉末)，或者以液體形式一起給予。固態(tài)載體的例子包括(但并不限于)乳糖、蔗糖、明膠和瓊脂。膠囊或片劑可以容易地制備，并且便于吞咽或咀嚼；其他的固體形式包括顆粒。片劑可含有適當(dāng)?shù)恼澈蟿?、?rùn)滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑等。液體劑型的例子包括在水、藥學(xué)上可接受的脂肪或油、醇或其他有機(jī)溶劑(包括酯)中的溶液或懸浮液、乳劑、糖漿、酏劑、用非泡騰顆粒再生的溶液和/或懸浮液、以及用泡騰顆粒再生的泡騰制劑。這樣的液體劑型可含有，例如，適當(dāng)?shù)娜軇⒎栏瘎?、乳化劑、懸浮劑、稀釋劑、甜味劑、增稠劑和助溶劑。口服劑型可含調(diào)味劑和著色劑。腸胃外和靜脈內(nèi)給予的劑型還可含有礦物質(zhì)和其他物質(zhì)，以便使它們與注射或所選的釋放系統(tǒng)類型相配伍。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將小分子生物活性肽制備成膠囊的形式，便于服用和存放。
在本發(fā)明中，作為活性成分的小分子生物活性肽可用任何合適的劑量，取決于動(dòng)物或人的體重、身體狀況等因素。一般地，小分子生物活性肽合適的劑量是約2-500mg/kg體重，較佳地5-100mg/kg體重。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比為重量百分比，份數(shù)為重量份數(shù)。
實(shí)施例實(shí)施例中，采用的主要原料如下乳清蛋白深圳市標(biāo)青健美用品有限公司(蛋白含量為80％以上)；大豆蛋白上海深遠(yuǎn)食品(集團(tuán))有限公司(蛋白含量為80％以上)；新鮮雞蛋市售無公害雞蛋(衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 2748-1981)；鮮牛奶 符合GB19301-2003標(biāo)準(zhǔn)。
采用的蛋白酶如下木瓜蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司(100萬u/g)；中性蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司(20萬u/g)；
胰蛋白酶無錫酶制劑廠生產(chǎn)(2200u/g)；凝乳蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司。
實(shí)施例1小分子生物活性肽的制備1、原料配比的確定以底物蛋白水解度DH為指標(biāo)，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶各50％復(fù)合酶，加酶量為1％，分別在PH7.0，溫度55℃下酶解不同比例原料，檢測(cè)底物的水解度，確定最佳原料配比。
在木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶＝50％∶50％、加酶量1％、pH7、溫度50℃、水解作用時(shí)間5小時(shí)的條件下，以底物蛋白水解度DH為指標(biāo)，對(duì)不同蛋白原料的配比進(jìn)行單因素分析，確定最佳原料配比。
各蛋白原料的重量配比(以干物質(zhì)計(jì)算)如下底物1大豆蛋白∶乳清蛋白∶雞蛋∶牛奶＝50％∶20％∶15％∶15％；底物2大豆蛋白∶乳清蛋白∶雞蛋∶牛奶＝55％∶15％∶10％∶20％；底物3大豆蛋白∶乳清蛋白∶雞蛋∶牛奶＝60％∶10％∶5％∶25％；底物4大豆蛋白∶乳清蛋白∶雞蛋∶牛奶＝65％∶5％∶5％∶25％。
不同蛋白原料的配比的水解曲線見圖1，確定最佳原料配比為底物2，即大豆蛋白∶乳清蛋白∶雞蛋∶牛奶＝55％∶15％∶10％∶20％。
2、酶解工藝條件的確定在底物原料配比確定的條件下，以所選擇的4種不同酶比例(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶∶凝乳蛋白酶∶胰蛋白酶)，復(fù)合酶量、酶解溫度、pH、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，具體見表3和表4。按L16(45)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行配比組合，以制得的多肽產(chǎn)品水解度(DH)為指標(biāo)，確定最佳工藝參數(shù)。
表3不同因素水平表L16(45)

表4酶作用效果正交試驗(yàn)與結(jié)果L16(45)

*因素主次關(guān)系B＞C＞E＞D＞A結(jié)果，獲得的最優(yōu)組合為A2B2C2D2E2。
3.產(chǎn)物酶解前后凝膠電泳分析原料酶解前及酶解后凝膠電泳圖譜對(duì)照見圖2。由圖可見，原料中大分子蛋白多數(shù)已被降解為分子量5000Da以下的小分子多肽。
實(shí)施例2小分子生物活性肽組合物的制造和檢測(cè)本發(fā)明的小分子生物活性肽可制備成膠囊的形式。按照常規(guī)制備藥物或保健品膠囊的方式，將前述制備的小分子生物活性肽進(jìn)行冷凍干燥，過100目篩后，與固體載體一起機(jī)制填充0號(hào)膠囊，每粒裝量0.3g，壓塑鋁箔板，每板12粒。檢驗(yàn)合格后，可包裝為成品。
1.理化指標(biāo)檢測(cè)選取3批次的前述制備的膠囊樣品，分別為樣品1、樣品2、樣品3。依據(jù)GB/T5009-2003和《藥典》2000版等規(guī)定的檢測(cè)方法分別對(duì)產(chǎn)品、蛋白質(zhì)、水分、灰分、崩解時(shí)限、鉛、砷、汞等項(xiàng)目指標(biāo)檢測(cè)。獲得的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表5。
表5理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.5KD以下的多肽含量測(cè)定同時(shí)取前述樣品1、樣品2、樣品3，沸水浴5分鐘。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳3-4小時(shí)，考馬斯亮蘭R250染色2小時(shí)，脫色至背景清晰，7％乙醇固定。電泳完成后由美國(guó)Bio-Rad公司凝膠圖像分析儀Del Doc2000掃描分析。
根據(jù)凝膠電泳分析，各樣品中蛋白質(zhì)中分子量5KD以下的多肽含量均在95％以上，結(jié)果見表6。
表6樣品中多肽的含量測(cè)定結(jié)果

3.多肽分子量分布狀況檢測(cè)取前述樣品1、樣品2、樣品3，采用激光飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定各樣品多肽的分子量分布狀況。
根據(jù)質(zhì)譜分析，各樣品蛋白質(zhì)中多肽分子量分布主要集中在Mass/charge0.1～1.5KD范圍之內(nèi)，分子量在3KD以下的多肽含量占44％左右。質(zhì)譜分析結(jié)果見表7。
表7樣品中多肽分子量分布狀況檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例3小分子生物活性肽組合物的毒性試驗(yàn)1、大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)SD大鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)20只，雌、雄各半，體重180-220g，于試驗(yàn)前隔夜禁食16小時(shí)，將實(shí)施例2制備的生物活性肽膠囊按15.0g/kg.bw劑量(相當(dāng)于人體推薦量的750倍)，以1.5mL/100g/kg.bw的灌胃容量，分三次灌胃給予(間隔4小時(shí))。然后觀察動(dòng)物的表現(xiàn)，連續(xù)14天。灌胃時(shí)用蒸餾水混合膠囊內(nèi)容物，配制各劑量濃度。結(jié)果見表8。
表8大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)觀察顯示，本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物對(duì)雌、雄大鼠經(jīng)口最大耐受劑量(MTD))均大于15.0g/kg.bw，其劑量相當(dāng)于人體推薦用量的750倍，未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。
2、大鼠30天喂養(yǎng)試驗(yàn)SD大鼠80只，體重50-70g，按體重半隨機(jī)分為4組，每組20只動(dòng)物，雌、雄各半。受試物設(shè)3個(gè)劑量組，分別為2.0g/kg.bw(相當(dāng)于人體推薦用量的100倍)、1.0g/kg.b w和0.5g/kg.bw。灌胃容為1.0mL/100g.bw，每天一次灌胃給予受試物(溶劑對(duì)照組灌胃等容的蒸餾水)，連續(xù)30天。灌胃時(shí)用蒸餾水混合膠囊內(nèi)容物，配制各劑量濃度。動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，每天觀察并記錄動(dòng)物的一般表現(xiàn)，每周稱體重及進(jìn)食量，最后計(jì)算食物利用率。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，拔眼球取血，用美國(guó)產(chǎn)AGII型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)(谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、肌酐、甘油三酯、血糖、白血球)。用瑞典產(chǎn)AC-900+型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)(血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)等)。然后將試驗(yàn)動(dòng)物脫頸椎處死進(jìn)行大體解剖，觀察有無異常，取肝、腎、脾、睪丸等臟器稱重，并將溶劑對(duì)照組和高劑量組動(dòng)物的肝、腎、脾、睪丸(卵巢)固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
對(duì)大鼠體重影響的試驗(yàn)顯示，各劑量組雌、雄動(dòng)物體重與溶劑對(duì)照組比較差異均無顯著性(p＞0.05)。對(duì)大鼠總食物利用率影響的試驗(yàn)顯示，各劑量組總食物利用率與溶劑對(duì)照組比較差異均無顯著性(p＞0.05)。大鼠血常規(guī)檢驗(yàn)顯示，各劑量組和溶劑對(duì)照組血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類均在正常參考值范圍內(nèi)。大鼠生化檢驗(yàn)顯示，各劑量組和溶劑對(duì)照組各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常參考值范圍內(nèi)。對(duì)大鼠臟器重量的影響試驗(yàn)顯示，各劑量組臟器重量數(shù)值和臟體比數(shù)值與溶劑對(duì)照組臟器重量數(shù)值和比數(shù)值比較差異均無顯著性(p＞0.05)。
因此可見，在試驗(yàn)劑量2.0g/kg.bw～0.5g/kg.bw范圍內(nèi)(最高劑量相當(dāng)于人體推薦用量的100倍)，對(duì)試驗(yàn)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、血液學(xué)、血液生化學(xué)及病理學(xué)方面相關(guān)指標(biāo)的檢驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)明顯不良影響。
3、遺傳毒性試驗(yàn)(1)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)50只，體重25-30g，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌、雄各半。將實(shí)施例2制備的生物活性肽膠囊設(shè)3個(gè)劑量組，分別為4.0g/kg.bw、2.0g/k g.bw、1.0g/k g.bw，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組(蒸餾水)和陽性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40mg/k g.b w)。以0.2mL/10g.bw的灌胃容量，經(jīng)口二次灌胃給予受試物，間隔24小時(shí)。灌胃時(shí)用蒸餾水混合膠囊內(nèi)容物，配制各劑量濃度。第二次給受試物后6小時(shí)，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取其股骨骨髓制片，鏡檢后結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表9。
表9小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表9可見，陽性對(duì)照組微核率明顯高于溶劑對(duì)照組，其差異有高度顯著性(p＜0.01)；受試物各劑量組微核率與溶劑對(duì)照組比較差異無顯著性(p＞0.05)。即本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物在試驗(yàn)劑量4.0g/kg.bw～1.0g/kg.bw范圍內(nèi)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
(2)小鼠精子畸形試驗(yàn)雄性小鼠25只，體重25-30g，隨機(jī)分為5組，每組5只動(dòng)物。將實(shí)施例2制備的生物活性肽膠囊設(shè)3個(gè)劑量，分別為4.0g/kg.bw、2.0g/kg.bw、1.0g/k g.bw，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組(蒸餾水)和陽性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40mg/k g.bw)。以0.2mL/10g.b w的灌胃容量，每天經(jīng)口給予受試物一次，連續(xù)5天。灌胃時(shí)用蒸餾水混合膠囊內(nèi)容物，配制各劑量濃度。于首次給受試物后的第35天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取其雙側(cè)附睪制片，鏡檢后結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。結(jié)果見表10。
表10小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表10可見，陽性對(duì)照組小鼠精子畸形率明顯高于溶劑對(duì)照組，其差異有高度顯著性(p＜0.01)，受試物各劑量組小鼠精子畸形率與溶劑對(duì)照組比較差異均無顯著性(p＞0.05)。即本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物在試驗(yàn)劑量4.0g/kg.bw～1.0g/kg.bw范圍內(nèi)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
(3)Ames試驗(yàn)菌種Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株由河南省疾病預(yù)防控制中心提供，經(jīng)本室按GB15193.4-2003方法進(jìn)行菌種鑒定，5種特性良好，液氮罐貯存?zhèn)溆谩?br> 肝S-92003年4月河南省疾病預(yù)防控制中心提供，經(jīng)陽性對(duì)照物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果活性良好，液氮罐儲(chǔ)存?zhèn)溆谩８蜸-9混合液試驗(yàn)用量為0.5mL/皿。
將本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物設(shè)計(jì)為為5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿、8μg/皿五個(gè)劑量組。另設(shè)自然回變對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和陽性對(duì)照組，用Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株TA97、TA98、TA100和TA102，在加與不加肝S-9混合液的條件下，分別對(duì)本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物做平板摻入法Ames試驗(yàn)。各菌株每劑量做三個(gè)平行皿，每皿加菌加樣各0.1mL，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)二次。培養(yǎng)48h后，記錄各皿回變菌落數(shù)，如果受試物的回變菌落數(shù)是自發(fā)回變菌落數(shù)的二倍以上，并且有劑量反應(yīng)關(guān)系者則定為陽性。試驗(yàn)結(jié)果見表11。
表11 Ames試驗(yàn)結(jié)果(X±S)

結(jié)果可見，每劑量組各菌株回變菌落數(shù)均未超過自然回變菌落數(shù)的二倍，而陽性對(duì)照組超過自然回變菌落數(shù)的二倍以上。本次Ames試驗(yàn)為陰性結(jié)果，即表明本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物在試驗(yàn)劑量8μg/皿-5000μg/皿范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)誘變作用。
經(jīng)上述試驗(yàn)，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，即本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物未見遺傳毒性作用。
實(shí)施例4小分子生物活性肽組合物增強(qiáng)免疫功能的測(cè)定依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)生部2003版)所規(guī)定的檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)方法進(jìn)行。以下試驗(yàn)均采用40只小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為4組，每組10只，各項(xiàng)試驗(yàn)受試物劑量均為0.4g/kg.bw、0.2g/kg.bw和0.1g/kg.bw三個(gè)劑量組和一個(gè)溶劑對(duì)照組。其劑量分別相當(dāng)于人體推薦用量的20倍、10倍和5倍。按上劑量各組每天灌胃一次(灌胃容量均為0.2mLg/10g.bw)。灌胃時(shí)用蒸餾水混合膠囊內(nèi)容物，配制各劑量濃度。連續(xù)給予30天后分別對(duì)動(dòng)物進(jìn)行各項(xiàng)免疫指標(biāo)測(cè)定。
1.血清溶血素測(cè)定(體液免疫功能測(cè)定)灌胃第26天給小鼠腹腔注射2％SRBC(0.2mL/只)，于免疫后第四天摘眼球采血，分離血清并在微量血凝板上進(jìn)行血清溶血素測(cè)定。37℃孵育3小時(shí)后，統(tǒng)計(jì)血球凝集度，計(jì)算相應(yīng)抗體積數(shù)，各劑量組結(jié)果與溶劑對(duì)照組比較進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表12。
表12小鼠血清溶血素測(cè)定結(jié)果

由表12可見，各劑量組抗體積數(shù)均高于溶劑對(duì)照組，且差異均有高度顯著性(p＜0.01)。
2.單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定(1)小鼠碳廓清試驗(yàn)按順序給各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁(4倍稀釋)0.1mL/10g.bw。每鼠均于注射墨汁后2分鐘及10分鐘分別準(zhǔn)時(shí)內(nèi)眥采血20ul，并迅速加入到2m10.1％碳酸鈉溶液中并搖勻。以752-C紫外可見分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值(OD)。同時(shí)取小鼠肝、脾稱重，按公式計(jì)算吞噬指數(shù)(a)，各劑量組結(jié)果與溶劑對(duì)照組比較進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表13。
表13小鼠碳廓清試驗(yàn)

由表13可見，高劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)高于溶劑對(duì)照組，且差異有顯著性(p＜0.05)。低劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)與溶劑對(duì)照組間差異無顯著性(p＞0.05)。
(2)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)于末次給予受試物后各組小鼠均腹腔注射20％雞紅細(xì)胞懸液1ml/只，間隔30分鐘處死小鼠，腹腔注入生理鹽水2mL/只，振搖一分鐘后取腹腔洗液制片，37℃溫育30分鐘，漂洗、固定后染色鏡檢。計(jì)數(shù)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)，以各劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)與溶劑對(duì)照組比較進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表14。
表14小鼠巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果

由表14可見，各劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率及巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)均高于溶劑對(duì)照組，且高、低劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率與溶劑對(duì)照組間比較差異均有顯著性(p＜0.05)；各劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與溶劑對(duì)照組間比較差異均有高度顯著性(p＜0.01)。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物對(duì)小鼠體液免疫功能及單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，故可判定本發(fā)明的小分子生物活性肽組合物具有增強(qiáng)免疫力功能的作用。
實(shí)施例5小分子生物活性肽組合物促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的測(cè)定1、小分子生物活性肽對(duì)大鼠消炎痛性潰瘍的作用實(shí)驗(yàn)分組Wistar大鼠(購自蘭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)體重200-240g，雄性，灌胃給藥組60只，隨機(jī)分為以下6組第1組空白對(duì)照組；第2組法莫替丁(40mg/kg)；第3組小分子生物活性肽(100ng活性肽/kg)；
第4組小分子生物活性肽(200ng活性肽/kg)；第5組小分子生物活性肽(400ng活性肽/kg)；第6組小分子生物活性肽(800ng活性肽/kg)。
給藥方法大鼠禁食(不禁水)24小時(shí)后給藥。按1ml/100g給予上述成分，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水。
給藥后60分子時(shí)背部皮下注射消炎痛溶液33mg/kg(10ml/kg)，12小時(shí)頸椎脫臼處死，將10％福馬林10ml注入胃內(nèi)，固定30分鐘后取胃沿胃大彎剪開，平鋪后用攝像機(jī)攝像，用真彩色圖象分析儀測(cè)量潰瘍面積。
結(jié)果見表15。灌胃給藥組小分子生物活性肽100-200ng/kg雖可使?jié)兠娣e縮小，但和空白對(duì)照組比較，差別不顯著(P＞0.05)，法莫替丁、小分子生物活性肽400、800ng/kg使大鼠消炎痛性潰瘍面積顯著縮小，和對(duì)照組比，差別高度顯著(P均＜0.01)。
表15各給藥組對(duì)大鼠消炎痛性潰瘍形成的影響

和空白對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2、小分子生物活性肽對(duì)大鼠慢性胃潰瘍(醋酸性胃潰瘍)的作用實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法同前。
Wistar大鼠禁食24小時(shí)后，乙醚麻醉，無菌切開腹腔，暴露胃，在胃竇與胃體交界處漿膜下用微量注射器注入30％醋酸50μl，敷適量青霉素粉，縫合腹壁肌層與皮膚，術(shù)后立即隨機(jī)分組(每組10只)。給藥12天后停藥禁食，于次日頸椎脫臼處死，開腹，胃內(nèi)注入10ml 10％福馬林溶液固定，取胃，在福馬林溶液內(nèi)繼續(xù)固定12小時(shí)，沿胃大彎縱行切開，用生理鹽水沖凈胃內(nèi)容物，將潰瘍標(biāo)本平鋪在平板上，用帶近攝鏡攝像機(jī)攝像，圖象分析儀測(cè)量潰瘍面積。
結(jié)果見表16。和空白對(duì)照組比較，灌胃給藥組法莫替丁、小分子生物活性肽200、400、800ng/kg使大鼠醋酸性潰瘍面積顯著縮小，和對(duì)照組比，差別均有顯著性。
表16灌胃給藥對(duì)大鼠醋酸性潰瘍面積的影響

和空白對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01。
3、小分子生物活性肽對(duì)大鼠皮膚燙傷的治療作用Wistar大鼠，雌雄各半，體重200-250g。背部剪毛后用脫毛劑脫毛(5×5cm)，24小時(shí)后進(jìn)行燙傷模型制備。衡溫、衡壓、定時(shí)燙傷。燙傷時(shí)用乙醚麻醉，背位固定，使背部皮膚充分平展、且與地面平行。燙傷器用銅管制成。底面直徑20mm，水由底部進(jìn)入，由上部流出，不再返回。燙傷器自重加水重共1kg。進(jìn)水管接10000ml衡溫水浴鍋(82℃)，出水管水溫80℃。將燙傷器垂直置動(dòng)物皮膚上，底面與皮膚保持平行。燙傷時(shí)間10秒，形成深I(lǐng)I°燙傷。每鼠燙傷1處。燙傷面積314mm2，約占體表面積的1％。
動(dòng)物分組陽性對(duì)照組因目前尚無同劑型(注射用)的促創(chuàng)面愈合的陽性對(duì)照藥物，本實(shí)驗(yàn)選已被國(guó)家批準(zhǔn)的外用藥物重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)作為陽性對(duì)照藥。實(shí)驗(yàn)分組大鼠68只。燙傷后立即隨機(jī)分組給藥，共分以下7組空白對(duì)照組8只，生理鹽水0.1ml/100g，創(chuàng)面滴生理鹽水0.2ml/只；對(duì)照組10只，肌肉注射賦形劑0.1ml/100g，創(chuàng)面滴生理鹽水0.2ml/只；bFGF組10只，肌肉注射賦形劑0.1ml/100g，創(chuàng)面噴涂bFGF溶液0.2ml/只(480AU)；
小分子生物活性肽100ng/kg組10只，肌肉注射受試藥0.1ml/100g，創(chuàng)面滴生理鹽水0.2ml/只；小分子生物活性肽200ng/kg組10只，肌肉注射受試藥0.1ml/100g，創(chuàng)面滴生理鹽水0.2ml/只；小分子生物活性肽400ng/kg組10只，肌肉注射受試藥0.1ml/100g，創(chuàng)面滴生理鹽水0.2ml/只；小分子生物活性肽800ng/kg組10只，肌肉注射受試藥0.1ml/100g，創(chuàng)面滴生理鹽水0.2ml/只；另取2只大鼠，燙傷后72小時(shí)處死，取皮膚創(chuàng)面用10％福馬林固定，石蠟包埋切片，光鏡下檢查燙傷深度。
注射用藥1日量分2次給予，空白組肌肉注射生理鹽水，對(duì)照組和bFGF組肌肉注射賦形劑溶液，受試組肌肉注射小分子生物活性肽。外用bFGF每日1次，每次0.2ml/創(chuàng)面，空白組、對(duì)照組和小分子生物活性肽受試組同時(shí)滴以等體積生理鹽水。從第4日起，每3-4日用攝像機(jī)攝取創(chuàng)面圖象1次(距離53cm)，輸入微機(jī)，用千分尺定標(biāo)，用圖象分析儀測(cè)創(chuàng)面面積。
結(jié)果見表17。大鼠皮膚燙傷后7天內(nèi)創(chuàng)面縮小速度較慢，各組之間亦無顯著性差別。9天后開始脫痂，且創(chuàng)面縮小速度明顯加快。10天時(shí)bFGF組縮小最為明顯，但該組在其后創(chuàng)面縮小速度慢于小分子生物活性肽治療組，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)(17天)，以小分子生物活性肽400-800ng/kg組創(chuàng)面面積最小，和對(duì)照組比較，差別均有顯著性意義?？瞻捉M和賦形劑對(duì)照組比較，差別無顯著性意義(P＞0.05)，說明賦形劑對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性影響。
表17小分子生物活性肽對(duì)大鼠皮膚燙傷后創(chuàng)面縮小速度的影響

和對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。初始創(chuàng)面面積314mm2。
4、小分子生物活性肽對(duì)小豬皮膚切割傷的作用中國(guó)小型豬24只，體重10-15kg，按體重、性別隨機(jī)分4組，每組5雄1雌，分別為對(duì)照組，陽性對(duì)照組和低、高劑量小分子生物活性肽受試藥組對(duì)照組，肌肉注射賦形劑溶液；陽性對(duì)照組，局部噴bFGF溶液0.2ml(480AU)；小分子生物活性肽低劑量組，肌肉注射小分子生物活性肽，日劑量125ng/kg；小分子生物活性肽高劑量組，肌肉注射小分子生物活性肽，日劑量250ng/kg。
用硫賁妥鈉25mg/kg麻醉(0.5ml/kg)。背部剪毛，剪毛范圍30×25cm。用溫肥皂水浸洗去毛部位后，用剃頭刀剃毛，用溫水沖洗去毛部位，棉布吸干水份。碘復(fù)消毒皮膚及打孔器。用特制打孔器在背部皮膚打孔，打孔時(shí)方向垂直，深度至皮下(約4mm)，各圓孔各周邊深度一致。用手術(shù)刀片水平切去皮片全層，深度恰到皮下(皮片厚約4mm)。無菌棉球壓迫止血。碘復(fù)棉球消毒切口及周圍皮膚，滅菌紗布敷蓋切口，用膠布2條繞腹部成腹帶狀固定。術(shù)后立即開始用藥治療對(duì)照組肌肉注射賦形劑溶液(甘露醇3.125mg/ml)0.1ml/kg，1日2次；陽性對(duì)照組每個(gè)創(chuàng)面噴以外用bFGF溶液0.2ml(480AU)，1日1次；小分子生物活性肽低劑量組小分子生物活性肽625ng/ml，0.1ml/kg，肌肉注射，1日2次，日劑量125ng/kg，按體表面積折算，此劑量與大鼠0.4μg/kg等效；小分子生物活性肽高劑量組小分子生物活性肽1250ng/ml，0.1ml/kg，肌肉注射，1日2次，日劑量250ng/kg，按體表面積折算，此劑量與大鼠0.8μg/kg等效。
為使各組處理相同，對(duì)照組、小分子生物活性肽低、高劑量組每天涂以0.2ml生理鹽水，而bFGF陽性對(duì)照組每天肌肉注射賦形劑溶液(3.125mg/ml甘露醇)，0.1ml/kg。
于術(shù)后次日、3、7、10、14、17天分別用數(shù)字照相機(jī)照像，拍照距離50cm，，無影燈照明，千分尺定標(biāo)。經(jīng)Photoshop6.0軟件輸入PII 350微機(jī)，轉(zhuǎn)變?yōu)閎mp格式后用圖象分析儀對(duì)創(chuàng)面面積進(jìn)行分析。肉芽組織充填速度用肉芽組織填平創(chuàng)面時(shí)間來表示。觀察方法為第5日后每天肉眼觀察創(chuàng)面一次，待肉芽組織充填創(chuàng)面使其距皮膚表面＜0.3mm時(shí)，即判定為創(chuàng)面已被肉芽組織填平，記錄肉芽組織填平創(chuàng)面時(shí)間，反映肉芽組織生長(zhǎng)速度。
豬皮膚切割傷后，3-4天時(shí)即可見肉芽組織自傷口底部長(zhǎng)出，色紅或因血痂的存在而呈深紅色，觸之出血，表面凸凹不平，難測(cè)深度。等肉芽組織接近填平創(chuàng)面時(shí)，肉芽表面較平，故創(chuàng)面肉芽組織填平時(shí)間較易判斷。結(jié)果見表18，對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織填平時(shí)間為11.16±1.33天，較bFGF組(6.33±0.81天)明顯為長(zhǎng)。小分子生物活性肽低、高劑量組創(chuàng)面肉芽組織填平時(shí)間分別為7.67±1.36天和7.00±1.09天，較對(duì)照組明顯為短，且和對(duì)照組比較差別均非常顯著。
表18對(duì)豬皮膚切割傷后皮膚創(chuàng)面肉芽組織填平時(shí)間的影響

和對(duì)照組比較，**P＜0.01。
豬皮膚切割傷后3天時(shí)創(chuàng)面輕度縮小，但各組間無顯著性差別。肉芽組織填平創(chuàng)面后上皮自周邊向中心生長(zhǎng)，創(chuàng)面開始明顯縮小。7天時(shí)bFGF組切口創(chuàng)面面積較對(duì)照組縮小13.7％，且差別有顯著性。小分子生物活性肽組皮膚創(chuàng)面面積縮小速度快于對(duì)照組，而慢于bFGF組，14天時(shí)小分子生物活性肽125、250ng/kg組切口創(chuàng)面面積較對(duì)照組明顯縮小，差別有顯著性。17天時(shí)對(duì)照組、bFGF組、小分子生物活性肽125、250ng/kg組每組6只動(dòng)物中創(chuàng)面愈合例數(shù)分別為0、5、4、5例；對(duì)照組尚殘留創(chuàng)面18.6％時(shí)，bFGF組和小分子生物活性肽低、高劑量組創(chuàng)面已基本愈合，結(jié)果見表19。
表19各組對(duì)豬皮膚切割傷后皮膚創(chuàng)面愈合速度的影響

和對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。初始創(chuàng)面面積254mm2。
以上研究結(jié)果說明，灌胃給予小分子生物活性肽200ng/kg(1日量分2次灌胃或肌注)對(duì)大鼠慢性醋酸性潰瘍具有明顯的治療作用，表現(xiàn)為潰瘍面積較對(duì)照組明顯為??；最佳有效劑量為400ng/kg，當(dāng)劑量繼續(xù)增大時(shí)，療效不再增加。小分子生物活性肽不影響胃液分泌量及其pH值、游離酸和總酸度，也不影響胃蛋白酶排出量及其活性，表明小分子生物活性肽的抗?jié)冏饔脵C(jī)理可能與侵襲因子胃酸和胃蛋白酶活性無關(guān)，與傳統(tǒng)抗?jié)兯幵谧饔脵C(jī)理上有較大差別。
小分子生物活性肽400、800ng/kg肌肉注射對(duì)大鼠深I(lǐng)I度皮膚燙傷具有明顯的治療作用，可明顯加快愈面愈合速度，治療終點(diǎn)時(shí)療效強(qiáng)于外用bFGF。小分子生物活性肽125、250ng/kg肌肉注射對(duì)小型豬皮膚切割傷模型也具有明顯的治療作用，可加快創(chuàng)面肉芽組織充填速度，加快皮膚創(chuàng)面愈合速度，和對(duì)照組比較，差別顯著。
實(shí)施例6小分子生物活性肽組合物對(duì)水上運(yùn)動(dòng)員生化指標(biāo)的影響選取皮艇、輕量級(jí)賽艇和皮劃艇各類專業(yè)水上運(yùn)動(dòng)員20名，平均年齡24.24±1.00歲、身高174.33±4.42cm、體重66.90±5.47kg，運(yùn)動(dòng)等級(jí)為1.00±0.84級(jí)。受試者身體健康狀況良好，無心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，測(cè)試期間無運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷。
將運(yùn)動(dòng)員隨機(jī)分為對(duì)照組和補(bǔ)肽組。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5周，每周訓(xùn)練7天，每天訓(xùn)練5～6小時(shí)，要求各組受試對(duì)象在5周大強(qiáng)度訓(xùn)練中的計(jì)劃基本相同。實(shí)驗(yàn)期間，除正常飲食和服用本發(fā)明的小分子生物活性肽外，受試者不使用其他營(yíng)養(yǎng)保健品。
實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后安靜狀態(tài)下各進(jìn)行一次測(cè)試，肘靜脈取血，一部分抗凝處理用于血象測(cè)試，另一部分制備血清。
1、蛋白質(zhì)合成分解代謝評(píng)定指標(biāo)的測(cè)試采用放射免疫法測(cè)定血睪酮(T)，試劑盒購自天津DPC公司，使用儀器為BECKMANGama 5500型γ計(jì)數(shù)儀；使用日立7020型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿素氮(BUN)，試劑盒由上海榮盛公司提供。
2、骨骼肌組織損傷評(píng)定指標(biāo)的測(cè)試使用日立7020型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸激酶(CK)，試劑盒由上海榮盛公司提供。
3、血象測(cè)試使用瑞典MEDONICCA 530型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)試紅細(xì)胞(RBC)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞比積(HCT)、血小板(PLT)、血色素(Hb)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)。各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)試結(jié)果見表20和表21。
表20對(duì)照組生化指標(biāo)對(duì)比

表21實(shí)驗(yàn)組生化指標(biāo)對(duì)比

由表20、表21可見，服用本發(fā)明的小分子生物活性肽后，運(yùn)動(dòng)員實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比各血液生化指標(biāo)有顯著性差異，血睪酮提高了近46.91％，血色素水平提高了近3.23％，而尿素氮下降達(dá)1.98％，同時(shí)肌酸激酶水平明顯下降，下降達(dá)100.94％。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種小分子生物活性肽，其特征在于，所述的生物活性肽來源于含大豆蛋白、乳清蛋白、雞蛋和牛奶的混合物，所述小分子生物活性肽中90％以上活性肽的分子量小于5KDa，并且所述的生物活性肽具有提高免疫力、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合和增強(qiáng)體能的活性，其中所述的混合物含有以下成分大豆蛋白40-70重量份；乳清蛋白5-30重量份；雞蛋5-20重量份；牛奶10-30重量份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子生物活性肽，其特征在于，所述的混合物含有以下成分大豆蛋白50-65重量份；乳清蛋白20-30重量份；雞蛋10-20重量份；牛奶15-25重量份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子生物活性肽，其特征在于，分子量為0.1-3KDa的小分子生物活性肽占全部小分子生物活性肽的重量百分比為40-90％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子生物活性肽，其特征在于，所述的小分子生物活性肽是用以下方法制備的(a)在40-90℃，用蛋白酶對(duì)混合物酶解3-8小時(shí)，酶解的pH值為6.0-9.0，其中，所述的混合物含有以下成分大豆蛋白40-70重量份；乳清蛋白5-30重量份；雞蛋5-20重量份；牛奶10-30重量份；所述的蛋白酶的用量為混合物重量的0.1-3％，并且所述的蛋白酶選自下組中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其組合；(b)分離平均分子量為0.1-5KDa的肽，獲得小分子生物活性肽。
5.一種權(quán)利要求1所述的小分子生物活性肽的制備方法，其特征在于，包含以下步驟(a)在40-90℃，用蛋白酶對(duì)混合物酶解3-8小時(shí)，酶解的pH值為6.0-9.0，其中，所述的混合物含有以下成分大豆蛋白40-70重量份；乳清蛋白5-30重量份；雞蛋5-20重量份；牛奶10-30重量份；所述的蛋白酶的用量為混合物重量的0.1-3％，并且所述的蛋白酶選自下組中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其組合；(b)分離平均分子量為0.1-5KDa的肽，獲得小分子生物活性肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的組合。
7.一種組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的小分子生物活性肽，以及藥學(xué)上或食品上可接受的載體。
8.一種權(quán)利要求1所述的生物活性肽在制備提高機(jī)體免疫功能、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合、或增強(qiáng)體能的制品方面的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的制品是藥物組合物、飲食補(bǔ)充劑、保健品、或食品組合物。
10.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的制品是片劑、顆粒劑、懸浮劑、膠囊、口服液、或糖漿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小分子生物活性肽，所述的生物活性肽來源于含大豆蛋白、乳清蛋白、雞蛋和牛奶的混合物，所述小分子生物活性肽中90％以上活性肽的分子量小于5KDa。本發(fā)明還公開了所述的小分子生物活性肽的制備方法。本發(fā)明還公開了所述生物活性肽的組合物，含有所述的小分子生物活性肽，以及適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上或食品上可接受的載體。本發(fā)明的小分子生物活性肽能夠提高免疫力、促進(jìn)機(jī)體組織創(chuàng)傷愈合和增強(qiáng)體能。
文檔編號(hào)A61K38/03GK1920049SQ20051002911
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日
發(fā)明者陳五嶺, 曹珉 申請(qǐng)人:上海弭陽生物技術(shù)有限公司