專利名稱：露蜂房在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及露蜂房的新用途，尤其涉及露蜂房在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)是指有功能的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)于子宮腔內(nèi)壁以外的部位。它引起的繼發(fā)性痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔痛等癥狀嚴重影響患者的生活質(zhì)量。盡管子宮內(nèi)膜異位癥為婦科良性疾病，但它具有侵襲性、廣泛種植、易復(fù)發(fā)的特征，與惡性腫瘤十分相似。子宮內(nèi)膜異位癥是育齡婦女的一個常見病和多發(fā)病，發(fā)病率高達15％，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。雖然子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)現(xiàn)已有100多年的歷史，并且多年來對子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理進行了深入廣泛的研究，但其確切的發(fā)病機理還不十分清楚。由于病因不明，目前治療方法有多種，尚無一種藥物能達到根治效果。因此，積極探索有效的治療方法具有十分重要的意義。
臨床和實驗研究證實，子宮內(nèi)膜異位癥是激素依賴性疾病。子宮內(nèi)膜異位癥患者初潮前無發(fā)病，絕經(jīng)后異位的內(nèi)膜可逐漸萎縮被吸收，如使用雌激素替代療法，此病還會復(fù)發(fā)。而切除卵巢或服用danozol使機體處于低雌激素狀態(tài)，病灶可明顯縮小，療程結(jié)束后隨著體內(nèi)雌激素水平的恢復(fù)，有的病人也會復(fù)發(fā)?？梢娮訉m內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病。異位內(nèi)膜可隨卵巢周期性變化而出現(xiàn)周期性增生、分泌變化，但變化不一定與子宮腔內(nèi)膜變化同步；卵巢雌/孕激素的周期性分泌，對異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜起同樣的作用，但雌二醇可能起主導(dǎo)作用，特別是中期的雌二醇峰在刺激子宮內(nèi)膜增厚的同時，也可刺激異位的內(nèi)膜生長。因此子宮內(nèi)膜異位癥的激素治療一般采用假孕療法和假絕經(jīng)療法，能夠取得一定的療效。但由于此二醇水平的降低，導(dǎo)致患者出現(xiàn)類似更年期樣的改變，帶來了比較明顯的副作用。同時此類藥物價格昂貴，且長期服用導(dǎo)致肝功能損害，停藥后又易復(fù)發(fā)，這些缺點限制了這些藥物的應(yīng)用。
露蜂房為胡蜂科昆蟲大黃蜂Polistes mandarinus Saussure的巢，許多文獻及中藥大辭典、中華人民共和國藥典等對露蜂房的特性均有詳細的報道，露蜂房具有攻毒殺蟲作用，目前臨床上用于乳腺小葉增生，取得了良好的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開露蜂房在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用，拓展露蜂房的應(yīng)用領(lǐng)域。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，露蜂房對子宮內(nèi)膜異位癥具有顯著的治療作用，可以用于制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物。發(fā)明人同時發(fā)現(xiàn)，露蜂房對子宮內(nèi)膜異位癥具有明顯的治療作用，動物實驗證明，露蜂房在安全使用范圍內(nèi)(3.6g/kg體重天)，動物的行為也沒有任何異常；雖連續(xù)大量服用，臨床上亦未發(fā)現(xiàn)任何副作用及毒性反應(yīng)。
所說的露蜂房，采用市售的露蜂房中藥飲片。
可以將露蜂房按照常規(guī)的中藥煎煮方法制成水煎劑，以水煎劑的形式，施加于需要治療的對象，一般成人(60kg)的用量為6～12g/次天，具體可根據(jù)患者的年齡、病情等進行變化，可以通過口服的形式施加于需要這種治療的對象。
動物實驗證明，露蜂房對子宮內(nèi)膜異位癥具有明顯的治療作用，更重要的是露蜂房與danazol相比，具有無可比擬的安全性。效果比較好，基本不會造成不良影響。因而露蜂房具有治療子宮內(nèi)膜異位癥的前景。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，以下將用露蜂房的藥理實驗及其結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
具體實施例方式
實施例1水煎劑取75.6g露蜂房，洗凈，放入煎藥鍋中，加水至高出藥5cm，先浸泡半小時，煮沸后，再煎煮半小時，取汁，然后再按上述方法分別煎煮2次，取汁。將3次的藥汁混合，裝瓶制成成品，此劑量藥液為15只大鼠一周的用量。
實施例21材料1.1實驗動物健康、性成熟未交配的SD雌性大鼠60只，鼠齡70d-80d，每只大鼠體重160-180g。大鼠由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，由本院動物實驗中心動物房，采用12h明12h暗交替飼養(yǎng)。
1.2主要器材Forma725型-80℃低溫冰箱(美國)，BCD-248普通冰箱(上凍青島海爾集團)，Olympus PM-10AD型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，高速低溫離心機(德國Hereaus公司)，Access全自動微?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，Array 360特定蛋白分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，勻漿器，濕盒，恒溫溫箱，浸蠟箱，包埋箱，切片機，烘箱等。
1.3主要試劑細胞色素芳香化酶P450單克隆抗體(購自北京中山生物工程公司)，雌激素受體α單克隆抗體(購自Santa Cruz公司)，兔二抗(購自日本NICHIREI公司)；danazol(上海華聯(lián)制藥有限公司，100mg/粒)，TES緩沖液，全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國)，DAB，Tris(PH7.6)，1％鹽酸，PBS緩沖液，10％福爾馬林，甲醇，乙醇，脫鈣劑，二甲苯，石蠟，蘇木素-伊紅(HE)染色劑等。
1.4方法1.4.1子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立子宮內(nèi)膜異位癥模型根據(jù)(俞超芹，劉玉環(huán)，彭新萍，等．內(nèi)異方對子宮內(nèi)膜異位癥IL-6、IL-10的調(diào)節(jié)作用．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1999，20(9)621)文獻公開的俞超芹等方法制作2％戊巴比妥鈉0.3ml腹腔麻醉，開腹找到子宮，剪下右側(cè)子宮長約3cm，行兩端結(jié)扎包埋術(shù)，剝離剪下的子宮內(nèi)膜，切成3塊4mm×4mm大小的內(nèi)膜片段，用4/0腸線分別固定于對側(cè)子宮的中段、Y型分叉處和卵巢附近。另設(shè)假手術(shù)組，即按上述方法剪下右側(cè)子宮長約3cm，行端端結(jié)扎包埋術(shù)，將3塊4mm×4mm大小的自體脂肪用4/0無損傷縫線分別固定于對側(cè)子宮的中段、Y型分叉處和卵巢附近。4周后麻醉剖腹探查，見移植的內(nèi)膜組織體積增大，呈透明結(jié)節(jié)狀、囊狀，出現(xiàn)澄清液體集聚，被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成。
1.4.2分組處理將模型大鼠隨機分為3組1)非治療組雙蒸水灌胃，每日2ml/只；2)danazol組灌胃，每日400mg/kg，共4周；3)露蜂房組實施例1的水煎劑灌胃，每日3.6g/kg，共4周；另外，假手術(shù)組雙蒸水灌胃，每日2ml/只；以上4組均在同等條件下飼養(yǎng)4周。在飼養(yǎng)過程中丟失6只大鼠，病死3只，灌胃不當死亡1只，故實驗結(jié)束時余74只大鼠。
2觀察指標與方法
2.1子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、異位灶重量以及處理組對異位灶的抑制率1)子宮系數(shù)＝子宮濕重mg/體重kg2)卵巢系數(shù)＝卵巢濕重mg/體重kg3)異位灶生長抑制率＝(非治療組平均異位灶重量-治療組平均異位灶重量)/非治療組平均異位灶重量×100％2.2肝、腎、骨骼以及子宮內(nèi)膜、卵巢、異位內(nèi)膜組織的病理形態(tài)學(xué)2.2.1取材和處理根據(jù)陰道涂片，分別于治療結(jié)束動情前期斷頭處死。
1)立即取部分肝、腎、卵巢、子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織，用10％福爾馬林固定。
2)另取部分卵巢、子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織立即凍存于-80℃低溫冰箱中。
3)用脫鈣劑將骨骼脫鈣48小時后，自來水沖洗2小時，再次置入10％福爾馬林中固定。
2.2.2石蠟標本制備將10％福爾馬林固定的肝、腎、骨骼、卵巢、子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織制成病理切片(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院病理科協(xié)助完成)。
1)第一步脫水將組織置于70％乙醇浸泡30分鐘，然后置于90％乙醇浸泡30分鐘，其次置于95％乙醇浸泡30分鐘，再次置于95％乙醇浸泡30分鐘，最后置于100％乙醇浸泡30分鐘。
2)第二步透明將脫水后的標本置于二甲苯浸泡30分鐘，重復(fù)兩次，直至肉眼觀察組織呈透明狀，完成透明。
3)第三步浸蠟將透明后的標本放入石蠟，再置于浸蠟箱，溫度調(diào)至56～58℃進行浸蠟處理30分鐘，重復(fù)三次，完成浸蠟。
4)第四步包埋將浸蠟處理過的組織取出放入充滿熔融石蠟的包埋框，使其冷卻從而形成鑄塊，完成包埋。
5)第五步切片用AO切片機將鑄塊切成5微米的切片。
2.2.3蘇木素-伊紅染色1)將切片脫蠟至水。
2)甲醇固定15分鐘。
3)95％乙醇處理30秒。
4)自來水30秒。
5)蘇木素染液染色5分鐘。
6)自來水2分鐘。
7)75％鹽酸乙醇溶液分化30秒。
8)自來水2分鐘。
9)溫熱水(50℃)5分鐘。
10)單蒸水1分鐘。
11)95％乙醇溶液1分鐘。
12)酸化伊紅乙醇2分鐘。
13)95％酒精和純酒精脫水各2次，每次2分鐘。
14)二甲苯透明10秒。
15)中性樹膠封片，完成封固。
16)干燥后鏡下觀察，隨機挑選視野，拍照。
2.3血清磷、鈣含量測定2.3.1取材斷頭后立即用不抗凝試管收集血液，室溫靜置2小時后，3000r/分鐘離心15分鐘，取血清。
2.3.2實驗方法用偶氮砷III比色自動生化分析儀測定血清鈣的含量，用紫外分光光度自動生化分析儀測定血清磷的含量(長海醫(yī)院檢驗科協(xié)助完成)。
2.4卵巢、子宮內(nèi)膜、異位子宮內(nèi)膜與血清雌二醇水平測定2.4.1取材取卵巢、子宮內(nèi)膜與異位內(nèi)膜組織標本，稱重，將組織剪碎，加入冰TES緩沖液1ml，4℃冰浴45s，4℃條件下105000g/分鐘離心60分鐘，分別吸取上清液，置低溫下待側(cè)。
2.4.2實驗方法用全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清、子宮、卵巢和異位灶中雌二醇的水平(中國科學(xué)院上海藥物研究所協(xié)助完成)。
2.6統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。
計量資料采用單因素方差分析。
結(jié)果1子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、異位灶重量以及處理組對異位灶的抑制率表1各組子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)及異位灶濕重(x±s)

與非治療組相比，*P＜0.05檢驗結(jié)果提示露蜂房治療組、丹那唑治療組異位內(nèi)膜組織質(zhì)量分別顯著低于非治療組(P＜0.001)，露蜂房治療組與丹那唑治療組之間無顯著差異。露蜂房治療組、丹那唑治療組、假手術(shù)組及非治療組子宮系數(shù)和卵巢系數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
2血清、子宮、卵巢及異位癥中雌二醇的含量表2各組血清、子宮內(nèi)膜、卵巢和異位灶中雌二醇(E2)水平(x±s，pg/ml)

與非治療組相比，△P＜0.05；與非治療組相比，#P＜0.001；與假手術(shù)組相比，▲P＜0.01；與非治療組子宮內(nèi)膜相比，*P＜0.01檢驗結(jié)果提示從表2中可以看出，非治療組血清中E2含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.001)；露蜂房治療組的血清E2水平下降，且與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學(xué)意義；非治療組、假手術(shù)組、露蜂房治療組與丹那唑治療組子宮內(nèi)膜中E2水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，非治療組中異位灶E2水平明顯高于子宮內(nèi)膜E2水平；非治療組與假手術(shù)組之間卵巢E2水平無明顯差異，露蜂房治療組的卵巢E2水平顯著下降(P＜0.001)，也明顯低于丹那唑組；露蜂房治療組、丹那唑治療組異位灶中E2水平明顯低于非治療組(P＜0.05)。
3各組子宮內(nèi)膜及卵巢組織形態(tài)學(xué)3.1卵巢組織形態(tài)1)假手術(shù)組鏡下見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細胞呈多層(多為6~8層)，形態(tài)完整、排列整齊，卵泡膜細胞呈梭形排列。
2)露蜂房組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術(shù)組基本相似。
3)非治療組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術(shù)組基本相似。
4)danazol組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術(shù)組基本相似。
3.2在位子宮內(nèi)膜組織形態(tài)1)假手術(shù)組在位內(nèi)膜上皮細胞形態(tài)規(guī)則，呈正常高柱狀，內(nèi)膜腺體數(shù)量較多，腺上皮細胞和間質(zhì)細胞形態(tài)規(guī)則。
2)露蜂房組子宮內(nèi)膜腺上皮出現(xiàn)空泡與細胞殘跡；。
3)非治療組內(nèi)膜上皮細胞層次較亂，上皮增生，內(nèi)膜腺體、腺上皮細胞以及間質(zhì)細胞基本沒改變。
4)danazol組在位內(nèi)膜上皮細胞呈扁平立方形，并且出現(xiàn)了較多的上皮細胞殘跡，內(nèi)膜腺體數(shù)量少，間質(zhì)細胞少，內(nèi)膜上皮較薄。
3.3異位子宮內(nèi)膜組織形態(tài)1)非治療組異位內(nèi)膜上皮細胞形態(tài)規(guī)則，呈正常高柱狀，內(nèi)膜腺體較多，但直徑較小，間質(zhì)細胞較多。
2)露蜂房組異位內(nèi)膜上皮細胞萎縮，出現(xiàn)了較多的上皮細胞殘跡，空泡較多，內(nèi)膜腺體非常少，間質(zhì)細胞也較少。
3)danazol組異位內(nèi)膜上皮細胞呈扁平立方形，并且出現(xiàn)了較多的上皮細胞殘跡，內(nèi)膜腺體少，間質(zhì)細胞較少，并出現(xiàn)了許多空泡。
4肝、腎和骨骼病理形態(tài)學(xué)4.1肝臟1)假手術(shù)組小葉結(jié)構(gòu)完好，肝竇清晰，肝細胞呈放射性排列，大小均勻，單核，核漿比例正常，膽管上皮細胞呈立方型。
2)露蜂房組與假手術(shù)組基本相似。
3)非治療組與假手術(shù)組基本相似。
4)danazol組肝細胞脂肪樣變性，胞漿透明度增加，細胞胞漿不清，部分細胞核崩解，肝板破壞，匯管區(qū)增粗。
4.2腎臟1)假手術(shù)組腎盂上皮細胞呈假復(fù)層(適合功能要求)，上皮完整。
2)露蜂房組、非治療組以及danazol組與假手術(shù)組腎臟形態(tài)無明顯改變。
4.3骨骼1)假手術(shù)組骨小梁粗壯，排列整齊并連接成網(wǎng)，間隙較小，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨小梁密度、面積正常，無減少。
2)露蜂房組與假手術(shù)組基本相似。
3)非治療組與假手術(shù)組基本相似。
6)danazol組骨小梁稍細，排列尚整齊并連接成網(wǎng)，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大，骨小梁密度、面積無明顯減少。
5血清磷、鈣含量表3血清磷、鈣含量(x±s，n＝6，mmol/ml)

檢驗結(jié)果提示露蜂房組與其它各組之間的血清磷含量均無顯著差異(P＞0.05)。露蜂房組、danazol組、假手術(shù)組以及非治療組之間血清鈣含量均無顯著差異(P＞0.05)。
討論1異位灶的E2水平據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥異位灶的E2水平明顯增高，其增高途徑有以下幾種(1)異位內(nèi)膜的基質(zhì)細胞經(jīng)cAMP類似物孵育后，可表現(xiàn)出相當高的芳香酶的活性，睪酮向E2的轉(zhuǎn)化增強；(2)子宮內(nèi)膜異位灶中存在17β-HSDHI型，缺乏17β-HSDHII型，使E2的轉(zhuǎn)化增加，滅活減少，導(dǎo)致局部E2水平明顯增高；(3)雌激素激活環(huán)氧化酶-2，促進花生四烯酸向PCE2的轉(zhuǎn)化，子宮內(nèi)膜異位癥高濃度的E2和PCE2形成了一個正反饋環(huán)，使增殖期和分泌期均有細胞色素芳香化酶P450的強表達，促進異位病灶的種植生長。本實驗中的非治療組異位灶E2水平明顯增高，從側(cè)面驗證了以上觀點。
2露蜂房治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及機理子宮內(nèi)膜異位癥大鼠用露蜂房治療4周后，移植物體積縮小，內(nèi)膜呈萎縮狀態(tài)。有部分移植物甚至消失。
露蜂房治療組的血清和卵巢E2的水平顯著下降，遠遠低于非治療組；而露蜂房組異位灶E2水平也明顯低于非治療組E2水平，提示了露蜂房對卵巢功能可能具有抑制作用，降低了血清E2的水平，從而抑制了雌激素對雌激素受體、孕激素受體合成的正向調(diào)節(jié)作用；同時，露蜂房也有可能通過降低芳香酶的活性，抑制睪酮轉(zhuǎn)化為E2，或者抑制雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌酮，從而減少了異位灶局部的E2的水平，使異位灶逐漸地萎縮。再者，露蜂房也有可能通過抑制異位灶的自分泌作用，抑制了17β-HSDHI型的活性，減少了雌酮向E2的轉(zhuǎn)變，從而降低了異位灶的E2水平，造成低性激素狀態(tài)，使異位內(nèi)膜失去激素的支持，導(dǎo)致異位內(nèi)膜萎縮。
但是露蜂房通過何種途徑抑制異位灶的種植生長，是否還存在其它的抑制途徑，仍有待于我們進一步的研究。
5露蜂房治療子宮內(nèi)膜異位癥的副作用露蜂房能夠有效地治療子宮內(nèi)膜異位癥，但它是否有一定的副作用呢？對此，我們做了以下的研究(1)卵巢。組織病理學(xué)觀察卵巢形態(tài)學(xué)基本無改變；而卵巢系數(shù)也與假手術(shù)組沒有明顯差別，提示了露蜂房對卵巢沒有明顯毒性作用。(2)子宮及子宮內(nèi)膜。與假手術(shù)組相比，雖然露蜂房組子宮系數(shù)無明顯改變，但是子宮內(nèi)膜粘膜上皮出現(xiàn)空泡、殘跡，這種粘膜狀態(tài)表明激素水平比較低。這些現(xiàn)象與經(jīng)丹那唑治療后子宮內(nèi)膜的改變基本相似。提示了露蜂房對子宮內(nèi)膜具有一定的不良影響。(3)肝腎。組織形態(tài)學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)露蜂房對肝腎有不良影響。(4)骨骼臨床與實驗研究均已證實，內(nèi)源性雌激素水平的降低可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而本實驗結(jié)果提示，未發(fā)現(xiàn)中露蜂房對骨骼產(chǎn)生不良的影響骨小梁粗壯，排列整齊并連接成網(wǎng)，間隙較小，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨小梁密度，面積正常，無減少。為了進一步了解露蜂房對骨骼的影響情況，我們又對血清磷和血清鈣的測定，發(fā)現(xiàn)露蜂房組血清鈣、磷的含量與danazol組、假手術(shù)組以及非治療組相比無明顯變化。而danazol是一種17α乙炔睪丸酮的衍生物，它通過對垂體促性腺激素的抑制，使FSH、LH水平下降，或直接抑制產(chǎn)生卵巢類固醇的酶，抑制卵巢類固醇的產(chǎn)生，造成持續(xù)性卵巢功能低落，也會導(dǎo)致內(nèi)源性雌激素水平的降低，進一步引發(fā)血清鈣的減少。
總之，露蜂房雖然對正常的子宮內(nèi)膜產(chǎn)生了一定的影響，但其能夠有效地治療子宮內(nèi)膜異位癥。
權(quán)利要求
1.露蜂房在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了露蜂房在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。動物實驗證明，露蜂房對子宮內(nèi)膜異位癥具有明顯的治療作用，更重要的是露蜂房與danazol(丹那唑)相比，具有無可比擬的安全性。露蜂房效果比較好，基本不會造成不良影響，因而具有治療子宮內(nèi)膜異位癥的前景。
文檔編號A61P15/00GK1899313SQ20051002792
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日
發(fā)明者俞超芹, 石書芳 申請人:上海長海醫(yī)院