專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白質(zhì)nmb1125及其在藥物制劑中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及開(kāi)發(fā)預(yù)防性或治療性應(yīng)用的新疫苗制劑，其可以提高抗不同來(lái)源的疾病抗原的免疫應(yīng)答的質(zhì)量。
唯一已知宿主是人的革蘭氏陰性雙球菌腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是腦膜炎球菌性腦膜炎的致病因子。通常在正常人群的無(wú)癥狀攜帶者(是其微生物分離的最常見(jiàn)的來(lái)源的生態(tài)位)中發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌。
就全世界而言，2歲以下的兒童是接觸性腦膜炎球菌性腦膜炎的最易感人群，但是年輕的成年人以及正常的成年人群體也可能被感染。
未治療的腦膜炎球菌病對(duì)大多數(shù)被感染的個(gè)體具有致死過(guò)程，免疫接種通過(guò)早在細(xì)菌的定殖階段停止所述事件而可能預(yù)防這種情形。
已經(jīng)發(fā)展了幾種策略旨在獲得能夠滿(mǎn)足在普通人群中誘導(dǎo)抗這種疾病的保護(hù)性所需的條件的疫苗。為此，已經(jīng)考慮了莢膜抗原，因?yàn)樗鼈兊拿庖咛禺愋阅軐⑦@種微生物分類(lèi)為血清群。這些血清群中的5種被確定為導(dǎo)致了全世界的大多數(shù)的腦膜炎球菌病的臨床病例。血清群A是在亞撒哈拉非洲中流行病的主要原因。在大多數(shù)情況下血清群B和C與發(fā)達(dá)國(guó)家中的發(fā)病有關(guān)。血清群Y和W135在大多數(shù)的該疾病的復(fù)發(fā)病例中常見(jiàn)，并且它們?cè)诿绹?guó)的一些地區(qū)中比較普遍，在最近幾年中有明顯的增加。從這些數(shù)據(jù)來(lái)看，將莢膜多糖作為疫苗候選物進(jìn)行使用、研究和評(píng)估是顯而易見(jiàn)的。一種基于莢膜多糖的抗血清群A、C、Y和W-135的四價(jià)疫苗在美國(guó)已經(jīng)獲得許可。免疫接種后產(chǎn)生的抗體是血清群特異的(Rosenstein N.等人，2001.Meningococcaldisease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。
血清群B與其他血清群不同，也是地方性和流行性腦膜炎球菌病的主要病因，這主要是因?yàn)楦緵](méi)有對(duì)其的有效疫苗。已經(jīng)注意到莢膜多糖B是弱免疫原性的，加之因?yàn)樵摶衔镌诮Y(jié)構(gòu)上類(lèi)似于人神經(jīng)系統(tǒng)胎兒結(jié)構(gòu)存在的寡糖鏈，因而存在基于該化合物的疫苗有誘導(dǎo)免疫耐受和自身免疫的理論危險(xiǎn)。(Finne J.等人，1987.An IgGmonoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts withdevelopmentally regulated polysialic acid units ofglycoproteins in neural and extraneural tisues.J.Immunol，1384402-4407)。因此，針對(duì)血清群B的疫苗的開(kāi)發(fā)集中于使用亞莢膜(sub-capsular)抗原。
外膜蛋白和泡囊(vesicle)疫苗在70年代，基于外膜蛋白制備疫苗的最初嘗試基于通過(guò)去污劑去除LPS的外膜蛋白制劑(Frasch CE和Robbins JD.1978.Protectionagainst group B meningococcal disease.III.Immunogenicity ofserotype 2 vaccines and specificity of protection in a guineapig model.J Exp Med 147(3)629-44)。然后沉淀外膜蛋白OMP以制備懸浮于氯化鈉中的聚集體。盡管在動(dòng)物研究中獲得了有希望的結(jié)果，但是這些疫苗不能在成人和兒童中誘導(dǎo)殺菌性抗體(Zollinger WD等，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidistype 2 protein vaccine in animals and humans.J.Infect.Dis.137(6)728-39)，這些疫苗較差的表現(xiàn)主要是由于沉淀導(dǎo)致的四級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失。因此，下一個(gè)合理的步驟是制備具有呈現(xiàn)天然構(gòu)象的外膜蛋白泡囊形式的蛋白的疫苗(Zollinger WD等，1979.complex ofmeningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membraneprotein immunogenic in man.J.Clin.Invest.63(5)836-48，WangLY和Frasch CE.1984.Development of a Neisseria meningitidisgroup B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mousemodel.Infect Immun.46(2)408-14136)。
這些外膜泡囊疫苗的免疫原性明顯比OMP聚集體的免疫原性高，并且該免疫原性通過(guò)吸附氫氧化鋁佐劑而進(jìn)一步加強(qiáng)(Wang LY和Frasch CE.1984.Neisseria meningitidis group B serotype 2bprotein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun.46(2)408-14136)。
使用可溶性外膜泡囊疫苗的不同制劑進(jìn)行了許多功效實(shí)驗(yàn)。分別應(yīng)對(duì)在古巴(Sierra GV等人，1991.Vaccine against group BNeisseria meningitidisprotection trial and mass vaccinationresults in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)195-210)和挪威(Bjune G等人，1991.Effect of outer membrane vesicle vaccine againstgroup B meningococcal disease in Norway.Lancet.338(8775)1093-6)的疾病爆發(fā)，在20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)了兩種最廣泛研究的疫苗。由古巴Finlay學(xué)院制備的OMV疫苗(商業(yè)名為VA-MENGOC-BC)是由具有血清群C多糖的株系B4P1.19，15和高分子量OMP制劑制備的，并吸附氫氧化鋁(Sierra GV等人，1991.Vaccineagainst group B Neisseria meningitidisprotection trial andmass vaccination results in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)195-210)。該疫苗導(dǎo)致古巴流行病的快速下降(Rodriguez AP等人，Theepidemiological impact of antimeningococcal B vaccination inCuba.1999.Mem Inst Oswaldo Cruz.94(4)433-40)。
由Norwegian National Institute for Public Health(NIPH)制備的疫苗同樣最初想在另一種來(lái)自ET-5克隆(B15P1.7，16)的生物體引起的高度地方性疾病期間使用。其也是一種單價(jià)疫苗，由吸附于氫氧化鋁的純化的外膜泡囊制備(Bjune G等，1991.Effect ofouter membrane vesicle vaccine against group B meningococcaldisease in Norway.Lancet.338(8775)1093-6)。
外膜泡囊疫苗有效地使外膜蛋白呈現(xiàn)充分天然的構(gòu)象以允許功能性殺菌抗體的產(chǎn)生，至少在十幾歲的青少年和成人中。也已經(jīng)顯示產(chǎn)生的抗體應(yīng)答增加了腦膜炎球菌的調(diào)理吞噬作用。疫苗的精確配方(即OMP含量、LPS含量和佐劑的存在與否)對(duì)免疫原性具有明顯的影響(Lehmann AK等，1991.Immunization against serogroup Bmeningococci.Opsonin response in vaccinees as measured bychemiluminescence.APMIS.99(8)769-72，Gomez JA等，1998.Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activityof antibodies against the transferrin-binding proteins ofNeisseria meningitidis.Vaccine.16(17)1633-9，Steeghs L等，1999.Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in aLipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidisInfluence of Adjuvants on the Immune Response.Infect Immun.67(10)4988-93)。
疾病分離物的抗原性特性譜也變化很快，因此只作用有限數(shù)量的選擇株系的疫苗在幾年以后就可能變得無(wú)效，除非根據(jù)地方流行病學(xué)改變疫苗的組成。
目前，OMV疫苗比其他任何血清群B的疫苗的應(yīng)用都廣泛，并且在單一PorA型導(dǎo)致的疾病的爆發(fā)中非常有用。
在株系間產(chǎn)生交叉反應(yīng)性的免疫原仍需充分地說(shuō)明。來(lái)自Finlay學(xué)院和NIPH疫苗實(shí)驗(yàn)的接種后血清研究表明針對(duì)PorA(P1，1類(lèi)血清亞型蛋白)和OpcA(另一種主要OMP，以前稱(chēng)為Opc)二者的抗體(WedegeE，等人，1998.Immune Responses against Major Outer MembraneAntigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and ControlsWho Contracted Meningococcal Disease during the NorwegianSerogroup B Protection Trial.Infect Immun.66(7)3223-31)對(duì)介導(dǎo)血清殺菌活性都非常重要(PorA免疫原性最大)，兩種抗原都顯示顯著的株系與株系的差異性。
PorA蛋白的顯著性和該蛋白的顯著水平的差異性在疾病爆發(fā)間期和期間其表位都持續(xù)發(fā)生變異(Jelfs J等人，2000.SequenceVariation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidisduring Epidemic Spread.Clin Diagn Lab Immunol.7(3)390-5)(其中接種后(疾病后)的大多數(shù)殺菌活性都是針對(duì)所述表位的)，這增加了基于單一菌株(單價(jià))OMV的疫苗可能是血清亞型限制性的(即依賴(lài)PorA型)的擔(dān)心。
為了克服這些潛在的問(wèn)題，在荷蘭的RIVM開(kāi)發(fā)了一種OMV疫苗，其含有來(lái)自六種不同流行的病原性分離株的PorA蛋白(van Der Ley P和Poolman JT.1992.Construction of a multivalentmeningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membraneprotein.Infect Immun.60(8)3156-61，Claassen I等，1996.Production，characterization and control of a Neisseriameningitidis hexavalent class 1 outer membrane proteincontaining vesicle vaccine.Vaccine.14(10)1001-8)。在該情形中，從兩種很好表征的H44/76株系的變體中分離了疫苗泡囊，所述的H44/76株系已經(jīng)遺傳改造以表達(dá)三種單獨(dú)的PorA蛋白。
通用抗原的研究顯然，外膜蛋白(OMP)能夠誘導(dǎo)抗血清群B疾病的功能性免疫應(yīng)答，但是至今沒(méi)有開(kāi)發(fā)出一種疫苗可以具有通用的保護(hù)性，因?yàn)橥饽さ鞍椎谋砻姹┞秴^(qū)域具有很大的異質(zhì)性。外膜泡囊(OMV)疫苗誘導(dǎo)的適度的交叉免疫刺激了對(duì)外膜抗原(或抗原組)的研究，所述的外膜抗原誘導(dǎo)功能性抗體并存在于所有的腦膜炎球菌株系上。這些抗原，如果它們存在于無(wú)論什么血清群的所有株系上，則可能形成真正通用的腦膜炎球菌疫苗的基礎(chǔ)，這可能會(huì)消除多糖接種后病原性株系上莢膜轉(zhuǎn)變的潛在問(wèn)題。
一旦該免疫顯性PorA蛋白的變異性限制其作為通用疫苗的應(yīng)用變得明顯，則可以考慮許多其他主要的外膜蛋白的疫苗潛力，并且其中的幾種正在進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)中。那些已經(jīng)被考慮的外膜蛋白包括第5類(lèi)蛋白(OpcA)，NspA和鐵調(diào)節(jié)的蛋白(TbpA和B，F(xiàn)bpA，F(xiàn)etA)。TbpB與TbpA形成轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合復(fù)合物的一部分。最近的工作表明TbpA不但在鐵結(jié)合中具有重要作用(Pintor M等人，1998.Analysis of TbpAand TbpB functionality in defective mutants of Neisseriameningitidis.J Med Microbiol 47(9)757-60，而且是比TbpB更有效的免疫原。
已經(jīng)使用來(lái)自不同腦膜炎球菌株系的外膜蛋白制劑的組合免疫小鼠通過(guò)新技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種高度保守的小的外膜蛋白(Martin D等人，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface ProteinConfers Protection against Experimental Infection.J Exp Med185(7)1173-83)。使用來(lái)自小鼠的B細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤，然后篩選其針對(duì)多腦膜炎球菌株系的交叉反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)一種高度交叉反應(yīng)性的單克隆抗體結(jié)合22kDa的外膜蛋白，其被稱(chēng)為NspA。用重組NspA蛋白的免疫顯示在小鼠中誘導(dǎo)了針對(duì)來(lái)自血清群A-C的株系的交叉反應(yīng)性殺菌應(yīng)答。疫苗接種也保護(hù)了小鼠抗致死性腦膜炎球菌感染(Martin D等，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidisSurface Protein Confers Protection against ExperimentalInfection.J Exp Med 185(7)1173-83)。在遺傳不同的腦膜炎球菌株系間的NspA序列的比較表明該蛋白是高度保守的(97％的同源性)(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-ProtectiveActivities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseriameningitidis NspA Outer Membrane Protein.Infect Immun 67(9)4955-9)。
使用抗NspA的單克隆抗體通過(guò)ELISA在99.2％的來(lái)自血清群A-C的測(cè)試株系上檢測(cè)到NspA的存在(Martin D等人，1997.HighlyConserved Neisseria meningitidis Surface Protein ConfersProtection against Experimental Infection.J Exp Med 185(7)1173-83)。這些單克隆抗體顯示對(duì)許多腦膜炎球菌株系具有殺菌活性，并且能夠降低小鼠模型中的腦膜炎球菌菌血癥(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-Protective Activities of a MonoclonalAntibody Directed against Neisseria meningitidis NspA OuterMembrane Protein.Infect Immun 67(9)4955-9)。盡管該數(shù)據(jù)表明NspA是一種有希望的能夠在跨血清群界限進(jìn)行保護(hù)的疫苗候選物，但是來(lái)自小鼠的多克隆抗重組NspA血清不結(jié)合大約35％的病原性血清群B腦膜炎球菌株系的表面，盡管在這些生物體中存在nspA基因(Moe GR等，1999.Differences in Surface Expression ofNspA among Neisseria meningitidis Group B Strains.Infect Immun67(11)5664-75)。
抗原呈遞和疫苗制劑早前的工作表明抗原呈遞的形式可能比較關(guān)鍵。膜結(jié)合蛋白上的表位通常依賴(lài)于正確的三級(jí)結(jié)構(gòu)的維持，這反過(guò)來(lái)又經(jīng)常依賴(lài)疏水性膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)顯示外膜蛋白制劑只有呈現(xiàn)泡囊形式時(shí)才在人體中引發(fā)免疫性(Zollinger WD等人，1979.complex of meningococcalgroup B polysaccharide and type 2 outer membrane proteinimmunogenic in man.J Clin Invest 63(5)836-48，Zollinger WD等人，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseriameningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans.JInfect Dis 137(6)728-39)。
單蛋白疫苗已經(jīng)在本領(lǐng)域中使用了幾十年，并通常表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。如果需要以泡囊的形式呈現(xiàn)，以使抗原保持膜結(jié)合，穩(wěn)定性和再現(xiàn)性可能難保證。外膜泡囊的免疫原性和反應(yīng)原性可能隨著蛋白量以及純化過(guò)程中LPS的去除的變化而變化。但是在OMV疫苗制備中產(chǎn)生了泡囊制備的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，對(duì)目前制備的疫苗進(jìn)行質(zhì)量控制。構(gòu)建完全合成的脂質(zhì)體泡囊可允許進(jìn)一步優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化這些疫苗(Christodoulides M等人，1998.Immunization with recombinantclass 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidisinfluence of liposomes and adjuvants on antibody avidity，recognition of native protein and the induction of abactericidal immune response against meningococci.Microbiology 144(Pt 11)3027-37)。換句話(huà)講，外膜蛋白已經(jīng)以泡囊和純的表達(dá)蛋白呈現(xiàn)，并且抗體應(yīng)答的產(chǎn)生是適度的。至今主要努力集中在腦膜炎球菌疫苗的肌內(nèi)注射，導(dǎo)致產(chǎn)生全身IgG。但是，在腦膜炎球菌疾病中，如果宿主的侵入是通過(guò)鼻上皮，那么分泌性IgA的產(chǎn)生可能也是重要的。
腦膜炎奈瑟氏球菌的基因組序列在2000年描述和公開(kāi)了MC58(血清群B腦膜炎球菌)的基因組序列(Tettelin H等人，2000.complete Genome Sequence ofNeisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58.Science 287(5459)1809-15172)以及Z2491(血清群A菌株)的基因組序列(Parkhill J等人，2000.complete DNA sequence of a serogroup Astrain of Neisseria meningitidis Z2491.Nature 404(6777)502-6173)。所述基因序列的獲得對(duì)腦膜炎球菌疫苗的研究產(chǎn)生了重大的影響。而MC58基因組測(cè)序取得了進(jìn)展，Pizza等人開(kāi)始簽定了被描述編碼膜結(jié)合蛋白、表面暴露蛋白和輸出蛋白的開(kāi)放閱讀框。他們鑒定了570種這樣的ORF，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)他們進(jìn)行了擴(kuò)增，并將他們克隆進(jìn)大腸桿菌中以允許編碼的蛋白以帶His標(biāo)簽或谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白形式表達(dá)(Pizza M等人，2000.Identificationof Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus byWhole-Genome Sequencing.Science 287(5459)1816-20)。61％(350)的所選擇的ORF被成功表達(dá)，那些不能表達(dá)的ORF通常含有一個(gè)以上疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(可能排除了大量外膜結(jié)合蛋白)。純化了重組蛋白并用于接種小鼠。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了免疫血清對(duì)多種腦膜炎球菌株系的表面結(jié)合，使用血清殺菌測(cè)定評(píng)價(jià)了免疫血清的對(duì)兩種株系的殺菌活性?；谠谒腥N測(cè)定中的陽(yáng)性應(yīng)答最后選擇了7種蛋白用于進(jìn)一步研究。使用多種這些蛋白的實(shí)驗(yàn)疫苗制劑組合佐劑顯示誘導(dǎo)了明顯的針對(duì)小鼠中同源腦膜炎球菌株系(MC58)的殺菌滴度，但是沒(méi)有一種蛋白誘導(dǎo)SBA的滴度和MC 58外膜泡囊疫苗一樣高(Giuliani MM等人，2000.Proceedings12th IPNC.p.22)。另一方面，有一些證據(jù)表明這些蛋白的組合可能在小鼠顯示高于單一蛋白的免疫原性(Santini L等人，2000.Proceedings 12th IPNC.p.25)。在該研究中排除的大量開(kāi)放閱讀框(可能通過(guò)不能蛋白質(zhì)表達(dá)或他們的免疫學(xué)特性的修飾)可能也具有疫苗潛力并需要進(jìn)一步研究。
一旦了解了各個(gè)抗原對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的發(fā)病機(jī)理的作用，就可能比較有效地選擇疫苗組分?？乖旧砜梢苑Q(chēng)為有效的疫苗候選物，或者減毒的突變體可能作為疫苗成分。
在這一指導(dǎo)下，使用在幾種病原性微生物中序列高度保守的疫苗候選物可能提供對(duì)它們引起的多種疾病的解決方案，如果這些候選物通過(guò)免疫系統(tǒng)作用誘導(dǎo)方便的應(yīng)答。
本發(fā)明的技術(shù)目的是開(kāi)發(fā)能夠增強(qiáng)和/或擴(kuò)寬針對(duì)不同病原體或廣泛的各個(gè)病原體變體的免疫應(yīng)答的疫苗制劑，所述的病原體為癌癥、細(xì)菌、病毒或任何其他來(lái)源的。
發(fā)明描述在本發(fā)明的工作目的中，首次報(bào)道了使用NMB 1125蛋白作為疫苗制劑的組分，所述的疫苗制劑具有抗腦膜炎球菌疾病或任何由奈瑟氏菌屬的成員引起的任何感染的治療或預(yù)防特性。
本發(fā)明的新特征在于以前未曾報(bào)道的NMB1125蛋白在具有新特性的制劑中的應(yīng)用，所述的制劑能夠誘導(dǎo)廣譜保護(hù)作用的全身或粘膜免疫應(yīng)答，這是由于該蛋白在腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的不同分離株中的保守特性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.在克隆和表達(dá)蛋白NMB1125中使用的克隆載體pM100。pTrip，色氨酸啟動(dòng)子；N-term P64k，P-64k N末端片段；T4終止子，T4噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子。
圖2.在pM100載體中的基因NMB1125的核苷酸序列的最終結(jié)構(gòu)。
圖3.細(xì)胞破碎獲得的部分的SDS-PAGE分析。泳道1總細(xì)胞；泳道2細(xì)胞沉淀；泳道3上清。
圖4.來(lái)自破碎的上清的NMB1125純化過(guò)程的SDS-PAGE分析。泳道1所得的蛋白；泳道2發(fā)現(xiàn)于不同層析級(jí)分中的低分子量污染蛋白；泳道3應(yīng)用前的樣品。
圖5.獲自通過(guò)鼻內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑免疫的小鼠的針對(duì)重組蛋白NMB1125的抗體水平(IgG)。顯示了ELISA結(jié)果，其被表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數(shù)。
圖6.使用用重組蛋白免疫的小鼠的血清對(duì)存在于腦膜炎奈瑟氏球菌OMV中的NMB1125的Western印跡。免疫鑒定的NMB1125比較顯著。
圖7.在通過(guò)鼻內(nèi)途徑免疫的小鼠中在粘膜水平的針對(duì)重組蛋白NMB1125的IgA抗體應(yīng)答。結(jié)果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數(shù)。(A)唾液中的IgA抗體應(yīng)答。(B)肺沖洗物中的IgA抗體應(yīng)答。
圖8.使用BLAST對(duì)NMB1125蛋白(查詢(xún))和來(lái)自不同血清群腦膜炎奈瑟氏球菌(“Sbjct”)的基因組的該序列之間的同源性探查的結(jié)果。
圖9.通過(guò)針對(duì)重組抗原引發(fā)的血清對(duì)不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中的NMB1125的識(shí)別。圖中只顯示了用半純化的蛋白的腹膜內(nèi)途徑獲得的結(jié)果，但是在其他情況中觀察到類(lèi)似的特性。結(jié)果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數(shù)。
圖10.在幼年大鼠模型的針對(duì)腦膜炎球菌感染的被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥用兩種方法獲得的蛋白免疫引發(fā)的血清的比較。
圖11通過(guò)產(chǎn)生的mAb(mAb H8/92，3H2764和7D2/15)對(duì)NMB1125蛋白和一組非相關(guān)抗原的識(shí)別。P1，腦膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.15的1類(lèi)蛋白；P64k，來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脫氫酶的E3亞基；T.T，破傷風(fēng)類(lèi)毒素；HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。
圖12.來(lái)自腦膜炎球菌病存活者的人恢復(fù)期血清對(duì)NMB1125的識(shí)別。使用健康供者血清作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示為在ELISA類(lèi)型測(cè)定中的吸光度(492nm)。
圖13.來(lái)自用游離肽(JY1)、重組蛋白(NMB1125)或綴合物JY1-NMB1125免疫的動(dòng)物的血清的JY1抗肽滴度。
實(shí)施例此處通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明，所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明本身提供了信息，但決不是對(duì)所述發(fā)明的限制。
實(shí)施例1在血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌外膜泡囊制劑中NMB1125蛋白的檢測(cè)為了研究存在于血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌(株系B:4:P1.19，15)外膜泡囊中的蛋白質(zhì)，根據(jù)別處描述的方法進(jìn)行了二維電泳(Grg A等人，1985.Electrophoresis 6599-604)。然后使用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，U.S.)對(duì)凝膠提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行了酶消化。消化后產(chǎn)生的肽通過(guò)微型柱(ZipTips，Millipore，MA，U.S.)提取入溶液。為了質(zhì)譜法分析，用60％乙腈、1％甲酸從微型柱中洗脫肽，然后立即應(yīng)用于nanotips(Protana，Denmark)。
在配備有電離源(nanoESI)具有cuadrupole和飛行時(shí)間的雜合質(zhì)譜儀(QTof-2TM，Manchester，United Kingdom)中進(jìn)行測(cè)量。400-2000范圍的w/z在0.98秒內(nèi)并使用0.02秒的掃描間隔獲得質(zhì)譜測(cè)定數(shù)據(jù)。使用MassLynx程序(versión 3.5，Micromass)進(jìn)行數(shù)據(jù)的獲得和數(shù)據(jù)處理。
使用ProFound程序(Zhang W和Chait BT.2000.ProFoundanexpert system for protein identification using massspectrometric peptide mapping information.Anal Chem722482-2489.http//prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)進(jìn)行基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)鑒定。對(duì)包含于SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因和衍生的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢索，考慮甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脫酰胺基作用和羧基酰胺甲基化作用作為可能遇到的修飾。
利用MASCOT程序(Perkins DN等，1999.Probability-basedprotein identification by searching sequence databases usingmass spectrometry data.Electrophoresis 203551-3567.http//www.matrixscience.com/)進(jìn)行基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定。檢索參數(shù)包括半胱氨酸修飾以及氧化作用和脫酰胺作用。
從存在于外膜泡囊制劑中的蛋白質(zhì)的鑒定獲得的結(jié)果的分析，選擇NM1125蛋白用于作為可能的疫苗候選物進(jìn)行評(píng)價(jià)，由此通過(guò)質(zhì)譜鑒定一種肽。
實(shí)施例2NMB1125蛋白與可用的數(shù)據(jù)庫(kù)中的報(bào)告的基因產(chǎn)物的同源性分析為了分析NM1125蛋白與其他基因產(chǎn)物的同源性，使用BLAST程序(Altschul SF等，1990.Basic local alignment search tool.J MolBiol 215403-410，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了基于同源性的檢索。該方法獲得的結(jié)果標(biāo)記為同源的，除了在公開(kāi)的奈瑟氏菌屬基因組中報(bào)告的蛋白質(zhì)外，識(shí)別了來(lái)自不同生物如Ralstonia，耶爾森氏菌屬(Yersinia)和假單孢菌屬(Pseudomonas)種的幾種標(biāo)記為假定的蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物。
這些蛋白質(zhì)在這些基因組中的高度保守性已經(jīng)產(chǎn)生了具有在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)告的保守結(jié)構(gòu)域的直向同源進(jìn)化組[(gnl|CDD|13507，COG4259，在細(xì)菌中保守的未表征的蛋白質(zhì)[功能未知)]，表明存在可能的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)聯(lián)和他們存在共同的祖先。
使用MBGD數(shù)據(jù)庫(kù)(Uchiyama，I.2003.MBGDmicrobial genomedatabase for comparative analysis.Nucleic Acids Res.31，58-62.)進(jìn)行對(duì)編碼NM1125的基因的基因組環(huán)境的分析，并揭示了在前面提到的微生物中這些基因的保守的基因組織，結(jié)合以前的數(shù)據(jù)，這促使我們得出這樣的結(jié)論，即這些基因在他們各自的基因組中是顯著同源的。
實(shí)施例3在大腸桿菌中克隆和表達(dá)編碼腦膜炎奈瑟氏球菌的NMB1125蛋白的NMB1125基因。
為了克隆和表達(dá)NM 1125基因，使用了pM-100克隆載體。該載體允許使用不同的限制酶進(jìn)行克隆，并且在大腸桿菌中產(chǎn)生高表達(dá)水平的包函體形式的異源蛋白。
該pM-100載體(圖1)具有下列元件色氨酸啟動(dòng)子、編碼來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.19，15的P64kDa的Nt片段的47個(gè)氨基酸穩(wěn)定序列的基因片段、T4噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子序列和賦予氨芐青霉素抗性的作為選擇標(biāo)志的基因的序列。
從編碼NMB1125蛋白的核苷酸序列(實(shí)施例1)設(shè)計(jì)了兩個(gè)引物(7738和7739)來(lái)從B:4:P1.19，15基因組DNA擴(kuò)增該基因片段，沒(méi)有編碼預(yù)測(cè)的信號(hào)肽的序列。
BglII77385＇TTAGATCTCTATCCCGATACCGTCTATGAAGG＇3(Seq.ID.No.1)77395＇AAGCTCGAGTCGTTTGCCTCCTTTACC 3＇Xhol(Seq.ID.No.2)使用SignalP World Wide Web server(http//www.cbs.dtu.dk/services/Signa1P-2.0)進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。使用引物7738和7739 PCR擴(kuò)增NMB1125基因之后(Randall K等人，1988.Science 42394487-491)，使用BglII和XhoI限制酶消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并克隆進(jìn)預(yù)先消化的pM-100克隆載體中。最后的構(gòu)建體示于圖2中，NMB1125蛋白表達(dá)為與P64kDa蛋白的Nt片段的融合蛋白。使用ALFexpress II自動(dòng)測(cè)序儀(Termo SequenaseTMCyTM5DyeTerminador Kit，Amersham Biosciences)和分別結(jié)合P64穩(wěn)定劑以及T4轉(zhuǎn)錄終止子的序列的寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)對(duì)克隆的基因NMB1125進(jìn)行測(cè)序。此處產(chǎn)生的質(zhì)粒在其以后的應(yīng)用中稱(chēng)為pM-238。
為了表達(dá)NMB1125基因，使用pM-238質(zhì)粒(圖2)通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)化GC366大腸桿菌。在補(bǔ)充1％甘油、1％酪蛋白水解物、0.1mM CaCl2，1mM MgSO4和50ug/mL氨芐青霉素的基本培養(yǎng)基(M9)(Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，NEW York，USA)中進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌培養(yǎng)物在37℃和250rpm下孵育12小時(shí)。離心生長(zhǎng)培養(yǎng)物，并超聲破碎細(xì)胞沉淀(IKA LABORTECHNIK)。通過(guò)SDS-PAGE(Laemmli UK.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.Nature 277680)和考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析沉淀和上清級(jí)分。通過(guò)凝膠密度測(cè)定法(LKB Bromma 2202 Ultrascanlaser densitometer；Amersham Pharmacia Biotech，United Kingdom)測(cè)定表達(dá)百分比。從上清級(jí)分中獲得NMB1125蛋白，大約是該級(jí)分總蛋白含量的60％(圖3)。含有蛋白的部分用緩沖液A(25mM的Tris-羥甲基氨基甲烷)進(jìn)行透析，并通過(guò)使用monoQ 5/5柱(AmershamBiosciences)以及在1小時(shí)內(nèi)的0-100％NaCl梯度[緩沖液A作為平衡緩沖液，緩沖液B(緩沖液A+1M NaCl)]的離子交換層析從中純化NMB1125蛋白，獲得80％純的蛋白，如圖4所示。
實(shí)施例4用NMB1125蛋白通過(guò)腹膜內(nèi)和鼻內(nèi)途徑免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)NMB1125蛋白的免疫原性，在小鼠中設(shè)計(jì)和進(jìn)行了免疫實(shí)驗(yàn)，其中給藥了通過(guò)兩種不同的方法獲得的相同的蛋白。第一個(gè)由從聚丙烯酰胺凝膠的帶中的提取物組成(Castellanos L等，1996.Aprocedure for protein elution from reverse-stainedpolyacrylamide gels applicable at the low picomole levelAnalternative route to the preparation of low a bundance proteinsfor microanalysis.Electroforesis 171564-1572)，而第二個(gè)是實(shí)施例3中所涉及的，所述的產(chǎn)物稱(chēng)為半純化的蛋白。
用這些制劑免疫雌性Balb/C小鼠(8-10周齡)，所述的小鼠分成4組，每組8只。通過(guò)鼻內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑進(jìn)行三次免疫，兩次間隔15天。通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥的蛋白用弗氏佐劑乳化。表1中描述了該免疫原的組成表1用于免疫的Balb/C小鼠的組別
在取自第三次接種后的血清樣品中針對(duì)重組蛋白和存在于細(xì)菌中的同源蛋白的抗體滴度(IgG)通過(guò)ELISA測(cè)定。在圖5中顯示了各個(gè)動(dòng)物的針對(duì)重組蛋白的抗體滴度。在第二次接種后確定抗體水平，盡管他們?cè)诘谌谓臃N后更高。另外，通過(guò)Western印跡進(jìn)行了免疫鑒定，其中識(shí)別了每個(gè)蛋白帶。通過(guò)腹膜內(nèi)途徑免疫的組的滴度顯著高于通過(guò)鼻內(nèi)途徑引發(fā)的。為了進(jìn)行結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)Bartlett’s檢驗(yàn)使用了Kruskal-Wallis的無(wú)參數(shù)方差分析，因?yàn)榻M中的非方差齊性。使用Dunn的多重比較檢驗(yàn)比較了每個(gè)處理的平均值。
用重組蛋白免疫后獲得的血清識(shí)別存在于株系CU385的外膜蛋白(OMP)制劑中天然蛋白。這些結(jié)果示于圖6中。為了分析粘膜應(yīng)答評(píng)價(jià)了唾液樣品和肺洗液。圖7只顯示了通過(guò)鼻內(nèi)途徑免疫的組。在接受半純化的蛋白的組中觀察到IgA滴度的增加。
實(shí)施例5在不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中編碼蛋白NMB1125的基因序列的表征為了分析在不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中編碼蛋白NMB1125蛋白的基因序列的保守性，使用程序BLAST(Altschul SF等人，1990.Basiclocal alignment search tool.J Mol Biol 215403-410.http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(NC_003116.1，NC_003112.1，NC_003221，SANGER_135720|Contigl)中標(biāo)注的腦膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B和C)基因組進(jìn)行了類(lèi)似的研究。圖8顯示了這些序列的序列比較結(jié)果，其在每個(gè)分析的基因組中產(chǎn)生明顯的比對(duì)。組A和組B中的序列與編碼蛋白NMB1125的基因的序列(Seq.ID.No.3)具有100％的序列相同性，血清群C的序列具有99％的相同性。另外，對(duì)3個(gè)古巴分離株確定了所述基因的序列(Seq.ID.No.5-7)，他們屬于血清群B(B:4:P1.19，15)，并使用ClustalX程序(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)進(jìn)行了序列比對(duì)。比對(duì)的結(jié)果顯示在被分析的株系中基因NMB1125的核苷酸序列具有很大的保守性。
考慮到存在于前述序列中的高度相似性，使用蛋白NMB1125作為疫苗候選物，將可以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，對(duì)腦膜炎球菌疾病具有廣譜的保護(hù)作用(由于交叉反應(yīng)性)。
實(shí)施例6用蛋白NMB1125免疫Balb/C小鼠誘導(dǎo)的廣譜作用的免疫應(yīng)答的表征。
為了評(píng)價(jià)用蛋白NMB1125的免疫是否誘導(dǎo)了與其他奈瑟氏菌屬株系廣泛的交叉反應(yīng)性應(yīng)答，進(jìn)行了ELISA。用7種奈瑟氏菌屬株系的全細(xì)胞包被聚苯乙烯平板，所述的株系屬于不同的血清型和血清亞型。所述的平板與通過(guò)兩種途徑免疫(如實(shí)施例4所述)獲得的針對(duì)蛋白NMB1125的混合血清溫育。
圖9顯示了用針對(duì)通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥的半純化的蛋白引發(fā)的血清獲得的結(jié)果。如所觀察到的結(jié)果，免疫血清識(shí)別存在于不同株系中的所述蛋白，其水平類(lèi)似于在株系CU385中發(fā)現(xiàn)的水平。其他的血清在該測(cè)定中具有相當(dāng)?shù)谋憩F(xiàn)。
實(shí)施例7在幼年大鼠模型中對(duì)蛋白NMB1125特異的鼠血清誘導(dǎo)的抗同源和異源株系的保護(hù)作用為了測(cè)定獲得的抗血清的功能活性，在幼年大鼠模型中進(jìn)行了對(duì)于腦膜炎球菌感染的保護(hù)作用測(cè)定。將24只大鼠(5-6天齡)分組，每組6只。
測(cè)定通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥的血清是否保護(hù)大鼠免受一小時(shí)后通過(guò)相同途徑接種的細(xì)菌(株系CU385)引起的感染?；旌厦拷M的血清并1/10(在滅菌PBS中)稀釋?zhuān)缓髮⑺麄兘臃N幼年大鼠。4小時(shí)后，對(duì)動(dòng)物取樣，并計(jì)數(shù)他們血液中的活菌。
為了解釋該結(jié)果，進(jìn)行了方差(Anova)分析，然后進(jìn)行了Dunnet’s多重比較測(cè)試，其中測(cè)試組與陰性對(duì)照組比較。如在圖10中所觀察到的，接受抗蛋白NMB1125的抗血清的組顯示與陰性對(duì)照統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異，因此他們被認(rèn)為在該模型中是保護(hù)性的。
用分離于古巴病人的株系H44/48和120/90(其血清學(xué)分類(lèi)與株系CU385同源)感染幼年大鼠進(jìn)行了類(lèi)似的測(cè)定。另外，用血清群C的株系233(C:2a:P1.5)和血清群B的株系H44/76(B:15:P1.7，16)進(jìn)行了攻擊實(shí)驗(yàn)。在所有情況中，抗血清保護(hù)幼年大鼠抵抗腦膜炎球菌感染。
實(shí)施例8能夠介導(dǎo)抗腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌活性的針對(duì)蛋白NMB1125的單克隆抗體的產(chǎn)生為了產(chǎn)生特異針對(duì)蛋白NMB1125的單克隆抗體(mAb)，并研究介導(dǎo)抗同源和異源抗腦膜炎奈瑟氏球菌株系的殺菌活性的功能性，用純度高于80％的蛋白NMB1125制劑(實(shí)施例3)進(jìn)行了免疫程序。在Balb/C(H-2d，雌性，5-6周齡)中進(jìn)行免疫，并應(yīng)用如下的四個(gè)劑量在第0、15和30天常規(guī)免疫，每只小鼠通過(guò)皮下途徑給藥用弗氏佐劑乳化的10μg抗原NMB1125(總體積100μl)；在第50天通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥每只小鼠在磷酸緩沖鹽水(140mM NaCl，270mM KCl，1.5mM KH2PO4，6.5mM Na2HPO4x 2H2O，pH 7.2)中的10μg抗原。在第0天和第45天進(jìn)行血液提取。
通過(guò)使用蛋白NMB1125作為包被抗原(實(shí)施例3)的間接ELISA測(cè)量的具有最高滴度的動(dòng)物的脾細(xì)胞與X63 Ag8 653小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Gavilondo JV.1995.AnticuerposMonoclonalesTeoría y Práctica，Elfos Scientiae，La Habana，Cuba)分離和篩選所得到的雜交瘤。
雜交瘤分泌的抗體針對(duì)蛋白NMB1125的反應(yīng)性以及他們與無(wú)關(guān)抗原的交叉反應(yīng)性通過(guò)使用5μg/ml的每種抗原的間接ELISA進(jìn)行測(cè)試，測(cè)定相同濃度的每種mAb。圖11顯示了該實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，共獲得3個(gè)陽(yáng)性克隆(mAb H8/92，3H2/64和7D2/15)，其特異識(shí)別蛋白NMB1125，并既不與相應(yīng)于P64K的N末端的氨基酸序列反應(yīng)，也不與測(cè)定的其他無(wú)關(guān)抗原反應(yīng)。
為了測(cè)定針對(duì)蛋白NMB1125產(chǎn)生的mAb介導(dǎo)抗腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源株系的殺菌應(yīng)答的能力，進(jìn)行了殺菌測(cè)試。殺菌抗體的滴度表示為測(cè)試的抗體能夠殺死50％或更多的細(xì)菌的最高稀釋度的倒數(shù)，所產(chǎn)生的抗體中兩種(3H2/64和7D2/15)具有高于1∶128的抗同源株系B:4:P1.19，15的殺菌滴度，一種mAb(H8/92)具有高于1∶80的滴度。另外，他們具有高于1∶64的抗異源株系B:15:P1.7，16和C:2a:P1.5的滴度。
實(shí)施例9鼠科動(dòng)物針對(duì)蛋白NMB1125的免疫應(yīng)答的靶區(qū)域的表征為了鑒定該蛋白的通常被針對(duì)重組抗原產(chǎn)生的鼠科動(dòng)物抗血清識(shí)別的區(qū)域，進(jìn)行了SPOTScan測(cè)定。在纖維素膜上合成了一套跨度所述蛋白序列的重疊肽，所述的肽與1∶100稀釋的混合血清溫育。通過(guò)與綴合抗鼠免疫球蛋白G-堿性磷酸酶溫育并隨后加入含有底物溴-氯-碘基磷酸的溶液來(lái)檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)。
無(wú)論用于免疫所使用的制劑，在蛋白中觀察到幾個(gè)共同的抗原性區(qū)域。但是，在用弗氏佐劑佐化的蛋白免疫的組中有比較廣的形式的識(shí)別。
實(shí)施例10人血清對(duì)NMB1125蛋白的識(shí)別在本研究中使用來(lái)自康復(fù)期個(gè)體的人血清收集物，通過(guò)ELISA進(jìn)行該研究。用獲自制備性電泳的蛋白NMB1125(5μg/ml)包被平板。用含有Tween-20的3％脫脂奶粉PBS溶液封閉平板后，用相同溶液1∶50稀釋血清，并于平板中溫育。如已經(jīng)廣泛報(bào)道的進(jìn)行免疫測(cè)定。健康供體血清用作陰性對(duì)照。另外，來(lái)自用重組的針對(duì)乙型肝炎的疫苗免疫的個(gè)體的混合血清作為無(wú)關(guān)對(duì)照(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖12顯示了該測(cè)定中用5個(gè)康復(fù)期血清獲得的結(jié)果。可以看到人血清識(shí)別該蛋白，這表明其在腦膜炎球菌感染階段表達(dá)并是免疫原性的。
實(shí)施例11蛋白NMB1125作為肽載體為了證明重組蛋白NMB1125的載體能力，將其綴合至15聚體(15mer)的合成肽，所述的合成肽來(lái)自HIV-1分離株JY1的gp120蛋白的V3區(qū)。通過(guò)戊二醛方法進(jìn)行所述的綴合。將游離JY1肽、重組蛋白NMB1125和綴合物JY1-NMB1125以三劑量方案給藥成年小鼠，其中免疫原用弗氏佐劑乳化。第三次劑量后兩周，從免疫的動(dòng)物獲取血清樣品，并通過(guò)ELISA分析該樣品以確定抗肽抗體滴度。為此，用游離肽(20μg/ml)包被平板，如以前所述進(jìn)行免疫測(cè)定。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖13)顯示了NMB1125的載體能力，即綴合后其能明顯地加強(qiáng)針對(duì)肽JY1的抗體應(yīng)答。
序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>NMB1125蛋白及其在藥物制劑中的用途<140>CU 2003/0285<141>2003-12-02<150>CU 2003/0285<151>2003-12-02<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>1ttagatctct atcccgatac cgtctatgaa gg32<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸7739<400>2aagctcgagt cgtttgcctc ctttacc 27<210>3<211>262<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>3ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60
cgaaaagatg gaaaaatact ttgtggaagc cggcaacaaa aaaatgaatg ccgccccggg 120tgcgcacgcc atctgggact gctgctttcc gttcgggaga caaagagggc cgttccgcca 180gtttgaagaa gagaaaaggc tgtttcccga atcgggcgta tttatggact tcctgatgaa 240aaccggtaaa ggaggcaaac ga 262<210>4<211>97<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>4Gln Lys Ser Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Pro Asp Thr Val Tyr Glu1 5 10 15Gly Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ser Leu Gly Lys Gln Thr Glu Lys Met20 25 30Glu Lys Tyr Phe Val Glu Ala Gly Asn Lys Lys Met Asn Ala Ala Pro35 40 45Gly Ala His Ala His Leu Gly Leu Leu Leu Ser Arg Ser Gly Asp Lys50 55 60Glu Gly Ala Phe Arg Gln Phe Glu Glu Glu Lys Arg Leu Phe Pro Glu65 70 75 80Ser Gly Val Phe Met Asp Phe Leu Met Lys Thr Gly Lys Gly Gly Lys85 90 95Arg<210>5<211>260<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>5ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240
aaaaccggta aaggaggcaa 260<210>6<211>260<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>6ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240aaaaccggta aaggaggcaa 260<210>7<211>260<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>7ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240aaaaccggta aaggaggcaa 260<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸1573<400>8ttccatggta gataaaagaa tggctttag 29<210>9<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸6795<400>9aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 2權(quán)利要求
1.腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的蛋白質(zhì)NMB1125，特征在于其是能夠在受體生物中產(chǎn)生針對(duì)由奈瑟氏菌屬的細(xì)菌引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答的抗原，并具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)NMB1125，其特征在于由序列表中SEQ IDNO3所示的基因NMB1125編碼。
3.權(quán)利要求2的基因NMB1125，其特征在于具有序列表中SEQ IDNO3所示的堿基序列并編碼權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)。
4.通過(guò)重組技術(shù)或化學(xué)合成獲得的蛋白質(zhì)或肽，特征在于蛋白質(zhì)NMB1125的序列并能在受體生物中產(chǎn)生抗由權(quán)利要求1的奈瑟氏菌屬細(xì)菌引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答。
5.藥物制劑，特征在于含有權(quán)利要求1、2和4的蛋白質(zhì)或肽或根據(jù)權(quán)利要求1、2和4，通過(guò)天然方法制備的權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的藥物制劑，特征在于是能夠在受體生物中產(chǎn)生抗奈瑟氏菌屬細(xì)菌引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗。
7.權(quán)利要求5和6的藥物制劑，特征在于是能夠在受體生物中產(chǎn)生抗腦膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗。
8.權(quán)利要求5和6的藥物制劑，特征在于是能夠在受體生物中產(chǎn)生抗淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗。
9.權(quán)利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于是預(yù)防性或治療性制劑。
10.權(quán)利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于是含有一種或幾種通過(guò)重組方式、合成方式獲得的或通過(guò)天然途徑制備的不同抗原性質(zhì)的抗原的組合制劑。
11.權(quán)利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于含有多糖抗原。
12.權(quán)利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于制劑的組分之一是腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
13.權(quán)利要求9的藥物制劑，特征在于含有一種多糖-蛋白質(zhì)綴合物，所述的多糖部分對(duì)應(yīng)于細(xì)菌多糖。
14.權(quán)利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于含有一種或幾種滅活的微生物。
15.權(quán)利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于含有肽抗原。
16.權(quán)利要求5和6的藥物制劑，特征在于含有激素。
17.權(quán)利要求5和6的藥物制劑，特征在于含有生長(zhǎng)因子。
18.權(quán)利要求5-17的藥物制劑，特征在于是通過(guò)腸胃外途徑給藥的制劑。
19.權(quán)利要求5-17的藥物制劑，特征在于是通過(guò)粘膜途徑給藥的制劑。
20.權(quán)利要求5-17的藥物制劑，特征在于是經(jīng)口途徑給藥的制劑。
21.權(quán)利要求5-20的藥物制劑，特征在于是免疫刺激劑或免疫增強(qiáng)劑制劑。
22.權(quán)利要求5-21的藥物制劑，特征在于含有NMB1125抗原的肽或片段。
23.權(quán)利要求5-21的藥物制劑，特征在于含有NMB1125抗原的模擬表位。
24.基因修飾的生物，特征在于含有權(quán)利要求3的基因或其部分，單獨(dú)或包括于另一基因序列中。
25.權(quán)利要求24的藥物制劑，特征在于含有基因修飾的生物，活的、減毒的或其制備物。
26.藥物制劑，特征在于含有權(quán)利要求24中的生物表達(dá)的蛋白質(zhì)，并且能在受體生物中產(chǎn)生針對(duì)由奈瑟氏菌屬的細(xì)菌引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答。
27.藥物制劑，特征在于含有權(quán)利要求1、2和4的蛋白質(zhì)或肽，作為不同性質(zhì)的抗原的載體。
28.藥物組分，特征在于含有權(quán)利要求1和2的蛋白質(zhì)NMB1125或其片段，并能夠單獨(dú)或在其他組分存在下檢測(cè)人體中的腦膜炎球菌病。
29.藥物組分，特征在于含有權(quán)利要求3的基因或其片段，并能夠單獨(dú)或在其他組分存在下檢測(cè)人體中的腦膜炎球菌病。
30.根據(jù)權(quán)利要求1和2的蛋白質(zhì)NMB1125或其片段在生物傳感器或其他制藥學(xué)或生物技術(shù)學(xué)應(yīng)用中的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求3的基因NMB1125或其片段在生物傳感器或其他制藥學(xué)或生物技術(shù)學(xué)應(yīng)用中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療細(xì)菌、病毒、癌性的或其他來(lái)源的疾病的新疫苗抗原的用途。本發(fā)明的技術(shù)目的是開(kāi)發(fā)能夠增加現(xiàn)有疫苗的保護(hù)譜的制劑并擴(kuò)展該疫苗抵抗不同的病原體。為此分離了蛋白質(zhì)NMB1125，并鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌外膜制劑的組分，其能誘導(dǎo)殺菌活性。另外，克隆和表達(dá)了編碼蛋白質(zhì)NMB1125的基因，純化所述的蛋白質(zhì)，并隨后在動(dòng)物生物模型中測(cè)定了其免疫原性。同源基因序列的高度保守水平表明當(dāng)以不同方式被呈遞時(shí)其作為誘導(dǎo)交叉免疫應(yīng)答的抗原的高度價(jià)值。所得的制劑適于用于制藥業(yè)作為用于人類(lèi)的疫苗制劑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1890260SQ200480035877
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者R·帕容費(fèi)伊特, G·E·古伊倫尼爾托, G·薩蒂納斯加西亞, L·H·貝坦科特紐涅茲, L·R·卡斯特拉諾斯薩拉, Y·佩雷拉尼格林, D·加西亞迪亞茲, O·尼布拉佩雷斯, E·卡巴雷羅米南德斯, S·岡薩雷斯布蘭克 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心