專利名稱：人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人溶菌酶在制藥領(lǐng)域的新用途，特別是人溶菌酶在治療皮膚病的藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
抗生素創(chuàng)造了許多醫(yī)學(xué)奇跡，使許多疾病消失無(wú)蹤，如肺炎、腦膜炎、產(chǎn)褥熱、敗血癥、結(jié)核等。21世紀(jì)的今天，耐藥菌的發(fā)展令人觸目驚心。如耐青霉素的肺炎鏈球菌，過去對(duì)青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現(xiàn)在幾乎“刀槍不入”。從細(xì)菌的耐藥發(fā)展史可以看出，在某種新的抗生素出現(xiàn)以后，就有一批耐藥菌株出現(xiàn)。開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右時(shí)間，而一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年的時(shí)間，抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上耐藥菌的發(fā)展速度。目前急需開發(fā)一種針對(duì)不同耐藥菌株均有效的“超級(jí)抗生素”用于臨床治療。
痱子也稱為栗粒疹、汗疹，是由于在溫?zé)岘h(huán)境中汗液分泌多，不易蒸發(fā)，汗液使表皮角質(zhì)層浸漬，致使汗液導(dǎo)管口閉塞，導(dǎo)管內(nèi)汗液潴留，壓力增高而導(dǎo)管破裂，汗液滲入周圍組織，引起刺激和炎癥，汗口處發(fā)生小皰和丘疹。此外，皮膚表面溫暖濕潤(rùn)可促進(jìn)表皮葡萄球菌繁殖，葡萄球菌可堵塞汗孔或沿汗管感染，形成痱子皮膚病。根據(jù)汗腺導(dǎo)管堵塞部位的深淺及皰液內(nèi)容，臨床分為以下幾種1、晶形栗粒疹2、紅色栗粒疹3、膿皰性栗粒疹4、深部栗粒疹。此病在溫暖潮濕地區(qū)及夏季多見，多急性發(fā)病，好發(fā)于手背、頸、軀干、乳房下、腋下及皮膚皺褶處，肥胖、產(chǎn)婦及嬰幼兒受害最大。目前治療痱子多是用上述抗菌素，病癥消除慢，容易反復(fù)發(fā)作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足，提供一種人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，治療效果顯著、不過敏、不產(chǎn)生耐藥菌、安全無(wú)副作用，使用簡(jiǎn)單。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及人溶菌酶在制備治療由汗液導(dǎo)管口閉塞、導(dǎo)管內(nèi)汗液潴留、葡萄球菌堵塞汗孔或沿汗管感染引起的炎癥形成痱子皮膚病的藥物中的新用途。
所述人溶菌酶為基因工程表達(dá)的重組人溶菌酶或者基因工程表達(dá)人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或者基因工程表達(dá)或化學(xué)合成突變體重組人溶菌酶。
所述藥物中含有人溶菌酶1500U～30萬(wàn)U/mL。
所述藥物按下述制備方法制成噴霧劑將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.0～7.5)75～85％、5～25％丙二醇(或丙三醇)、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、萬(wàn)分之1～5吐溫80，1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸鉀0.01～0.1％。在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥廠按制藥規(guī)程完成)制成噴霧劑。
所述藥物按下述制備方法制成乳劑(1)將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g稱取西西黃蓍膠0.1～0.4％和阿拉伯膠1～3％，放入50ml95％乙醇液中，備用。
(2)、分別稱取山梨酸鉀0.01～0.1％、尼泊金0.01～0.05％、萬(wàn)分之1～5吐溫80、5～25％丙二醇(或丙三醇)、1～5％水溶性氮酮、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉加入到10～20mM(pH6.0～7.5)75～80％磷酸鹽緩沖液中120℃高壓滅菌待用。
(3)、在第(2)項(xiàng)水溶液不斷的攪拌下，將第(1)項(xiàng)膠醇液攪勻倒入其中，繼續(xù)攪拌乳化，在乳液降到50度時(shí)加入重組人溶菌酶，繼續(xù)攪拌乳化，混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成乳劑。
所述藥物按下述方法制成乳膏劑(1)將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g備用；稱取5～15％硬脂酸加熱熔化，過慮、除雜、除菌備用。
(2)量取(pH6.0～7.5)75～80％磷酸鹽緩沖液10～20mM，加入5～30％丙二醇(或丙三醇)、萬(wàn)分之1～8吐溫80、1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸鉀0.01～0.5％、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、1～5％十八醇攪勻，加熱至沸，除菌備用。
(3)將以熔化的固相在不斷的攪拌下加入液相的水溶液中，進(jìn)行乳化，待溫度降至50度時(shí)，將重組人溶菌酶與其它原料攪拌、混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成乳膏劑。
所述藥物按下述制備方法制成軟膏劑將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g備用，分別稱取5～25％丙二醇(或丙三醇)、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用。待溫度降至50度時(shí)，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后倒入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成軟膏劑。
所述藥物噴霧劑、乳劑、乳膏劑、軟膏劑，含有重組人溶菌酶蛋白活性為30000U/mg。
本發(fā)明對(duì)基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。與現(xiàn)有治療痱子的藥物相比，采有人溶菌酶為原料具有顯著的優(yōu)點(diǎn)人溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體的淚液、痰、鼻涕、白細(xì)胞和血清中，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌有殺菌作用，基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme)主要切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，引起細(xì)菌裂解?；蛑亟M人溶菌酶不過敏、不產(chǎn)生耐藥菌、安全無(wú)毒副作用，有很好的藥用前景?；蛑亟M人溶菌酶來(lái)源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單，并可做成噴霧劑、乳劑、乳膏劑、軟膏劑等，使用方便，療效顯著。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和效果，下面將用基因重組人溶菌酶的藥效試驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測(cè)定蛋白量、純度和重組人溶菌酶活性(30000U/mg)保存。
一、基因重組人溶菌酶(HLZ)體外抗菌作用評(píng)價(jià)受試藥品及試劑；1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供，2、對(duì)照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品，批號(hào)L6876。
3、克拉霉素效價(jià)948μ/mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)4、羅紅霉素效價(jià)878μ/mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)5、注射用阿莫西林哈爾濱制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)030504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學(xué)試驗(yàn)廠，批號(hào)030211試驗(yàn)菌株
所用菌株均為2003.2～2004.3月于四川、北京地區(qū)收集的臨床分離致病菌。經(jīng)本室用API方法重新鑒定后用于試驗(yàn)。
質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單孢菌ATCC27853培養(yǎng)基1、Tris-HCl緩沖液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，HighWater 800ml，測(cè)PH值，用HCl溶液調(diào)至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂瓊養(yǎng)基在Tris-Cl緩沖液中加入脂瓊糖116℃無(wú)菌后使用。
3、M-H培養(yǎng)基中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃20分鐘。M-H固體培養(yǎng)基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃20分鐘，用于革蘭陽(yáng)性、陰性需氧菌的藥敏試驗(yàn)。
試驗(yàn)方法體外抗菌活性(MIC)測(cè)定采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定受試藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當(dāng)稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，以二倍稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點(diǎn)接種儀(Denley A400，England)將稀釋至105CFU/ml的試驗(yàn)菌液接種于各含藥平皿表面，置于37℃培養(yǎng)8-10小時(shí)，取出分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于37℃培養(yǎng)10小時(shí)取出，觀察結(jié)果，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
試驗(yàn)結(jié)果人溶菌酶對(duì)臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1，人溶菌酶對(duì)臨床分離致病菌的MIC50見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，對(duì)耐藥菌株的抗菌活性也有很好的作用。
表1人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體外抗菌活性MIC細(xì)菌 HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬(wàn)μ/ml)mg/ml(萬(wàn)μ/ml)mg/ml mg/ml金葡 MRSA02-220.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡 MRSA02-230.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡 MRSA02-260.025(0.03) 0.004(0.02) ＞1＞1金葡 MRSA02-280.5(1.5) 0.016(0.08) ＞1＞1金葡 02-19-5 0.03(0.1) ＜0.002(0.001)＞1＞1表葡 MssE25 0.016(0.05) 0.004(0.02) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-29 0.063(0.2)0.5(2.5) 0.03 0.5表葡 MRSE 02-5＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-6＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-20-2 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＞11表葡 MRSE 02-20-3 ＜0.001(0.003)0.004(0.02) ＞11表葡 MRSE 02-20-4 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＞1＞1表葡 MRSE 02-20-5 0.004(0.012) ＜0.001(0.005)＞1＞1表葡 MRSE 02-20-6 0.004(0.012) ＜0.001(0.005)＞1＞1表葡 MRSE 02-20-7 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)1 1表葡 MRSE 02-20-8 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-20-9 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-20-1 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-31(3) 0.015(0.08) ＞1＞1表葡 MRSE 02-40.004(0.012) 0.008(0.04) 0.5＞1
表2MIC細(xì)菌HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬(wàn)/ml) mg/ml(萬(wàn)μ/ml) mg/ml mg/ml表葡 MRSE 02-10 0.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡 MRSE 02-12 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡 MRSE 02-11 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-15 0.008(0.024) 0.002(0.01) 1 ＞1表葡 MRSE 02-17 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡 MRSE 02-18 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-20 0.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡 MRSE 02-21 0.016(0.05) 0.25(1.25) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-22 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001白葡萄菌 02-6-40.008(0.02) 4(20) 0.002 0.002白葡萄菌 02-6-50.008(0.02) 0.25(0.63) ＜0.001＜0.001白葡萄菌 02-6-60.008(0.02) 0.063(0.31) 0.008 0.25白葡萄菌 02-6-90.063(0.2)0.125(0.63) 0.008 0.016白葡萄菌 02-6-70.125(0.4)0.016(0.08) 0.032 0.25白葡萄菌 03-2-22 0.032(0.1)0.5(2.5)1 1白葡萄菌 03-2-30 0.063(0.2)4(10) ＞1＞1白葡萄菌 03-3-32 0.016(0.05) 0.25(1.25) 0.008 0.5白葡萄菌 03-3-33 0.032(0.1)2(10) ＞1＞1白葡萄菌 03-3-36 0.063(0.2)4(20) 0.25 0.5白葡萄菌 03-3-37 0.032(0.1)＞4(20) ＞11白葡萄菌 03-3-39 0.032(0.1)0.5(2.5)0.51注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對(duì)照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，RO紅霉素二、人溶菌酶對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響(1)受試藥物人溶菌酶白色粉末，批號(hào)020110，3萬(wàn)單位/毫克，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供。臨用時(shí)用無(wú)菌雙蒸水配成所需濃度。
(2)對(duì)照品雞溶菌酶白色粉末，2萬(wàn)單位/毫克，Lysozyine Sigma L6878。臨用時(shí)用無(wú)菌雙蒸水配制。
(3)試劑角叉菜膠，淺黃白色粉末，批號(hào)21H0340，Sigam Chemical CO生產(chǎn)。臨用時(shí)用無(wú)菌生理鹽水配成1％的濃度。
實(shí)驗(yàn)方法選用體重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工業(yè)研究所動(dòng)物中心提供。合格證川實(shí)動(dòng)管第99-32號(hào)。每籠5只。動(dòng)物自由飲水，試驗(yàn)室溫度控制在22~28℃左右，動(dòng)物喂飼大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料。隨機(jī)分成5組，每組10只。測(cè)量各鼠正常左后足跖容積。第1組為空白對(duì)照組，外涂等容積無(wú)菌雙蒸水；第2、3、4組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第5組為雞溶菌酶，劑量為30IU/只。每鼠外涂各組藥物(20μl/只)一次后1小時(shí)，給大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜膠0.1ml。致炎后半小時(shí)再涂一次藥。致炎前和致炎后1、2、4、6小時(shí)按微量吸管測(cè)量法測(cè)定致炎前后大鼠左后足容積。致炎前后足容積差為腫脹度。試驗(yàn)重復(fù)一次。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析對(duì)計(jì)量資料，把原始數(shù)據(jù)按組分別輸入Microsoft Excel中，各組結(jié)果以算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)《新藥西藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》中的有關(guān)新藥藥效研究中統(tǒng)計(jì)處理的指導(dǎo)原則，選擇Student t檢驗(yàn)進(jìn)行各用藥組均數(shù)與模型對(duì)照組均數(shù)、相同劑量的受試藥組與對(duì)照品組的差異顯著性檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果見表3，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小時(shí)內(nèi)，使由1％角叉菜膠誘發(fā)的左后足跖腫脹度明顯減輕。
說(shuō)明人溶菌酶具有抗炎作用，重組人溶菌酶不但有殺菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表3(1)人溶菌酶對(duì)大鼠由角叉菜膠所致足跖腫脹的影響(第一次試驗(yàn)結(jié)果)致炎后不同時(shí)間足跖腫脹度(X±SD，ml)組別劑量 左后足跖(IU/只)正常體積 1hr 2hr 4hr6hr空白- 0.86 0.35 0.49 0.420.29對(duì)照 ±0.06 ±0.06 ±0.05 ±0.08 ±0.13人溶1200.84 0.24**0.35**0.34*0.22菌酶 ±0.07 ±0.06 ±0.05 ±0.06 ±0.07人溶60 0.87 0.30*0.41**0.35*0.24菌酶 ±0.09 ±0.04 ±0.05 ±0.06 ±0.08人溶30 0.87 0.29*0.41*0.34*0.26菌酶 ±0.08 ±0.05 ±0.08 ±0.07 ±0.08雞溶30 0.86 0.29*0.40**0.34*0.25菌酶 ±0.08 ±0.06 ±0.05 ±0.07 ±0.10注經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3(2)人溶菌酶對(duì)大鼠由角叉菜膠所致足跖腫脹的影響(第二次試驗(yàn)結(jié)果)致炎后不同時(shí)間足跖腫脹度(X±SD，ml)組別劑量左后足跖(IU/只) 正常體積 1hr2hr4hr 6hr空白- 0.92 0.30 0.40 0.35 0.29對(duì)照±0.10 ±0.08 ±0.10 ±0.05 ±0.15人溶120 0.90 0.22*0.31*0.30*0.25菌酶±0.10 ±0.06 ±0.08 ±0.05 ±0.07人溶60 0.92 0.23*0.31*0.29*0.24菌酶±0.11 ±0.04 ±0.06 ±0.05 ±0.07人溶30 0.92 0.25 0.32*0.29*0.25菌酶±0.09 ±0.07 ±0.06 ±0.05 ±0.07雞溶30 0.89 0.22*0.32*0.30*0.26菌酶±0.10 ±0.05 ±0.07 ±0.04 ±0.12注經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。
三、用法與用量1、噴霧劑直接噴霧作用于病灶局部給藥，每日1～6次，每次1500u～30000u成人與小兒相同。每次按病灶部位大小給藥。
2、乳劑、乳膏劑直接作用于病灶局部給藥每日1～6次，每次1500u～30000u。每次按病灶部位大小給藥。
3、霜?jiǎng)?、軟膏劑直接作用于病灶局部給藥，每日2～3次，每次1500u～30000u/g，每次按病灶部位大小給藥。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實(shí)施例1基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準(zhǔn)，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的基因重組人溶菌酶濃縮液進(jìn)行測(cè)蛋白、測(cè)活性保存。將純度95％基因重組人溶菌酶濃縮液溶于水中制得30000U/mL。
將純度98％的基因重組人溶菌酶制得1500U U/ml/g，磷酸鹽緩沖液10mM(pH6.0)85％、15％丙二醇(或丙三醇)、10％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、萬(wàn)分之3吐溫80，3％水溶性氮酮、尼泊金0.02％、山梨酸鉀0.05％。在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥廠按制藥規(guī)程完成)制成噴霧劑。
實(shí)施例2重組人溶菌酶制備方法同實(shí)施例1，將純度96％的基因重組人溶菌酶制得30000U/ml/g備用，其他原料為磷酸鹽緩沖液15mM(pH6.5)78％、18％丙二醇(或丙三醇)、8％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、2％水溶性氮酮、阿拉伯膠2％、西黃蓍膠0.3％、尼泊金0.04％、山梨酸鉀0.08％、萬(wàn)分之4吐溫80。具體制法為(1)、稱取西黃蓍膠和阿拉伯膠，放入50ml95％乙醇液中，備用。
(2)、分別稱取山梨酸鉀、尼泊金、吐溫80、水溶性氮酮、2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉加入倒磷酸鹽緩沖液中120℃高壓滅菌待用。
(3)、在第(2)項(xiàng)水溶液不斷的攪拌下，將第(1)項(xiàng)膠醇液攪勻倒入其中，繼續(xù)攪拌乳化，在乳液降到50度時(shí)加入重組人溶菌酶，繼續(xù)攪拌乳化，混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成乳劑。
實(shí)施例3重組人溶菌酶制備方法同實(shí)施例1，將純度97％的基因重組人溶菌酶制得10萬(wàn)U/ml/g備用，其他原料為磷酸鹽緩沖液13mM(pH6.0)80％、20％丙二醇(或丙三醇)、萬(wàn)分之7吐溫80、10％硬脂酸、4％水溶性氮酮、尼泊金0.03％、山梨酸鉀0.15％、9％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、3％十八醇。具體制法為(1)稱取硬脂酸加熱熔化，過慮、除雜、除菌備用。
(2)量取磷酸鹽緩沖液，加入丙二醇(或丙三醇)、吐溫80、水溶性氮酮、尼泊金、山梨酸鉀、吡咯烷酮-5-羧酸鈉、十八醇攪勻，加熱至沸，除菌備用。
(3)將以熔化的固相在不斷的攪拌下加入液相的水溶液中，進(jìn)行乳化，待溫度降至50度時(shí)，將重組人溶菌酶與其它原料攪拌、混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成乳膏劑。
實(shí)施例4重組人溶菌酶制備方法同實(shí)施例1，將純度96％的基因重組人溶菌酶制得20萬(wàn)U/ml/g備用，其他原料為16％丙二醇(或丙三醇)、11％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、4％水溶性氮酮、羊毛脂3％、70％凡士林。
具體制法為分別稱取羊毛脂、凡士林、水溶性氮酮、吡咯烷酮-5-羧酸鈉、丙二醇(或丙三醇)，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用。待溫度降至50度時(shí)，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后到入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成軟膏劑。
實(shí)施例5將純度98％的基因重組人溶菌酶制得50000U/ml/g備用，其他原料為磷酸鹽緩沖液17mM(pH6.5)78％、20％丙二醇(或丙三醇)、9％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、2％水溶性氮酮、阿拉伯膠1％、西黃蓍膠0.2％、尼泊金0.03％、山梨酸鉀0.05％、萬(wàn)分之5吐溫80，按實(shí)施例2的具體制法制得乳劑。
實(shí)施例6將純度97％的基因重組人溶菌酶制得25萬(wàn)U/ml/g備用，其他原料為磷酸鹽緩沖液14mM(pH6.0)80％、22％丙二醇(或丙三醇)、萬(wàn)分之5吐溫80、12％硬脂酸、3％水溶性氮酮、尼泊金0.04％、山梨酸鉀0.3％、13％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、4％十八醇，按照實(shí)施例3的具體制法制得乳膏劑。
實(shí)施例7將純度96％的基因重組人溶菌酶制得15萬(wàn)U/ml/g備用，其他原料為19％丙二醇(或丙三醇)、7％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、4％水溶性氮酮、羊毛脂2％、72％凡士林，按照實(shí)施例4的具體制法制得軟膏劑。
權(quán)利要求
1.人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是人溶菌酶在制備治療由汗液導(dǎo)管口閉塞、導(dǎo)管內(nèi)汗液潴留、葡萄球菌堵塞汗孔或沿汗管感染引起的炎癥形成痱子皮膚病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是人溶菌酶為基因工程表達(dá)的重組人溶菌酶、基因工程表達(dá)人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的重組人溶菌酶或者基因工程表達(dá)或化學(xué)合成突變體重組人溶菌酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是藥物中含有重組人溶菌酶1500U～30萬(wàn)U/ml/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是藥物為噴霧劑、乳劑、乳膏劑、軟膏劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是含有重組人溶菌酶蛋白活性為30000U/mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是所述藥物按下述制備方法制成噴霧劑將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.0～7.5)75～85％、5～25％丙二醇或丙三醇、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、萬(wàn)分之1～5吐溫80，1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸鉀0.01～0.1％，在常溫下混合均質(zhì)，制成噴霧劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是所述藥物按下述制備方法制成乳劑(1)將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g；稱取西西黃蓍膠0.1～0.4％和阿拉伯膠1～3％，放入50ml95％乙醇液中，備用；(2)、分別稱取山梨酸鉀0.01～0.1％、尼泊金0.01～0.05％、萬(wàn)分之1～5吐溫80、5～25％丙二醇或丙三醇、1～5％水溶性氮酮、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉加入到10～20mM(pH6.0～7.5)75～80％磷酸鹽緩沖液中120℃高壓滅菌待用；(3)、在第(2)項(xiàng)水溶液不斷的攪拌下，將第(1)項(xiàng)膠醇液攪勻倒入其中，繼續(xù)攪拌乳化，在乳液降到50度時(shí)加入重組人溶菌酶，繼續(xù)攪拌乳化，混合均質(zhì)，制成乳劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是所述藥物按下述方法制成乳膏劑(1)將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g備用；稱取5～15％硬脂酸加熱熔化，過慮、除雜、除菌備用；(2)量取(pH6.0～7.5)75～80％磷酸鹽緩沖液10～20mM，加入5～30％丙二醇或丙三醇、萬(wàn)分之1～8吐溫80、1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸鉀0.01～0.5％、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、1～5％十八醇攪勻，加熱至沸，除菌備用；(3)將以熔化的固相在不斷的攪拌下加入液相的水溶液中，進(jìn)行乳化，待溫度降至50度時(shí)，將重組人溶菌酶與其它原料攪拌、混合均質(zhì)，制成乳膏劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人溶菌酶在制備治療痱子的藥物中的新用途，其特征是所述藥物按下述制備方法制成軟膏劑將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬(wàn)U/ml/g備用，分別稱取5～25％丙二醇或丙三醇、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用，待溫度降至50度時(shí)，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后倒入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，制成軟膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人溶菌酶在制藥領(lǐng)域的新用途，本發(fā)明是人溶菌酶在制備治療由汗液導(dǎo)管口閉塞、導(dǎo)管內(nèi)汗液潴留、葡萄球菌堵塞汗孔或沿汗管感染引起的炎癥形成痱子皮膚病的藥物中的應(yīng)用。藥物可做成噴霧劑、乳劑、乳膏劑、軟膏劑等。本發(fā)明基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。基因重組人溶菌酶不過敏、不產(chǎn)生耐藥菌、安全無(wú)毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來(lái)源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單，使用方便。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1634573SQ200410087550
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者張華 申請(qǐng)人:張華