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黃芪甲苷的制法及在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:974674閱讀:245來源:國知局
專利名稱:黃芪甲苷的制法及在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及黃芪甲苷(ASI)的制備方法和新用途,特別是涉及黃芪甲苷的制備方法及其在制備預(yù)防和治療糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是指糖尿病特發(fā)性全身微血管病變的腎臟表現(xiàn),是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國糖尿病的標化患病率為3.2%,也就是說目前我國有5000萬人以上正面臨著糖尿病的威脅,在我國93%的糖尿病患者是2型糖尿病,其中40%將發(fā)展為DN[1]??梢灶A(yù)見,隨著我國人民生活水平的迅速提高和人均壽命的延長,21世紀我國糖尿病的患病率將不斷上升,由DN發(fā)展而來的終末期腎功能衰竭的發(fā)生比例也將顯著提高。因此,DN正在成為本世紀全世界醫(yī)藥界的重要研究課題之一。
黃芪具補氣固表,利尿脫毒,斂瘡生肌之功效,為歷代常用補益中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并列為上品,在祖國醫(yī)藥中常作為君藥。現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)黃芪藥理作用甚廣,對黃芪粗制劑的臨床研究也日益深入。據(jù)不完全統(tǒng)計,自1997年以來臨床上以黃芪復(fù)方制劑、黃芪注射液等治療DN和慢性腎炎的報道甚多。黃芪制劑對腎病患者具有減少尿蛋白、降低血糖、改善血液流變學等作用。因此,人們對黃芪與DN有關(guān)的療效及作用機制的表現(xiàn)出極大的關(guān)注和興趣,并對其有效成分進行了有益的探索。
黃芪甲苷是從中藥黃芪提取出來的有效單體化合物。南京醫(yī)科大學黃芪課題組于1982年開始首次并相繼報導了黃芪甲苷(ASI)的以下藥理作用,①ASI有抗生物氧化如SOD活性增加,MDA含量下降,GSH含量增加等;抗炎如降低組胺,5-HT,所致的毛細血管通透性,角叉菜膠所致的足爪腫脹,穩(wěn)定紅細胞膜等作用;②ASI能促進B細胞增殖分化和漿細胞抗體合成,對人外周血自然殺傷活性有明顯的增強作用,提高巨噬細胞吞噬指數(shù),使其誘生干擾素,超微結(jié)構(gòu)也有不同程度的改善。ASI有促進霍亂弧菌LPS誘生干擾素,此外ASI能對抗環(huán)磷酰胺,60CO-γ射線所致的白細胞減少,對抗氫化考的松所致的淋巴細胞減少;③ASI對抗D-半乳糖胺,醋氨酚,CCL4引起的肝損傷;④ASI對中樞有鎮(zhèn)靜,安定作用;⑤ASI有對抗高溫,耐低溫,耐缺氧和增強游泳能力等,說明ASI能提高機體對有害因子的抵抗力;此外ASI尚有增加蛋白質(zhì)合成,促進肝細胞再生及增加血漿內(nèi)cAMP,抗血小板聚集,降壓等作用。本課題組的研究成果和其它相關(guān)研究提示,ASI是一個很有希望的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑.黃芪甲苷的藥理活性越來越受到人們的關(guān)注,隨后,國內(nèi)學者報道了黃芪甲苷對心肌的有利影響,ASI促進胰島素和C肽的分泌、黃芪皂苷對人系膜細胞基質(zhì)分泌的抑制作用等;已報道黃芪粗制劑具有抑制醛糖還原酶的的作用,至今尚未見報道ASI有防治糖尿病腎病的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供黃芪甲苷的制法及其新用途,即在制藥中的新應(yīng)用。
實際上,本發(fā)明涉及黃芪甲苷的制法及其在制備防治糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。
2.技術(shù)方案(1).黃芪甲苷是從黃芪中提取出來的一種單體化合物,其化學結(jié)構(gòu)式如下 (2).黃芪甲苷的制備方法膜莢黃芪(Astragalus membranaceus bunge)經(jīng)粉碎機成粉末,取粉末1.0-2.0kg,用60-95%工業(yè)乙醇2000-5000ml浸泡回流提取三次,提取液合并減壓濃縮至藥材量的1.5∶1,加固體NaOH 5-10g,回流2小時,蒸盡反應(yīng)物中的乙醇,得乙醇水解液,用50-300ml乙酸乙酯萃取三次,棄去乙酸乙酯液后,所得的水解液用水飽和的正丁醇50-200ml分次萃取六次,合并萃取液,用正丁醇飽和的水洗至中性,得中性正丁醇水解液,將此液蒸干即為粗皂苷。向粗皂苷內(nèi)加5-10倍乙酸乙酯,于70℃水浴加熱,攪拌,放冷,滲去雜質(zhì),重復(fù)2-3次,過濾,沉淀,棄去乙酸乙酯,即得較純的皂苷*.上步所得的較純的皂苷.用甲醇重結(jié)晶二次即得黃芪甲苷。
將根據(jù)以上方法提取的黃芪甲苷運用紅外.核磁共振-質(zhì)譜等進行分析,并同黃芪甲苷標準品比較,確認以本法提取的黃芪甲苷與黃芪甲苷標準品結(jié)構(gòu)完全相同。以高效液相色譜法確認以本法所提取的黃芪甲苷的純度達97%以上。
(3)將以上的黃芪甲苷用于藥理試驗,以觀察其對糖尿病腎病的防治作用。
A.ASI對糖尿病腎病DN大鼠血糖和腎功能的影響,實驗表明ASI對血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白、BUN、腎臟指數(shù)等直接反映DN病程的指標有顯著的降低作用,因此,可以認為ASI對DN大鼠具有一定的降血糖和保護腎臟的作用。
B.ASI對DN大鼠的抗氧化作用,實驗表明ASI可降低腎皮質(zhì)和血清中的AGES,且此降低作用呈劑量依賴性關(guān)系,而ASI可顯著升高T-AOC,GSH、CAT,顯示ASI具有抗氧化作用。
C.ASI對醛糖還原酶(AR)的抑制作用,實驗結(jié)果表明ASI對AR的抑制作用,這對DN的治療很有益處。
D.ASI對DN大鼠的細胞外基質(zhì)的作用,實驗結(jié)果表明ASI具有一定的抑制系膜細胞增生、減輕腎臟肥大的作用。
E.ASI對DN大鼠血清中TGF-β的作用,實驗結(jié)果表明ASI可以明顯地降低TGF-β1的含量,而且隨著劑量的加大、ASI降低TGF-β1的作用越來越強,這對DN的治療具有重要意義。
綜上所述,黃芪甲苷對糖尿病腎病具有較強的防治作用。
在黃芪甲苷中加入適當?shù)妮o料,用常規(guī)的制備方法,可以制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液等口服制劑。所述的輔料是常用的助劑,如淀粉、明膠、阿拉伯膠、聚乙二醇等。
3.有益效果從以上藥理試驗結(jié)果,可以看出本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明對已知黃芪甲苷發(fā)現(xiàn)了新的醫(yī)療用途,開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域,(2)本發(fā)明的黃芪甲苷的藥理效果好,作用強,預(yù)示著有良發(fā)的藥用前景,(3)本發(fā)明黃芪甲苷具有顯著的降低血糖、糖化血紅蛋白,尿蛋白、BUN、腎臟指數(shù),因此ASI具有一定的降血糖和保護腎臟的作用。
(4)本發(fā)明黃芪甲苷具有降低腎皮質(zhì)和血清中的AGES,顯示ASI具有抗氧化作用。
(5)本發(fā)明ASI對醛糖還原酶AR有抑制作用,這對DN的治療很有益處。
(6)本發(fā)明ASI具有一定的抑制系膜細胞增生、減輕腎臟肥大的作用。
(7)本發(fā)明ASI具有明顯降低TGF-β1的含量,表明對DN的治療具有重要意義。
具體實施例方式
實施例1 黃芪甲苷制備方法膜莢黃芪(Astragalus membranaceus bunge)經(jīng)粉碎機成粉末,取粉末1.0kg,用95%工業(yè)乙醇2500ml浸泡回流提取三次,提取液合并減壓濃縮至藥材量的1.5∶1,加固體NaOH 5g,回流2小時,蒸盡反應(yīng)物中的乙醇,得乙醇水解液,用150ml乙酸乙酯萃取三次,棄去乙酸乙酯液后,所得的水解液用水飽和的正丁醇100m1分次萃取六次,合并萃取液,用正丁醇飽和的水洗至中性,得中性正丁醇水解液,將此液蒸干即為粗皂苷。向粗皂苷內(nèi)加6倍乙酸乙酯,于70℃水浴加熱,攪拌,放冷,滲去雜質(zhì),重復(fù)2次,過濾,沉淀,棄去乙酸乙酯,即得較純的皂苷,上步所得的較純的皂苷.用甲醇重結(jié)晶2次即得黃芪甲苷。
實施例2 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠血糖和腎臟功能的影響1 材料和方法1.1 實驗動物 SD品系大鼠8周齡,雄性,體重160~180g。由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷為本課題組自提取,鏈脲霉素(STZ)購自Calbiochem公司,血糖檢測藥盒購自浙江東甌生物工程有限公司,尿白蛋白放免檢測藥盒購自北京中國原子能科學研究院,epalrestat由江蘇揚子江藥業(yè)集團提供。
1.3 方法1.3.1 造模與實驗治療85只大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病腎病模型組、黃芪甲苷低劑量治療組、黃芪甲苷中劑量治療組、黃芪甲苷高劑量治療組、epalrestat(EPS)陽性藥治療組,共6組,除正常對照組10只以外,其余各組15只。各組禁食12h后,腹腔一次性注射STZ 60mg·kg-1(臨用前溶于0.1mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液,pH4.4),正常對照組僅給等量的該緩沖液。72h后尾靜脈取血,測定血糖≥13.88mmol·L-1者為造模成功。糖尿病腎病成模當日作為實驗第1天,低中高黃芪甲苷治療組的劑量分別為3、6、12mg·kg-1,均配成混懸液,灌胃給藥。實驗中觀察各組大鼠的體重、進食水量、尿量、毛發(fā)等,每周測體重1次。于第8周末處死大鼠,收集尿液,腹主動脈收集血液標本測定除血糖外各項血指標,取出腎臟稱重,切片。
1.3.2 指標測定空腹血糖測定采用葡萄糖氧化酶法;尿白蛋白采用放免法測定由南京醫(yī)科大學同位素室測定;HbAlC由南京建成生物工程研究所用親和層析法測定;BUN由南京建成生物工程研究所分別用化學比色法測定;腎臟濕重用電子天平稱量。
1.4 統(tǒng)計學處理 所有測定結(jié)果用x±s表示,采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
2 結(jié)果2.1 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠整體生理狀況及體重的影響正常對照組大鼠精神振奮、活動頻繁、毛發(fā)純白光澤、飲水量正常、尿量正常、墊料干燥。糖尿病腎病模型組大鼠精神萎靡、活動度低、耳廓眼球蒼白、尾巴蒼白濕冷、毛發(fā)枯黃、無色澤、豎毛弓背、飲水量高、尿量多、墊料極潮、下腹部及外陰部毛浸濕狀。與糖尿病腎病模型組相比,黃芪甲苷高劑量治療組大鼠的精神、活動、外表、飲水量和尿量等方面在接近于正常對照組大鼠,墊料干燥。黃芪甲苷中劑量治療組的精神、活動、外觀接近于正常組大鼠,而飲水量和尿量仍然較高,墊料較潮。黃芪甲苷低劑量治療組的精神不振、活動較少、毛發(fā)枯黃、無色澤、飲水量和尿量高,墊料潮。EPS陽性治療組的整體表現(xiàn)則界于黃芪甲苷低劑量治療組和中劑量治療組之間。
2.2 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠的改善作用糖尿病腎病模型組大鼠的血糖、HbAlC、尿白蛋白、腎重/體重與正常對照組相比明顯升高,且皆有非常顯著性差異(P<0.01),表明造模成功。黃芪甲苷低劑量治療組的以上指標與糖尿病腎病模型組基本相近,無組間的顯著性差異;中高劑量治療組的血糖和腎重/體重較糖尿病腎病模型組有較大幅度的降低,在兩組之間有顯著性差異(P<0.05),尿白蛋白和BUN的降低幅度很大,在兩組之間有非常顯著性差異(P<0.01);高劑量治療組的HbAlC較糖尿病腎病模型組有較大幅度的降低,在兩組之間有非常顯著性差異(P<0.01)。EPS組的HbAlC和尿白蛋白較糖尿病腎病模型組有明顯的降低,兩組之間有非常顯著性差異(P<0.01)(見表1)。
表1 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠血糖、HbAlC、尿白蛋白、腎重/體重、BUN的作用(x±s)組別 n血糖 HbAlC尿白蛋白腎重/體重 BUN(mmol·L-1) (%) (μg·mol-1Cr-1) (×1000)(mmol·L-1)NS組 10 4.58±0.75 12.31±1.83 3.39±1.93 6.61±0.52 7.73±0.96DN組 10 18.26±6.98##21.20±3.41##29.07±9.98##11.54±3.85##11.16±0.56##ASIL組10 14.83±4.10 20.56±3.49 27.26±2.38 10.33±1.69 11.63±0.65ASIM組11 12.62±3.30*19.28±5.18 14.87±9.63**8.62±1.85*7.23±0.89**ASIH組10 10.08±2.69*15.32±4.21*7.92±5.31**8.40±1.61*7.65±0.81**EPS組 10 17.10±5.62 13.14±3.08**6.19±2.40**9.72±4.37 10.78±1.81與正常對照組相比,##P<0.01;與DN模型組相比,*P<0.05,**P<0.01實施例3 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠的抗氧化作用1 材料和方法實驗動物、藥品與試劑、造模與實驗治療皆同實施例1。
1.1 指標測定1.1.1 腎皮質(zhì)AGEs含量測定 大鼠處死后,迅速取腎皮質(zhì)浸泡于生理鹽水中,去除結(jié)締組織和脂肪,濾紙吸干后稱重,加入6mL PBS(pH7.4)緩沖液,超聲勻漿,勻漿液于4℃下4000rpm離心5min后取沉淀,以雙蒸水洗滌3次。于沉淀中加入氯仿/甲醇(1∶1)5mL,振蕩過夜。再加入甲醇/水(4∶1)2mL 4℃下4000rpm離心5min。沉淀以甲醇5mL洗滌2次,雙蒸水洗滌2次,再用pH7.5,0.02mol/L Hepes緩沖液(含0.1mol/LCaCl2)洗2次。沉淀于5mL Hepes緩沖液中4℃下過夜。離心去除緩沖液,將顆粒懸浮于10mL含290U I型膠原酶的Hepes緩沖液中,加入甲苯和氯仿各2μl。以只含Hepes緩沖液和膠原酶的空白管為標準,374℃振蕩24h,將消化液離心,留取上清液。用熒光分光光度法檢測AGEs的相對含量,激發(fā)波長為370nm,吸收波長為440nm,儀器為島津RF-5000型熒光分光光度計(SHIMADZU spectrofluorophoto meter RF-5000)。結(jié)果以任意熒光單位AUF/mg皮質(zhì)蛋白表示。
1.1.2 血清AGEs含量測定 大鼠血樣離心取血清,以0.02mol/L Hepes緩沖液稀釋10倍后,用熒光分光光度法檢測AGEs的相對含量,激發(fā)波長為370nm,吸收波長為440nm,儀器為島津RF-5000型熒光分光光度計(SHIMADZU spectrofluorophoto meter RF-5000)。結(jié)果以任意熒光單位AUF/mg血清蛋白表示。
1.1.3 血清中總抗氧能力(total antioxidative capability,T-AOC)、CAT活力(activity ofcatalase)、GSH含量分別用由南京建成生物工程研究所分別用化學比色法測定。
1.2 統(tǒng)計學處理 所有測定結(jié)果用x±s表示,采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
2 結(jié)果2.1 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠皮質(zhì)AGEs和血清AGEs的影響糖尿病腎病模型組大鼠的腎皮質(zhì)中的AGEs相對含量(AUF/mg皮質(zhì))和血清中的AGEs相對含量(AUF/mg蛋白)與正常對照組相比明顯升高,在兩組之間皆有非常顯著性差異(P<0.01);黃芪甲苷低劑量治療組的血清AGEs即有明顯下降,有非常顯著性差異(P<0.01),中劑量和高劑量組的腎皮質(zhì)AGEs和血清AGEs進一步下降,與糖尿病腎病模型組相比皆有非常顯著性差異(P<0.01)。而且黃芪甲苷對腎皮質(zhì)中AGEs的降低作用皆呈劑量依賴性關(guān)系;EPS治療組大鼠的皮質(zhì)AGEs和血清AGEs也都有顯著性或非常顯著性降低(P<0.05或P<0.01)(見表2)。
2.2 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量的影響糖尿病腎病模型組大鼠的血清中總抗氧化能力T-AOC(U/mL)、過氧化物酶CAT活力(U/mL)和谷胱苷肽含量GSH(mg/L)與正常對照組相比明顯降低,在兩組之間皆有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷中高劑量治療組的T-AOC與糖尿病腎病模型組相比有非常顯著性升高(P<0.01),且此升高作用有劑量依賴性,EPS治療組對T-AOC也有升高作用,與糖尿病腎病模型組相比有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷中高劑量治療組的CAT活力與糖尿病腎病模型組相比有一定程度的升高,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而EPS治療組的CAT活力與糖尿病腎病模型組相比則無統(tǒng)計學差異。黃芪甲苷低中高劑量組的GSH含量與糖尿病腎病模型組相比皆有較大幅度的升高,皆具有非常顯著性差異(P<0.01),且該升高作用的劑量依賴性明顯,EPS治療組的GSH含量與糖尿病腎病模型組基本相同(見表3)。
表2 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠皮質(zhì)AGEs和血清AGEs的影響組別樣本數(shù) 皮質(zhì)AGEs(AUF/mg皮質(zhì))血清AGEs(AUF/mg蛋白)NS 10 0.54±0.18 4.70±0.94DN 10 2.30±0.71##17.25±2.50##ASIL10 1.75±0.37 7.64±0.61**ASIM10 1.26±0.28**6.68±1.58**ASIH10 1.14±0.49**7.57±2.79**EPS 10 1.60±0.36*8.46±2.07**與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比,*P<0.05,**P<0.01表3 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量的影響組別樣本數(shù)T-AOC(U/ml) CAT活力(U/ml) GSH(mg/L)NS 1015.85±0.99 5.37±1.13 258.3±17.6DN 106.94±1.81##3.74±0.91##165.4±7.9##ASIL107.33±0.75 4.61±0.47 179.3±6.4**ASIM1012.86±1.31**5.46±0.81*197.4±9.7**ASIH1013.76±4.22**5.89±1.22*244.4±17.5**EPS 109.00±0.70**4.33±0.40 165.2±9.0與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比,*P<0.05,**P<0.01實施例4 黃芪甲苷對醛糖還原酶的抑制作用1 材料和方法實驗動物、藥品與試劑、造模與實驗治療皆同實施例1。
1.1 黃芪甲苷在糖尿病腎病整體大鼠上對醛糖還原酶的抑制作用造模與實驗治療與實施例1相同外,于第8周末處死大鼠,腹主動脈收集全血標本1.0mL于冰水浴中預(yù)冷的肝素抗凝管,3000 rpm離心10min,分離紅細胞層,以5mL冷等滲生理鹽水分別沖洗3次后,加入1.5倍體積的水制成溶血液,4℃ 10000rpm離心30min,取上清液測定紅細胞醛糖還原酶活性。
反應(yīng)溫度為25℃,酶促反應(yīng)體系體積為1.0ml,其組成為67mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.47)、400mmol/L硫酸鋰、0.10mmol/L NADPH、大鼠血清、10mmol/L DL-甘油醛,以磷酸鹽緩沖液補足體積。其中DL-甘油醛最后加入并開始記時,反應(yīng)30min后加入11.8mol/L NaOH終止反應(yīng),在島津RF-5000型熒光分光光度計(SHIMADZUspectrofluorophoto meter RF-5000)上記錄其熒光強度的變化,激發(fā)波長為360nm,檢測波長為450nm。規(guī)定37℃下反應(yīng)體系吸光度每分鐘下降0.001為一個酶活力單位U。以不含底物的樣品為空白對照,扣除空白對照體系中NADPH自然氧化所造成的吸光度變化。例如比色杯中每分鐘吸光度下降0.050,即具有50個酶活力單位U。
1.2 統(tǒng)計學處理 所有測定結(jié)果用x±s表示,采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
2 結(jié)果2.1 黃芪甲苷在糖尿病腎病整體大鼠上對醛糖還原酶的抑制作用糖尿病腎病模型組大鼠血清中醛糖還原酶的活性是正常對照組的3倍,在兩組之間皆有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷低中高劑量治療組的醛糖還原酶活性與糖尿病腎病模型組相比皆有非常顯著性降低(P<0.01),且此降低作用有劑量依賴性,EPS治療組對醛糖還原酶的降低作用較強,與糖尿病腎病模型組相比有非常顯著性差異(P<0.01)(見表4)。
表4 黃芪甲苷在糖尿病腎病整體大鼠上對醛糖還原酶的抑制作用組別 樣本數(shù) AR活性(U)NS 106.94±9.00DN 1027.29±13.35##ASIL1024.91±5.73ASIM1017.18±3.84**ASIH109.88±3.89**EPS 1011.07±4.91**與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比**P<0.01實施例5 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠的細胞外基質(zhì)的作用1 材料和方法實驗動物、藥品與試劑、造模與實驗治療皆同實施例1。
1.1 IV型膠原和層粘蛋白的提取與測定將低溫保存的腎皮質(zhì)標本吸干水分后制備均漿(勻漿液為0.15mol/L NaCl,0.05mol/L Tris-HCl,pH7.4),加提取液1mL(提取液為HAc 0.5mol/L,胃蛋白酶1g/L),4℃抽提18h,取上清液測定IV型膠原和層粘蛋白含量。
1.2 統(tǒng)計學處理 所有測定結(jié)果用x±s表示,采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
2 結(jié)果糖尿病腎病模型組大鼠腎組織中IV型膠原(μg/g)和層粘蛋白(μg/g)含量與正常對照組相比明顯升高,在兩組之間皆有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷低中高劑量治療組大鼠腎皮質(zhì)中IV型膠原的含量與糖尿病腎病模型組相比略有降低,而且此降低作用隨著劑量的增大而依次增大,但都無統(tǒng)計學意義(P>0.05),EPS治療組的IV型膠原含量與糖尿病腎病模型組基本一樣(P>0.05)。黃芪甲苷低中劑量治療組和EPS治療組的層粘蛋白含量與糖尿病腎病模型組相比有明顯下降,分別有非常顯著性和顯著性差異(P<0.01,P<0.05)(見表5)。
表5 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中IV型膠原和層粘蛋白的影響組別n IV型膠原(μg/g)層粘蛋白(μg/g)NS 10 0.490±0.124 1.004±0.689DN 10 0.753±0.259##2.913±1.864##ASIL10 0.713±0.293 0.660±0.622*ASIM10 0.652±0.125 0.723±0.487**ASIH10 0.598±0.171 0.890±1.267*EPS 10 0.715±0.185 1.282±0.973*與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比,*P<0.05,**P<0.01實施例6 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠血清中TGFβ的作用1 材料和方法實驗動物、藥品與試劑、造模與實驗治療皆同實施例1。
1.1 腎皮質(zhì)TGFβ1的PCR測定以酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法用Trizol試劑提取大鼠腎組織總RNA。以O(shè)ligo(dT)15為引物,在逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)催化下合成第一鏈cDNA。具體反應(yīng)體系為總RNA 1μg與Oligo(dT)150.5μL,65℃10min,然后加入MgCl2(25mmol/L)4μL,10×RT Buffer 2μL,MMLV 0.8μL,DEPC處理水4.7μL,42℃水浴1h,沸水浴5min,-20℃保存。以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。所用引物均由GENETOOL軟件設(shè)計,上海生工生物公司合成。TGFβ1上游引物為5’-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3’,下游引物為5’-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3’,擴增長度519bp。β-actin上游引物為5’-GCTGCGTGTGG CCCCTGAG-3’,下游引物為5’-ACGCAGGATGGCATGAGGGA-3’,擴增長度252bp。取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,在25μL體系中先將模板于94℃預(yù)變性5min,進入循環(huán),94℃ 1min,54℃ 5min,72℃ 1min,30個循環(huán)后72℃ 7min。將TGFβ1的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳(80V,60min)分離,EB染色后置于凝膠圖象分析系統(tǒng)進行吸光度掃描,以管家基因β-actin作為內(nèi)參照校正,用TGFβ1的吸光度與β-actin吸光度的比值表示目的基因TGFβ1的相對表達含量。
1.2 統(tǒng)計學處理 所有測定結(jié)果用x±s表示,采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
2.黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中TGFβ1含量的影響糖尿病腎病模型組大鼠腎皮質(zhì)中TGFβ1的相對含量與正常對照組相比明顯升高,在兩組之間皆有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷低劑量治療組的TGFβ1含量與糖尿病腎病模型組相比較為接近(P>0.05),中劑量和高劑量治療組與糖尿病腎病模型組相比有非常顯著性降低(P<0.01),而且此降低作用隨著劑量的增大而依次增大,有劑量依賴性傾向,EPS治療組的TGFβ1含量也有非常顯著性降低(P<0.01)(見表6)。
表6 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中TGFβ1相對含量的影響組別n TGFβ含量(TGFβ1/β-actin)NS 100.55±0.09DN 101.21±0.25##ASIL101.07±0.24ASIM100.80±0.12**ASIH100.67±0.12**EPS 100.82±0.19**與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比,*P<0.05,**P<0.01
實施例7 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠的腎臟組織形態(tài)學的影響1 材料和方法實驗動物、藥品與試劑、造模與實驗治療皆同實施例1。
1.1 形態(tài)學光鏡觀察將腎組織塊脫水、石蠟包埋、切片(3μm),蘇木精-伊紅(HE)和PAS雙重染色,觀察光鏡下腎臟形態(tài)學改變。將腎小球系膜增生分成0~III級,分別記為0、2、4、6分。0級正常腎小球;I級系膜增生寬度小于毛細血管直徑,呈節(jié)段性分布;II級系膜增生寬度大于毛細血管直徑,呈彌漫性分布;III級系膜增生寬度呈團塊狀聚集,彌漫指狀分布,擠壓血管腔。每例隨機取1個腎小球按上述標準記分取均數(shù)。
1.2 形態(tài)學電鏡觀察從每組大鼠中隨機抽取3例標本進行電鏡觀察。取腎皮質(zhì)常規(guī)固定、脫水、包埋(Epon 812),RKB-V型切片機切片,HE染色,光鏡腎小球定位后超薄切片,醋酸鈾染色30min,枸櫞酸鉛染色5min,JEM-1200EX ELECTRON MICROSCOPE透射電鏡(日本電子,JEOL)觀察腎小球系膜區(qū)基質(zhì)和基底膜,并照相,每例標本5張照片。將照片掃描轉(zhuǎn)換為JPG文件,然后以LEICA QWIN STANDARD V2.6(Leica MicrosystemsLtd)圖象分析系統(tǒng)測量計算基底膜厚度。每張照片上隨機測量7處基底膜的厚度,并計算其平均值。
1.3 統(tǒng)計學處理 所有測定結(jié)果用x±s表示,采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
2 結(jié)果2.1 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎組織光鏡形態(tài)的影響光鏡顯示,與正常大鼠相比,糖尿病腎病模型組大鼠腎組織形態(tài)表現(xiàn)出一定程度的異常,如腎小球肥大、系膜細胞增生等。與糖尿病腎病模型大鼠相比,黃芪甲苷高劑量組的系膜細胞增生減輕,并有顯著性差異(P<0.05),其他方面的組織形態(tài)學也有一定的改善;而低劑量組則基本上沒有變化。
在光鏡下觀察糖尿病腎病模型組大鼠的腎小球系膜增生和中性白細胞兩個指標與正常對照組相比明顯增大,有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷低劑量治療組的腎小球系膜增生與糖尿病腎病模型組大鼠相比無顯著性差異(P>0.05),而中高劑量治療組則較糖尿病腎病模型組則有顯著性差異降低(P<0.05,P<0.01);黃芪甲苷低中劑量治療組的中性白細胞與糖尿病腎病模型組大鼠相比無顯著性差異(P>0.05),高劑量治療組的與糖尿病腎病模型組大鼠相比有顯著性降低(P<0.05);EPS治療組的以上這兩個指標皆有一定程度的降低,但無統(tǒng)計學意義。3個劑量組的腎小球系膜增生和中性白細胞下降幅度與其給藥劑量呈一定的劑量依賴性(見表7)。
2.2 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎組織電鏡形態(tài)的影響在電鏡下觀察,正常對照組大鼠的腎小球毛細血管均開放良好;毛細血管基底膜厚度均一平滑;足突無微絨毛化和扁平化;系膜細胞及基質(zhì)無增生。糖尿病腎病模型組大鼠的腎小球毛細血管部分開放,較為擁擠,有輕度淤血;毛細血管基底膜基本平滑,但其厚度在少數(shù)部位不均一;足突微絨毛化約占30%,扁平化占50%;系膜細胞及基質(zhì)輕度結(jié)節(jié)性增生。黃芪甲苷低劑量治療組大鼠的腎小球毛細血管部分開放,有擁擠現(xiàn)象;毛細血管基底膜基本平滑,厚度基本均一;足突微絨毛化約占20%,扁平化占30%;系膜細胞及基質(zhì)輕度增生。黃芪甲苷中劑量治療組大鼠的腎小球毛細血管基本全部開放,略有擁擠現(xiàn)象;毛細血管基底膜基本平滑,厚度基本均一;足突微絨毛化約占10-20%,扁平化占10-20%;系膜細胞及基質(zhì)輕微增生。黃芪甲苷高劑量治療組大鼠的腎小球毛細血管全部開放,無擁擠現(xiàn)象;毛細血管基底膜平滑,厚度均一;足突基本無微絨毛化和扁平化;系膜細胞及基質(zhì)無增生。EPS陽性藥治療組大鼠的腎小球毛細血管部分開放,有擁擠現(xiàn)象;毛細血管基底膜基本平滑,厚度基本均一;足突微絨毛化約占10%,扁平化占20%;系膜細胞及基質(zhì)輕微增生。
糖尿病腎病模型組大鼠的基底膜厚度與正常對照組相比明顯增大,有非常顯著性差異(P<0.01)。黃芪甲苷低中劑量治療組的基底膜厚度雖有一定幅度的降低,但無顯著性差異(P>0.05);而黃芪甲苷高劑量治療組和EPS治療組則較糖尿病腎病模型組有進一步的降低,并具顯著性差異(P<0.05)(見表8)。
表7 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎組織光鏡下腎小球系膜增生和中性白細胞的影響組別n腎小球系膜增生記分中性白細胞記分NS 100.6±1.0 0.3±0.7DN 104.4±1.8##3.4±1.3##ASIL103.6±0.9 3.2±1.1ASIM102.8±1.0*2.4±0.8ASIH102.4±0.8**2.2±0.6*EPS 103.6±0.8 2.4±0.8與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比,*P<0.05,**P<0.01
表8 黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎組織電鏡基底膜厚度的影響組別n基底膜厚度(nm)NS 3141.6±9.7DN 3219.4±8.5##ASIL3189.3±46.4ASIM3178.9±18.5*ASIH3152.9±6.0**EPS 3160.2±15.9*與正常對照組相比,##P<0.01;與糖尿病腎病模型組相比,*P<0.05,**P<0
權(quán)利要求
1.黃芪甲苷的制備方法,其制備步驟如下(1)將黃芪粉末用乙醇浸泡回流提取三次,合并提取液減壓濃縮,得濃縮液;(2)加固體NaoH,回流2小時,將回流液中的乙醇蒸去,得乙醇水解液;(3)用乙酸乙酯萃取三次,棄去乙酸乙酯后,所得的水解液用水飽和的正丁醇分次萃取六次,合并萃取液,用正丁醇飽和的水洗至中性,得中性正丁醇水溶液,并蒸干得粗皂苷;(4)向粗皂苷內(nèi)加入乙酸乙酯,于水浴中加熱、攪拌、放冷、滲去雜質(zhì),重復(fù)2-3次,過濾、沉淀、棄去乙酸乙酯,即得較純的皂苷;(5)將較純的皂苷,用甲醇重結(jié)晶二次即得黃芪甲苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪甲苷,其特征是在步驟(1)中取黃芪粉末1.0-2.0kg,用60-95%的乙醇回流提取,減壓濃縮至藥材量的1.5∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪甲苷,其特征是在步驟(2)中,加固體NaoH5-10g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪甲苷,其特征是在步驟(3)中,用50-300ml的乙酸乙酯萃取。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪甲苷,其特征是在步驟(4)中,向粗皂苷中加入5-10倍的乙酸乙酯,于70℃水浴中攪拌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪甲苷,其特征是在黃芪甲苷中加入適當?shù)妮o料,用常規(guī)的制備方法,可以制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液等口服制劑。
7.黃芪甲苷在制備預(yù)防和治療糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃芪甲苷的制備方法及其在制藥中的新用途。它的制備方法是將黃芪粉末用乙醇回流,用回流液減壓濃縮,在濃縮液中加NaoH,醇液回流,蒸去乙醇得乙醇水解液,用乙酸乙酯萃取,用正丁醇飽和水洗至中性,蒸干得粗皂苷,加入乙酸乙酯后于水浴中攪拌、放冷、過濾、沉淀、得較純的皂苷,再用甲醇重結(jié)晶得到黃芪甲苷。它具有顯著降低血糖、糖化血紅蛋白和尿蛋白的作用,可降低腎皮質(zhì)和血清中的AGE
文檔編號A61K9/10GK1569884SQ20041001478
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者張銀娣, 印曉星, 沈建平, 李爾廣, 趙復(fù)中, 莊碧年, 丁緒亮, 吳?,| 申請人:南京醫(yī)科大學
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