專利名稱：用作拭子的基于明膠的材料的制作方法
技術領域：
基于明膠或膠原的材料用于從許多采集介質(zhì)中采集目標物，例如微生物細胞、哺乳動物細胞、核苷酸和其它的化學和生物分子。
背景技術：
基于明膠的海綿已經(jīng)在外科手術中用作止血劑。
Dean Jr.(US 4,997,753；US 4,863,856和US 4,861,714)公開了weighted膠原微海綿用于固定生物活性物質(zhì)的應用。
EP 0 702 081公開了用于組織培養(yǎng)的含有2種海綿的基質(zhì)。
US 5,462,860公開了用于微生物的快速生長和檢測的培養(yǎng)基。
從目標區(qū)域取樣的常規(guī)方法包括使用棉簽。從表面回收樣品受到限制，因為從表面區(qū)域向拭子的回收率較低，然后從拭子向培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移也較低。當按照USP/NF指南和EU-GMP指南操作時，從表面回收微生物的水平是關鍵的。本發(fā)明解決了該問題，并提供了用于取樣的顯著改進的裝置。
發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于明膠的海綿可以用于從許多采集介質(zhì)中采集多種物質(zhì)，例如微生物和哺乳動物細胞，也可以是哺乳動物組織和各種分子，包括核苷酸。該海綿可以用于例如取樣和培養(yǎng)目的。發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)方法相比，該海綿具有顯著更高的取樣物質(zhì)的回收水平。而且，通過許多方法，可以將結(jié)合在海綿上的目標物質(zhì)從海綿轉(zhuǎn)移到另一種介質(zhì)中。
本發(fā)明的第一個目的涉及一種裝置，其包含用于取樣或采集的裝置，后者包含i)含有明膠或膠原的拭子；和ii)固定于所述拭子的支持物。
該裝置或基于明膠的海綿可以用于許多與從海綿高水平回收目標物有關的用途。因此，本發(fā)明的另一個目的涉及基于明膠的海綿從采集介質(zhì)采集目標物的應用，其包括使基于明膠的海綿和介質(zhì)接觸。而且，本發(fā)明的一個目的涉及降低目標物在樣品區(qū)域的量的方法，其包括使基于明膠的海綿和所述樣品區(qū)域的至少一部分接觸，使得目標物粘附到海綿上。該海綿令人驚奇的特性的重要的和其它的用途涉及定性地或定量地對某區(qū)域取樣檢測目標物含量的方法，其包括使用基于明膠的海綿和下述步驟i)使用基于明膠的海綿進行濕取樣；和/或ii)使用基于明膠的海綿進行干取樣。本發(fā)明的一個同樣重要的方面涉及培養(yǎng)微生物或哺乳動物細胞的方法，其包括使細胞粘附到基于明膠的海綿上，并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
本發(fā)明提供了一種拭子，其能從樣品中高水平地回收目標物，而且當從拭子向分析介質(zhì)中轉(zhuǎn)移時，能再次高水平地回收。
發(fā)明描述在上下文中，目標物是指能結(jié)合到本發(fā)明的基于明膠的海綿上的任何物質(zhì)。采集介質(zhì)是指可以從中采集所述目標物的任何介質(zhì)。術語“轉(zhuǎn)移介質(zhì)”意指采集的目標物向其轉(zhuǎn)移的介質(zhì)。
在上下文中，術語″回收″意指目標物從采集介質(zhì)到轉(zhuǎn)移介質(zhì)的總回收產(chǎn)率。因而，回收包括i)目標物到本發(fā)明的基于明膠的海綿的采集產(chǎn)率，和ii)從基于明膠的海綿到轉(zhuǎn)移介質(zhì)的轉(zhuǎn)移產(chǎn)率。
在上下文中，認為第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)是用于從海綿采集目標物的介質(zhì)。合適的第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)的實例包括酶溶液、或合適的將目標物機械地或化學地從海綿去除到介質(zhì)中的洗滌劑，例如液體介質(zhì)。認為第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)是第二種介質(zhì)，向其中轉(zhuǎn)移了第一介質(zhì)或來自第一介質(zhì)的樣品，其中包括采集的目標物。
在上下文中，認為微生物是選自細菌、細菌芽孢、古細菌(archea)、酵母和真菌的任意生物。
在上下文中，認為分散劑是可以在采集后向其中分散目標物的任意液體試劑。
在實驗過程的上下文中認為中性稀釋劑是中性的液體，即它不會干擾正在進行的診斷實驗。因此，在該上下文中，中性稀釋劑不必但可以是具有中性pH的稀釋劑。水、水性緩沖液是中性稀釋劑的合適的實例。
林格氏溶液是指這樣的水性溶液，其含有蒸餾水和氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣，濃度大致與其在體液中的濃度相同。
“半固體表面”是性質(zhì)上不嚴格是固體的表面，例如哺乳動物組織或任意其它的天然的和/或合成的組織。合適的半固體表面的實例是哺乳動物皮膚或被結(jié)締組織覆蓋的其它表面，例如哺乳動物器官的表面。
在上下文中，″去污劑″可以是用于清潔目的的任意天然的或合成的、有機的或無機的化合物或化合物的混合物，例如用于從表面去除雜質(zhì)或污染物。
在上下文中，認為術語″把手″涉及可以用于抓緊的任何裝置，不應當理解為限于特別設計為起把手作用的裝置。作為實例，連接到本發(fā)明的基于明膠的海綿上的手柄可以由此用于操作海綿，因此認為代表把手。而且，認為僅僅暫時連接到海綿上的鑷子或夾子也是把手。
在上下文中，認為拭子是用于施用物質(zhì)、或從區(qū)域或表面去除物質(zhì)的任意材料?！笆媚?擦拭”是指使用所述的拭子施用物質(zhì)或從區(qū)域或表面去除物質(zhì)的方法。
本發(fā)明涉及基于明膠的海綿和它們的結(jié)合目標物的特性，所述的目標物例如微生物和哺乳動物細胞、以及分子物質(zhì)，例如核苷酸，其適于結(jié)合基于明膠的海綿。前述目標物的結(jié)合性質(zhì)可以用于從各種介質(zhì)采集所述的目標物。一旦采集到目標物，可以任選地通過機械的、酶促的或化學的方法，將其從海綿上釋放。
目標物典型地選自病毒、微生物、哺乳動物細胞和有機分子。有機分子選自核苷酸、核酸、蛋白或去污劑。核苷酸是含有嘌呤或嘧啶的核苷酸，優(yōu)選ATP。微生物選自細菌、古細菌、細菌芽孢、酵母和真菌。
哺乳動物細胞可以選自來自血漿的細胞、白細胞、紅細胞、血小板，但是也可以是其它的哺乳動物細胞，例如皮膚細胞或為了各種診斷和/或清潔目的可以用于采集的任何其它類型的哺乳動物細胞。
根據(jù)本發(fā)明，由目標物向本發(fā)明的拭子的高采集產(chǎn)率、和/或隨后的從拭子向轉(zhuǎn)移介質(zhì)的高轉(zhuǎn)移產(chǎn)率而致的高回收率需要i)包含明膠或膠原的拭子。該拭子典型地固定到把手或支持物上。
在本發(fā)明的一個特別令人感興趣的實施方案中，拭子可選自基于明膠的海綿、基于膠原的海綿、微原纖維明膠或微原纖維膠原。優(yōu)選地，拭子是基于明膠的海綿或基于膠原的海綿，更優(yōu)選地，是基于明膠的海綿?；诿髂z的海綿或基于膠原的海綿材料優(yōu)選地分別含有至少50％的明膠或膠原，例如至少60％，例如至少70％，典型地至少75％，優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少85％，例如至少90％，合適地至少95％，最優(yōu)選地選自分別至少96％、97％、98％、99％的明膠或膠原，基于海綿的干重。
在最優(yōu)選的實施方案中，拭子是明膠海綿或膠原海綿，更優(yōu)選地是明膠海綿。也就是說，拭子本身是海綿，典型地分別包含至少95％、最優(yōu)選地選自至少96％、97％、98％、99％的明膠或膠原，基于海綿的干重。
基于明膠的海綿或基于膠原的海綿的特征在于其物理特性，其更具體地可以通過海綿的明膠或膠原組成、孔徑、恢復(reconfirmation)速度、吸水率和消化率來描述。
不受具體理論的約束，認為海綿的孔徑會至少部分地影響海綿采集和轉(zhuǎn)移本發(fā)明的目標物的能力。而且，孔徑會影響海綿的密度，還對其物理特征有影響，例如恢復速度和吸水率。
不受具體理論的約束，高回收率可以是部分地由于拭子表面賦予的適當?shù)拇植诙?，使樣品采集到本發(fā)明的拭子的表面。而且，不受具體理論的約束，包含在拭子中的膠原或明膠的化學性質(zhì)所賦予的物理特性也可以部分地通過粘附機制有助于高回收率。
不受具體理論的約束，認為適當?shù)目讖綍糠值馗纳聘叱跏蓟厥章?。在基于明膠的海綿、基于膠原的海綿、微原纖維明膠和微原纖維膠原中的明膠或膠原會形成或具有平均孔徑為約10nm至約2mm的孔。不受任何一種理論的約束，特別是在非-無水的環(huán)境中，來自采集介質(zhì)的高回收率可以由一種形式的毛細作用進入拭子來提供。對于病毒的采集或取樣，至少10％的孔可具有小于1000nm的孔徑，例如小于800nm，例如小于500nm，例如小于400nm。對于細菌的采集或取樣，至少10％的孔可具有小于100μm的孔徑，例如小于80μm，例如小于50μm，例如小于10μm。對于真菌或紅細胞的采集或取樣，至少10％的孔可具有小于1000μm的孔徑，例如小于800μm，例如小于500μm，例如小于100μm，例如小于50μm。技術人員可以調(diào)整明膠或膠原到理想的孔徑，技術人員也可以根據(jù)目標選擇孔徑。
在本發(fā)明的典型實施方案中，基于明膠的或基于膠原的海綿的明膠或膠原是豬來源的。預期本發(fā)明可以修改以包含其它來源的明膠，例如?；蛉我馄渌溉閯游锏拿髂z，包括海洋哺乳動物、魚或小龍蝦，或植物來源，并包括任何其它來源的明膠，例如有機來源、或合成或半合成來源的明膠。
恢復速度代表著基于明膠的或基于膠原的海綿的彈性的衡量指標。在本發(fā)明的一個實施方案中，基于明膠的海綿具有不超過10秒、且典型地不超過5秒的恢復速度。但是，預期基于來自不同來源的明膠的海綿會具有更寬范圍的恢復。典型地通過基于海綿恢復其原始大小和形狀的速度的方法，如實施例1所述，測定恢復速度。
本發(fā)明的基于明膠的海綿典型地具有至少30g/g、更典型地至少40g/g的吸水能力，如實施例3所測定的。但是，預期基于來自不同來源的明膠的海綿的吸水能力可以是至少5g/g，例如至少10g/g或至少20g/g的更寬范圍。吸水率的測定典型地按照USP標準進行。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，拭子是天然的或合成的材料，例如包含明膠顆粒或膠原顆粒、優(yōu)選明膠顆粒的吸收材料。天然的或合成的吸收材料實質(zhì)上是在其內(nèi)部或其表面上可以含有松散地結(jié)合或固定的明膠或軟骨顆粒的任何物質(zhì)。明膠或膠原顆粒可以被該材料的松的或緊的織物或基質(zhì)包埋，或被粘著物質(zhì)包埋。在該實施方案中，顆粒可以具有下述范圍的粒徑約1μm至約2mm，典型地約5μm至約1mm、例如約5μm至約0.5mm，更典型地約5μm至約0.25mm，優(yōu)選地約10μm至約0.25mm，例如約10μm至約0.1mm。
拭子中明膠顆?；蚰z原顆粒、優(yōu)選明膠顆粒的含量占1-95％重量/重量，基于拭子和顆粒的總干重，例如2-90％、典型地5-90％。如技術人員能理解的，重量含量取決于天然的或合成的材料的性質(zhì)。
拭子意圖用于許多表面和其它采集介質(zhì)。根據(jù)用途和采集介質(zhì)，是工業(yè)機械、墻壁、桌面、在常規(guī)的或小規(guī)模的實驗室設備中使用的排氣口，拭子的大小可以變化。典型地，拭子的大小范圍是約1cm×1cm至約15cm×15cm。根據(jù)其用途，它可以是任意的形狀。特別令人感興趣的是基于膠原的海綿或基于明膠的海綿的使用，因為它們是可高度壓縮的，且可以壓進或擠進所有的縫隙和孔中。
本發(fā)明的另一方面涉及試劑盒，其包含i)含有明膠或膠原的拭子；和ii)試劑，其選自中性稀釋劑、抗微生物劑和分散劑。拭子可以是如上所述。存在選自中性稀釋劑、抗微生物劑和分散劑的試劑，以輔助目標物的采集或取樣。
本發(fā)明的另一方面涉及本文所述的裝置或試劑盒在從采集介質(zhì)采集目標物中的應用，其包括使拭子和目標物相接觸。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于明膠的海綿能緊密地、但是可逆地結(jié)合微生物。因而，拭子可以用于從樣品例如從表面取樣，以檢查微生物的存在。在這樣的實施方案中，可以通過本發(fā)明的方法將微生物從拭子轉(zhuǎn)移。可以任選地進一步培養(yǎng)由此采集的微生物，其可以用于特定的目的，例如詳細表征所述的微生物?；蛘?，拭子可以用于定量地從樣品例如表面去除微生物。在這樣的實施方案中，可以任選地將抗微生物劑或消毒劑合適地引入拭子中。
還預期，拭子可以用于采集除微生物以外的其它類型的細胞，例如哺乳動物細胞?？梢詫崿F(xiàn)這樣的實施方案，例如通過從哺乳動物表面采集，例如從哺乳動物皮膚或任何哺乳動物器官的表面。而且，拭子可以適應于內(nèi)部使用，例如在對哺乳動物進行手術操作的過程中，可以在這種實施方案中用于從傷口或從哺乳動物的內(nèi)部器官采集目標物，以及健康診所或醫(yī)院中的(例如手術室中的)、或用于進行或執(zhí)行手術操作的任何其它場所中的手術設備和特定化的器具、墻壁或地板。
發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，基于明膠的海綿能以可逆的方式結(jié)合某些分子，例如基于嘌呤或嘧啶的核苷酸或核酸、優(yōu)選ATP。該發(fā)現(xiàn)具有有益的用途，其中已經(jīng)通過檢測細菌性三磷酸腺苷(ATP)的量估計了食物中的細菌數(shù)目。預期拭子可以更普遍地用于采集多種分子物質(zhì)，因而拭子可以普遍地用于采集某些分子。
在一個實施方案中，這樣的分子是基于嘌呤或嘧啶的核苷酸，例如ATP。在另一個實施方案中，這樣的分子是核酸。在另一個實施方案中，分子是去污劑，其可以方便地從樣品例如表面采集。在該上下文中，去污劑可以是用于清潔目的的任意的天然的或合成的、有機的或無機的化合物或化合物的混合物，例如用于從表面去除雜質(zhì)或污染物。
而且，拭子可以用于從樣品同時采集微生物、哺乳動物細胞和/或分子的混合物。在某些實施方案中，構建基于明膠的海綿以采集一種特定類型的目標物可能是有用的。
由于拭子能粘附目標物，例如微生物或哺乳動物細胞以及分子物質(zhì)，特別是有機分子例如核苷酸，其理想的性質(zhì)使得許多有益的用途成為可能。
在本發(fā)明的合適的實施方案中，對拭子進行修改使其與支持物接觸，或連接到支持物上。支持物的目的可以是提供不接觸海綿材料本身而操縱拭子的方式，從而避免污染。這可以特別地用于其中理想地預先消毒海綿的實施方案，即用于采集或分析微生物或哺乳動物細胞的實施方案。支持物還可以有利于拭子的使用和方便地從各種樣品采集目標物。支持物還可以是非常有價值的，用于從難以達到的樣品采集目標物，或用于其它的沒有支持物時難以操縱拭子的應用。
支持物可以由任何合適的用于特定用途的材料制成，例如木材、天然的或合成的聚合物材料，包括塑料和橡膠材料，或任何其它的適用于特定實施方案的有機或無機材料。
支持物可以有多種，例如方便地以把手的形式。把手可以是短的，例如范圍為約1cm至約30cm，例如約3cm至約20cm，優(yōu)選地約5cm至約15cm。對于某些用途，把手可以適當?shù)叵鄬ΩL，例如范圍為約30cm至數(shù)米長。把手可以是方便用于特定實施方案的任何形狀，但是典型地是伸長形的，任選地彎曲的，且基于明膠的海綿連接在把手的一端，同時把手的另一端用于抓緊或以其它方式應用基于明膠的海綿。
在一個合適的實施方案中，其中拭子連接到把手形式的支持物上，基于明膠的海綿具有橢圓或其它方式伸長形狀的海綿位于手柄的一端，該手柄起把手的作用。在另一個實施方案中，海綿連接在固體支持物上，例如圓形的或矩形的支持物，后者又位于把手或手柄的末端。但是應當明白，拭子可以在多個不同的實施方案中連接到手柄或把手形式的支持物上，合適地變化以用于基于明膠的海綿的任何特定的用途。
在另一個實施方案中，支持物任選地是涂層形式。涂層可以含有任何合適的材料，例如聚合物材料或塑料，或任何其它的適用于提供涂層的材料。在一個合適的實施方案中，將涂層應用到本發(fā)明的拭子的一側(cè)，該拭子已經(jīng)制成扁平形狀。
在另一個實施方案中，支持物可以是固體材料，其具有合適的形狀，例如圓盤、立方體、球體或塊的形狀。在這樣的實施方案中，基于明膠的海綿優(yōu)選地連接到支持物的一側(cè)，但是在優(yōu)選的實施方案中，可以連接到支持物的幾個或所有表面。
在有的實施方案中，立方體形狀的拭子是特別有用的，這樣的實施方案可以用于采集液體樣品或從包含液體涂層的表面進行采集。在這樣的實施方案中，拭子可以合適地連接到支持物上，后者可以任選地是把手的形狀，或者適當?shù)剡B接到手柄或把手上。
應當明白，由于拭子材料的性質(zhì)，可以使其形狀適用于任何特定的用途。因而，其中通過將拭子固定到支持物上實現(xiàn)本發(fā)明的實施方案的尺寸和形狀可以進行調(diào)整以理想地適合于它們的用途。
拭子可以通過本領域技術人員已知的任何常規(guī)方法連接到支持物上。這樣的實施方案的本質(zhì)取決于實施方案的特定形狀和其目的用途。
還預期，支持物可以是多孔容器的形式，例如坩堝或者其它合適的材料，其形狀使得包封著拭子，同時允許液體和目標物穿過包封材料。在這樣的實施方案中，包埋的基于明膠的海綿可以用于從液體中采集樣品。通過將包埋的海綿浸入液體介質(zhì)中，從而使介質(zhì)中的目標物接觸并結(jié)合到基于明膠的海綿上，可以合適地進行這樣的采集。
在拭子適用于采集氣體目標物的實施方案中，優(yōu)選地使海綿的表面和/或孔徑最大化。根據(jù)上述的實施方案中的任一個，可以實現(xiàn)這樣的實施方案，因為氣體目標物的結(jié)合性質(zhì)與液體介質(zhì)中的目標物的結(jié)合遵循相同的原理。氣體目標物可以是任意的分子種類，其在采集過程中使用的溫度下是氣體，或者是液體或固體化合物，其具有足夠高的蒸氣壓，使得該目標物可以被采集。在本上下文中，認為“氣體目標物”包括性質(zhì)上是固體的目標物，包括微生物和哺乳動物細胞，但是捕獲在液滴或微滴中，或形成可以被氣體(例如環(huán)境大氣)攜帶的顆粒。
在本發(fā)明的另一方面，可以將明膠粉末或膠原粉末直接應用到樣品，以采集目標物，例如當樣品存在于液體或流體中時。在這樣的實施方案中，可以通過過濾、離心或通過本領域已知的其它方法回收明膠粉末。
明膠粉末還可以包封在坩堝或其它合適的材料中，其形狀能包封粉末，同時允許液體和目標物穿過包封材料。這樣的實施方案可以特別地用于從液體介質(zhì)中采集。在另一個實施方案中，包封材料可透過氣體目標物，通過將包封的粉末狀的明膠物質(zhì)置于含有所述氣體目標物的環(huán)境中，可以實現(xiàn)目標物的采集。
使用本發(fā)明的拭子從表面采集目標物所使用的方法包括這樣的技術，例如擦拭技術和count-tact技術。擦拭技術原則上包括機械刮擦或拭取目標物，例如表面，且是本領域的技術人員熟知的。Count-tact技術包括使用特別設計的裝置，如實施例6所述。
在本發(fā)明的一個實施方案中，任選地連接到支持物上的基于明膠的海綿可以用于從樣品采集目標物。目標物可以選自微生物、哺乳動物細胞，但是也可以是哺乳動物組織，或者為分子物質(zhì)，例如核酸或基于嘌呤或嘧啶的核苷酸，優(yōu)選ATP。微生物可以選自細菌、古細菌、細菌芽孢、酵母或真菌。哺乳動物細胞可以是任意的哺乳動物細胞類型，但是可以特別地選自來自血漿的細胞、白細胞、紅細胞、血小板、上皮細胞、皮膚細胞或任何其它的可以用于各種診斷和/或清潔目的的采集的哺乳動物細胞類型。
在優(yōu)選的實施方案中，使用濕取樣和干取樣的組合從表面采集目標物。在該上下文中，認為濕取樣包括使用本發(fā)明的基于明膠的海綿，其任選地已經(jīng)連接到支持物上，且已經(jīng)用合適的中性稀釋劑或分散劑預潤濕。這樣的稀釋劑或分散劑用于促進從表面回收目標物的目的，同時不干擾實驗。稀釋劑和分散劑可以是任何合適的水性溶液，任選地包含鹽或其它對要采集的目標物無毒的或化學上或生物上無害的試劑，例如鹽水、鹽水胨、緩沖的鹽水胨、林格氏溶液和有機的或無機的緩沖液，其任選地含有無機鹽。稀釋劑或分散劑還可以任選地含有適合于所采集的微生物或哺乳動物細胞類型的生長培養(yǎng)基，用于針對這樣的目標物的實驗。海綿還可以任選地預消毒。通過用至少一個這樣的預潤濕的海綿刮擦表面，然后用至少一個干的基于明膠的海綿刮擦所述的表面，可以實現(xiàn)目標物的采集。干刮擦的目的是從表面回收盡可能多的殘留液體和目標物。
在其它的實施方案中，通過單獨的濕取樣或干取樣，可以實現(xiàn)目標物的采集。所用方法的選擇隨要測試的樣品類型和要采集的目標物類型而異。
典型地，從拭子上轉(zhuǎn)移采集在拭子中的目標物，包括微生物、哺乳動物細胞和/或分子。這種采集的目標物的轉(zhuǎn)移包括將這樣的目標物從海綿去除或脫附進入合適的介質(zhì)中。在優(yōu)選的實施方案中，這是通過將基于明膠的海綿置于包含能消化基于明膠的海綿的溶液的介質(zhì)中實現(xiàn)的。海綿的消化可以通過化學的和/或酶的方法來實現(xiàn)，優(yōu)選地使用酶，例如蛋白酶，更優(yōu)選地使用諸如alcalase或胃蛋白酶的蛋白酶?；瘜W方法的消化可以包括以不會使目標物變性的合適濃度使用無機酸或羧酸或堿。在一個實施方案中，消化包括使用至少一種酶的混合物，且可以任選地包括無機酸或堿、和任選地無機鹽、以及有機的或無機的緩沖劑。適用于從海綿回收目標物的溫度高度取決于使用的方法。在使用酶實現(xiàn)轉(zhuǎn)移的實施方案中，將實驗溫度調(diào)整到使在使用的消化介質(zhì)的組成環(huán)境下特定酶的消化效率最大化。
通常，通過本領域已知的從海綿釋放所述目標物的任何技術，可以實現(xiàn)目標物從本發(fā)明的基于明膠的海綿的轉(zhuǎn)移。因而，這可以通過改變條件(例如pH或溫度)、或通過加入鹽、離液劑或有機溶劑來實現(xiàn)。從海綿的轉(zhuǎn)移還可以任選地包括機械作用，例如通過摩擦或搖動海綿、或通過其它的能促進目標物脫離海綿的機械方法產(chǎn)生。從海綿的轉(zhuǎn)移還可以通過從基于明膠的海綿洗脫目標物來實現(xiàn)。
預期本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案包括從海綿釋放微生物和/或哺乳動物細胞的消化方法，因為微生物和哺乳動物細胞通常對條件變化是敏感的。但是，也可能存在例外，特別是預期到對于某些應用，使用實驗條件的變化會有利于某些微生物或哺乳動物細胞、特別是嗜極生物的回收，它們是適應耐受pH、鹽、溫度和/或有機溶劑的苛刻條件的生物。根據(jù)本發(fā)明任意特定實施方案和結(jié)合的分子類型，通過前述技術中的任一種，可以回收結(jié)合到海綿上的分子。
使用膜過濾，可以任選地進一步分離從基于明膠的海綿回收的微生物或哺乳動物細胞，其中膜過濾器具有的性質(zhì)允許溶劑和小分子穿過過濾器，而全細胞和微生物則不能。在一個典型的實施方案中，這樣的過濾器的孔徑小于1μm，例如小于0.8μm，例如小于0.6μm，更典型地小于0.45μm，例如小于0.2μm。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，基于明膠的海綿用于消毒樣品，例如表面。在這樣的實施方案中，海綿用于從樣品去除目標物(在該情況下是微生物和/或哺乳動物細胞)，其與任選地抗微生物劑或消毒劑的聯(lián)合作用能有效地從樣品中去除所述的微生物或哺乳動物細胞，從而使其無菌。在這樣的實施方案中，海綿優(yōu)選地通過本領域已知的方法消毒滅菌，例如通過熱和/或輻射，和任選地用抗微生物劑或消毒劑預處理。這樣的試劑優(yōu)選地是液體，例如乙醇、包含乙醇的水性溶液或其它能殺死微生物或哺乳動物細胞的液體試劑，但是可以是有利于滅菌過程的任何化合物。通過將任選地連接在支持物上且任選地用滅菌劑預處理的每個基于明膠的海綿分別包入密封包裝(其理想地用于單次使用)，可以實現(xiàn)樣品滅菌的實施方案。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以培養(yǎng)已經(jīng)捕獲到基于明膠的海綿上的活微生物或哺乳動物細胞。培養(yǎng)通常需要使微生物或哺乳動物細胞和合適的生長培養(yǎng)基接觸。生長培養(yǎng)基可以是液體形式；或者，其是固體瓊脂的形式。生長培養(yǎng)基由本領域的技術人員熟知的組分組成。通過常規(guī)技術可以完成所述的培養(yǎng)，包括
1.使基于明膠的海綿(任選地連接在支持物上)和液體或固體生長培養(yǎng)基接觸。在一個這樣的實施方案中，使用合適形狀的基于明膠的海綿(位于手柄的末端)從表面采集目標物，并隨后與生長培養(yǎng)基接觸，將通過海綿采集的微生物或哺乳動物細胞轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基。
2.將液體生長培養(yǎng)基(任選地含有瓊脂)注射進明膠海綿，從而為基于明膠的海綿中結(jié)合的微生物或哺乳動物細胞的原位生長提供條件。
3.將基于明膠的海綿轉(zhuǎn)移到含有液體生長培養(yǎng)基的容器中，從而在所述的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)合的微生物或哺乳動物細胞的完整群體。
應當明白，可以在培養(yǎng)采集的微生物或哺乳動物細胞之前進行一個步驟，其中結(jié)合的細胞已經(jīng)脫離或通過其它方式釋放到介質(zhì)中。在這樣的實施方案中，認為所述的介質(zhì)是第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)。介質(zhì)可以是適于應用的任意的液體，例如中性稀釋劑、分散劑或生長培養(yǎng)基。通過本文所述的任何方法，包括對基于明膠的海綿的酶促的和/或化學的消化，可以實現(xiàn)結(jié)合的微生物或哺乳動物細胞的脫附，且可以包括機械轉(zhuǎn)移入所述的第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)中。隨后將由此脫附的微生物或哺乳動物細胞轉(zhuǎn)移到第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)中，其理想地含有液體或固體生長培養(yǎng)基。向第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)的轉(zhuǎn)移可以是部分的，即將來自所述的第一生長培養(yǎng)基的一個樣品轉(zhuǎn)移到所述的第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)中。或者，轉(zhuǎn)移是完全徹底的，即將第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)的全部體積都轉(zhuǎn)移到第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)中。
培養(yǎng)通過本發(fā)明的基于明膠的海綿采集的微生物或哺乳動物細胞，可以特別地用于進一步表征或生產(chǎn)采集的微生物或哺乳動物細胞?；诿髂z的海綿的優(yōu)選的實施方案可以例如用于定性檢測從樣品中采集的目標群體中的微生物和/或哺乳動物細胞組成。在這樣的實施方案中，樣品可以是例如食品生產(chǎn)線(例如肉或魚加工線)中的表面，或來自其它的表面，例如在這樣的加工線中使用的地板、墻壁或設備?；蛘?，樣品可以是來自健康診所或醫(yī)院(例如手術室)的設備、專門器具或墻壁或地板的表面。樣品還可以是從開放傷口、從內(nèi)部器官表面采集的，或者它可以由任意的哺乳動物組織組成。但是，原則上，基于明膠的海綿可以適應用于從任何樣品采集和培養(yǎng)目標物，由此其可用于檢測微生物和/或哺乳動物細胞的含量。
在一個實施方案中，采集介質(zhì)是可以從其采集目標物的固體表面。在第二個實施方案中，介質(zhì)是也可以從中采集目標物的液體。在這樣的實施方案中，基于明膠的海綿的高吸水能力是有用的特征，因為它可以采集大量的水。液體介質(zhì)可以位于表面，例如在表面上的凹陷中。因此，海綿可以用于從多種來源采集目標物，例如肉和/或魚類產(chǎn)品的食品生產(chǎn)加工廠的生產(chǎn)設備、醫(yī)療裝置，以及用于傷口的處理和清潔，例如手術傷口。
還預期，基于明膠的海綿可以用于從其它類型的液體和/或氣體性質(zhì)的樣品中采集目標物。
原則上，可以從固體表面進行采集，無論該表面的組成材料如何，例如有機或無機材料的天然的或合成的表面。而且，可以從半固體表面采集目標物，例如從哺乳動物表面和哺乳動物組織，包括哺乳動物皮膚和哺乳動物器官的表面。
實施例下面的方法和實施例解釋了本發(fā)明的基于明膠的海綿如何特別地用于從不銹鋼表面采集和回收細菌芽孢。回收產(chǎn)率，即從表面向海綿的轉(zhuǎn)移和隨后的從海綿向培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移的總產(chǎn)率，是非常高的，這例示了基于明膠的海綿用于從樣品例如不銹鋼表面采集和轉(zhuǎn)移目標物的有效性。
但是，這些方法和實施例僅僅應當理解為本發(fā)明的有用實施方案的實例，而不以任何方式限制它的其它用途。
實施例1.檢測基于明膠的海綿的恢復時間該方法的目的是檢測基于明膠的海綿的恢復速度。該方法包括浸濕海綿，并隨后擠壓它。監(jiān)測海綿的天然形狀的出現(xiàn)作為時間的函數(shù)，直到海綿達到其天然形狀所經(jīng)歷的時間稱作恢復時間。
該方法包括下述步驟1.切下適當大小的可吸收的基于明膠的海綿，約1×1cm，并在室溫下在水中充分浸濕。
2.將樣品從水中取出，擠壓它，直到它是扁平的，且不能再擠出氣泡或水滴。
3.在室溫下，將樣品置于裝滿水的燒杯中，并測量樣品恢復其原來大小和形狀的時間(秒)。
4.重復測試2次，記錄3次檢測的平均值作為結(jié)果。
實施例2.使用胃蛋白酶檢測基于明膠的海綿的消化性目的使用胃蛋白酶通過酶法檢測基于明膠的海綿的消化時間該方法中使用的試劑Milli-Q-水胃蛋白酶(1∶3000)稀鹽酸，Ph.Eur.
胃蛋白酶溶液1％精確稱量20.0g胃蛋白酶，使用2000ml容量瓶，將其溶解到100ml稀鹽酸中。加水至刻度，并混合。
儀器金屬絲籃，6cmφ，1mm開口。
恒溫水浴方法1.將100ml胃蛋白酶溶液(1％)轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中。加入磁棒，將燒杯置于在磁力攪拌器上預先加熱到37℃的水浴中。
2.切下一片重為50±5mg的可吸收的明膠海綿，將其置于一燒杯水中。用手指輕捏，直到明膠海綿徹底潤濕、且所有的空氣都已排出，小心不要破壞組織。
3.從水中取出，并輕輕擠壓以去除任何多余的水。
4.將潤濕的樣品置于燒杯中的金屬絲籃中，開始計時。
5.觀察直到這片可吸收的明膠海綿完全溶解，停止計時，記錄所用的時間。
6.重復實驗2次，共計3次，并計算平均值。
對于明膠粉末的替代方法1.將100ml胃蛋白酶溶液(1％)轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中。加入磁棒，將燒杯置于在磁力攪拌器上預先加熱到37℃的水浴中。
2.制備重約50mg±5mg的樣品。
3.將樣品直接置于燒杯中。
4.觀察直到可吸收的明膠粉末完全溶解，停止計時，記錄用的時間。
5.重復實驗2次，共計3次，并計算3次測量的平均值。
實施例3.檢測基于明膠的海綿的吸水率目的檢測基于明膠的海綿可以吸收的水的量。預期海綿能吸收數(shù)倍于它自身重量的水，以重量與重量相比為基礎。
方法根據(jù)USP方法″Absorable Gelatine SpongeWaterabsorption″。對6片不同的基于明膠的海綿共進行了6次測定。
實施例4.基于明膠的海綿的大小測量目的對6個樣品測量了明膠海綿的大小、重量、高度、長度、寬度、中心孔和直徑；對6個樣品中的每一個進行一系列的測量。記錄6次測量的平均值。計算密度。
儀器測徑器，Mitutoyo 500-系列或類似的。
特別制作的用于測量可吸收的明膠海綿膜的長度和寬度的尺子。
天平，Mettler AK 160或具有類似精確度的天平。
方法和計算使用測徑器或尺子進行想要的測量。記錄在6個樣品上進行的6次測量的平均值(mm)。
測量了海綿的重量。記錄在6個樣品上進行的6次測量的平均值(0.001g)。以下述方式計算可吸收的明膠海綿的密度 其中，D＝海綿的直徑，d＝海綿中的孔的直徑。
實施例5.使用濕取樣和干取樣對不銹鋼表面取樣的方案目的使用濕取樣和干取樣的組合對不銹鋼表面取樣材料基于明膠的海綿鹽水-胨溶液Alcalase溶液具有24cm2接觸區(qū)域的不銹鋼表面兜袋(stomacher bag)方法1.使用以鹽水-胨溶液潤濕的明膠海綿拭子，從左向右水平擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)域。
2.使用以鹽水-胨溶液潤濕的明膠海綿拭子，從上向下垂直擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)域。
3.使用干明膠海綿拭子，從左向右水平擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)域。
4.使用干明膠海綿拭子，從上向下垂直擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)域。
5.將拭子置于兜袋中。
6.將消化溶液加到每個兜袋中。
7.用stomacher使兜袋均勻。
8.在36℃孵育兜袋，直到拭子溶解。
9.使用膜過濾，進行芽孢的提取。
實施例6.通過Count-Tact涂敷器(applicator)拭取。
簡介通過施加均勻的壓力500±50g持續(xù)10±1秒(歐洲標準草案CEN/TC 243)，用Count-Tact涂敷器標準化表面測試。
描述涂敷器由2個塑料元件組成●基座，其將Count-Tact板固定在位，由固定在校正彈簧上的按鈕裝置組成；●夾在基座上的元件，其含有電子計時器、可聽見的蜂鳴裝置和電池。
該方法包括下述步驟1.將Count-Tact板滑動進在固定到基座底部上的2個透明夾子下面的位置(蓋子朝外)。
2.從Count-Tact板去除蓋子。
3.將涂敷器靠到要從中取樣的表面的位置，不移動它(確認表面不是潮濕的)。
4.與表面接觸10秒后，可聽見的蜂鳴會發(fā)出聲音。從表面取下涂敷器。將蓋子放回板上，從涂敷器取下板(不要忘記清潔從中取樣的表面，以去除任何可能的瓊脂痕跡)。
5.關于板的孵育，參考Count-Tact技術sheet和Count-Tact照射sheet。
實施例7.來自拋光的不銹鋼的評價方案。
簡介該方案描述了用于從拋光的不銹鋼進行微生物取樣的方法的評價，該不銹鋼已經(jīng)用70％異丙醇進行了清潔。
使用所述的取樣方法進行了評價方案，以定義該方法的準確度和精密度、和來自在該實驗中使用的材料類型的微生物的回收產(chǎn)率。
只要根據(jù)目前所述的取樣方法從用異丙醇清潔過的拋光的不銹鋼進行微生物取樣，該測試就可以應用。
評價參數(shù)。
選擇性使用芽孢桿菌的芽孢作為不銹鋼上的微生物活性的標記。因為該芽孢是在55℃孵育，認為任何微生物污染都不太可能影響評價實驗過程中的結(jié)果。因而，選擇性對于該實驗不相關。
精密度(重復性)和準確度(回收率)在同一天中，使用相同的分析人員、相同的設備和相同的試劑，使用下述物質(zhì)重復地提取和分析拭子樣品，進行了評估2個濃度水平(5和25個芽孢)；1種表面材料；2次擦拭每種表面材料(合并到一個樣品中進行分析)；共6次重復(n＝6)；因此，共分析了12個樣品。
線性使用覆蓋了5至50個芽孢范圍的3點校正曲線建立。以6次重復進行了測試，使用3個濃度水平(5、25和50個芽孢)、2次擦拭每種表面材料，合并進行分析。
中間精密度在不同天，使用相同的試劑批次、相同的裝置、不同的分析人員，進行重復分析而建立。使用2個濃度水平(5和25個芽孢)、1種表面材料和2次擦拭(合并進行分析)，并且由3個分析人員在3天的6次重復，進行了驗證。因此，共108個樣品。
裝置培養(yǎng)箱，高壓滅菌器，無菌Drigalski spate，無菌手套，明膠拭子，混合器，膜過濾設備，菌落計數(shù)器，無菌兜袋。
材料嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在40％乙醇中的芽孢懸浮液(1*106個芽孢/0.1mL乙醇)。表面材料(拋光的不銹鋼)的測試樣品。擦拭區(qū)模板(6×4cm＝24cm2)胰蛋白酶大豆瓊脂無菌過濾器無菌的50mL注射器一次性無菌移液管吸頭Count-Tact涂敷器，其帶有含有TSA、Tween和卵磷脂的接觸板。
化學試劑鹽水-胨溶液乙醇96％Elga水Alcalase溶液測試評價溶液的制備陽性對照A組將含有5個芽孢/313μL的芽孢懸浮液用作陽性對照。將0.100ml芽孢懸浮液(1.6*106芽孢/0.1ml)在9.90ml 40％乙醇中稀釋3次，得到1.6個芽孢/0.1ml的最終懸浮液，其對應于5個芽孢/1.6個芽孢＝3.125×0.1ml＝0.3125ml芽孢懸浮液/接觸板(24cm2)。
B組將含有25個芽孢/63μL的芽孢懸浮液用作陽性對照。將0.100ml芽孢懸浮液(1.6*106芽孢/0.1ml)在19.90ml 40％乙醇中稀釋2次，得到40個芽孢/0.1ml的最終懸浮液，其對應于25個芽孢/40個芽孢＝0.625×0.1ml＝0.0625ml芽孢懸浮液/接觸板(24cm2)。
陰性對照無菌乙醇用作陰性對照。
線性在線性研究中，使用3種芽孢懸浮液a)含有5個芽孢，b)含有25個芽孢，和c)含有50個芽孢。
a)將0.100ml芽孢懸浮液(1.6*106芽孢/0.1ml)在9.90ml 40％乙醇中稀釋3次，得到1.6個芽孢/0.1ml的最終懸浮液，其對應于5個芽孢/1.6個芽孢＝3.125×0.1ml＝0.3125ml芽孢懸浮液/接觸板(24cm2)。
b)將0.100ml芽孢懸浮液(1.6*106芽孢/0.1ml)在19.90ml 40％乙醇中稀釋2次，得到40個芽孢/0.1ml的最終懸浮液，其對應于25個芽孢/40個芽孢＝0.625×0.1ml＝0.0625ml芽孢懸浮液/接觸板(24cm2)。
c)將0.100ml芽孢懸浮液(1.6*106芽孢/0.1ml)在19.90ml 40％乙醇中稀釋2次，得到40個芽孢/0.1ml的最終懸浮液，其對應于50個芽孢/40個芽孢＝1.25×0.1ml＝0.125ml芽孢懸浮液/接觸板(24cm2)。
樣品制備使用擦拭技術取樣。
●將芽孢懸浮液應用到每個不銹鋼板上；●使不銹鋼板上的芽孢懸浮液中的乙醇蒸發(fā)；●將1.0ml alcalase溶液稀釋到90ml鹽水胨溶液中；●將兜袋置于匹配的兜袋夾子中；●使用以鹽水-胨溶液潤濕的拭子，從左向右水平擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)。
●使用以鹽水-胨溶液潤濕的拭子，從上向下水平擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)。
●使用干拭子，從左向右水平擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)。
●使用干拭子，從上向下水平擦拭不銹鋼板的24cm2接觸區(qū)。
●將拭子置于兜袋中。
●將稀釋的alcalase溶液加到每個兜袋中。
●用stomacher使兜袋均勻。
●在36℃孵育兜袋，直到拭子溶解(至少1小時，最多2.5小時)。
●使用膜過濾，進行芽孢的提取。
用Count-Tact涂敷器進行取樣●使用手套●將芽孢懸浮液應用到每個不銹鋼板上；●使不銹鋼板上的芽孢懸浮液中的乙醇蒸發(fā)；●在不銹鋼板上應用Count-Tact涂敷器。
陰性對照也加到不銹鋼板上。陽性對照樣品不加到不銹鋼板上，而是直接加到Count-Tact涂敷板上。
孵育所有的樣品都在55±2℃孵育至少1天至最多7天。
清潔表面材料和模板每次使用和再次使用后應清潔表面材料和模板●用浸有乙醇的實驗紙擦拭，清洗表面；●在121℃高壓滅菌不小于20分鐘。
計算回收率％＝樣品(CFU)*100/加入的芽孢，其中樣品＝來自準確度測試溶液的芽孢數(shù)目，且加入的芽孢＝準確度對照樣品中的芽孢的數(shù)目。
評價方法回收率/精密度/準確度使用不銹鋼研究了回收率/精密度和準確度，并按照上述的方法進行。該測試用于計算來自實驗樣品的微生物回收率。不改變試劑批次和設備，因為估計這些參數(shù)的變化對最終實驗結(jié)果的影響較小或無影響。
方法一位分析人員用每板約5和25個芽孢桿菌污染6個不銹鋼板。
每個不銹鋼板擦拭一式四份，或使用Count-Tact涂敷器取樣。將樣品在55±2℃孵育至少1天至最多7天，并計數(shù)。根據(jù)上述方法進行測試。
回收率/準確度與陽性對照相比，回收率應高于20％。
最低回收率設定了界限(在任意特定芽孢濃度——5至25個芽孢/24cm2的最低平均回收率)。
精密度
●計算重復分析的平均值和％RSD●％RSD應當小于10％線性方法使用上述的a)、b)和c)芽孢懸浮液制備6個相同的樣品。樣品用于建立這些芽孢水平的回收效率，并用于隨后的線性回歸。
評價●對每個水平的芽孢計算回收率，由5至50個芽孢進行回歸。
●計算標準曲線的回歸參數(shù)，并記錄每條曲線的斜率、截距和相關系數(shù)。
●相關系數(shù)應當滿足標準r2＞0.940。
中間精密度方法在隨后連續(xù)3天中，使用3名不同的分析人員，方法與上面對精密度所述相同。
評價●計算芽孢的回收率●計算每天的重復分析的平均值和％RSD●使用所有天(中間精密度第1天、第2天和第3天)，計算平均值和％RSD●％RSD應當小于15％實施例8.評價從拋光的不銹鋼的取樣目的為了評價用于從已經(jīng)用70％異丙醇清潔過的拋光的不銹鋼進行微生物取樣的方法，參考實施例7的評價方法。
簡介使用所述的取樣方法，進行了該評價研究，以定義用于從表面進行微生物取樣的方法的準確度、精密度和線性，并估計來自實驗中使用的材料類型的微生物的回收效率。在本研究中，從用70％異丙醇清潔的拋光的不銹鋼取樣。取樣的基本原理是，這是用于設備生產(chǎn)的普通材料。測試的方法是，通過擦拭技術取樣，和通過count-tact技術取樣。在表面上進行取樣，該表面上應用的細菌芽孢的數(shù)目與10,000級生產(chǎn)設備的USP，NF指南和10,000級生產(chǎn)設備的微生物純度的EU-GMP指南相同。
結(jié)果回收率計算使用擦拭技術的回收率(表1)，顯示了分析人員之間當應用5個芽孢時的差異(40％至175％)和當應用25個芽孢時的差異(73％至105％)。當應用5個芽孢時，使用擦拭技術的所有分析人員的平均回收率計算為80％，當應用25個芽孢時，為91％。
計算使用count-tact技術的回收率(表2)，顯示了分析人員之間當應用5個芽孢時的差異(54％至88％)和當應用25個芽孢時的差異(36％至57％)。當應用5個芽孢時，使用count-tact技術的所有分析人員的平均回收率計算為74％，當應用25個芽孢時，為45％。
精密度計算相對標準偏差百分比(RSD％)，當使用擦拭技術時(表1)，顯示了分析人員之間當應用5個芽孢時的差異(34％至70％)和當應用25個芽孢時的差異(30％至57％)。使用count-tact技術(表2)，當應用5個芽孢時的RSD％為41％至90％，當應用25個芽孢時為20％至65％。
中間精密度使用擦拭技術(表1)，當應用5個芽孢時的中間精密度是64％，當應用25個芽孢時是43％。使用coun-tact技術(表2)，當應用5個芽孢時的中間精密度是77％，當應用25個芽孢時是54％。
表1.使用擦拭技術的取樣結(jié)果
1)應用的芽孢的數(shù)目計算為5、25或50。應用的芽孢的實際量用于計算回收率。
2)僅僅一位分析人員從應用了50個芽孢的表面上取樣，其唯一目的是研究線性。
3)每位分析人員都完成了6次重復的取樣和分析。
5至50個芽孢的線性相關系數(shù)(R)＝0.9995；R2＝0.9990；截距＝-2.3；斜率＝1.0線性通過對一位分析人員應用的5、25和50個芽孢的芽孢濃度進行回歸，計算線性。定義的可接受水平是R2＞0.9400。當使用擦拭技術時，計算的R2是0.9990，當使用count-tact技術時，是0.9989。
表2.使用count-tact技術的取樣結(jié)果
1)應用的芽孢的數(shù)目計算為5、25或50。應用的芽孢的實際量用于計算回收率。
2)僅僅一位分析人員從應用了50個芽孢的表面上取樣，其唯一目的是研究線性。
3)每位分析人員都完成了6次重復取樣和分析。
5至50個芽孢的線性相關系數(shù)(R)＝0.9989；R2＝0.9979；截距＝-2.4；斜率＝0.4討論回收率當遵照USP/NF指南和EU-GMP指南時，微生物從表面的回收水平是關鍵的。當使用方案中所述的擦拭技術和count-tact技術時，細菌回收率均優(yōu)于從與USP/NF指南和EU-GMP指南相同的已知微生物污染的樣品回收微生物時預期的回收率。當使用擦拭技術時，(對所有分析人員的)平均最低回收率是80％，對于count-tact技術是45％。對于選擇的用在不銹鋼上的取樣方法，該回收率應該用于估計表面上的實際微生物量。
精密度重復分析的相對標準偏差(％RSD)(對于單個分析人員)比最初預期的大。但是，陽性對照和測定的％RSD的對比表明，高％RSD主要是由樣品分析造成的，而不是由使用count-tact或擦拭技術造成的。應當預料到不會達到相當于化學分析的％RSD，因為通常知道，微生物分析的％RSD比化學分析大得多。
中間精密度重復分析的相對標準偏差(％RSD)(分析人員之間)比最初預期的大。但是，陽性對照和測定的％RSD的對比表明，高％RSD主要是由樣品分析造成的，而不是由使用的擦拭或count-tact技術造成的。應當預料到不會達到相當于化學分析的％RSD，因為通常知道，微生物分析的％RSD比化學分析大得多。
對于擦拭技術，對上面給出的最低回收率計算出的平均％RSD是64％，對于count-tact方法是54％。為了校正分析的較大差異，當估計表面上的微生物的實際數(shù)目時，應當考慮％RSD。
結(jié)論結(jié)果表明，上述方法可以用于以總體上令人滿意的方式從拋光的不銹鋼進行微生物取樣，且沒有理由預期該方法不能適用于所有表面。當遵照USP/NF指南和EU-GMP指南時，微生物從表面的回收水平是關鍵的。當使用方案中所述的擦拭技術和count-tact涂敷器時，細菌回收率均優(yōu)于從與USP/NF指南和EU-GMP指南相同的已知微生物污染的樣品回收微生物時預期的。
權利要求
1.用于取樣或采集的裝置，其包含i)含有明膠或膠原的拭子；和ii)固定于所述拭子的支持物。
2.根據(jù)權利要求1的裝置，其中所述的拭子選自基于明膠的海綿、基于膠原的海綿、微原纖維明膠或微原纖維膠原。
3.根據(jù)權利要求2的裝置，其中所述的拭子是基于明膠的海綿。
4.根據(jù)權利要求2的裝置，其中所述的拭子是明膠海綿或膠原海綿，優(yōu)選明膠海綿。
5.根據(jù)權利要求1的裝置，其中所述的拭子是天然的或合成的吸收材料，其包含明膠顆?；蚰z原顆粒，優(yōu)選明膠顆粒。
6.根據(jù)前面權利要求中的任一項的裝置，其中所述的明膠或膠原是天然的或合成來源的，例如來自哺乳動物例如海洋哺乳動物、豬、牛或來自魚、小龍蝦或植物。
7.根據(jù)權利要求6的裝置，其中所述的明膠或膠原是豬來源的。
8.根據(jù)權利要求2的裝置，其中所述的基于明膠的或基于膠原的海綿具有不超過10秒、典型地不超過5秒的恢復時間，如通過實施例1的方法所測定的。
9.根據(jù)權利要求2的裝置，其中所述的基于明膠的海綿具有至少30g/g、典型地至少40g/g的吸水能力，如通過實施例3的方法所測定的。
10.根據(jù)權利要求2的裝置，其中所述的基于明膠的海綿含有至少50％的明膠，例如至少60％、例如至少70％、典型地至少75％的明膠，優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％的明膠，例如至少90％明膠，合適地至少95％的明膠，最優(yōu)選地選自至少96％、97％、98％、99％的明膠，基于海綿的干重。
11.根據(jù)權利要求2的裝置，其中所述的基于明膠的海綿、基于膠原的海綿、微原纖維明膠和微原纖維膠原具有平均孔徑約10nm至約2mm的孔。
12.根據(jù)權利要求5的裝置，其中所述的顆粒具有下述范圍的粒徑約1μm至約1mm，典型地約5μm至約0.5mm，更典型地約5μm至約0.25mm，優(yōu)選地約10μm至約0.25mm，例如約10μm至約0.1mm。
13.根據(jù)權利要求5的裝置，其中所述的拭子具有含量為1-95％重量/重量的明膠顆?；蚰z原顆粒、優(yōu)選明膠顆粒，基于拭子和顆粒的總干重，例如2-90％、典型地5-90％。
14.根據(jù)權利要求1的裝置，其中所述的拭子的大小范圍為約1cm×1cm至約15cm×15cm。
15.試劑盒，其包含i)含有明膠或膠原的拭子；和ii)試劑，其選自中性稀釋劑、抗微生物劑和分散劑。
16.根據(jù)權利要求15的試劑盒，其中所述的中性稀釋劑選自鹽水、鹽水胨、緩沖的鹽水胨、林格氏溶液和有機的或無機的緩沖劑。
17.根據(jù)權利要求15的試劑盒，其還含有固定于拭子的支持物。
18.根據(jù)權利要求15的試劑盒，其中所述的拭子選自基于明膠的海綿、基于膠原的海綿、微原纖維明膠或微原纖維膠原。
19.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述的拭子是基于明膠的海綿。
20.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述的拭子是明膠海綿或膠原海綿，優(yōu)選明膠海綿。
21.根據(jù)權利要求15的試劑盒，其中所述的拭子是天然的或合成的吸收材料，其包含明膠顆粒或膠原顆粒，優(yōu)選明膠顆粒。
22.根據(jù)權利要求15至21中的任一項的試劑盒，其中所述的明膠或膠原是天然的或合成來源的，例如來自哺乳動物例如海洋哺乳動物、豬、?；騺碜贼~、小龍蝦或植物。
23.根據(jù)權利要求22的試劑盒，其中所述的明膠或膠原是豬來源的。
24.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述的基于明膠的或基于膠原的海綿具有不超過10秒、典型地不超過5秒的恢復時間，如通過實施例1的方法所測定的。
25.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述的基于明膠的海綿具有至少30g/g、典型地至少40g/g的吸水能力，如通過實施例3的方法所測定的。
26.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述的基于明膠的海綿含有至少50％的明膠，例如至少60％、例如至少70％、典型地至少75％的明膠，優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％的明膠，例如至少90％明膠，合適地至少95％的明膠，最優(yōu)選地選自至少96％、97％、98％、99％的明膠，基于海綿的干重。
27.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述的基于明膠的海綿、基于膠原的海綿、微原纖維明膠和微原纖維膠原具有平均孔徑約10nm至約2mm的孔。
28.根據(jù)權利要求21的試劑盒，其中所述的顆粒具有下述范圍的粒徑約1μm至約1mm，典型地約5μm至約0.5mm，更典型地約5μm至約0.25mm，優(yōu)選地約10μm至約0.25mm，例如約10μm至約0.1mm。
29.根據(jù)權利要求21的試劑盒，其中所述的拭子具有含量為1-95％重量/重量的明膠顆粒或膠原顆粒、優(yōu)選明膠顆粒，基于拭子和顆粒的總干重，例如2-90％、典型地5-90％。
30.如權利要求1-14中的任一項定義的裝置在從采集介質(zhì)采集目標物中的應用，其包括使拭子和目標物接觸。
31.如權利要求15-29中的任一項定義的試劑盒在從采集介質(zhì)采集目標物中的應用，其包括使拭子和目標物接觸。
32.根據(jù)權利要求30至31中的任一項所述的應用，其中所述的采集是從選自下述的采集介質(zhì)固體或半固體表面，液體，氣體和其組合。
33.根據(jù)權利要求30至31中的任一項所述的應用，其中所述的目標物選自病毒、微生物、哺乳動物細胞和有機分子。
34.根據(jù)權利要求30至31中的任一項所述的應用，其中所述的有機分子選自核苷酸、核酸、蛋白或去污劑。
35.根據(jù)權利要求30至31中的任一項所述的應用，其中所述的核苷酸是含有嘌呤或嘧啶的核苷酸，優(yōu)選ATP。
36.根據(jù)權利要求30至31中的任一項所述的應用，其中所述的微生物選自細菌、古細菌、細菌芽孢、酵母和真菌。
37.根據(jù)權利要求30至36中的任一項所述的應用，還包括將目標物從拭子轉(zhuǎn)移至第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)的步驟。
38.根據(jù)權利要求37的應用，其中所述的轉(zhuǎn)移包括對明膠或膠原的消化。
39.根據(jù)權利要求37的應用，其中所述的轉(zhuǎn)移包括將目標物從明膠或膠原機械轉(zhuǎn)移到第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)。
40.根據(jù)權利要求37的應用，其中所述的轉(zhuǎn)移包括從明膠或膠原洗脫目標物。
41.根據(jù)權利要求38的應用，其中所述的消化包括使用選自下述的試劑酶、無機酸、羧酸、堿和其組合。
42.根據(jù)權利要求41的應用，其中所述的酶是蛋白酶，例如alcalase或胃蛋白酶。
43.根據(jù)權利要求37-42中的任一項所述的應用，還包括通過膜過濾提取目標物的步驟。
44.降低目標物在樣品區(qū)域中的量的方法，其包括使包含明膠或膠原的拭子和至少一部分所述的樣品區(qū)域接觸，達到使得目標物粘附到拭子上的程度。
45.根據(jù)權利要求44的方法，其中所述的采集介質(zhì)選自固體或半固體表面、液體、氣體和其組合。
46.根據(jù)權利要求44的方法，其中所述的目標物選自病毒、微生物、哺乳動物細胞和有機分子。
47.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述的分子目標物是核苷酸、核酸、蛋白或去污劑。
48.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述的核苷酸是含有嘌呤或嘧啶的核苷酸，優(yōu)選ATP。
49.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述的微生物選自細菌、古細菌、細菌芽孢、酵母和真菌。
50.根據(jù)權利要求44至49中的任一項的方法，還包括將目標物從海綿轉(zhuǎn)移至第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)的步驟。
51.根據(jù)權利要求50的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移包括對明膠或膠原的消化。
52.根據(jù)權利要求50的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移包括將目標物從明膠或膠原機械轉(zhuǎn)移到第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)。
53.根據(jù)權利要求50的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移包括從明膠或膠原洗脫目標物。
54.根據(jù)權利要求44的方法，其中所述的拭子如權利要求1至14中的任一項所定義。
55.根據(jù)權利要求44至54中的任一項的方法，還包括使用選自下述的試劑中性稀釋劑、抗微生物劑、消毒劑和分散劑。
56.根據(jù)權利要求55的方法，其中所述的抗微生物劑或消毒劑是乙醇。
57.定性地或定量地對區(qū)域取樣檢測目標物含量的方法，其包括基于明膠的海綿的使用和下述步驟i)使用如權利要求1-14中的任一項所定義的拭子濕取樣；和/或ii)使用如權利要求1-14中的任一項所定義的拭子干取樣。
58.根據(jù)權利要求57的方法，其中所述的區(qū)域選自固體或半固體表面、液體、氣體和其組合。
59.根據(jù)權利要求57的方法，其中所述的目標物選自選自病毒、微生物、哺乳動物細胞和有機分子。
60.根據(jù)權利要求59的方法，其中所述的分子目標物是核苷酸、核酸、蛋白或去污劑。
61.根據(jù)權利要求60的方法，其中所述的核苷酸是含有嘌呤或嘧啶的核苷酸，優(yōu)選ATP。
62.根據(jù)權利要求59的方法，其中所述的微生物選自細菌、古細菌、細菌芽孢、酵母和真菌。
63.根據(jù)權利要求57至62中的任一項的方法，還包括將目標物從海綿轉(zhuǎn)移至第一轉(zhuǎn)移介質(zhì)的步驟。
64.根據(jù)權利要求63的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移包括對明膠或膠原的消化。
65.根據(jù)權利要求63的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移包括將目標物從明膠或膠原機械轉(zhuǎn)移到第二轉(zhuǎn)移介質(zhì)。
66.根據(jù)權利要求63的方法，其中所述的轉(zhuǎn)移包括從明膠或膠原洗脫目標物。
67.根據(jù)權利要求57的方法，其中所述的拭子如權利要求1至14中的任一項所定義。
68.培養(yǎng)微生物或哺乳動物細胞的方法，其包括使細胞粘附到基于明膠的海綿上，并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
69.根據(jù)權利要求68的方法，其中將所述的生長培養(yǎng)基添加到基于明膠的海綿。
70.根據(jù)權利要求68的方法，其中所述的基于明膠的海綿在液體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
71.根據(jù)權利要求68的方法，還包括消化基于明膠的海綿的步驟。
72.根據(jù)權利要求68的方法，其中所述的消化包括使用選自下述的試劑酶、無機酸、羧酸、堿和其組合。
73.根據(jù)權利要求72的方法，其中所述的酶是蛋白酶。
74.根據(jù)權利要求73的方法，其中所述的蛋白酶是alcalase或胃蛋白酶。
全文摘要
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有明膠或膠原的拭子對微生物具有顯著高的回收率。而且，可以從包含膠原或明膠的拭子充分回收樣品，例如微生物、芽孢、核苷酸和其它的生物學上或生物化學上相關的化合物。本發(fā)明因而提供了方法和拭子，其能從樣品中高水平地回收目標物，而且當從拭子向分析介質(zhì)中轉(zhuǎn)移時，能再次高水平地回收。
文檔編號A61B10/02GK1739017SQ200380108960
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權日2002年12月11日
發(fā)明者J·E·漢森, N·霍爾里克 申請人:弗羅桑公司