專利名稱：鉑聚集體及其制備方法
專利說明鉑聚集體及其制備方法 本發(fā)明要求美國臨時申請60/400,875，申請日為2002年8月2日的優(yōu)先權(quán)。
[2]很久以來，脂質(zhì)體和脂類絡(luò)合物就被認(rèn)為是可以提高很多生物活性劑和造影劑的治療和診斷效果的給藥系統(tǒng)。很多不同的抗生素和X-射線造影劑的試驗(yàn)顯示，通過將帶有脂質(zhì)體或脂類絡(luò)合物的生物活性劑和造影劑制成膠囊可以達(dá)到具有較高安全水平的更好治療效果或者更好對比效果。對作為生物活性劑的膠囊系統(tǒng)的脂質(zhì)體和脂類絡(luò)合物的研究表明，這些產(chǎn)品的成功發(fā)展和商業(yè)化需要可以大規(guī)模生產(chǎn)帶有合適特性的脂類囊的可重復(fù)方法。因此，人們已經(jīng)在尋求根據(jù)柔性脂類化合物需求條件來連續(xù)生產(chǎn)具有所需尺寸和濃度、粒度分布，和重要的截留性能的脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物的方法。當(dāng)考慮到目前藥物產(chǎn)品可接受的好的生產(chǎn)實(shí)踐的時候，這些方法應(yīng)該提供具有持續(xù)脂類比率的活性物質(zhì)。作為尋找的結(jié)果，以及由于帶有產(chǎn)品參數(shù)的脂質(zhì)體和脂類絡(luò)合物性質(zhì)的可變性，到目前為止已經(jīng)提出了很多不同的方法。
[3]傳統(tǒng)的脂質(zhì)體和脂類絡(luò)合物的制備方法包括以下很多步驟，將雙分子層形式的物質(zhì)(典型的磷脂，或者磷脂和如膽固醇的其他脂類的混合物)溶解在圓底燒瓶中的揮發(fā)性有機(jī)溶劑或者溶劑混合物中，然后在將要阻止析相作用的如溫度和壓力的條件下，進(jìn)行溶液的蒸發(fā)。通常將以沉淀在反應(yīng)器壁上的薄膜形式存在的去除溶劑的干燥脂類混合物與含有溶解的緩沖劑、鹽、調(diào)節(jié)劑和包埋的活性物質(zhì)的水介質(zhì)進(jìn)行水合。在水合步驟中形成脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物，致使將一部分水介質(zhì)封入到脂質(zhì)體中。通過攪拌、超聲波或者微液化、或者隨后通過一個或者多個如聚碳酸酯過濾器的過濾器擠塑，能夠在激發(fā)或者不激發(fā)溶液的情況下進(jìn)行水合。通過分離回收游離的、沒有封入的活性物質(zhì)，以及將產(chǎn)品過濾、殺菌、或者凍干，和包裝。
[4]總的來說，在這個傳統(tǒng)方法中，水合作用比任何步驟更多地影響形成的脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物的類型(尺寸、脂類的層數(shù)、包埋量)。當(dāng)干燥的脂膜保持稀薄時，典型地，水合作用和包埋工藝最有效率。這意味著脂類的數(shù)量越大，要求脂類沉積的表面積就越大。即使可以用玻璃珠和其他惰性不可溶的粒子來提高膜沉積的表面積，但是薄膜方法主要還是一種實(shí)驗(yàn)室方法。
[5]許多專利申請或?qū)＠岢銎渌苽渲|(zhì)體或者脂類絡(luò)合物的方法，包括將脂類的有機(jī)溶液注射到持續(xù)去除溶劑的水介質(zhì)中，噴物干燥、凍干、微乳化、微液化等的使用。這樣的專利包括，例如美國專利No.4,529,561和美國專利No.4,572,425。
[6]順鉑-順-二胺-二氯鉑(II)-是一種用于癌癥系統(tǒng)治療中比較有效的抗癌劑。這種化療藥物對試驗(yàn)動物和人體腫瘤的腫瘤模型的治療非常有效，如子宮內(nèi)膜、膀胱、卵巢和睪丸瘤，以及頭和頸鱗片狀細(xì)胞瘤(Sur等人，1983 Oncology 40(5)372-376；Steerenberg等人，1988Cancer Chemother Pharmacol.21(4)299-307)。順鉑還廣泛地用于包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的肺癌治療中(Schiller等人，2001Oncology 61(Suppl1)3-13)。其他的活性鉑化合物(如下定義)也用于癌癥的治療中。
[7]像其他癌癥化療劑一樣，典型地，如順鉑的活性鉑化合物具有劇毒。順鉑的主要不足是作為一個主要的劑量限制因素的極端腎毒性，由于只有幾分鐘的半衰期而通過腎臟的快速排泄，以及對血漿蛋白的較強(qiáng)親和力(Freise等人，1982 Arch Int Pharmacodyn Ther.258(2)180-192)。
[8]減少活性鉑化合物毒性的試驗(yàn)，包括聯(lián)合化療、合成類似物(Prestayko等人，1979 Cancer Treat Rev.6(1)17-39；Weiss等人，1993Drugs.46(3)360-377)，免疫療法和脂質(zhì)體包埋(Sur等人，1983；Sweiss等人，1993)。相對于游離形式的劑型，包括在脂質(zhì)體內(nèi)包埋的順鉑的抗腫瘤劑，在保持抗腫瘤活性的同時，具有較低毒性(Steerenberg等人，1987；Sweiss等人，1993)。
[9]但是，由于生物活性劑的水溶解度低，室溫下大約1.0mg/ml，以及低親油性，導(dǎo)致生物活性劑/脂類的比率低，所以難以在脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物中有效地包埋順鉑。
[10]包含順鉑的脂質(zhì)體和脂類絡(luò)合物還存在另外一個問題-化合物的穩(wěn)定性。特別地，在儲存過程中的脂質(zhì)體中生物活性劑效力的持久性和生物活性劑的保持力為公認(rèn)問題(Freise等人，1982；Gondal等人，1993；Potkul等人，1991 Am J Obstet Gynecol.164(2)652-658；Steerenberg等人，1988；Sweiss等人，1993)，另外有報道稱包含順鉑的脂質(zhì)體的保存期有限，在4℃下為幾個星期(Gondal等人，1993 Eur JCancer.29A(11)1536-1542；Potkul等人，1991)。
發(fā)明概述 [11]本發(fā)明描述的是一種新型的由脂類包埋的鉑及其制備方法。尤為特別地，本發(fā)明描述的是一種具有高活性鉑化合物與脂類比率的新型脂類絡(luò)合活性鉑。本發(fā)明描述的方法是形成這種新型活性鉑化合物聚集體的新方法。
[12]除了其他以外，本發(fā)明提供一種包括脂質(zhì)體或脂類絡(luò)合物和活性鉑化合物的組合物，所述脂質(zhì)體包含一種或者多種脂類，其中活性鉑化合物與脂類的重量比率為1∶50-1∶2，或者1∶50-1∶5，或者1∶50-1∶10?；钚糟K化合物與脂類的重量比率可以為，例如1∶25-1∶15。一種或者多種脂類可以包括，例如50-100mol％DPPC和0-50mol％膽固醇。一種或者多種脂類可以包括，例如50-65mol％DPPC和35-50mol％膽固醇。
[13]同時本發(fā)明還提供一種鉑聚集體的制備方法，包括以下步驟(a)使活性鉑化合物與疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)結(jié)合；(b)在第一溫度下形成混合物；和(c)隨后在低于第一溫度的第二溫度下形成混合物；其中步驟(b)和(c)對提高活性鉑化合物的封裝是有效的。典型地，通過加熱來實(shí)現(xiàn)步驟(b)，而典型地，通過冷卻來實(shí)現(xiàn)步驟(c)。在作為選擇的實(shí)施例中，循環(huán)從冷卻步驟開始，轉(zhuǎn)換到加熱步驟，重復(fù)這樣兩個步驟。所述方法包括繼續(xù)使步驟(b)和(c)重復(fù)二或三或者更多個循環(huán)?？梢酝ㄟ^將活性鉑化合物溶解在鹽溶液中形成鉑溶液來制備活性鉑化合物溶液。疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)最好包括脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物-型的脂類。在所有的步驟(b)和(c)完成以后，鉑聚集體的制備方法可以進(jìn)一步包括(d)通過穿過具有分子重量定點(diǎn)選擇能力的膜來進(jìn)行過濾，去除未包封的活性鉑化合物，保留需要的脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物，并且將脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物相容的液體加入到洗凈的未包埋的活性鉑化合物中。
[14]本發(fā)明進(jìn)一步提供了按照本發(fā)明方法制備的聚集體和本發(fā)明組合物的藥劑配方。所述配方包括藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑或者適于對病人進(jìn)行吸入或注射的傳輸。



[15]圖1顯示出根據(jù)本發(fā)明的1升批次的脂類絡(luò)合順鉑的穩(wěn)定性。


發(fā)明內(nèi)容
[16]本發(fā)明包括一種新型的脂類絡(luò)合的活性鉑化合物，其生物活性劑與脂類比率非常高，例如現(xiàn)有活性鉑化合物順鉑未曾有過的。本發(fā)明中生物活性劑與脂類的重量比率是在1∶5到1∶50之間。更優(yōu)選地，生物活性劑與脂類的重量比率是在1∶10到1∶30之間。最優(yōu)選地，生物活性劑與脂類的重量比率是在1∶15到1∶25之間。
[17]活性鉑化合物的制備方法包括將活性鉑化合物與適當(dāng)?shù)氖杷|(zhì)混合以及使混合物在兩種單獨(dú)的溫度下進(jìn)行一個或者多個循環(huán)?？梢酝ㄟ^這個方法形成活性鉑化合物聚集體。
[18]在水溶液中，順鉑形成晶體直徑超過幾微米的大晶體聚集體。在兩親基質(zhì)系統(tǒng)，比如脂雙層的存在下，小順鉑聚集體形成。例如，可以在脂雙層的碳?xì)浠衔锖诵膮^(qū)域形成聚集體。在本方法的加熱循環(huán)過程中，可認(rèn)為順鉑在混合物的水合區(qū)域以比雙層中更快的速度返回溶液。作為采用一個以上的冷卻/加熱循環(huán)的結(jié)果，順鉑進(jìn)一步在雙層中得到積累。未將本發(fā)明限制于提出的理論中，試驗(yàn)顯示順鉑聚集體導(dǎo)致界面雙層區(qū)域的直接圍繞物更為疏水和緊湊。這在冷卻和生物循環(huán)重復(fù)時，引起活性鉑化合物的高水平包埋。
[19]本發(fā)明的配方具有顯著的高包埋率。在某些情況下，包埋率幾乎可以達(dá)到92％。這個數(shù)據(jù)比傳統(tǒng)水合包埋達(dá)到的最有效的包埋率要高很多，其大約是2-10％。本發(fā)明的這個功效在實(shí)施例3中有所說明。
[20]本發(fā)明的制備方法包括將活性鉑與合適的疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)結(jié)合以及使溶液在較低溫度和較高溫度下循環(huán)。優(yōu)選地，循環(huán)進(jìn)行一次以上。更優(yōu)選地，循環(huán)進(jìn)行兩次或更多次，或者三次或更多次。循環(huán)的低溫部分可以采用零下25攝氏度到25攝氏度。更優(yōu)選地，這個步驟采用零下5到5攝氏度或者在1和5攝氏度之間。為了便于生產(chǎn)以及達(dá)到所期望的溫度，冷卻和加熱步驟可以保持一段時間，比如大約5-300分鐘或者30-60分鐘。加熱步驟包括將反應(yīng)器加熱到4攝氏度至70攝氏度。更優(yōu)選地，加熱步驟包括將反應(yīng)器加熱到45攝氏度至55攝氏度。上述溫度范圍特別適合于主要包括二棕櫚酸磷脂酰膽堿(DPPC)和膽固醇的脂類混合物。
[21]另外一種確認(rèn)溫度循環(huán)的方法是依據(jù)循環(huán)中加熱和冷卻步驟之間的溫度差。這種溫度差可以為，例如25攝氏度或者更多，比如25到70攝氏度的差量，優(yōu)選的差量是40到55攝氏度。以提高活性鉑化合物的包埋為基礎(chǔ)來選擇加熱和冷卻步驟的溫度。不受理論的限制，可以相信選擇能夠?qū)嵸|(zhì)上有效提高處理混合物中活性鉑化合物溶解度的較高溫度是有用的。優(yōu)選地，加熱步驟的溫度為50攝氏度或者更高。也可以選擇低于或者高于脂類混合物中脂類轉(zhuǎn)變溫度的溫度。
[22]如常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌驔Q定的，在某些情況下，方法中采用的合適溫度可以隨方法中采用的脂類混合物而變化。
[23]合成的活性鉑絡(luò)合物具有高或很高的藥與脂類比率。配方可以適用于吸入或者注射。
[24]為了公開目的，采用下列技術(shù)術(shù)語 [25]“溶液輸灌”是包括在少量、優(yōu)選微量的工藝相容溶劑中溶解一種或者多種脂類來形成脂類懸浮液或者溶液(優(yōu)選溶液)，然后將溶液注射到包含生物活性劑的水介質(zhì)中的方法。典型地，能夠在含水工藝，例如透析中洗凈工藝相容溶劑。優(yōu)選地，通過溶液輸灌，優(yōu)選為乙醇輸灌來形成循環(huán)冷卻/加熱的混合物。酒精為優(yōu)選溶劑。“乙醇輸灌”，一種溶液輸灌類型，是包括在少量、優(yōu)選微量的乙醇中溶解一種或者多種脂類來形成脂類溶液，然后將溶液注射到包含生物活性劑的水介質(zhì)中的方法?！吧倭俊比芤菏窃谳敼噙^程中與形成脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物相容的數(shù)量。
[26]“疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)”是由上述溶液輸灌方法生產(chǎn)的脂類/溶液混合物。
[27]用于本發(fā)明的脂類可以是合成的、半合成的或者天然存在的脂類，包括磷脂、維生素E、固醇、脂肪酸、醣脂、陰離子脂、陽離子脂。所述磷脂能夠包括卵磷脂(EPC)、磷脂酰甘油(EPG)、磷脂酰肌醇(EPI)、磷脂酰絲氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)和磷脂酸(EPA)；大豆相應(yīng)物，大豆卵磷脂(SPC)；SPG、SPS、SPI、SPE和SPA；氫化的卵和大豆相應(yīng)物(例如HEPC、HSPC)，硬脂酸(stearically)修正的卵磷脂乙醇胺，膽固醇衍生物，類胡羅卜素，其他通過酯鍵結(jié)構(gòu)成的卵磷脂，該酯由在2和3位上含有12-26個碳原子鏈的甘油和在1位上含有不同個包括膽堿、甘油、肌糖、絲氨酸、乙醇胺的主要基團(tuán)的甘油組成，以及相應(yīng)的卵磷脂酸。這些脂肪酸鏈可以是飽和或者不飽和的，磷脂可以由不同長度和飽和度的脂肪酸構(gòu)成。特別地，配方的組合物可以包括DPPC，自然存在的肺表面活性劑的主要成分。其他的例子包括肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和二棕櫚酸磷脂酰膽堿(DPPC)和二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)和二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和混合磷脂，如棕櫚酰硬脂酰磷脂酰-膽堿(PSPC)和棕櫚酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)，三酰甘油，seranide、二酰甘油，鞘氨醇，鞘磷脂和如單-油酰-磷脂乙醇胺(MOPE)的單酰磷脂。
[28]“生物活性劑”是對細(xì)胞、病毒、組織、器官或者有機(jī)體作用，使細(xì)胞、病毒、組織、器官或者有機(jī)體的功能產(chǎn)生變化的物質(zhì)。本發(fā)明中使用的生物活性劑是活性鉑，例如順鉑。
[29]“活性鉑”化合物是含有配位鉑，同時具有抗腫瘤性質(zhì)的化合物。額外的活性鉑化合物包括，例如卡鉑和如奧沙利鉑的DACH-鉑化合物。
[30]試驗(yàn)結(jié)果明顯地顯示出在脂質(zhì)體囊形成過程中主要通過包埋順鉑來實(shí)現(xiàn)封裝。結(jié)果進(jìn)一步顯示出，由于順鉑濃度比溶解極限高很多，所以順鉑的物理狀態(tài)為固態(tài)(聚集體)或者脂質(zhì)結(jié)合。結(jié)果進(jìn)一步顯示出過程中不需要冷凍混合物，但是冷卻到比冷凍溫度高的溫度可以產(chǎn)生更好的效果。結(jié)果進(jìn)一步顯示出3個冷卻和加熱循環(huán)的包埋效果和6個循環(huán)的包埋效果類似，其說明3個循環(huán)的溫度處理足以實(shí)現(xiàn)優(yōu)選級別的包埋。
[31]結(jié)果進(jìn)一步顯示了在增加包埋順鉑效率的同時，可以擴(kuò)大這個過程的規(guī)模。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供用來供應(yīng)適于整個給藥為200mLS或更多、或者800mLS或更多(適當(dāng)?shù)纳倭吭黾?的方法。所有其他的都相同，可以相信生產(chǎn)較大體積通常比小規(guī)模易達(dá)到增加的效果。如果這樣的體積適于給藥時，能夠減少體積來使其適于存儲。
[32]結(jié)果進(jìn)一步顯示了，由于最小限度的泄漏，通過本發(fā)明方法制備的脂類絡(luò)合順鉑能夠保持包埋在一年以上。配方的獨(dú)特性的進(jìn)一步證實(shí)顯示出順鉑被限制在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中并且不易泄漏。
實(shí)施例 實(shí)施例1 [33]將70mg DPPC和28mg膽固醇溶解在1ml乙醇中，并且加入到10ml的，溶解在0.9％的鹽溶液的4mg/ml順鉑中。
[34](i)使等分部分(50％)的樣品經(jīng)過冷卻到4℃和加熱到50℃的三個循環(huán)。試管中的等分部分通過冰箱冷卻和通過水浴進(jìn)行加熱。通過透析沖洗得到的未包埋的順鉑(游離順鉑)。
[35](ii)不經(jīng)過溫度循環(huán)處理，而是直接通過透析沖洗樣品的剩余部分。
表1經(jīng)過和未經(jīng)過冷卻和加熱循環(huán)處理順鉑的包埋率順鉑的最終濃度，μg/ml％包封率沒有經(jīng)過冷卻和加熱循環(huán)處理的脂類561.4絡(luò)合順鉑冷卻和加熱循環(huán)之后的脂類絡(luò)合順鉑3609.0 實(shí)施例2 [36]通過嵌入雙層中疏水核心區(qū)域的二苯基己三烯的熒光各向異性測定脂類絡(luò)合順鉑(“HLL”順鉑或者“高負(fù)荷脂質(zhì)體”順鉑)的雙層膜硬度，該脂類絡(luò)合順鉑如實(shí)施例1中所述由冷卻/加熱循環(huán)過程制備得到。[參見Jahnig，F(xiàn).，1979 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(12)6361.]通過氘同位素對TMA-DPH(三甲基氨-二苯基己三烯)熒光強(qiáng)度的交換效應(yīng)測量雙層的水合作用。[參見Ho，C.，Slater，S.J.，and Stubbs，C.D.，1995 Biochemistry 346188.] 表2脂質(zhì)體、未經(jīng)過冷卻/加熱循環(huán)過程的脂類絡(luò)合順鉑和HLL順鉑的水合程度和硬度。對照劑(沒有順鉑的脂質(zhì)體)未經(jīng)過冷卻/加熱循環(huán)過程的脂類絡(luò)合順鉑 HLL 順鉑 雙層的硬度0290.29 0.36 雙層的水合程 度1.131.15 1.02 實(shí)施例3 [37]將1.0g DPPC和0.4mg膽固醇溶解在6ml乙醇中。將60mg順鉑在65℃下溶解于10ml 0.9％的鹽溶中。在10ml得到的順鉑溶液中加入1ml得到的脂類混合物。將脂類/順鉑懸浮液冷卻到大約4℃并且在該溫度下保持20分鐘，加熱到50℃并保持20分鐘。在加熱過程中通過將N2鼓入到懸浮液中來除去乙醇。將冷卻和加熱步驟再重復(fù)5次。
表3順鉑包埋率總順鉑的濃度(mg/ml)％順鉑包埋率 藥∶脂類(重量) HLL順鉑5.891.6 1∶26 實(shí)施例4 [38]使用卵磷脂(PC)和膽固醇(以摩爾比57∶43)來制備順鉑配方。將0.55毫摩爾卵磷脂(PC)和0.41毫摩爾膽固醇溶解在2ml乙醇中，并且加入到20ml的4mg/ml順鉑溶液中。每個樣品的等分部分(50％)經(jīng)過3個冷卻和加熱循環(huán)，并且通過透析洗凈。每個樣品的另一等分部分直接通過透析洗凈。利用最終濃度和初始濃度的比率計算包埋率。
表4帶有不同卵磷脂的順鉑包埋率以及藥與脂類的比率PC 未冷卻和加熱 冷卻和加熱 最終 [順鉑] (mg/ml) ％ 包埋 藥∶脂類 (重量) 最終 [順鉑] (mg/ml) ％ 包埋 藥∶脂類 (重量)DOPC0.16 4.0 1∶1420.215.31∶108EggPC0.09 2.3 1∶2470.123.01∶185DMPC0.15 3.8 1∶1230.246.01∶77DPPC0.17 4.3 1∶1150.8521.31∶23HSPC0.11 2.8 1∶2020.235.81∶97DSPC0.10 2.5 1∶1840.5814.51∶32 實(shí)施例5 [39]將脂類配方(DPPC∶膽固醇為5∶2，w/w)溶解在乙醇中，并且加入到順鉑溶液?；旌衔锏囊徊糠纸?jīng)過冷卻到4攝氏度、和加熱到55攝氏度的循環(huán)處理，另一部分未經(jīng)過循環(huán)處理。然后經(jīng)過透析洗凈脂類/順鉑懸浮液。
表5經(jīng)過和未經(jīng)過冷卻和加熱循環(huán)處理的順鉑濃度順鉑溶液的起 始濃度 脂類濃度 冷卻和加熱循環(huán)順鉑的總濃度 0.2mg/ml 1.4mg/ml否未檢測到 0.2mg/ml 1.4mg/ml是未檢測到 4.0mg/ml 28mg/ml否0.22mg/ml 4.0mg/ml 28mg/ml是 0.46mg/ml 實(shí)施例6 對本發(fā)明中包埋的順鉑囊體積的測定 [40]本實(shí)施例的目的是通過測定脂質(zhì)體中包埋的順鉑濃度來測定脂質(zhì)體包埋的順鉑(HLL順鉑)性質(zhì)。
V總＝V脂質(zhì)體+V外部 [V脂質(zhì)體的測量] 在450nm的吸收 重鉻酸鹽V外部V脂質(zhì)體HLL順鉑0.874 0.67mg/ml1.88ml0.12ml單純的鹽0.822 0.60mg/ml2mll0ml [41]方法1)通過離心過濾裝置濃縮2ml根據(jù)實(shí)施例4所述制備的HLL順鉑。2)獲得0.8ml的濃縮樣品，并且在獲得的原始體積中加入1.2ml的1mg/ml重鉻酸鹽。還要制備0.8ml普通鹽+1.2ml的重鉻酸鹽來作為對比物。3)通過測量在450nm時的吸收來檢測在重鉻酸鹽中的不同。為了避免脂質(zhì)體樣品的渾濁，兩種樣品都通過離心過濾器過濾。
[42]結(jié)果脂質(zhì)體占總體積的6％。
V脂質(zhì)體＝1.53μL/μmol脂質(zhì)體(總脂類39.3mM) 下一步，V脂質(zhì)體＝V截留+V雙層 測量HLL順鉑囊的薄片來檢測V雙層。
[HLL順鉑囊薄片的測量]F總F內(nèi)部％位于小葉最外層的探針脂類*熒光強(qiáng)度141931134920 ％位于小葉最外層的探針脂類＝(F總-F內(nèi)部)×100÷F總 [43]方法在按照實(shí)施例9的方法(1升批次)制備的順鉑囊中加入0.5重量％的熒光探針脂類(NBD-PE)。這種探針脂類均勻分布在膜的里部和外部。通過存在于HLL順鉑中的脂質(zhì)體層的多少來測定位于膜最外層(脂質(zhì)體的表面)的探針與余下探針的數(shù)量比率。通過加入還原劑連二亞硫酸鹽以僅僅熄滅表面探針來測定位于脂質(zhì)體外部和脂質(zhì)體內(nèi)部的探針比率。然后，通過清潔劑使脂質(zhì)體斷裂來達(dá)到完全熄滅。
結(jié)果最外層的雙層外殼占總脂質(zhì)體的40％。
[44]根據(jù)幾何學(xué)的計算，位于最外面雙層外殼的雙薄片和三薄片的％脂類分別是52％和36％。因此，可以推斷出HLL順鉑的平均薄片數(shù)為三。
[45]假設(shè)為三薄片囊，計算出V脂質(zhì)體/V截留的比率是1.2635。因此，截留體積為 V截留＝V脂質(zhì)體÷1.2635＝1.53μL/μmol脂類÷1.2635＝1.21μL/μmol脂類＝1.21μL/μmol脂類×39.3mM(總脂類濃度)＝47.6μL/M] [46]每毫升HLL順鉑的截留體積是47.6μL，占總體積的4.76％。如果假定包埋順鉑存在于脂質(zhì)體的水區(qū)域中，預(yù)計其局部順鉑濃度為21.0mg/ml。這個濃度不僅比室溫下順鉑的溶解極限要高，而且重要地，比初始變化濃度(4mg/ml)要高得多。
實(shí)施例7冷卻溫度對HLL順鉑包埋效率的影響 [47]本實(shí)施例的目的是找到最適宜的冷卻溫度，使順鉑達(dá)到最高的包埋率，并且避免冷凍和解凍。得到的的數(shù)據(jù)有助于優(yōu)化生產(chǎn)工藝。后灌輸溫度處理 樣品實(shí)際溫度冷卻和加熱循環(huán) [順鉑] Mg/ml ％包埋率干冰浴(-70℃)凍結(jié)15分鐘冷卻和15分鐘升溫循環(huán)6次0.348.5制冷器(-20℃)0℃15分鐘冷卻和15分鐘升溫循環(huán)6次0.9824.5冰浴4℃15分鐘冷卻和15分鐘升溫0.6315.8 (1℃)循環(huán)6次 [48]通過乙醇灌輸制備20mg/ml的DPPC，8mg/ml的膽固醇和4mg/ml的順鉑懸浮液。將樣品分為三等份，在三個不同的冷卻溫度下經(jīng)過6次冷卻和加熱循環(huán)處理。在溫度循環(huán)的一個處理之后，透析樣品來除去游離的順鉑。
實(shí)施例8 溫度循環(huán)次數(shù)對包埋效率的影響 [49]為了使順鉑達(dá)到最好的包埋效率，本實(shí)施例測定最適宜的溫度循環(huán)次數(shù)。這將有助于確定必要的工藝，以實(shí)現(xiàn)順鉑最佳包埋效率。
溫度 循環(huán) 次數(shù)低脂類(7.5mg/ml DPPC &3mg/ml膽固醇)高脂類(12.5mg/ml DPPC &5mg/ml膽固醇) [順鉑]％包封 [順鉑]％包封 0個循環(huán) 0.05mg/ml1.3 0.21mg/ml5.3 1個循環(huán) 0.11mg/ml2.8 0.23mg/ml5.8 3個循環(huán) 0.39mg/ml9.8 0.88mg/ml22 [50]按照前面的實(shí)施例制備樣品。樣品冷卻溫度為0℃。通過15分鐘冷卻和15分鐘加熱來實(shí)現(xiàn)溫度循環(huán)。順鉑的起始濃度是4mg/ml，通過透析除去游離的順鉑。
實(shí)施例9 批量規(guī)模與工藝效率 [51]檢驗(yàn)包埋效率是否因批次大小而發(fā)生改變。按照實(shí)施例4制備20mL的批次。按照下述步驟制備1L批次 1.在65℃下，將四克順鉑溶解在1L 0.9％氯化鈉注射液中。
2.在65℃下，將20克DPPC和8克膽固醇溶解在120mL純乙醇中。
3.當(dāng)以300轉(zhuǎn)/分鐘(65℃)的速度混合順鉑溶液時，將脂類溶液以20mL/分鐘的流速加入(灌輸)到順鉑溶液中。
4.灌輸后，使用丙烯乙二醇/水浴將順鉑/脂類分散體冷卻到零下5℃到0℃，并保持45分鐘(冷卻)。
5.將分散體加熱到50℃，并保持15分鐘(加熱)。
6.按照步驟4和步驟5描述的冷卻/加熱循環(huán)過程再進(jìn)行兩次(總共3個循環(huán))。
7.通過膜滲濾沖洗分散體來除去游離的順鉑。滲透去除速率為17-22mL/分鐘。通過用新鮮無菌的0.9％氯化鈉溶液補(bǔ)充滲透劑來使分散體體積(1L)保持恒定。
[52]按照同一方法制備200mL的批次，但是只使用20％的組分。
[53]用初始成分的脂類/藥(重量/重量)比率除以最終產(chǎn)品中脂類/藥比率來定義工藝效率。批次#批次大小脂類/藥的 預(yù)形成脂類/藥的最 終產(chǎn)品 工藝效率C3-18FT-0420ml4.454.50.08C3-18FT-17200ml5.8527.30.21C3-18FT-19200ml5.8537.20.16C3-18FT-23200ml5.8536.90.16PC-1L-5081L5.8514.40.41CL-CISP-TN-011L7.019.20.36CL-CISP-TN-021L7.021.20.33 實(shí)施例10包埋脂質(zhì)體絡(luò)合順鉑的穩(wěn)定性 [54]在內(nèi)容物泄漏的時間內(nèi)對1L批次的HLL順鉑的穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)視。得到的數(shù)據(jù)見圖1。
[55]本說明書引述的包括但不限于專利和專利申請的出版物和參考資料，雖然只是引述了一個部分，但在此將其整體作為參考。本申請要求優(yōu)先權(quán)的任何專利申請按照對上述出版物和參考資料的態(tài)度在此一并參考。
[56]雖然本發(fā)明只著重描述了優(yōu)選的實(shí)施例，但是，可以使用變化的優(yōu)選設(shè)備和方法，以及可以試圖使用與這里描述的方法不同的方法進(jìn)行，這對于本領(lǐng)域一般人員而言是顯而易見的。因此，本發(fā)明包括在下述權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的所有修改。
權(quán)利要求
1.一種包括脂質(zhì)體或脂類絡(luò)合物和包埋的活性鉑化合物的組合物，所述脂質(zhì)體或脂類絡(luò)合物包括一種或多種脂類，其中活性鉑化合物與脂類的重量比率為1∶50到1∶2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中活性鉑化合物與脂類的重量比率為1∶50到1∶5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中活性鉑化合物與脂類的重量比率為1∶50到1∶10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中活性鉑化合物是順鉑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中活性鉑化合物與脂類的重量比率為1∶25到1∶15。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中活性鉑化合物是順鉑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，一種或多種脂類包括DPPC。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，一種或多種脂類包括膽固醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，一種或多種脂類包括50-100[90？]摩爾％DPPC和0-50摩爾％膽固醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，一種或多種脂類包括50-65摩爾％DPPC和35-50摩爾％膽固醇。
11.一種制備鉑聚集體的方法，包括以下步驟
(a)使活性鉑化合物與疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)結(jié)合；
(b)在第一溫度下形成混合物；和
(c)隨后在比第一溫度低的第二溫度下形成混合物；
其中步驟(b)和(c)對提高活性鉑化合物的封裝是有效的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括繼續(xù)使步驟(b)和(c)重復(fù)總共兩個或者更多個循環(huán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過將活性鉑化合物溶解在鹽溶液中形成鉑溶液來制備活性鉑化合物溶液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中活性鉑化合物是順鉑。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)包括脂質(zhì)體或者脂類復(fù)合型脂類。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中一種或多種脂類包括DPPC。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中一種或多種脂類還包括膽固醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過將一種或多種脂類溶解在乙醇中形成脂類溶液并且將所述脂類溶液注射到包含活性鉑化合物的水介質(zhì)中來制備疏水基質(zhì)負(fù)載系統(tǒng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括繼續(xù)使步驟(b)和(c)重復(fù)總共三個或者更多個循環(huán)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中步驟(c)包括在零下25攝氏度到25攝氏度的溫度下形成混合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中步驟(c)包括在零下5攝氏度到5攝氏度的溫度下形成混合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中步驟(b)包括在4攝氏度到75攝氏度的溫度下形成混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中步驟(b)包括在45攝氏度到55攝氏度的溫度下形成混合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)和(c)的溫度差為25攝氏度或者更多。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(b)的溫度是50攝氏度或者更高。
26.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的溫度是50攝氏度或者更高。
27.按照權(quán)利要求11所述方法制備的鉑聚集體。
28.按照權(quán)利要求14所述方法制備的鉑聚集體。
29.一種包括權(quán)利要求1所述的組合物和藥學(xué)上可以接受的載體或者稀釋劑的藥物配方。
30.一種包括權(quán)利要求1所述的組合物，適合于病人吸入的藥物配方。
31.一種包括權(quán)利要求1所述的組合物，適合于對病人注射的藥物配方。
32.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括在所有的步驟(b)和步驟(c)完成以后
(d)通過穿過具有分子量定點(diǎn)選擇能力的膜來進(jìn)行過濾，去除未包封的活性鉑化合物，保留需要的脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物，并且將脂質(zhì)體或者脂類絡(luò)合物相容的液體加入到洗凈的未包埋的活性鉑化合物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物及其制備方法，所述組合物包括脂質(zhì)體和活性鉑化合物，所述脂質(zhì)體包括一種或多種脂類，且具有高的活性鉑與脂類的比率。
文檔編號A61K9/127GK1681478SQ03821989
公開日2005年10月12日 申請日期2003年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月2日
發(fā)明者J·李, B·S·米勒, F·吳, L·T·伯尼 申請人:川塞夫有限公司