專利名稱：在化療期間保護內(nèi)皮和上皮細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用放射治療和/或化療的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及減輕與這種治療相關(guān)的副作用的方法。
現(xiàn)有技術(shù)的說明同種異基因干細胞移植(SCT)是一種公知方法，用于治療血液瘤和不斷增加的各種其它惡性疾病。SCT主要由兩個順序的步驟組成預(yù)移植處理，它經(jīng)典地由全身輻射(TBI))和化療組成，從而使得殘留疾病和受體免疫抑制最小化，以作為第一步，和同種異基因干細胞的轉(zhuǎn)移以作為第二步，這種同種異基因干細胞的轉(zhuǎn)移應(yīng)當(dāng)最后提供對病人的治愈。然而，由于在主要組織相容性抗原(MHC)和次要組織相容性抗原(mHAg)內(nèi)的差異，在移植后的不同階段中可能發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，其中包括急性移植物對抗宿主的疾病(GvHD)。基于本發(fā)明者1和數(shù)個其它研究者2，3的研究，廣泛被接受的是，預(yù)移植處理藉助于非特異性發(fā)炎助長了這些與移植有關(guān)的并發(fā)癥(TRC)。另外，特別是TBI的直接毒性已得到證明4，5。這已導(dǎo)致目前正在研究的各種可供替代的預(yù)移植處理方案。另外，新的預(yù)移植治療允許擴展治療方案和患者的選擇。這些新型預(yù)移植處理概念的一種化合物是氟達拉濱(fludarabine)，一種非骨髓消融(non-myleoablative)免疫抑制劑，它最初用于治療慢性淋巴白血病6。氟達拉濱與例如BCNU和美法侖、環(huán)磷酰胺或其它試劑的結(jié)合可替代TBI或與劑量降低的TBI方案一起使用7，8。迄今為止獲得的臨床數(shù)據(jù)支持氟達拉濱的低副作用以及造血和免疫細胞特異性9。然而，該化合物對非造血細胞如內(nèi)皮和上皮細胞的影響還尚未進行研究。
事實上所有TRC與內(nèi)皮功能障礙和損壞有關(guān)10。本發(fā)明者和其它人已證明，內(nèi)皮是在體內(nèi)和體外進行預(yù)移植處理的目標。電離輻射誘發(fā)內(nèi)皮細胞內(nèi)的程序性細胞死亡(apoptosis)11-14。與此同時，內(nèi)皮以粘附分子表達的方式被激活，從而導(dǎo)致了作為炎癥反應(yīng)的先決條件的增加的白細胞-內(nèi)皮細胞相互作用15，16。通過細菌的內(nèi)毒素(脂質(zhì)多糖，LPS)顯著加強了這些效果，所述細菌的內(nèi)毒素可通過破損的粘膜阻擋層從胃腸道易位17。另外，已表明LPS增加了內(nèi)皮細胞對同種異基因CD8+細胞毒性T淋巴細胞的抗原性18。
迄今為止獲得的含有氟達拉濱的降低強度的處理(RIC)方案的臨床結(jié)果表明，對預(yù)移植處理相關(guān)的毒性具有明顯向下調(diào)節(jié)作用，而沒有影響免疫重建25。接受RTC的患者中，急性GvHD的發(fā)病率與接受經(jīng)典處理方案的那些患者相當(dāng)或甚至要小26。然而，關(guān)于同樣嚴重或甚至加劇的后期效果如骨壞死27、肺部并發(fā)癥28和更多慢性GvHD29病例的報道，清楚地證明與氟達拉濱治療相關(guān)的嚴重副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)氟達拉濱激活并破壞內(nèi)皮和上皮細胞。這些細胞的激活導(dǎo)致其中使用氟達拉濱的治療環(huán)境的破壞，例如當(dāng)使用SCT治療惡性腫瘤時。可以通過采用去纖苷酸(defibrotide)治療，來保護內(nèi)皮和上皮細胞免除這種激活和破壞。這種治療可以是伴隨的，或者在用氟達拉濱治療之前或之后給予去纖苷酸。
縮寫和定義SCT造血干細胞移植免疫抑制劑一旦給藥，將向下調(diào)節(jié)受試驗者免疫應(yīng)答的物質(zhì)。免疫抑制劑用于對接受干細胞治療的患者的免疫系統(tǒng)進行抑制。免疫抑制劑的例子包括氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、BCNU、環(huán)胞霉素(cyclosporin)、雷帕霉素(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)和美法侖。在本申請的上下文內(nèi)優(yōu)選氟達拉濱(也稱為2-氟-9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤)。
保護性寡聚脫氧核糖核苷酸(protective oligodeoxyribonucleotide)在本申請的上下文中，應(yīng)當(dāng)指在美國專利5,646,268中所定義的寡聚脫氧核糖核苷酸和美國專利5,223,609中所定義的多脫氧核糖核苷酸這二者，在此通過參考將其全文引入。
美國專利5,646,268公開了一種生產(chǎn)具有下述物理化學(xué)和化學(xué)特征的寡聚脫氧核糖核苷酸的方法
分子量 4000-10000h ＜10A+T/C+G*1.100-1.455A+G/C+T*0.800-1.160比旋度 +30°-+48°*基本摩爾比h＝增色參數(shù)生產(chǎn)這種寡聚脫氧核糖核苷酸的方法包括通過添加選自由乙醇、丙醇和異丙醇組成的一組物質(zhì)中的一種烷基醇，在20℃下，沉淀0.8M多脫氧核糖核苷酸鈉鹽的醋酸鈉水溶液。
美國專利5,223,609公開了一種去纖苷酸，若形成它的核苷酸部分與以下的無規(guī)序列的多脫氧核糖核苷酸分子式在化學(xué)計量上一致的話，則它滿足某些藥物和治療性能，因此是特別合適的P1-5，(dAP)12-24，(dGp)10-20，(dTp)13-26，(dCp)10-20其中P＝磷基dAP＝脫氧腺苷酸單體(deoxyadenylic monomer)dGp＝脫氧鳥苷酸單體(deoxyguanylic monomer)dTp＝脫氧胸苷酸單體(deoxythymidylic monomer)dCp＝脫氧胞苷酸單體(deoxycytidylic monomer)相應(yīng)于該分子式的去纖苷酸此外顯示出下述物理化學(xué)性能電泳＝均勻陽極的遷移率；消光系數(shù)，在260±1nm處的E1cm1％＝220±10；消光比，E230/E260＝0.45±0.04；摩爾消光系數(shù)(指磷)，ε(P)＝7.750±500；旋光度[α]D20°＝53°±6；在天然DNA內(nèi)以％表示的可逆增色性，h＝15±5。
優(yōu)選的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸是去纖苷酸(CAS登記號83712-60-1)，熟練本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的一種多核苷酸，它通常被認為是通過從動物和/或植物組織中萃取獲得的多脫氧核糖核苷酸(US3,770,720和US3,899,481)；這種多脫氧核糖核苷酸通常以堿金屬鹽，通常鈉鹽的形式使用，和通常具有約45-50kDa的分子量。去纖苷酸主要是因它的抗凝活性而被使用，例如用于治療急性腎功能不足(US4,694,134)和治療急性心肌缺血(US4,693,995)。美國專利US4,985,552和US5,223,609公開了一種生產(chǎn)去纖苷酸的方法，它能使獲得的產(chǎn)品具有恒定和非常確定的物理化學(xué)特征，且還不具有任何非所需的副作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及治療患者的方法，所述患者正在接受免疫抑制劑的治療，該方法包括給患者施用有效劑量的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟。采用免疫抑制劑的治療優(yōu)選在SCT期間發(fā)生。免疫抑制劑優(yōu)選選自包括抗代謝物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU))、甲氨蝶呤(MTX)、氟達拉濱、抗微管劑(例如長春新堿、長春堿、紫杉烷類(taxanes)(如紫杉醇和多烯紫杉醇))、烷化劑(例如環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸美法侖、雙氯乙亞硝脲(BCNU))、鉑試劑(例如順鉑(也稱為cDDP)、卡鉑、奧沙利鉑，JM-216，CI-973)、蒽環(huán)霉素(例如阿霉素、柔毛霉素)、包括絲裂霉素-C在內(nèi)的抗生素，拓撲異構(gòu)酶抑制劑(例如依托泊苷、喜樹堿)、環(huán)胞菌素、他克莫司、雷帕霉素(sirolimus)，和起到抑制免疫系統(tǒng)作用的其它細胞毒試劑?？稍贕onzale等著的，Alergol.Immunol.Clin.15，161-181，2000中，找到在惡性腫瘤的治療中常用的這種試劑的綜述，在此通過參考將其引入。優(yōu)選的免疫抑制劑是核苷(即來自從核苷酸中除去磷酸基團的糖苷)，順便說一下，例如氟達拉濱，對于本發(fā)明目的來說，它是優(yōu)選的免疫抑制劑。
可平行、同時或一起施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸與免疫抑制劑。優(yōu)選的組合是去纖苷酸和氟達拉濱的同時給藥。
優(yōu)選施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟與給予患者免疫抑制劑平行、伴隨、同時、之后或之前發(fā)生。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在給予患者免疫抑制劑之后發(fā)生施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟。在進一步優(yōu)選的實施方案中，施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸和給予患者免疫抑制劑的步驟之間的時間延遲為約1小時到約2周。施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸和給予患者免疫抑制劑的步驟之間的時間延遲優(yōu)選為約2天到約7天。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，在給予患者免疫抑制劑之前發(fā)生施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟。優(yōu)選地，施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸和給予患者免疫抑制劑的步驟之間的時間差為約1小時到約2周。更優(yōu)選，施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸和給予患者免疫抑制劑的步驟之間的時間差優(yōu)選為約2小時到約2天。
優(yōu)選的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸是去纖苷酸，然而，可使用以上提及的作為保護性寡聚核苷酸的其它物質(zhì)。下述實施方案確定了去纖苷酸的優(yōu)選劑量；然而，當(dāng)使用不是去纖苷酸的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸時，可使用類似的劑量。至于任何保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的最佳劑量，將由參與的醫(yī)生來確定。以下所述的實驗示出了去纖苷酸的保護效果。在這樣的實驗中確定的有效劑量可用作確定治療用有效劑量的指導(dǎo)。優(yōu)選口服施用或靜脈注射去纖苷酸。
選擇去纖苷酸的優(yōu)選劑量，以便達到約100μg/mL-0.1μg/mL的血液水平。更優(yōu)選地，選擇去纖苷酸的優(yōu)選劑量，以便達到約10μg/mL-100μg/mL的血液水平。最優(yōu)選地，選擇去纖苷酸的優(yōu)選劑量，以便達到約100μg/mL的血液水平。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所施用的去纖苷酸的劑量為約100mg/kg患者體重到約0.01mg/kg體重。優(yōu)選地，所施用的去纖苷酸的劑量為約20mg/kg患者體重到約0.1mg/kg體重。更優(yōu)選地，所施用的去纖苷酸的劑量為約15mg/kg患者體重到約1mg/kg體重。更優(yōu)選地，施用每Kg患者體重約12mg到約14mg的每日劑量。最優(yōu)選地，所施用的去纖苷酸的劑量為約12mg/kg患者體重。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的施用能保護內(nèi)皮細胞和上皮細胞避免免疫抑制劑的影響。免疫抑制劑優(yōu)選激活內(nèi)皮細胞和上皮細胞，并誘導(dǎo)其內(nèi)的程序性細胞死亡。因此，在一個優(yōu)選實施例中，保護性寡聚脫氧核糖核苷酸保護上皮和/或內(nèi)皮細胞避免程序性細胞死亡和/或被免疫抑制劑激活。免疫抑制劑優(yōu)選氟達拉濱。保護性寡聚脫氧核糖核苷酸優(yōu)選去纖苷酸。
激活包括ICAM-1和MHC I類分子的加強表達。表達的加強優(yōu)選為實質(zhì)性的。進一步優(yōu)選地，免疫抑制劑誘導(dǎo)患者的內(nèi)皮細胞和/或上皮細胞的促炎激活。細胞優(yōu)選為人類微血管內(nèi)皮細胞(HMEC)和/或表皮和/或肺泡上皮細胞。對細胞的破壞優(yōu)選發(fā)生在當(dāng)患者的內(nèi)皮細胞和/或上皮細胞已暴露在免疫抑制劑下約1小時至約1周或更多的時候。更優(yōu)選地，當(dāng)所述細胞已暴露約5小時至約72小時時，發(fā)生所述破壞。甚至更優(yōu)選地，這種暴露的持續(xù)時間為20小時至72小時。最優(yōu)選地，這種暴露的持續(xù)時間大于48小時。
用免疫抑制劑的治療優(yōu)選發(fā)生在造血干細胞移植期間。造血干細胞移植優(yōu)選為同種異基因造血干細胞移植。
本發(fā)明還涉及包括至少一種保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的藥物組合物，用于治療需要它的患者，其中所述患者正在采用免疫抑制劑治療。施用所述藥物組合物減輕或避免由免疫抑制劑，或由免疫抑制劑和移植物所引起的副作用。移植物優(yōu)選是骨髓或造血干細胞移植物。更優(yōu)選地，移植物是同種異基因骨髓或造血干細胞移植物。
副作用優(yōu)選涉及患者的內(nèi)皮細胞和/或上皮細胞和/或組織。優(yōu)選地，所述副作用涉及所述細胞的程序性細胞死亡，和/或所述細胞的激活。激活優(yōu)選包括MHC I類分子和/或細胞間粘附分子1(ICAM-1)的加強表達。當(dāng)以藥物相關(guān)的濃度(范圍10μg/mL至1μg/mL)使用時，副作用在培養(yǎng)48小時之后破壞人類的微血管內(nèi)皮細胞(HMEC)，以及，優(yōu)選表皮和肺泡上皮細胞系。
副作用通常包括與破壞移植的靶組織相關(guān)的并發(fā)癥和被激發(fā)的同種異基因免疫應(yīng)答。
副作用優(yōu)選包括對在患者的內(nèi)皮細胞和/或上皮細胞內(nèi)，尤其在肺泡內(nèi)皮細胞內(nèi)的細胞間粘附分子1(ICAM-1)和MHC I類分子的顯著正調(diào)節(jié)。副作用進一步包括微血管的內(nèi)皮細胞的促炎激活。副作用進一步優(yōu)選包括通過來自于移植物的同種異基因MHC I類的受限的細胞毒性T淋巴細胞所導(dǎo)致的這種細胞的加強裂解。
施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸優(yōu)選防止免疫抑制劑誘導(dǎo)的副作用，其中包括程序性細胞死亡和同源激活。含本發(fā)明免疫抑制劑的藥物組合物可采用常規(guī)和公知類型的技術(shù)、賦形劑和載體配制，供通過口服與注射這兩種方式給藥，尤其通過靜脈線路給藥。至于單位劑量，在本發(fā)明組合物內(nèi)的活性成分的劑量范圍介于50至1500mg，而為了達到所需結(jié)果，建議10到40mg/kg的每日給藥量。可在US4,985,552和US5,223,609中找到制備去纖苷酸的方法，該專利在此通過參考將其全文引入。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，它含有有效治療劑量的免疫抑制劑和有效治療劑量的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸。免疫抑制劑優(yōu)選氟達拉濱，保護性寡聚脫氧核糖核苷酸優(yōu)選去纖苷酸。
附圖的簡要說明

圖1氟達拉濱在人類微血管內(nèi)皮細胞(HMEC)內(nèi)誘發(fā)程序性細胞死亡。HMEC或者靜置未處理，或者與濃度遞減的2-氟-9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(下文稱為F-Ara，氟達拉濱的代謝形式)一起培養(yǎng)48小時，并進行流式細胞分析(A)或微區(qū)DAPI染色分析。A碘化吡啶(PI)-負細胞的側(cè)面散射(SSC)圖像(x-軸)對正面散射圖像(y-軸)的輪廓圖作為細胞粒度對細胞尺寸的參數(shù)。BDAPI染色的內(nèi)皮細胞的定量熒光顯微分析。以凋亡的HMEC的百分數(shù)(凋亡細胞％)±標準偏差(n＝10的顯微場之中，平均70個細胞/場)給出結(jié)果。示出了代表性的至少5個獨立的實驗。*未處理的對照組對F-Ara(10μg/mL)處理過的細胞的P＜0.001。
圖2去纖苷酸(D)在HMEC內(nèi)抑制F-Ara-誘發(fā)的程序性細胞死亡，胞內(nèi)拮抗作用的證據(jù)。F-Ara10μg/mL，D100μg/mL。PI-負細胞的SSC-圖像的流式細胞分析。A由F-Ara重復(fù)誘發(fā)的細胞凋亡。B由D造成的對F-Ara誘發(fā)的細胞凋亡的劑量相關(guān)的抑制作用。C左圖HMEC與F-Ara一起培育1小時，隨后在洗滌之后與D一起培育48小時。右圖HMEC與D一起培育1小時，隨后在洗滌之后與F-Ara一起培育48小時。關(guān)于實驗細節(jié)，參見圖1的圖注和材料與方法部分。示出了三個獨立的實驗之中的一個代表。
圖3F-Ara在角質(zhì)形成細胞和肺泡上皮細胞內(nèi)誘發(fā)細胞凋亡，但在內(nèi)臟或支氣管上皮細胞內(nèi)沒有誘發(fā)細胞凋亡去纖苷酸的保護效果。F-Ara10μg/mL，D100μg/mL。PI-負細胞的SSC-圖像的流式細胞分析(圖3A)和凋亡細胞的DAPI-染色分析(圖3B)。以出自三個不同實驗的平均凋亡細胞百分數(shù)(％)±標準偏差給出結(jié)果。HaCaT人類角質(zhì)形成細胞系。SW 480內(nèi)臟上皮細胞系。A 549來自肺泡上皮的肺癌細胞系。BEAS-2B支氣管上皮細胞系。主支氣管上皮細胞來自于支氣管鏡刷步驟。圖3A*F-Ara對F-Ara+D處理過的HaCaT細胞的p＝0.005；**F-Ara對F-Ara+D處理過的A 549細胞的p＝0.116； 沒有誘發(fā)細胞凋亡。圖3B+F-Ara對F-Ara+D處理過的HaCaT細胞的p＝0.026；++F-Ara對F-Ara+D處理過的A 549細胞的p＝0.001。關(guān)于實驗細節(jié)，參見圖1的圖注和材料與方法部分。對于每一細胞系概述了三個獨立的實驗。
圖4去纖苷酸(D)沒有干擾F-Ara的抗白細胞和抗PBMC效果。F-Ara10μg/mL，D100μg/mL。A在胚細胞危象中，來自于患者的初級急性骨髓白細胞(AML)的碘化吡啶染色(全部PBMC數(shù)量的70％的胚細胞)。以三個獨立的實驗的平均活力百分數(shù)(％)給出結(jié)果。*對照組對F-Ara處理過的AML細胞的p＝0.008。BPI-負PBMC的SSC-圖像的流式細胞分析。示出了具有不同血液供體的5個獨立的實驗之中的一個代表。
圖5F-Ara誘發(fā)在HMEC上的ICAM-1表達，去纖苷酸(D)的保護效果。ICAM-1正細胞的流式細胞分析。在存在或者不存在濃度遞減的D的情況下，HMEC或者靜置未處理，或者與F-Ara(10μg/mL，或在B中以遞減濃度)一起培養(yǎng)。A來自代表性實驗的ICAM-1表達的直方圖。虛線背景染色(零對照)；細線未處理的對照細胞的ICAM-1表達粗線F-Ara處理過的細胞的ICAM-1表達。B由F-Ara誘導(dǎo)的劑量相關(guān)的ICAM-1表達。概述了三個獨立的實驗。以ICAM-1正細胞的平均百分數(shù)(％)±標準偏差的形式給出結(jié)果。*F-Ara對未處理的對照細胞的p＝0.075。C由去纖苷酸(D)造成的對F-Ara誘導(dǎo)的劑量相關(guān)的ICAM-1表達的抑制。以ICAM-1正細胞的平均百分數(shù)(％)±標準偏差的形式給出結(jié)果。**F-Ara對F-Ara+D處理過的HMEC的p＝0.004。
圖6F-Ara增加HMEC對CD8-正細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的同種異基因性，去纖苷酸的保護效果。A在白介素2(50U/mL)存在下，用輻照過的HMEC刺激PBMC 7天，并采用未處理(對照組)和F-Ara(10μg/mL)處理過的HMEC(24小時培育)作為靶細胞進行51Cr釋放分析。自身的B-LCL自身(效應(yīng)子)EBV-轉(zhuǎn)化的B-成淋巴細胞。K562天然殺傷細胞(NK)用靶細胞。以材料與方法部分中所述的比裂解百分數(shù)(％)形式給出結(jié)果。*-在抗MHC I類抗體w6/32存在下，F(xiàn)-Ara處理過的HMEC的比裂解％。E/T比效應(yīng)子/靶之比。B由去纖苷酸(D)造成的，HMEC對CD8-正CTL的F-Ara誘導(dǎo)的同種異基因性的向下調(diào)節(jié)。已經(jīng)通過磁珠分離，負選擇(非CD8+-細胞-耗盡)CD8-正PBMC。關(guān)于實驗細節(jié)參見圖6A的圖注。
圖7F-Ara降低HMEC對NK細胞的同種異基因性，通過阻斷MHC I類提高裂解。已經(jīng)通過磁珠分離，負選擇(非NK-細胞-耗盡)NK細胞，并在IL-2(50U/mL)存在下，采用輻照過的HMEC刺激4天，隨后如圖6所述進行51Cr釋放分析。圖下方的表用HMEC刺激之前和之后，效應(yīng)子細胞群的流式細胞分析。NK細胞表征為CD3-/CD16+CD56+.*-在20∶1的E/T比下，K 562細胞的比裂解百分數(shù)(％)。
表1抗內(nèi)皮CTL引起Tc1狀顯形
用于在刺激效應(yīng)子細胞的上清液中生產(chǎn)γ-干擾素(IFN-γ)和白介素4(IL-4)(7天，輻照過的HMEC，50U/mL，IL-2)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。如圖6中的實驗所給出的那樣，PBMC或者靜置未分離，或者對CD8+T細胞負選擇。以3個獨立實驗的平均pg/mL細胞因子±標準偏差形式給出結(jié)果。
舉例方法細胞培育和試劑人類表皮微血管內(nèi)皮細胞系CDC/EU.-HMEC-1(進一步稱為HMEC)由疾病控制和預(yù)防中心(美國喬治亞州亞特蘭大)友好地提供，并以如前所述的形式確立19。HMEC在MCDB 131介質(zhì)中培育，并補充加入15％的胎牛血清(FCS)，1μg/mL的氫化可的松(德國，Deisenhofen，Sigma)，10ng/mL的表皮生長因子(美國，MA，貝德福德，協(xié)作生物化學(xué)產(chǎn)品)和抗生素。除非另有說明，所有細胞培育試劑通過Gibco BRL(德國，卡爾斯魯厄)購買。2-氟腺嘌呤-9-β-D-阿拉伯呋喃糖(F-Ara)獲自德國，Deisenhofen，Sigma。去纖苷酸小瓶獲自意大利，Como，Crinos，ProciclideTM。
程序性細胞死亡分析一種在人類內(nèi)皮細胞內(nèi)進行細胞凋亡檢測的公知方法是采用如前所述20的流式細胞法(德國，海德爾堡，Becton Dickinson的FACScanTM和CellQuestTM軟件)。內(nèi)皮細胞和上皮細胞或者靜置未處理，或者以遞減的濃度(范圍10μg/mL-0.1μg/mL)，在存在或不存在去纖苷酸下與F-Ara一起培育48小時。之后，在PBS/10％FCS中洗滌細胞，并用壞死檢測染料碘化吡啶(PI，0.2μg/mL，德國，Deisenhofen，Sigma)染色。通過PI-負染色和通過不同于非凋亡細胞的特征側(cè)散射圖像來鑒定凋亡細胞。每類細胞進行至少三次實驗。
檢測細胞凋亡的一種替代方法是使用DNA熒光標記的細胞的顯微分析。在35mm培養(yǎng)皿(德國，Wiesbaden，Nunc)中接種1×105/板內(nèi)皮細胞。按照以上所給出的方法處理這些細胞，和隨后用甲醇/丙酮(1∶1)固定2分鐘，在PBS內(nèi)洗滌1次，并用溶解在20％甘油/PBS內(nèi)的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(0.5μg/mL，德國，Deisenhofen，Sigma)染色。放置樣品并進行顯微分析。在不存在錐蟲藍吸收的情況下，通過DAPI染色揭示的核縮合被認為是與壞死病毒相反的細胞凋亡的特征21。定量分析包括計算相對于所有可鑒定的細胞，來自至少10個顯微場的細胞凋亡的數(shù)量，其中平均70個細胞/場。
為了圖表的清楚起見，僅對具有內(nèi)皮細胞和HaCaT以及A 549細胞的實驗顯示DAPI染色結(jié)果。
細胞表面分析通過間接的免疫熒光技術(shù)，和隨后使用FACScanTM流式細胞計數(shù)器和CellQuestTM分析程序(德國，Heidelberg，Becton Dickinson)的流式細胞法，評估在HMEC上的ICAM-1(德國，Heidelberg，Becton Dickinson/ Pharmingen)和MHC I類(美國，VA，Manassas，ATCC，雜交瘤的上清液，w6/32)分子的細胞表面表達。按照所給出的方法處理內(nèi)皮細胞和在培育之后用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)收獲，在冷的PBS/10％FCS中洗滌1次，和連同5μg/mL的抗粘附分子MoAbs在冰上培育1小時。再次洗滌細胞，并與山羊抗鼠IgG-FITC共軛抗體F(ab)2片段(德國，Hamburg，Dako)一起在冰上培育45分鐘。然后在PBS/10％FCS中洗滌，和隨后進行分析。通過平行的碘化吡啶(0.2μg/ml，德國，Deisenhofen，Sigma)染色確定細胞的活力。省去作為負對照來檢測非特異的熒光的第一抗體。與使用同種型的對照抗體不同，該方法通過內(nèi)皮細胞缺少Fc受體的前述觀察結(jié)果而被證明是合理的22。因此，可排除通過其Fc部分的抗體的非特異結(jié)合。
用HMEC異體刺激外周血液細胞根據(jù)使用Ficoll-hypaque(德國，F(xiàn)reiburg，Pharmacia)密度梯度離心的標準實驗程序，外周血液單核細胞(PBMC)來自于健康人類志愿者的肝素化(德國，Mainz，Novo Nordisk)血液，或來自巴伐利亞紅十字(Bavarian Red Cross)的血沉棕黃色層。然后，在白介素2(50U/mL)和10％人類AB血清(德國，Deisenhofen，Sigma)的存在下，細胞和輻照(20Gy)過的HMEC以1∶1和2∶1的比例，刺激細胞7天?；蛘?，根據(jù)制造商的說明書，使用細胞分離試劑盒(德國，Bergisch-Gladbach，Miltenyi Biotech，MACSTM)，分別基于非CD8+和非NK細胞的缺失，對CD8+T細胞和天然殺傷細胞(NK)選擇PBMC。對所選擇的細胞的刺激與對整個PBMC培養(yǎng)物的刺激相同，所不同的是，對于NK細胞，僅刺激3天。
細胞毒性測定根據(jù)公知的實驗程序23，使用4小時的51Cr放射性同位素分析，評估T細胞或NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性。或者靜置未處理，或者過夜的用F-Ara(10μg/mL)培育的HMEC用作靶細胞，所述靶細胞將用0.4mCi Na251CrO4標記2小時。在3個洗滌步驟之后，調(diào)節(jié)細胞到104個細胞/mL，并以遞減的效應(yīng)子對靶細胞之比，用PBMC、CD8+或NK效應(yīng)子細胞共培育另外4小時。將上清液轉(zhuǎn)移到干燥閃爍板上，并在γ-計數(shù)器內(nèi)計數(shù)(所有均來自德國，Darmstadt，CanberraPackard)。取自身(效應(yīng)子)B-成淋巴細胞系(B-LCL)和作為NK敏感細胞的K562作為額外的對照靶。比裂解的百分數(shù)計算為[(實驗釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)]×100。在所有實驗中的自發(fā)釋放總是低于20％。
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)根據(jù)制造商的試劑盒的說明書(美國，MN，Minneapolis，R&D Systems)，準確地進行ELISA，以檢測在同種異型效應(yīng)子T細胞的上清液內(nèi)的白介素4(IL-4，Tc2應(yīng)答)和干擾素γ(IFN-γ，Tc1應(yīng)答)、IL-1和IL-10。
統(tǒng)計分析藉助研究者的t試驗來評估在實驗值之間的差別顯著性。
例1F-Ara在人類微血管內(nèi)皮細胞(HMEC)內(nèi)誘導(dǎo)細胞凋亡(程序性細胞死亡)為了評估F-Ara對培育的人類內(nèi)皮細胞活力的影響，用遞減的藥學(xué)相關(guān)濃度(10μg/mL至0.1μg/mL)的2-氟腺嘌呤-9-β-D-阿拉伯呋喃糖作為氟達拉濱的代謝形式，培育HMEC。靶細胞內(nèi)活性(細胞毒性)氟達拉濱三磷酸鹽的中值胞內(nèi)水平為20μM，這代表5.8μg/mL的濃度(medac SCHERING，制造商的說明書)。在培育48小時之后，分別使用碘化吡啶負細胞的細胞粒度(在流式細胞法內(nèi)的側(cè)散射(SSC)圖像)和DAPI-染色細胞的顯微分析的檢測結(jié)果，對HMEC進行細胞凋亡分析。與分析系統(tǒng)無關(guān)，圖1A和B清楚地證明了在HMEC內(nèi)，10至5μg/mL濃度下的F-Ara引起細胞凋亡，而1μg/mL不再有效。F-Ara的細胞毒性的臨界閾值為2至3μg/mL之間。因F-Ara導(dǎo)致的細胞凋亡在24小時后已經(jīng)是可檢測的，但在較低的程度下(數(shù)據(jù)未示出)。
例2去纖苷酸保護HMEC避免F-Ara誘導(dǎo)的細胞凋亡在存在或者不存在可變濃度(100μg/mL至0.1μg/mL)的去纖苷酸的情況下，HMEC或者靜置未處理，或者用F-Ara處理，并使用圖1A所述的SSC圖像的流式細胞分析法，在48小時后評估程序性細胞死亡。圖2A(中間的輪廓曲線圖)示出了去纖苷酸單獨作為第二對照組不影響內(nèi)皮細胞的活力。在圖2A(右邊的輪廓曲線圖)中重現(xiàn)了F-Ara的細胞凋亡效果，而圖2B示出了去纖苷酸對F-Ara誘導(dǎo)的細胞死亡的依賴于劑量的保護作用。為了排除在體外F-Ara和去纖苷酸的非特異人工胞外相互作用，用去纖苷酸預(yù)處理HMEC 1小時，和隨后，在3次洗滌步驟之后，用F-Ara培育另外48小時，和反之亦然。圖2C(右邊的輪廓曲線圖)證明對HMEC預(yù)處理1小時足以保護細胞避免F-Ara誘導(dǎo)的細胞凋亡。類似地，用F-Ara預(yù)處理HMEC 1小時(圖2C，左邊的輪廓曲線圖)和隨后用去纖苷酸培育并沒有導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的程序性細胞死亡。
例3F-Ara對不同上皮細胞系的影響，去纖苷酸的保護效果皮膚、胃腸道(GIT)和最可能的肺，是GvHD的主要靶。因此，測試F-Ara對來自于這些器官的細胞系的影響是合理的。如圖1和2所給出的用F-Ara(10μg/mL)培育來自角質(zhì)形成細胞(HaCaT)、GIT(SW 480)、肺泡(A549)和支氣管上皮(BEAS-2B)細胞系的細胞以及主支氣管上皮細胞，并在治療后48小時后的流式細胞法細胞凋亡分析中測定。圖3A概述了內(nèi)臟和支氣管上皮細胞看起來對F-Ara的細胞凋亡刺激有耐受力，而角質(zhì)形成細胞(HaCaT)和肺泡上皮細胞(A549)顯示出細胞凋亡的信號，如SSC圖像的流式細胞法所測定(分別地，對于HaCaT為34.0[±1.0]％的凋亡細胞百分數(shù)，和對于A549為42.9[±26.7]％)。另外，評估去纖苷酸(100μg/mL)的保護潛力。在用F-Ara和去纖苷酸處理之后，圖3A(插入的柱狀圖表)，HaCaT(4.3[±3.0]％)和A549(5.4[±2.9]％)的細胞完全受到保護而避免程序性細胞死亡。為了證實這些結(jié)果，對于HaCaT(圖3B，左欄)和A549細胞(圖3B，右欄)，進行DAPI-染色的細胞凋亡分析。對于內(nèi)皮細胞，可見，在任一細胞系內(nèi)，單獨的去纖苷酸不影響凋亡細胞的數(shù)量(數(shù)據(jù)未示出)。
例4去纖苷酸不干擾F-Ara的抗白細胞和抗PBMC效果對于抗F-Ara誘導(dǎo)的細胞凋亡的內(nèi)皮細胞和上皮細胞，僅次于其所需的保護能力，重要的是研究去纖苷酸是否也干擾F-Ara的抗白細胞性能。為了解決該問題，解凍胚細胞量為70％的初級外周血液衍生的急性髓樣白細胞(AML)，保溫培育24小時，隨后在存在或不存在去纖苷酸情況下，用F-Ara處理另外48小時。圖4A證明了幾乎50％的細胞因壞死性細胞死亡而自發(fā)死亡。然而，F(xiàn)-Ara誘導(dǎo)最多80％細胞的細胞死亡。與它對內(nèi)皮細胞和上皮細胞的影響相反，去纖苷酸不能保護AML細胞避免F-Ara介導(dǎo)的毒性。值得注意的是，圖4A描述了細胞的活力百分數(shù)(％)，不是凋亡細胞百分數(shù)(％)，這是因為F-Ara在AML細胞內(nèi)直接引起壞死，而不是細胞凋亡的事實所致。這可在最早培育24小時之后觀察到。另外，圖4A清楚地示出了去纖苷酸沒有干擾F-Ara對白細胞的所需毒性。我們接下來要問，去纖苷酸是否可能調(diào)節(jié)F-Ara對正常造血細胞的影響，并采用來自正常人血供體的PBMC進行細胞凋亡分析(SSC-圖像)。根據(jù)圖4B所描述的代表性實驗可獲悉，F(xiàn)-Ara在40.1％的細胞內(nèi)誘導(dǎo)細胞凋亡，與之相比，在未處理的對照組中，誘導(dǎo)5.1％的細胞凋亡。另外，去纖苷酸沒有干擾F-Ara對PBMC的細胞凋亡活性(43.1％的凋亡細胞)，這表明F-Ara的免疫抑制性能沒有因使用去纖苷酸共同進行治療而被破壞。
例5F-Ara正調(diào)節(jié)具有去纖苷酸的拮抗作用的在HMEC上的細胞間粘附分子1(ICAM-1)
基于前述觀察結(jié)果，即通過粘附分子的誘導(dǎo)，預(yù)移植不僅破壞，而且導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的促炎激活15，我們接下來研究在F-Ara的影響下ICAM-1的表達。如圖5A和B所示，流式細胞分析證明，在24小時培育之后，F(xiàn)-Ara以劑量相關(guān)的方式顯著提高在HMEC上的表達，所述劑量相關(guān)的方式與在細胞凋亡誘導(dǎo)中所觀察到的劑量相關(guān)方式相類似。減到1μg/mL的F-Ara的濃度在誘導(dǎo)ICAM-1方面是有效的。我們接下來要問，在該實驗環(huán)境下，去纖苷酸是否也充當(dāng)F-Ara的拮抗劑。如所給出的用F-Ara處理HMEC，并在不存在或存在遞減濃度的去纖苷酸的情況下培育HMEC。圖5C概述了獨立的實驗，該實驗表明，在100μg/mL和10μg/mL的濃度下，去纖苷酸實際上拮抗F-Ara誘導(dǎo)的ICAM-1表達。值得注意的是，單獨的去纖苷酸不激活內(nèi)皮細胞，在所測試的每一濃度下，ICAM-1表達維持不變(數(shù)據(jù)未示出)。
由于靶細胞的促炎激活常常與主要組織相容性抗原(MHC)I和II類的增加表達有關(guān)，在各種濃度下，用F-Ara培育24小時之后，我們進行了這些抗原的進一步的流式細胞分析。盡管F-Ara具有公眾所熟知的免疫抑制性能，但令人驚奇地，F(xiàn)-Ara在HMEC上以劑量相關(guān)的方式誘導(dǎo)MHC I類分子(在10μg/mL下為平均熒光強度的1.5倍誘導(dǎo)，在5μg/mL下為1.3倍誘導(dǎo))，而MHC II類分子維持不變(數(shù)據(jù)未示出)。
例6通過去纖酸的保護，F(xiàn)-Ara增加內(nèi)皮細胞對同種異基因外周血液細胞的抗原性MHC I類分子通過F-Ara在HMEC上的誘導(dǎo)促使我們檢驗F-Ara是否還提高HMEC刺激異源細胞毒應(yīng)答。作為效應(yīng)子的外周血液單核細胞(PBMC)或者來自于健康人類志愿者的肝素化血液或者來自于血沉棕黃色層，在50U/mL白介素2(IL-2)存在下，用輻照(20Gy)過的HMEC刺激7天，和隨后進行標準的51Cr釋放測定(關(guān)于細節(jié)，參見材料與方法部分)。在第1天，作為靶的新鮮HMEC或者靜置未被刺激，或者在存在或不存在抗MHC I類中和抗體(w6/32)情況下，用F-Ara(10μg/mL)培育。轉(zhuǎn)換成作為經(jīng)典的天然殺傷細胞(NK)靶的B-成淋巴細胞系(B-LCL)和K562細胞的自身效應(yīng)子愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒起到對照組的作用。圖6A證明了在所測試的所有E/T比下，F(xiàn)-Ara確實增加HMEC對異基因PBMC的抗原性。K562和自身效應(yīng)子B-LCL缺少比裂解證實了牽涉MHC的受限細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。另外，在用抗MHC I類抗體w6/32共培育這些細胞之后，未處理或F-Ara處理過的HMEC任何一種的裂解可幾乎完全被阻斷(圖6A，*-)。為了進一步證實CD8+CTL決定抗內(nèi)皮細胞的細胞毒活性，使用具有MACSTM珠試劑盒的磁珠分離，對于CD8+和CD4+細胞，選擇PBMC(分別是非CD8+和非CD4耗盡的PBMC)。在所有情況下，制劑的純度≥93％，且完全不存在其它細胞群(未示出)。完全如對未選擇的PBMC中所述(參見上面)，用HMEC和IL-2刺激分離的T細胞，如圖6B所示，通過CD8+CTL，F(xiàn)-Ara處理過的HMEC的裂解再次顯著高于對照的HMEC。此外，用F-Ara和去纖苷酸(F-Ara+D)預(yù)處理HMEC靶向下調(diào)節(jié)比裂解甚至低于對照水平，這表明去纖苷酸也保護內(nèi)皮細胞對抗異基因效應(yīng)子淋巴細胞的裂解。在該實驗環(huán)境中。HMEC刺激過的CD4+T細胞沒有顯示出細胞毒活性的任何信號(數(shù)據(jù)未示出)。F-Ara對F-Ara+D處理過的HMEC的流式細胞分析得出去纖苷酸對MHC I類分子的顯著向下調(diào)節(jié)，這表明在調(diào)節(jié)由F-Ara誘導(dǎo)的細胞毒應(yīng)答方面，MHC I類表達是臨界元素(數(shù)據(jù)未示出)。
例7抗內(nèi)皮CTL顯示出Tc1狀顯型為了獲得關(guān)于抗內(nèi)皮CTL本質(zhì)的信息，按照以上給出的方法，刺激PBMC和CDB+T細胞，和收集上清液，供使用ELISA分析以評估γ-干擾素(IFN-γ)和白介素4(IL-4)。如表1所示，用HMEC和IL-2刺激明顯導(dǎo)致Tc1狀T細胞的外生長，這可從IFN-γ的獨特表達，而沒有產(chǎn)生IL-4中獲悉。
例8通過異基因NK細胞，F(xiàn)-Ara向下調(diào)節(jié)HMEC的裂解另一令人感興趣的問題是，F(xiàn)-Ara誘導(dǎo)調(diào)節(jié)MHC I類表達將如何影響天然殺傷性能(NK)對內(nèi)皮細胞的細胞毒應(yīng)答。對于NK細胞(非NK細胞耗盡的)，負選擇來自健康個體的PBMC，并在IL-2存在下，用輻照過的HMEC刺激4天，這與圖6B中的實驗所述的一樣。在第4天，作為靶細胞的HMEC或者靜置未處理，或者用F-Ara(10μg/mL)培育24小時，并采用刺激過的NK細胞作為效應(yīng)子，進行標準51Cr釋放分析。圖7證明了F-Ara顯著向下調(diào)節(jié)HMEC對NK細胞的抗原性。作為對NK細胞活性的正對照，可觀察到MHC I類負K562細胞的裂解(圖7，*-)。用抗MHC I類抗體w6/32預(yù)處理F-Ara刺激過的HMEC完全消除了F-Ara的影響，和導(dǎo)致HMEC幾乎100％的比裂解(圖7)，這再次表明在HMEC表面上的MHC I類是調(diào)節(jié)NK細胞的細胞毒應(yīng)答的臨界轉(zhuǎn)變點。已發(fā)現(xiàn)殺傷細胞抑制劑受體(KIR)的作用是通過MHC I類分子的高表達來進行負調(diào)節(jié)24，這種作用可能決定了NK細胞的降低的細胞毒應(yīng)答。
討論迄今為止獲得的采用含氟達拉濱的降低強度的處理(RIC)方案的臨床結(jié)果表明，與處理相關(guān)的毒性的明顯向下調(diào)節(jié)，且沒有影響免疫重建25。接受RIC的患者中，急性GvHD的發(fā)病率與接受經(jīng)典調(diào)節(jié)方案的那些患者相當(dāng)或甚至要小26。然而，出現(xiàn)關(guān)于同樣嚴重或甚至加劇的后期效果如骨壞死27、肺部并發(fā)癥28和更多慢性GvHD病例29的報道。盡管在我們的研究中，充分地論證了氟達拉濱的免疫抑制性能，但結(jié)果是激活和破壞內(nèi)皮細胞和上皮細胞。這一觀察結(jié)果至少部分地解釋了以上所述的非所需的臨床副作用，這是因為骨壞死是內(nèi)皮細胞功能障礙的表達，和氟達拉濱對肺泡上皮細胞具有毒性。令人感興趣地注意到，氟達拉濱對肺細胞的有害效果看起來是區(qū)室特異的，因為支氣管細胞沒有響應(yīng)免疫抑制劑而經(jīng)歷細胞凋亡。角質(zhì)形成細胞系(HaCaT)也對氟達拉濱敏感這一事實說明了它可能也牽涉在SCT之后的皮膚疾病。由于后期并發(fā)癥的病理是多因素且也可能受到SCT患者年齡增加和使用外周干細胞的影響，因此在肺和皮膚并發(fā)癥的臨床分析中需要進一步的評價。
由于在許多預(yù)移植實驗方案中，使用氟達拉濱與電離輻射的組合，因此重要的是，測試這兩種化合物在影響內(nèi)皮細胞方面是否協(xié)作。令人感興趣的是，我們未能發(fā)現(xiàn)由氟達拉濱誘導(dǎo)的輻射的任何提高或反之亦然(數(shù)據(jù)未示出)。這表明，細胞凋亡的信號如何轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞上的機理不同。
氟達拉濱在內(nèi)皮細胞和上皮細胞內(nèi)如何誘導(dǎo)細胞凋亡仍待解釋?？赡苁?，作為嘌呤同系物的氟達拉濱整合到DNA內(nèi)并因此引起導(dǎo)致如前所報道的基因缺失的突變30。也已據(jù)推測，在觸發(fā)細胞凋亡的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)路徑31上，氟達拉濱可與細胞色素c和細胞凋亡蛋白質(zhì)激活因子-1(APAF-1)協(xié)作。
對于CD8+T細胞，氟達拉濱增加內(nèi)皮細胞靶的異基因性。相反，氟達拉濱通過異基因的NK細胞顯著向下調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞裂解。MHC I類表達看起來對于調(diào)節(jié)任何這些免疫應(yīng)答是關(guān)鍵的，這是因為I類的阻斷充分消除CTL裂解，和通過NK細胞極大地正調(diào)節(jié)裂解。氟達拉濱的這些相反效果，連同氟達拉濱顯示出較少的急性和等于或甚至大于經(jīng)典調(diào)節(jié)方案的慢性毒性的臨床觀察結(jié)果，提出了NK細胞和CTL在GvHD病理生理的不同期可能活性不同的推測，即NK細胞將主要在早期起作用(被氟達拉濱抑制)，和CTL在后移植的后期起作用(被氟達拉濱加強)。關(guān)于抗內(nèi)皮CTL的本質(zhì)，令人感興趣的問題是，這些CTL是否是內(nèi)皮特異或簡單地異源特異的。以前描述過內(nèi)皮特異的效應(yīng)子淋巴細胞的存在32。與我們表征為顯示Tc1狀表型的CTL相反，所報道的許多CTL克隆幾乎不顯示出，如果有的話，IFN-γ和在可能提高細胞毒活性的其余處非凡表達CD40配體33。但這些數(shù)據(jù)不排除對非造血靶具有特異性的額外的異基因CTL的存在。
去纖苷酸是成功地用于治療作為SCT之后主要肝病并發(fā)癥的靜脈閉塞疾病的非常耐受的藥物34。另外，存在增加數(shù)量的預(yù)臨床和臨床報道，顯示出它在治療局部缺血/再灌注損(reperfusion)傷和粥樣硬化以及反復(fù)凝血的血小板減少性紫癲35-37中的效果。已知去纖苷酸在沒有進一步要求代謝的情況下，直接在內(nèi)皮細胞上起作用38，和因此可在我們的體外研究中使用。去纖苷酸充分保護內(nèi)皮細胞和上皮細胞避免氟達拉濱介導(dǎo)的細胞凋亡。需要額外的實驗評估去纖苷酸拮抗氟達拉濱所藉助的準確機理，但人們可想象去纖苷酸在氟達拉濱的DNA整合或前述caspase激活的抑制中的作用。除了它的抗細胞凋亡效果以外，去纖苷酸還能通過調(diào)節(jié)MHC I類的表達來降調(diào)節(jié)抗內(nèi)皮TCL應(yīng)答。相反，去纖苷酸不影響氟達拉濱所需的抗白細胞效果，這通過缺少AML細胞的保護來證明。另一重要的觀察結(jié)果是，去纖苷酸不可能阻斷氟達拉濱介導(dǎo)的PBMC的細胞凋亡。這表明為了進行處理，氟達拉濱所強制的免疫抑制劑效果沒有受到用去纖苷酸共處理的影響。
值得注意的是，去纖苷酸不是輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞破壞的保護劑，這表明它對氟達拉濱介導(dǎo)的細胞變化具有特異性(數(shù)據(jù)未示出)。
基于這些結(jié)果和關(guān)于它的很小的副作用，如果有的話39，我們根據(jù)我們的研究得出結(jié)論，特別地在冒V0D風(fēng)險的患者中，去纖苷酸是在SCT之前，在處理過程中與氟達拉濱結(jié)合使用的良好選擇物。內(nèi)皮細胞保護對抗進一步的處理劑的分析研究應(yīng)當(dāng)有助于弄明白去纖苷酸是否可用作寬范圍的保護劑。
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權(quán)利要求
1.保護性寡聚脫氧核糖核苷酸在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療正在接受免疫抑制劑治療的患者。
2.保護性寡聚脫氧核糖核苷酸在制造藥物中的用途，所述藥物用于保護上皮細胞和/或內(nèi)皮細胞避免免疫抑制劑的影響。
3.保護性寡聚脫氧核糖核苷酸在制造藥物中的用途，所述藥物用于保護上皮細胞和/或內(nèi)皮細胞避免因施用免疫抑制劑誘導(dǎo)的細胞凋亡和/或激活。
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制劑是一種核苷。
5.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制劑選自包括氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、BCNU、美法侖的物質(zhì)組。
6.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制劑是氟達拉濱。
7.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的用途，其特征在于，所述保護性寡聚脫氧核糖核苷酸是去纖苷酸。
8.如權(quán)利要求1-7中任何一項所述的用途，其特征在于，在給患者施用免疫抑制劑的伴隨過程中、同時、之后或之前，發(fā)生施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，在給患者施用免疫抑制劑之后，發(fā)生施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，在施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟和給患者施用免疫抑制劑的步驟之間的時間延遲為約1小時至約2周，優(yōu)選約2天至約7天。
11.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，在給患者施用免疫抑制劑之前，發(fā)生施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，在施用保護性寡聚脫氧核糖核苷酸的步驟和給患者施用免疫抑制劑的步驟之間的時間差為約1小時至約2周，優(yōu)選約2小時至約2天。
13.如權(quán)利要求1-12中任何一項所述的用途，其特征在于，選擇所施用的去纖苷酸的劑量，以便達到約100μg/mL至約0.1μg/mL的血液水平，優(yōu)選約10μg/mL至約100μg/mL。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，選擇所施用的去纖苷酸的劑量，以便達到約10μg/mL的血液水平。
15.如權(quán)利要求1-14中任何一項所述的用途，其特征在于，所施用的去纖苷酸的劑量為約100mg/kg患者體重至約0.01mg/kg體重，優(yōu)選約20mg/kg患者體重至約0.1mg/kg體重。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，所施用的去纖苷酸的劑量為約15mg/kg患者體重至約1mg/kg體重，優(yōu)選約12mg/kg患者體重。
17.如前述任何一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述激活包括ICAM-1的加強表達。
18.如前述任何一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，使用免疫抑制劑治療發(fā)生在干細胞移植期間。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其特征在于，所述干細胞移植是同種異基因干細胞移植。
20.一種藥物組合物，包含有效治療劑量的免疫抑制劑和有效治療劑量的保護性寡聚脫氧核糖核苷酸。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，它由兩種不同的可獨立地施用的配方構(gòu)成，一種含有免疫抑制劑和另一種含有保護性寡聚脫氧核糖核苷酸。
22.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，作為用于同時、單獨或相繼應(yīng)用的組合制劑。
23.如權(quán)利要求20-22中任何一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述免疫抑制劑是一種核苷。
24.如權(quán)利要求20-22中任何一項所述的藥物組合物，其特征在于，免疫抑制劑選自包括氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、BCNU、美法侖的物質(zhì)組。
25.如權(quán)利要求20-22中任何一項所述的藥物組合物，其特征在于，免疫抑制劑是氟達拉濱。
26.如權(quán)利要求20-22中任何一項所述的藥物組合物，其特征在于，保護性寡聚脫氧核糖核苷酸是去纖苷酸。
27.如前述任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，進一步含有常規(guī)的賦形劑和/或助劑。
28.如前述任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，它可靜脈注射。
全文摘要
本發(fā)明涉及保護性寡聚脫氧核糖核苷酸用于治療患者的用途，所述患者正在接受免疫抑制劑的治療。本發(fā)明進一步涉及一種藥物組合物，它含有有效治療劑量的免疫抑制劑和有效治療劑量的保護的寡聚脫氧核糖核苷酸。
文檔編號A61K31/664GK1655801SQ03812501
公開日2005年8月17日 申請日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者甘特·艾斯內(nèi), 恩斯特·霍勒 申請人:雷根斯堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院