專利名稱：一種新型冠狀病毒株及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物病毒領(lǐng)域，涉及新型冠狀病毒的新毒株及其醫(yī)藥用途。
本發(fā)明的另一目的是采用新型冠狀病毒毒株制備SARS診斷試劑、抗SARS疫苗、藥物的篩選、抗SARS病毒的消毒藥物。
上海市于2003年3月上旬開始SARS的監(jiān)控，由于當(dāng)時對SARS的病原不明，本發(fā)明對SARS可疑病例進(jìn)行了檢驗。本發(fā)明檢測了流感病毒、禽類流感病毒、呼吸道合胞病毒與衣原體為主的病原學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定，對可疑SARS病例進(jìn)行了診斷排除。本發(fā)明在最初的上海23例發(fā)熱病例中，檢測出了A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原體。通過對上海市第一例確診SARS病例，患者李某，女，40歲，2003年3月27日發(fā)病，2003年3月31日診斷為SARS疑似病例，2003年3月31日采樣，標(biāo)本為咽試，2003年4月3日臨床確診SARS病例。
咽拭標(biāo)本于2003年4月3日按本領(lǐng)域公知技術(shù)進(jìn)行Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)，2003年4月8日結(jié)果顯示了細(xì)胞病變，分離出直徑60-100nm的冠狀病毒樣顆粒，感染的Vero E6細(xì)胞和病人血清間接熒光抗體顯示陽性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒等病原體后，證實所分離的冠狀病毒為新冠狀病毒的變異毒株，於2003年6月6日保藏，命名SARS冠狀病毒復(fù)旦I株(冠狀病毒SARS-CoV-Fudan-I株)CGMCC NO.0942。
本發(fā)明采用的細(xì)胞系為本領(lǐng)域公知的Veroe E6細(xì)胞、HEP-2細(xì)胞。
本發(fā)明采用的單克隆抗體、第1抗體為確診的SARS病人三周后的恢復(fù)期血清，所用熒光標(biāo)記第2抗體購自CHEMICON公司產(chǎn)品。
本發(fā)明通過下述方法進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定。
1)病原體分離培養(yǎng)咽拭標(biāo)本經(jīng)用青、鏈霉素、兩性霉素處理后，接種Veroe E6細(xì)胞、HEP-2細(xì)胞，在CO233℃條件下培養(yǎng)，每天對細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)進(jìn)行觀察，經(jīng)培養(yǎng)5-7d后，病變細(xì)胞上清液蔗糖梯度超速離心，分離病毒顆粒進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察。
2)間接免疫熒光以分離感染病毒發(fā)生病變的Vero E6細(xì)胞制細(xì)胞片，細(xì)胞發(fā)生病變時，取出感染細(xì)胞滴片，放入CO233℃條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未貼壁的細(xì)胞，涼干。放入冷丙酮內(nèi)，-20℃ 30min，涼干，冷藏備用。
結(jié)果顯示，(1)、標(biāo)本感染Vero E6細(xì)胞，細(xì)胞有病變現(xiàn)象，將發(fā)生病變的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，經(jīng)Giemsa細(xì)胞染色，顯微鏡下見細(xì)胞發(fā)生融合，細(xì)胞核試驗破碎，高爾基體形成的現(xiàn)象；標(biāo)本感染HEP-2細(xì)胞，從相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞生長過程，細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)見細(xì)胞從單個生長良好的狀態(tài)形成網(wǎng)狀，絮狀相聯(lián)。
(2)電鏡負(fù)染病毒形態(tài)觀察，感染細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)5-7天后，蔗糖梯度超速離心，電鏡負(fù)染觀察，顯示具有放射狀表面的冠狀病毒樣顆粒(coronavirus-like particles)，直徑在60-100nm。冠狀病毒在細(xì)胞膜邊緣的細(xì)胞質(zhì)和粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)狀組織的囊腔中。細(xì)胞外的顆粒堆積成簇，常沿著質(zhì)膜表面分布。熒光染色呈陽性反應(yīng)，病毒形態(tài)符合SARS-CoV。
(3)熒光抗體染色，標(biāo)本感染的Vero E6細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光染色，見感染細(xì)胞邊緣呈半月狀著色，熒光明顯。正常Vero E6細(xì)胞則無熒光著色細(xì)胞。
圖2為72小時正常Vero E6細(xì)胞。
圖3Giemsa細(xì)胞染色，其中可見融合的細(xì)胞。
圖4電鏡負(fù)染色可見冠狀病毒樣顆粒。
圖5感染Vero E6細(xì)胞間接熒光染色呈陽性反應(yīng)。
本發(fā)明從上海市首例確診SARS患者分離、培養(yǎng)成功新型冠狀病毒“SARS-CoV-Fudan-I株”，并且可被傳代培養(yǎng)。所述確診SARS患者病原學(xué)培養(yǎng)檢測，排除了呼吸道常見的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒感染。
本發(fā)明提供的新型冠狀病毒毒株冠狀病毒復(fù)旦I株，為地區(qū)SARS病毒標(biāo)準(zhǔn)株，能確定病原，診斷SARS疾病，可以對可疑SARS病原變異進(jìn)行比較，作為SARS病原學(xué)診斷與SARS抗體診斷方法的金標(biāo)準(zhǔn)。為SARS診斷試劑制備、抗SARS疫苗的研究與生產(chǎn)、抗SARS藥物的篩選、抗SARS病毒的消毒藥物提供基礎(chǔ)和依據(jù)。
實施例2將分離感染病毒發(fā)生病變的Vero E6細(xì)胞制細(xì)胞片，細(xì)胞發(fā)生病變時，取出感染細(xì)胞滴片，放入CO235℃條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未貼壁的細(xì)胞，涼干。放入冷丙酮內(nèi)，-20℃ 30min，涼干。滴入1∶10稀釋的來自確診的SARS病人三周后的恢復(fù)期血清，放入溫盒內(nèi)37℃作用30min，用0.0lmol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液體。滴加熒光標(biāo)記羊抗人IgG抗體，購自CHEMICON公司，放入溫盒內(nèi)37℃作用30min，用0.01mol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液體。經(jīng)間接免疫熒光染色，可見到感染細(xì)胞邊緣呈半月狀著色，熒光明顯。正常Vero E6細(xì)胞則無熒光著色細(xì)胞。表明病變的Vero E6細(xì)胞被感染病毒。上述方法能確定病原，診斷疾病，可作為SARS病原學(xué)診斷與SARS抗體診斷方法的金標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種新型冠狀病毒SARS冠狀病毒復(fù)旦I株CGMCC NO.0942，其具有下述特征，①感染細(xì)胞有病變，包括細(xì)胞發(fā)生融合，細(xì)胞核試驗破碎，高爾基體形成形成網(wǎng)狀，絮狀相聯(lián)；②病毒在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組織囊腔中，細(xì)胞外顆粒成簇，沿質(zhì)膜表面分布；③熒光染色呈陽性反應(yīng)，電鏡負(fù)染顯示具有放射狀表面的冠狀病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型冠狀病毒SARS冠狀病毒復(fù)旦I株，其特征是所述病毒株直徑在60-100nm。
3.權(quán)利要求1和2所述的新型冠狀病毒SARS冠狀病毒復(fù)旦I株在制備SARS診斷試劑中的用途。
4.權(quán)利要求1和2所述的新型冠狀病毒SARS冠狀病毒復(fù)旦I株在制備抗SARS疫苗中的用途。
5.權(quán)利要求1和2所述的新型冠狀病毒SARS冠狀病毒復(fù)旦I株在制備抗SARS病毒的消毒藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物病毒領(lǐng)域，涉及冠狀病毒的新毒株及其用途。本發(fā)明通過對確診SARS病人的咽拭細(xì)胞培養(yǎng)，分離出新型冠狀病毒，命名SARS冠狀病毒復(fù)旦I株，經(jīng)感染Vero E6細(xì)胞和病人血清間接熒光抗體顯示陽性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原體后，證實所分離的冠狀病毒為新冠狀病毒的變異毒株，本毒株，可以對可疑SARS病原變異進(jìn)行比較，為SARS診斷試劑制備、抗SARS疫苗的研究與生產(chǎn)、抗SARS藥物的篩選、抗SARS病毒的消毒藥物提供基礎(chǔ)和依據(jù)。
文檔編號A61K39/215GK1450164SQ03129248
公開日2003年10月22日 申請日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月11日
發(fā)明者姜慶五, 居麗雯, 李子華, 林玉尊, 俞順章 申請人:復(fù)旦大學(xué)