專(zhuān)利名稱：中藥白花前胡在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中國(guó)傳統(tǒng)中藥——白花前胡的第二醫(yī)藥用途，具體地說(shuō)涉及白花前胡在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
Ling等鑒定了一種170KD的膜P-糖蛋白(P-gp)，后來(lái)從MDR腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)它介導(dǎo)每種癌癥治療藥物的ATP依賴的流出，這些藥物包括anthracyclines，長(zhǎng)春花生物堿、表鬼臼毒素和Taxanes。P-gp位于細(xì)胞膜上，其功能是作為天然產(chǎn)生的親脂生物異源物質(zhì)的向外運(yùn)輸者。導(dǎo)致MDR的其他機(jī)制包括19-kDa的ATP-依賴的多重耐藥性相關(guān)蛋白(MRP)的表達(dá)，它顯示出可轉(zhuǎn)運(yùn)某些anthracyclines、長(zhǎng)春花生物堿和表鬼臼毒素，但是不能轉(zhuǎn)運(yùn)Taxanes。與P-gp不同，MRP可以位于細(xì)胞膜上和胞質(zhì)內(nèi)膜上，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。作為MRP的藥物底物既可以以GSH共軛物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，也可以與GSH共同轉(zhuǎn)運(yùn)。GSH的缺乏使MRP過(guò)度表達(dá)細(xì)胞變得對(duì)由MRP轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物敏感。
過(guò)去幾年進(jìn)行的研究表明，先天的和后天的P-gp表達(dá)在臨床MDR上扮演了一個(gè)主要角色。未接受化療而常常表達(dá)P-gp的腫瘤類(lèi)型包括結(jié)腸直腸癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌和慢性白血病。在幾種其他的腫瘤中發(fā)現(xiàn)有10～50％的病例在診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)P-gp表達(dá)，這些腫瘤的例子包括乳腺癌、急性髓性白血病和卵巢癌。這些腫瘤在診斷時(shí)P-gp表達(dá)可能在治療結(jié)果中扮演了重要的角色。例如，有P-gp表達(dá)的乳腺癌病人比P-gp陰性的腫瘤病人發(fā)生化療失敗的要多三倍。
諸如阿霉素的化療藥物可以對(duì)導(dǎo)致P-gp表達(dá)增加的突變進(jìn)行選擇，并且發(fā)現(xiàn)了一種抑制MDR1基因表達(dá)活性并降低對(duì)阿霉素抗性的突變率的P-gp抑制物。最近，在體內(nèi)用阿霉素治療后的人轉(zhuǎn)移性肉瘤中觀察到MDR1基因表達(dá)的瞬時(shí)活化。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)顯示，使用化療藥物的最有效的途徑是在腫瘤診斷和治療時(shí)將P-gp底物與P-gp抑制劑協(xié)同使用。
MDR的逆轉(zhuǎn)是癌癥化療的主要目標(biāo)。對(duì)P-gp有效的逆轉(zhuǎn)劑已鑒別出來(lái)，使用這些逆轉(zhuǎn)劑的臨床追蹤也正在進(jìn)行。用于逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的MDR的第一個(gè)嘗試是采用例如異博定和環(huán)孢菌素A的鈣離子通道阻斷劑。這些藥物雖然有一些功效，但是它們是相對(duì)較弱的P-gp抑制劑(EC50，2-10μM)，常常是作為P-gp的底物，并且表現(xiàn)出劑量限制的副作用，這一缺陷嚴(yán)格限制了這類(lèi)藥物的使用。為解決這一問(wèn)題，人們開(kāi)始研究在需要抑制P-gp時(shí)不會(huì)引起明顯的劑量毒性的第二代P-gp抑制劑，對(duì)于這類(lèi)化合物，通常的劑量限制毒性是共濟(jì)失調(diào)和高膽紅素血，這些癥狀隨著藥物治療的停止是可逆的。
最早是通過(guò)形態(tài)特征來(lái)描述細(xì)胞凋亡的，這些形態(tài)特征包括細(xì)胞收縮、膜起泡、染色質(zhì)濃縮以及核碎片。由于凋亡程序可以對(duì)細(xì)胞死亡產(chǎn)生巨大的改變，因此控制細(xì)胞凋亡的基因和蛋白是有效的藥物靶。許多從經(jīng)驗(yàn)上得出的細(xì)胞毒性藥物已經(jīng)可以將細(xì)胞凋亡作為目標(biāo)，雖然其作用是間接的和非特異的，這些藥物也對(duì)正常組織具有誘變性和毒性。相反，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物發(fā)生獲得性藥物抗性的機(jī)會(huì)較少，它還可減少誘變和降低毒性。
在治療癌癥方面植物藥具有較長(zhǎng)的使用歷史。已將中藥用于改善癌癥病人的普通狀況，但是從未將中藥用于MDR癌細(xì)胞的具體根除上。自然界提供了許多植物來(lái)源的抗癌藥物，例如長(zhǎng)春花堿、irinotecan、toptancan、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和紫杉醇。這些從植物中分離的有效成分表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應(yīng)，且相對(duì)于人工合成的化學(xué)藥物來(lái)說(shuō)，其毒性較低的優(yōu)點(diǎn)使這些植物來(lái)源的抗癌藥物在腫瘤治療中得到了大量的應(yīng)用。
由于目前使用的化療藥物具有明顯的細(xì)胞毒性作用，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的細(xì)胞也具有很大的傷害，而且通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MDR已成為目前提高治療效果的有效手段，因此從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的MDR的機(jī)制入手，尋找高效、低毒的治療腫瘤的藥物已成為目前抗癌藥物研究的方向。
白花前胡是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，白花前胡是傘形科植物白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)的干燥根，在中藥大辭典中記載了其臨床功用主治宣散風(fēng)熱、下氣、消痰，可用于治療風(fēng)熱頭痛、痰熱咳喘、嘔逆、胸隔滿悶。在《本草綱目》中也有記載前胡，乃手足太陰、陽(yáng)明之藥，與柴胡純陽(yáng)上升、入少陽(yáng)、厥陰者不同也。其功長(zhǎng)于下氣，故能治痰熱喘嗽、痞膈逆諸疾。氣下則火降、痰亦降矣，所以有推陳出新之績(jī)，為痰氣要藥。白花前胡中含有多種斜型非—糖苷吡喃香豆素，現(xiàn)代藥理研究表明，前胡中含有的某些香豆素類(lèi)成分具有以下作用(1)細(xì)胞分化作用；(2)通過(guò)抑制肥大細(xì)胞鈣離子的流入而具有抗過(guò)敏作用；(3)抗血小板聚集作用；(4)抑制乙酰膽平滑肌的收縮；(5)非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗豬冠狀動(dòng)脈血管和豚鼠心房肌的收縮作用；(6)降低冠狀動(dòng)脈血管阻力，增加冠狀動(dòng)脈血流量等作用。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供中藥白花前胡或其有效成分或含有它們?nèi)魏我环N的藥物組合物在制備腫瘤輔助治療藥物中的新用途，白花前胡或其有效成分或含有它們?nèi)魏我环N的藥物組合物可作為腫瘤化療中的輔助藥物中的有效成分，通過(guò)有效抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多重耐藥性(MDR)而對(duì)化療藥物起到增效作用。這類(lèi)化療藥物包括但不限于抗代謝產(chǎn)物、微管抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑和鉑化合物；中藥白花前胡還可以在治療前用于預(yù)防腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供中藥白花前胡或其有效成分或含有它們?nèi)魏我环N的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的新用途，白花前胡或其有效成分或含有它們?nèi)魏我环N的藥物組合物可作為抗腫瘤藥物中的有效成分，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1為白花前胡乙醇抽提物的HPLC圖譜(流動(dòng)相-60％甲醇，流速2.5ml/分，柱-C18，紫外檢測(cè)320nm)；圖2為白花前胡乙醇粗提物處理KB-3-1細(xì)胞和KB-V1細(xì)胞24小時(shí)后的DNA梯度電泳圖譜，使用的粗提物濃度為對(duì)照(0)、1×LD50(+)、2×LD50(2+)、10×LD50(10+)，在三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到相同的結(jié)果；圖3為對(duì)阿霉素和白花前胡的各種藥物聯(lián)合作用的研究，A和B分別代表KB-3-1細(xì)胞和KB-V1細(xì)胞，在白花前胡和阿霉素的聯(lián)合作用中，分別以CI＞1、CI＝1和CI＜1表示對(duì)抗、附加效果和增效，圖中 CI＝0.0-0.2 CI＝0.2-0.4 CI＝0.4-0.6 CI＝0.6-0.8 CI＝0.8-1.0 CI＞1.0在三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到相同的結(jié)果；圖4為從白花前胡中分離鑒定的單一化合物——吡喃香豆素(APC)的HPLC圖譜(流動(dòng)相-60％甲醇，流速2.5ml/分，柱-C18，紫外檢測(cè)320nm)。
發(fā)明的詳細(xì)描述實(shí)施例1白花前胡中有效成分的提取材料來(lái)源 白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)購(gòu)自中國(guó)安徽省，該白花前胡的植物標(biāo)本樣本保藏在中國(guó)香港特別行政區(qū)，香港城市大學(xué)。
有效成分的提取為了以下進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方便，對(duì)白花前胡中的有效成分進(jìn)行提取，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50％冷乙醇可抽提出最多的中藥成份，所以白花前胡中有效成份粗提物的制備步驟包括1)將干的白花前胡粉碎；2)將粉碎的白花前胡用50％冷乙醇抽提72小時(shí)，將抽提液過(guò)濾并去除乙醇，獲得粗品。
用HPLC鑒定獲得的粗品，其圖譜如圖1所示。實(shí)施例2白花前胡抗腫瘤作用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及分析以下對(duì)于白花前胡抗腫瘤作用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均以白花前胡的乙醇粗提物為材料進(jìn)行研究。
細(xì)胞系和試劑用人癌細(xì)胞系KB-3-1和KB-V1(從KB-3-1中用長(zhǎng)春花堿篩選的MDR細(xì)胞)。將這些細(xì)胞在含10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素溶液(Gibco，MD，USA)的MEM(Gibco，MD，USA)中培養(yǎng)，加入300ng/ml的長(zhǎng)春花堿以維持對(duì)KV-V1細(xì)胞的藥物抗性。在5％CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
研究發(fā)現(xiàn)，KB-V1細(xì)胞對(duì)抗代謝產(chǎn)物、微管抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑和鉑化合物均發(fā)生多重耐藥，在以下實(shí)驗(yàn)中，選擇拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑中的阿霉素作為代表進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。
對(duì)照物長(zhǎng)春花堿、阿霉素和異博定從Sigma公司商購(gòu)，以中藥白花前胡的乙醇粗提物(下稱粗提物)作為抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的藥物。
1、細(xì)胞增值分析該實(shí)驗(yàn)用于證明白花前胡對(duì)有MDR的腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。
基本如Sulfo-Rhodamine(SRB)描述的細(xì)胞毒性分析和培養(yǎng)基作用方程，在96孔板上一式三份從3天劑量反應(yīng)曲線測(cè)定粗提物和阿霉素的各自細(xì)胞增值LD50，通過(guò)測(cè)定515nmOD估計(jì)與細(xì)胞數(shù)正相關(guān)的SRB的顏色強(qiáng)度。在所有樣本中白花前胡粗提物的藥物溶劑濃度(20％DMSO和80％乙醇)均≤0.1％DMSO，溶劑對(duì)照一同進(jìn)行分析，并且沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)。
結(jié)果MDR細(xì)胞的選擇性殺傷作用 Sulfo-Rhodamine B(SRB)細(xì)胞毒性分析和培養(yǎng)基影響方程表明藥物敏感的KB-3-1細(xì)胞和MDRKB-V1細(xì)胞其阿霉素的LD50分別為0.0371±0.0102μg/ml和1.769±0.1650μg/ml。然而，藥物敏感的KB-3-1細(xì)胞和MDR KB-V1細(xì)胞其白花前胡粗提物的LD50則分別為63.9105±12.52μg/ml和32.273±4.77μg/ml。在MDR KB-V1細(xì)胞和藥物敏感的KB-3-1細(xì)胞上的白花前胡粗提物的LD50之比提示對(duì)于MDR KB-V1細(xì)胞白花前胡要敏感2倍(表1)。該結(jié)果顯示白花前胡對(duì)MDR癌細(xì)胞有選擇性殺傷活性。
表1 白花前胡粗提物和阿霉素的細(xì)胞毒性(LD50)分析LD50(μg/ml±SD)細(xì)胞系 阿霉素粗提物KB-3-1 0.0371±0.010263.9105±12.52KB-V1 1.7695±0.165032.273±4.77比值 47.7 0.5通過(guò)SRB細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定了阿霉素和白花前胡粗提物的LD50。MDR KB-V1細(xì)胞的LD50與藥物敏感的KB-3-1細(xì)胞的LD50比值表明了難以控制的MDR細(xì)胞對(duì)于特定的藥物的敏感程度(成反比)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到相同的結(jié)果。
2.細(xì)胞凋亡分析該實(shí)驗(yàn)用于證明白花前胡可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。
用不同濃度的白花前胡粗提物(32.273μg/ml，64.546μg/ml和96.819μg/ml)處理細(xì)胞24小時(shí)后，通過(guò)DNA梯度分析細(xì)胞凋亡。將5×106個(gè)細(xì)胞用PBS洗后，用凋亡DNA梯度試劑盒-Best.Nr.1835246(Roche)按照其操作手冊(cè)提取基因組DNA，用含0.1％溴化乙錠的TAE緩沖液中進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳(99v，30分鐘)分析DNA，用Multi-Imager(Bio-Rad，California，USA)觀察并記錄DNA帶。
結(jié)果細(xì)胞凋亡研究顯示該選擇性殺傷作用是通過(guò)白花前胡與某些未知的抑制細(xì)胞凋亡的途徑發(fā)生聯(lián)系，DNA梯度提示白花前胡的凋亡誘導(dǎo)作用是劑量依賴的，并且在同樣的白花前胡粗提物濃度下MDRKB-V1細(xì)胞比藥物敏感的KB-3-1細(xì)胞更敏感(圖2)。這些實(shí)驗(yàn)顯示白花前胡對(duì)MDR細(xì)胞具有劑量依賴的選擇性凋亡誘導(dǎo)作用。
3、聯(lián)合指數(shù)和增效作用 該實(shí)驗(yàn)用于證明白花前胡對(duì)化療藥物的增效作用。
用Chou和Talalay的CI-isobologram測(cè)定白花前胡粗提物和阿霉素的聯(lián)合指數(shù)(CI)。為了對(duì)白花前胡粗提物的增效作用有一個(gè)全面的理解，在聯(lián)合作用的研究中采用了各種藥物濃度的聯(lián)合使用(表2)。用相互非特異方程計(jì)算CIs并從的平均影響數(shù)計(jì)算每個(gè)藥物濃度的CI。CI＞1、CI＝1和CI＜1分別表示對(duì)抗、附加效果和增效。
表2白花前胡與各種濃度的阿霉素聯(lián)合指數(shù)和增效作用研究。白化前胡粗提物與各種濃度的阿霉素藥物的聯(lián)合以藥物A～H來(lái)表示


結(jié)果聯(lián)合作用的結(jié)果顯示，在MDR KB-V1細(xì)胞中，特別是在部分殺傷＞50％時(shí)，白花前胡與阿霉素有極強(qiáng)的增效作用(圖3)。這些實(shí)驗(yàn)還表明，在MDR KB-V1細(xì)胞中，白花前胡與阿霉素的增效作用是劑量依賴的，白花前胡粗提物的濃度范圍從23.4375μg/ml至1500μg/ml。在濃度范圍為23.4375μg/ml至1500μg/ml的相同的粗提物濃度下，用作對(duì)照實(shí)驗(yàn)的KB-3-1細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出有相互的增效作用(圖3A)，聯(lián)合作用的研究顯示對(duì)MDR細(xì)胞白花前胡將產(chǎn)生增效活性，這將開(kāi)辟未來(lái)聯(lián)合化學(xué)預(yù)防和治療戰(zhàn)略上的潛在途徑(表2)。
4、白花前胡對(duì)化療藥物增效作用的機(jī)制研究有研究表明，白花前胡對(duì)化療藥物的增效作用是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的MDR1(腫瘤多重耐藥基因)和MRP(ATP-依賴的多重耐藥相關(guān)蛋白)基因及其表達(dá)的P-gp蛋白和MRP蛋白，從而有效地抑制了腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MDR，提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
經(jīng)對(duì)白花前胡的進(jìn)一步提取和純化，發(fā)明人成功地從白花前胡中分離并鑒定了單一成分的化合物——吡喃香豆素(下稱APC)，圖4為APC的HPLC分析圖譜，從圖1和圖4的對(duì)比中可發(fā)現(xiàn)，白花前胡乙醇粗提物(圖1)中的主要成分即為APC，進(jìn)一步從分子水平對(duì)APC對(duì)腫瘤細(xì)胞MDR的抑制作用進(jìn)行的研究表明，APC可下調(diào)MDR1和MRP的mRNA水平，并且以劑量依賴方式在MDR KB-V1細(xì)胞中抑制P-gp和MRP的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)和結(jié)果已記錄在申請(qǐng)人于2001年12月19日提交的另一中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)01143860.6中，在此不再重復(fù)贅述。
因此，白花前胡是P-gp介導(dǎo)的MDR和MRP介導(dǎo)的MDR的有效抑制劑。
在用于治療腫瘤時(shí)，白花前胡可以以傳統(tǒng)中藥的用法，作為中藥單方、組方或復(fù)方中的有效成分使用，也可以對(duì)其中的有效成分進(jìn)行提取(例如，乙醇抽提)和純化后，作為藥物組合物的有效成分，在治療腫瘤中發(fā)揮作用。
總而言之，中國(guó)傳統(tǒng)中藥白花前胡與常用的化療藥物相比具有輕微的細(xì)胞毒性，可選擇性誘導(dǎo)MDR細(xì)胞凋亡，在MDR細(xì)胞中與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用具有增效作用，白花前胡是一種在體外可逆轉(zhuǎn)MDR的新的特異性藥物。
以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.中藥白花前胡或其有效成分或含有它們中任何一種的藥物組合物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述白花前胡或其有效成分或含有它們中任何一種的藥物組合物在制備治療腫瘤藥物中單獨(dú)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述白花前胡或其有效成分或含有它們中任何一種的藥物組合物與化療藥物聯(lián)合使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述化療藥物選自抗代謝產(chǎn)物、微管抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑或鉑化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述化療藥物為阿霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國(guó)傳統(tǒng)中藥—白花前胡的第二醫(yī)藥用途，白花前胡或其有效成分或含有它們?nèi)魏我环N的藥物組合物可作為腫瘤化療中的輔助藥物中的有效成分，通過(guò)有效抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多重耐藥性(MDR)而對(duì)化療藥物起到增效作用，也可作為抗腫瘤藥物中的有效成分，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1433790SQ0210248
公開(kāi)日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2002年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月21日
發(fā)明者方宏勛, 胡耀昌 申請(qǐng)人:方宏勛, 胡耀昌