專利名稱：中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因ej01編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
由于中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1在GenBank數(shù)據(jù)庫中尚無同源基因，本發(fā)明人對該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果全都是開創(chuàng)性的。美國國家生物技術(shù)情報中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)已正式接受該基因為GenBank的新成員，接受號為AY185917。GAGAGTATCT GGAGTCTTAG ACCTGAACAT ACGGACGAGA TGTGGTGCAG TATCTTGCTG60GCGGCAGTGA TGGTGGCGGT GGCGGGCGGC CAGAGTCGAT TTAGTTATGA TGGGACGCCC 120CTGGCTGACG ACGTTGTAGT TGGGTCAGGA CAGCGTCAGC AGTTCTTTGC GTCCCGACAG 180CCCCGGCCAC AACAGCTGTT TGTACAGGAG CGGCCCCAGC AGGTCTTCGT CCAGCAGCAG 240CCTCAGCCAC CGGTGTTTGT GCAGCCTGAG CCACAGCAGG TGTTTGTGCA GCCCCAGCCA 300CGCCCCATGT TCCAGATGCT CCCCTCGTTC TCACAGCAGG CGGCGGTGAT CCAGAGCGTC 360CAGCCGCAAG TGTCTTCCGC CTGTCCGGCC ACTTACTCCC TGGTCCACAC CACCTACCAA 420GGCCGAGTCT ACCACTCCTC CTGGTGCAAC CTGCCCGGCC ACCGTTTCTC CCAGTCCGCC 480GCCAGAGACT ACTGCCGCGG CCTCGGCGAG GTAACAGTGA TGAACCGACG CGGCAGCTTT 540GACCTATACA GCGTCGATCG CACTACTGAT TTCGATTACT TCTTCGAGCT GCTCCTCCAG 600CACCAAATCC CCTCCGTCTG GACCAGGGAC CTTGCCTCCA CCGCGCCCTA TGAAATCCGC 660GGCTCCATCA CCAGGTCCGG GGACTCTACG GCTGGCCAAG ACTGCCTCTC GCTGGAGGCT 720TCCACAGACG GCCTCTTCCT CCTCCAGGAC TCTTGCTCCG ACCGGAAGGC CGCCGTCTGC 780GTGGCTCATT GGCAGTAGAT GAGTTTGTCA ATAACCTGCT TATCATTGTG TAAATAAATG 840TGCTCCTACA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 876中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1的cDNA序列Met Trp Cys Ser Ile Leu Leu Ala Ala Val Met Val Ala Val Ala Gly Gly Gln Ser Arg16 11 16Phe Ser Tyr Asp Gly Thr Pro Leu Ala Asp Asp Val Val Val Gly Ser Gly Gln Arg Gln21 26 31 36Gln Phe Phe Ala Ser Arg Gln Pro Arg Pro Gln Gln Leu Phe Val Gln Glu Arg Pro Gln41 46 51 56Gln Val Phe Val Gln Gln Gln Pro Gln Pro Pro Val Phe Val Gln Pro Glu Pro Gln Gln61 66 71 76Val Phe Val Gln Pro Gln Pro Arg Pro Met Phe Gln Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala81 86 91 96Ala Val Ile Gln Ser Val Gln Pro Gln Val Ser Ser Ala Cys Pro Ala Thr Tyr Ser Leu101 106 111 116Val His Thr Thr Tyr Gln Gly Arg Val Tyr His Ser Ser Trp Cys Asn Leu Pro Gly His121 126 131 136Arg Phe Ser Gln Ser Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Arg Gly Leu Gly Glu Val Thr Val Met141 146 151 156Asn Arg Arg Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Val Asp Arg Thr Thr Asp Phe Asp Tyr Phe161 166 171 176Phe Glu Leu Leu Leu Gln His Gln Ile Pro Ser Val Trp Thr Arg Asp Leu Ala Ser Thr181 186 191 196Ala Pro Tyr Glu Ile Arg Gly Ser Ile Thr Arg Ser Gly Asp Ser Thr Ala Gly Gln Asp201 206 211 216Cys Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Asp Gly Leu Phe Leu Leu Gln Asp Ser Cys Ser Asp221 226 231 236Arg Lys Ala Ala Val Cys Val Ala His Trp Gln Glx241 246 251中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1編碼蛋白的氨基酸序列本發(fā)明的目的鑒于中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類對此基因的認識和了解僅限于本發(fā)明人所做的研究，且該基因是中華絨螯蟹卵巢發(fā)育過程中的差異表達基因，因此該基因很可能具有調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育的功能。本發(fā)明擬通過對EJO1基因功能的研究，從基因工程技術(shù)角度尋找解決河蟹性早熟這一問題的方法，為發(fā)展河蟹養(yǎng)殖業(yè)服務(wù)。EJO1基因的研究可用于1、通過制備該基因的融合蛋白，用于研究該基因與中華絨螯蟹卵巢發(fā)育的關(guān)系。
2、制備抗體中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1編碼蛋白抗體的制備，可用于免疫組織化學染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等根據(jù)免疫學原理設(shè)計的檢測方法，也可用于該基因編碼蛋白在組織細胞中的定位和定量研究。該抗體有可能用于中華絨螯蟹雌性性早熟個體的早期鑒別。
3、將根據(jù)該基因制備的融合蛋白作用于雌性性早熟個體，有可能通過劑量的控制，減緩雌性性早熟個體卵巢的發(fā)育速度。本發(fā)明技術(shù)方案1、中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1的融合蛋白的制備以中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1開放閱讀框的核苷酸序列與質(zhì)粒pDESTTM15制備成GST-EJO1-pDEST15表達質(zhì)粒，在無NaCL的LB中30℃培養(yǎng)到OD600為0.5，經(jīng)0.3MNaCL誘導，超聲粉碎后經(jīng)GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。
2、中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1編碼蛋白特異性多克隆抗體將融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Lncomplete Freund’s Adjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發(fā)注射一次，共三次，于3個月后取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA，測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進一步用抗原作競爭抑制免疫試驗確定抗體的特異性。根據(jù)ELISA結(jié)果確定其用于免疫組織化學染色的稀釋倍數(shù)1∶200～500。
3、中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1的融合蛋白用于控制卵巢發(fā)育通過注射法或浸泡法將不同劑量的中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1的融合蛋白送入中華絨螯蟹的幼體內(nèi)，觀察卵巢發(fā)育情況；并通過融合蛋白對雌性性早熟個體卵巢發(fā)育的影響實驗，確定能夠抑制雌性個體性早熟的合適劑量。
權(quán)利要求
1.一種中華絨螯蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因(EJO1)克隆制備的融合蛋白，其特征是EJO1基因全部開放閱讀框編碼的氨基酸，序列為Met Trp Cys Ser Ile Leu Leu Ala Ala Val Met Val Ala Val Ala Gly Gly Gln Ser Arg16 11 16Phe Ser Tyr Asp Gly Thr Pro Leu Ala Asp Asp Val Val Val Gly Ser Gly Gln Arg Gln21 26 31 36Gln Phe Phe Ala Ser Arg Gln Pro Arg Pro Gln Gln Leu Phe Val Gln Glu Arg Pro Gln41 46 51 56Gln Val Phe Val Gln Gln Gln Pro Gln Pro Pro Val Phe Val Gln Pro Glu Pro Gln Gln61 66 71 76Val Phe Val Gln Pro Gln Pro Arg Pro Met Phe Gln Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala81 86 91 96Ala Val Ile Gln Ser Val Gln Pro Gln Val Ser Ser Ala Cys Pro Ala Thr Tyr Ser Leu101 106 111 116Val His Thr Thr Tyr Gln Gly Arg Val Tyr His Ser Ser Trp Cys Asn Leu Pro Gly His121 126 131 136Arg Phe Ser Gln Ser Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Arg Gly Leu Gly Glu Val Thr Val Met141 146 151 156Asn Arg Arg Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Val Asp Arg Thr Thr Asp Phe Asp Tyr Phe161 166 171 176Phe Glu Leu Leu Leu Gln His Gln Ile Pro Ser Val Trp Thr Arg Asp Leu Ala Ser Thr181 186 191 196Ala Pro Tyr Glu Ile Arg Gly Ser Ile Thr Arg Ser Gly Asp Ser Thr Ala Gly Gln Asp201 206 211 216Cys Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Asp Gly Leu Phe Leu Leu Gln Asp Ser Cys Ser Asp221 226 231 236Arg Lys Ala Ala Val Cys Val Ala His Trp Gln Glx241 246 251
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，針對EJO1基因開放閱讀框編碼的氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，針對EJO1基因開放閱讀框編碼的氨基酸序列制備的融合蛋白，其特征是可用于解決養(yǎng)殖過程中雌性中華絨螯蟹的性早熟問題。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，所述的中華絨螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)卵巢發(fā)育相關(guān)基因EJO1的cDNA全長為876 bp，開放閱讀框為759 bp，編碼252個氨基酸，GenBank接受號為AY185917。該基因在中華絨螯蟹的卵巢發(fā)育過程中存在表達差異，查閱基因庫，該基因為新基因。本發(fā)明利用EJO1基因克隆制備融合蛋白，并利用該蛋白免疫動物制備多克隆抗體，同時將該蛋白用于解決養(yǎng)殖過程中雌性中華絨螯蟹的性早熟問題。
文檔編號A61P15/08GK1431224SQ0311270
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日
發(fā)明者周開亞, 馬長艷 申請人:南京師范大學