專利名稱：自體移植的方法,器械和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟骨細(xì)胞移植，骨和軟骨移植，愈合，關(guān)節(jié)修復(fù)和預(yù)防關(guān)節(jié)炎病理變化的領(lǐng)域。特別是提供準(zhǔn)備移植位點(diǎn)的方法，作所述準(zhǔn)備和將細(xì)胞自體移植到所準(zhǔn)備移植位點(diǎn)的器械。
背景技術(shù)：
美國(guó)每年進(jìn)行500,000例以上的關(guān)節(jié)形成術(shù)和全關(guān)節(jié)置換術(shù)。在歐洲進(jìn)行類似手術(shù)的數(shù)量基本相同。該數(shù)字包括歐洲每年的大約90,000例全膝蓋置換術(shù)和大約50,000例修復(fù)膝蓋缺損的手術(shù)。該項(xiàng)手術(shù)的數(shù)量與美國(guó)基本相等。(InPraemer A.，F(xiàn)urner S.，Rice，D.P.，Musculoskeletal conditions in theUnited States，American Academy of Orthopaedic Surgeons，Park Ridge，Ill.，1992，125)。軟骨的再生處理方法會(huì)很有用，并且可在關(guān)節(jié)損害的早期階段進(jìn)行，從而減少需要人工關(guān)節(jié)置換外科手術(shù)的病人數(shù)量。通過(guò)此種預(yù)防性處理方法，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病病人的數(shù)量也會(huì)減少。
用于關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨結(jié)構(gòu)表面重建的技術(shù)主要用軟骨下鉆孔，磨損和其它切除患病軟骨和軟骨下的骨，暴露血管化松質(zhì)骨的方法(Insall，J.，Clin.Orthop.1974，101，61；Ficat R.P.等Clin Orthop.1979；144，74；Johnson L.L.，InOperative Arthroscopy，McGinty J.B.，Ed.，Raven Press，New York，1991，341)來(lái)誘導(dǎo)軟骨修復(fù)。
Coon和Cahn(Science 1966，153，1116)描述了一種從小雞胚胎體節(jié)進(jìn)行軟骨合成細(xì)胞培養(yǎng)的方法。之后Cahn和Lasher(PNAS USA 1967，58，1131)用此系統(tǒng)分析作為軟骨分化先決條件所涉及的DNA合成。軟骨細(xì)胞會(huì)響應(yīng)EFG和FGF而生長(zhǎng)(Gospodarowicz和Mescher，J.Cell Physiology 1977，93，117)，但最終會(huì)失去它們的分化功能(Benya等Cell 1978，15，1313)。過(guò)去描述的軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)方法已被Brittberg，M.等(New Engl.J.Med.1994，331，889)稍做調(diào)整來(lái)主要應(yīng)用。用這些方法生長(zhǎng)的細(xì)胞被用作病人膝蓋關(guān)節(jié)的自體移植物。另外，Kolettas等(J.Cell Science 1995，108，1991)檢查了軟骨-特異性分子如膠原蛋白和蛋白聚糖在延長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)除了在單層培養(yǎng)物的培養(yǎng)中的形態(tài)學(xué)變化外(Aulthouse，A.等.，In Vitro Cell Dev.Biol.，1989，25，659；Archer，C.等，J.Cell Sci.1990，97，361；Hanselmann，H.等，J.Cell Sci.1994，107，17；Bonaventure，J.等，Exp.Cell Res.1994，212，97)，當(dāng)與在瓊脂糖凝膠，藻膠珠子上生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物相比時(shí)，或者當(dāng)很多科學(xué)家所檢測(cè)的離心培養(yǎng)物(保持圓形細(xì)胞形態(tài))不變時(shí)，所述軟骨細(xì)胞-表達(dá)標(biāo)記如II型和IX型膠原蛋白及大聚集蛋白聚糖，聚集蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖和連接蛋白不發(fā)生變化(Kolettas，E.等，J.Cell Science 1995，108，1991)。
關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是僅發(fā)現(xiàn)于軟骨的特化間充質(zhì)衍生的細(xì)胞。軟骨為一類其物理性質(zhì)依賴于所述軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的無(wú)血管組織。在軟骨內(nèi)骨化過(guò)程中，軟骨細(xì)胞成熟從而導(dǎo)致了以X型膠原蛋白開(kāi)始表達(dá)為特征的細(xì)胞肥大(Upholt，W.B.and Olsen，R.R.，InCartilage Molecular Aspects(Hall，B &Newman，S，Eds.)CRC Boca Raton 1991，43；Reichenberger，E.等，Dev.Biol.1991，148，562；Kirsch，T.等，Differentiation，1992，52，89；Stephens，M.等，J.Cell Sci.1993，103，1111)。
II型膠原蛋白在關(guān)節(jié)的外層或關(guān)節(jié)表面的過(guò)度降解也由骨關(guān)節(jié)炎造成。所述膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)相應(yīng)變?nèi)踅Y(jié)果發(fā)展了原纖維形成作用，其中基質(zhì)材料如蛋白聚糖丟失并最后被完全置換。該變?nèi)醯墓顷P(guān)節(jié)炎性軟骨的原纖維形成作用可深達(dá)鈣化軟骨并達(dá)到所述軟骨下的骨(Kempson，G.E.等，Biochim.Biophys.Acta 1976，428，741；Roth，V.和Mow，V.C.，J.Bone Joint Surgery，1980，62A，1102；Woo，S.L.-Y.等，in Handbook of Bioengineering(R.Skalak和S.Chien eds.)，McGraw-Hill，New York，1987，pp.4.1-4.44)。
關(guān)于骨，軟骨和其它此類結(jié)締組織的基本發(fā)育，組織學(xué)和顯微解剖學(xué)描述可見(jiàn)例如Wheater，Burkitt和Daniels，F(xiàn)unctional Histology，2nd Edition，(Churchill Livingstone，London，1987，Chp.4)。關(guān)于骨，軟骨和其它此類結(jié)締組織的缺損的基本組織解剖學(xué)描述可見(jiàn)例如Wheater，Burkitt，Stevens和Lowe，Basic Histopathology(Churchill Livingstone，London，1985，Chp.21)。
除了在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，和處理骨和軟骨上的進(jìn)步外，在試圖移植軟骨或軟骨細(xì)胞用于修復(fù)受損關(guān)節(jié)表面上沒(méi)有太大突破。本發(fā)明提供了有效并且高效的方法，它可以促進(jìn)軟骨和/或軟骨細(xì)胞移植到在關(guān)節(jié)(articulating joint)或其它軟骨覆蓋的骨表面的缺損，其中使軟骨再生從而修復(fù)所述缺損。本發(fā)明也提供了被設(shè)計(jì)用來(lái)準(zhǔn)備移植位點(diǎn)從而有利于移植材料高效整合到移植位點(diǎn)的外科手術(shù)器械。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種有效處理關(guān)節(jié)面軟骨的方法，該方法是通過(guò)在合適基質(zhì)中將軟骨細(xì)胞與止血屏障和無(wú)細(xì)胞蓋片(covering-patch)移植到要處理的表面，具體包括首先將止血屏障臨近要處理的表面，將合適基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞置于遠(yuǎn)離止血屏障的要處理的表面上，用無(wú)細(xì)胞蓋片覆蓋要處理的表面。如下進(jìn)一步介紹的止血屏障，為抑制血管化細(xì)胞穿透并組織化進(jìn)入要移植材料的屏障。具體來(lái)說(shuō)，本方法提供了一種為可重吸收(resorbable)，半滲透性材料的止血屏障，其抑制或阻止血管穿過(guò)所述屏障。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述止血屏障含有膠原蛋白。在本領(lǐng)域中如本文所用的無(wú)細(xì)胞，是指一種材料基本上不帶有能進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞分裂，播散或具有生物活性的完整細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，無(wú)細(xì)胞材料不帶有所有完整的有核細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，本方法包括含有半滲透性膠原蛋白基質(zhì)的無(wú)細(xì)胞蓋片的用途。在本方法一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述無(wú)細(xì)胞蓋片的有孔表面直接導(dǎo)向(directed towards)所述植入材料。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了將膠原蛋白或軟骨細(xì)胞自體移植到移植位點(diǎn)，其中所述移植位點(diǎn)首先通過(guò)外科手術(shù)處理來(lái)準(zhǔn)備從而更容易接納所述移植材料。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，造型(sculpt)所述移植位點(diǎn)來(lái)使此移植位點(diǎn)的壁輪廓呈波動(dòng)型，從而在把所述移植材料置于該移植位點(diǎn)內(nèi)并伸展以接觸所述移植位點(diǎn)壁時(shí)，會(huì)抗拒整個(gè)移植物從所述移植位點(diǎn)移動(dòng)或者排除。本發(fā)明進(jìn)一步提供了如本發(fā)明方法所授設(shè)計(jì)用來(lái)造型所述移植位點(diǎn)的外科手術(shù)器械。
本發(fā)明還提供了將軟骨和/或軟骨細(xì)胞移植到關(guān)節(jié)表面的試劑盒，其中該試劑盒包括止血屏障，無(wú)細(xì)胞半滲透性蓋片，和有機(jī)膠。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒還可選提供一或多種根據(jù)本發(fā)明方法用來(lái)造型所述移植位點(diǎn)的外科手術(shù)器械。
本發(fā)明還提供了用于動(dòng)物軟骨修復(fù)的植入物。在一實(shí)施方案中，所述植入物為1)支持基質(zhì)，2)軟骨細(xì)胞，和3)粘附到支持基質(zhì)邊緣的生物相容性膠合劑。在一實(shí)施方案中，所述支持會(huì)被所述動(dòng)物吸收。
附圖簡(jiǎn)述通過(guò)下述說(shuō)明本發(fā)明某些性質(zhì)的圖表將有利于更好理解本發(fā)明，其中

圖1A用繪圖顯示了骨的典型關(guān)節(jié)末端。通常，骨材料覆蓋在帶有軟骨帽的關(guān)節(jié)表面(見(jiàn)交叉影線所示)。
圖1B的實(shí)例顯示了軟骨帽出現(xiàn)缺損或損傷的位置(交叉影線中的間隙)，此缺損可被直接處理，輕微放大，或造型從而在處理前通過(guò)外科手術(shù)來(lái)接受所述移植材料。
圖1C顯示止血屏障(實(shí)心黑色，附圖標(biāo)記1)如何被置于軟骨帽內(nèi)的缺損來(lái)抑制或避免從下面的骨血管化進(jìn)入再生軟骨。然后將要植入缺損腔的軟骨細(xì)胞置于所述止血屏障的頂部。
圖2用繪圖顯示了在軟骨帽(交叉影線區(qū)域)內(nèi)為無(wú)細(xì)胞半滲透性材料(實(shí)心黑色，附圖標(biāo)記2)所覆蓋的要處理的缺陷(交叉影線區(qū)域中的間隙)，所述材料被用于形成覆蓋于缺損位點(diǎn)的帽/貼片(patch)或繃帶。通過(guò)粘附，或縫合在位于所述腔和健康軟骨的邊緣來(lái)將該帽固定。該帽覆蓋所述關(guān)節(jié)的缺損區(qū)域，此區(qū)域中已經(jīng)置入膠和所培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞/軟骨移植物。
圖3A用圖表說(shuō)明較硬和較軟的軟骨對(duì)壓縮和剪切力量的差別(differential)反應(yīng)及所得的分界區(qū)。
圖3B圖示在造型所述缺陷使其具有波動(dòng)形壁之后的移植位點(diǎn)。
圖3C圖示造型后的移植位點(diǎn)，其中止血屏障(1)，移植材料(3)，和無(wú)細(xì)胞蓋片(2)位于關(guān)節(jié)表面軟骨(4)內(nèi)。
圖4A圖示了本發(fā)明外科手術(shù)裝置的一實(shí)施方案，所示為切齒(5)和突出的定位針(placement pin)(6)。
圖4B圖示了本發(fā)明外科手術(shù)裝置的另一實(shí)施方案。
圖5用圖表說(shuō)明較硬和較軟的軟骨在造型所述移植位點(diǎn)后對(duì)壓縮和剪切力量的改進(jìn)差別反應(yīng)。
圖6A為顯示左側(cè)(內(nèi)側(cè))髁的軟骨缺陷的豬膝蓋的MRI影像。
圖6B為處理3月后同一只豬膝蓋的MRI影像。
圖7圖示了無(wú)止血屏障的移植位點(diǎn)或缺陷(23)，其包括移植細(xì)胞(21)和生物相容性膠(22)在具有有孔面的支持基質(zhì)(18)上的混合物，軟骨材料和移植材料的界面(30)，軟骨(10)，骨材料和軟骨材料的界面(12)，可重吸收針(24)和骨材料(14)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及某些抑制血管組織形成，例如如在軟骨細(xì)胞自體移植到軟骨內(nèi)缺陷過(guò)程中毛細(xì)血管袢(capillary loop)突入所形成軟骨的產(chǎn)品的用途。從其下的骨形成的血管組織會(huì)趨向于突入要形成的新軟骨從而導(dǎo)致出現(xiàn)所需間充質(zhì)特化軟骨細(xì)胞以外的細(xì)胞。
由血管化引入的污染細(xì)胞會(huì)引起植入的軟骨細(xì)胞侵蝕和過(guò)度生長(zhǎng)進(jìn)入所形成的軟骨。本發(fā)明可用的商品之一是Surgicel(Ethicon Ltd.，UK)，它會(huì)在7-14天的階段后被吸收。該材料在本發(fā)明方法中的用途與Ethicon Ltd的止血裝置，如Surgicel在其包裝插頁(yè)中所述的一般用途相反。
我們驚喜地發(fā)現(xiàn)在希望抑制血運(yùn)重建(revascularization)進(jìn)入軟骨時(shí)，止血材料會(huì)象凝膠樣人工凝結(jié)物一樣作用。如果紅細(xì)胞位于被止血屏障帽狀覆蓋的關(guān)節(jié)軟骨全層(full-thickness)缺損內(nèi)，這些血細(xì)胞會(huì)化學(xué)變化成為血色素，從而不能誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)。由此，用作血運(yùn)重建抑制屏障的止血產(chǎn)物有或無(wú)纖維蛋白膠粘劑，如例如Surgicel，對(duì)如本發(fā)明所授構(gòu)思的方法都是有效的。本發(fā)明的另一部分是無(wú)細(xì)胞組分的應(yīng)用，該組分被用作貼片來(lái)覆蓋移植入所培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞/軟骨的關(guān)節(jié)缺損區(qū)域，用自體軟骨細(xì)胞來(lái)移植。本發(fā)明方法也考慮應(yīng)用合適的同種軟骨細(xì)胞或異種軟骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)軟骨缺損。
從而本發(fā)明教導(dǎo)了有效修復(fù)或處理關(guān)節(jié)骨表面內(nèi)軟骨缺損的方法，該法包括給予制劑或裝置來(lái)阻斷血管侵入需修復(fù)的軟骨位點(diǎn)，并提供無(wú)細(xì)胞屏障來(lái)分離修復(fù)位點(diǎn)并保持所移植細(xì)胞在位。本發(fā)明也提供了包含插入要修復(fù)位點(diǎn)的止血屏障組分的試劑盒，由此可有效抑制所修復(fù)位點(diǎn)的血管化；一旦把要移植的軟骨細(xì)胞置于要修復(fù)的位點(diǎn)，就將無(wú)細(xì)胞半滲透性屏障帽狀覆蓋到所述修復(fù)位點(diǎn)上來(lái)將被移植的軟骨細(xì)胞保持在位，但仍有途徑能獲得營(yíng)養(yǎng)。
本發(fā)明的某些方面已經(jīng)舉例應(yīng)用體外系統(tǒng)來(lái)研究所述軟骨細(xì)胞在接觸到抑制血管組織形成的某產(chǎn)品或某些產(chǎn)品組合物時(shí)的行為。該體外試驗(yàn)預(yù)測(cè)了某些待測(cè)材料抑制血管化的能力，所述情況就如同在體內(nèi)，在軟骨細(xì)胞自體移植入軟骨內(nèi)缺陷的過(guò)程中毛細(xì)血管袢突入所建立的軟骨時(shí)會(huì)出現(xiàn)的那樣。
合適的止血產(chǎn)品以能抑制血管組織，骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等生長(zhǎng)或侵入發(fā)育中的軟骨為特征。合適的止血材料可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的目的，因?yàn)榭梢苑乐箯难芎图?xì)胞侵入發(fā)育中的軟骨來(lái)最優(yōu)化軟骨形成并全層修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的任何缺損。理想的話，所述止血屏障將穩(wěn)定足以完全修復(fù)軟骨的較長(zhǎng)(extended)一段時(shí)間，然后被重吸收或者隨時(shí)間而降解。一種經(jīng)鑒定認(rèn)為合適的材料被稱作SurgicelW1912(含有氧化的可再生無(wú)菌纖維素的可吸收止血?jiǎng)?hemostat)；Lot GG3DH，Ethicon Ltd.UK)。另一種合適材料的實(shí)例為BioGide(商品化I型膠原蛋白基質(zhì)墊(pad)；Geistlich Sohne，Switzerland)。
發(fā)現(xiàn)可以商品化的合適有機(jī)膠材料有，例如Tisseel或Tissucol(纖維蛋白基的膠合劑；Immune AG，Austria)，Adhesive Protein(Cat.#A-2707，SigmaChemical，USA)，和Dow Cornling Medical Adhesive B(Cat.#895-3，DowCorning，USA)。
本發(fā)明包括的外科手術(shù)器械可以用適合制備一次使用的一次性或多次使用的重復(fù)使用的外科手術(shù)器械的金屬和/或塑料制造。所述切割器械可包含閉合環(huán)狀(fully circular)或扁平的，或介于之中的切割齒。當(dāng)軟骨為相對(duì)軟的材料時(shí)，它對(duì)于制備可以不損壞骨就造型軟骨的較硬塑料切割邊緣是有利的。制造的該切割器械可以結(jié)合給予液體和吸取除去切割殘?jiān)鸵后w的開(kāi)口，以及為缺損位點(diǎn)照明和可視的光導(dǎo)纖維線(fiber optic threads)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)胞21和膠22以(1)膠22和細(xì)胞21的混合物或(2)支持基質(zhì)18上細(xì)胞21和膠22的一或多交替層來(lái)組合(combine)在一起。
在一個(gè)此類實(shí)施方案中，認(rèn)為細(xì)胞21是要移植到缺損23的自體軟骨細(xì)胞。在把軟骨細(xì)胞/膠混合物用到支持基質(zhì)18之前，以均勻或非均勻方式將軟骨細(xì)胞21與合適的膠22混合。優(yōu)選，立即混合膠22和軟骨細(xì)胞21(也就是說(shuō)，在操作臺(tái)上)是在把膠22和細(xì)胞21用到支持基質(zhì)18，并且把膠22，細(xì)胞21和支持基質(zhì)18的組合物植入缺損23之前?；蛘呒?xì)胞21和膠22以一或多層交替應(yīng)用到支持基質(zhì)18上。在一實(shí)施方案中，膠22是生物相容性膠，如纖維素膠，更具體為自體纖維蛋白膠或非自體纖維蛋白膠。優(yōu)選應(yīng)用自體纖維蛋白膠。
當(dāng)軟骨細(xì)胞21在支持基質(zhì)23上與膠22組合，將所述膠/軟骨細(xì)胞/支持基質(zhì)組合物植入缺損23，具有或不具有骨14和膠/軟骨細(xì)胞/支持基質(zhì)組合物之間的止血屏障(如本文所述)。在一實(shí)施方案中，如圖2所示，被處理的缺損23不含有骨14和膠/軟骨細(xì)胞/支持基質(zhì)組合物之間的止血屏障。
在一實(shí)施方案中，如圖7所示，不用通過(guò)在膠/軟骨細(xì)胞/支持基質(zhì)組合物和缺損23的基底之間應(yīng)用止血屏障，就可根據(jù)本發(fā)明類似處理缺損23。
另外，在圖7所示的實(shí)施方案中，膠22和軟骨細(xì)胞21的組合物只存在于支持基質(zhì)18的一部分。例如，膠22和軟骨細(xì)胞21優(yōu)選只存在于支持基質(zhì)18有孔面的外邊緣?；蛘撸浌羌?xì)胞21和/或膠22穿入支持基質(zhì)18有孔面達(dá)到理想水平，例如支持基質(zhì)18深度的2-50％。典型地，所述支持基質(zhì)18在離粗糙面，也就是細(xì)胞21和膠22沉積的一面最近時(shí)，其有孔性最高，而在支持基質(zhì)18的相反面其有孔性最低。如圖7進(jìn)一步闡述，支持基質(zhì)18的有孔性以陰影來(lái)表示，陰影越深表示有孔性越低，陰影越淺表示有孔性越高。
在另一實(shí)施方案中，將軟骨細(xì)胞21用到支持基質(zhì)18，然后用一層合適的生物相容性膠22覆蓋。盡管在支持基質(zhì)18上的一單層軟骨細(xì)胞21和位于(positioned)軟骨細(xì)胞21上的一單層膠22足以有效處理缺損，還是可用一層以上的膠22和軟骨細(xì)胞21交替層。或者，首先將一層生物相容性膠22沉積到支持基質(zhì)18上，再將一層軟骨細(xì)胞21沉積到膠22上。
在一實(shí)施方案中，支持基質(zhì)18為能支持軟骨細(xì)胞21生長(zhǎng)并賦予所述移植物件物理完整性來(lái)方便其處理的片狀膜。在一實(shí)施方案中，支持基質(zhì)18包括多肽或蛋白如膠原蛋白。特別的是，支持基質(zhì)18包括馬，豬，牛，羊和雞的膠原蛋白。另外，所述膠原蛋白可以為I型或II型膠原蛋白。適宜膠原蛋白支持基質(zhì)18的實(shí)例包括ChondraGide和BioGide(商品化I型膠原蛋白基質(zhì)墊；購(gòu)自Geistlich Sohne，Switzerland)。另外，支持基質(zhì)18可以可逆變形并或者具有如上所述的一有孔粗糙面，或者一光滑面，或者兩粗糙面。盡管任何一面都可以是有孔的，在本文所述的一實(shí)施方案中，相對(duì)于光滑面所述粗糙面還是具有較高的有孔性。如圖7所示，支持基質(zhì)18和位于其上的細(xì)胞21可用額外的生物相容性膠22和/或一或多枚生物可相容重吸收針24來(lái)被保持在缺損內(nèi)。
在一實(shí)施方案中，支持基質(zhì)18的一或多個(gè)部分在性狀上或者是固體或者是凝膠樣的。
通過(guò)下面的實(shí)施例可能更容易理解本發(fā)明某些方面，所述實(shí)施例是為闡述而不是為了限定。
實(shí)施例1
為了根據(jù)本發(fā)明將Surgicel用于避免血管發(fā)展入自體植入的軟骨或軟骨細(xì)胞，首先用固定劑，如戊二醛處理Surgicel。簡(jiǎn)單講，用0.6％戊二醛處理Surgicel1分鐘，之后多次洗滌去除另外對(duì)組織有毒的戊二醛殘基?；蛘呷鐚?shí)施例2所述，Surgicel與稱作Tisseel的纖維蛋白膠粘劑在用戊二醛處理前進(jìn)行處理。我們發(fā)現(xiàn)例如用固定劑如戊二醛固定，之后用無(wú)菌生理鹽水(0.9％)洗滌并儲(chǔ)藏在冰箱中的Surgicel，在1到2月內(nèi)不溶解。通常，Surgicel在7到14天的階段會(huì)再吸收。這段時(shí)間可能過(guò)短，因?yàn)樵谥踩氲能浌羌?xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)進(jìn)入固體軟骨層來(lái)從臨近軟骨得到它所需要的營(yíng)養(yǎng)之前，避免血管發(fā)展或血管化如從骨結(jié)構(gòu)進(jìn)入植入軟骨需要更長(zhǎng)的時(shí)間。換言之，完全抑制血管化需要更長(zhǎng)時(shí)間，如例如1個(gè)月。因此，該產(chǎn)品在這段時(shí)間之前不應(yīng)該被明顯吸收。另外最后也需要重吸收。因此，用作抑制屏障的所述有機(jī)材料應(yīng)該具有這些能力，而且發(fā)現(xiàn)以這種方式處理的Surgicel也具有該功能。
實(shí)施例2也用有機(jī)膠包被所述Surgicel，在此實(shí)施例中所用的膠為Tisseel但其它的也可用。該產(chǎn)品和Surgicel產(chǎn)生用于本發(fā)明特定目的的屏障?？捎萌魏纹渌闹寡?jiǎng)┗蜓芤种破琳稀Ｈ缦滤龌旌蟃isseel。然后通過(guò)在Surgicel材料的兩面噴涂Tisseel直至吸收來(lái)將Surgicel包被。然后讓該Tisseel(纖維蛋白膠)在室溫固化。在馬上完全固化之前，將所包被的Surgicel置于0.6％戊二醛中1分鐘然后用無(wú)菌生理鹽水(0.9％)洗滌。再用PBS和/或NaOH調(diào)整pH直到pH穩(wěn)定在7.2到7.4。之后在組織培養(yǎng)基中用如有15mM Hepes緩沖液的極限必需培養(yǎng)基/F12洗滌所述處理的Surgicel。
如本實(shí)施例所述我們用Tisseel作為纖維蛋白膠粘劑包被Surgicel。而且所述纖維蛋白膠粘劑或膠也會(huì)被直接用于Surgicel所膠著之上的朝向骨的損傷底部。所用的體外系統(tǒng)，替代體內(nèi)試驗(yàn)，由用于細(xì)胞研究工作的NUNCLONTMDelta 6-孔無(wú)菌一次性平板(NUNC.InterMed，Roskilde，Denmark)組成。每孔測(cè)量的直徑為大約4厘米。
在本發(fā)明中所述纖維蛋白膠粘劑可為任何與纖維蛋白組分生成在人可耐受的膠(Ihara，N，et al.，Burns Incl.Therm.Inj.，1984，10，396)的膠粘劑。本發(fā)明也期望任何其它可替代纖維蛋白膠粘劑使用的膠組分。在本發(fā)明中我們使用Tisseel或Tissucol(Immuno AG，Vienna，Austria)。所述Tisseel試劑盒由以下組分組成-Tisseel，一種凍干的病毒滅活的封閉劑(Sealer)，其中含有如下的可凝固蛋白纖維蛋白原，血漿纖連蛋白(CIG)和因子X(jué)III，和纖溶酶原；-抑酶肽(Aprotinin)溶液(牛的)；-纖維蛋白原4(牛的)；-纖維蛋白原500(牛的)；和-氯化鈣溶液。
該Tisseel試劑盒包含DUPLOJECT應(yīng)用系統(tǒng)。用Tisseel試劑盒的所述纖維蛋白膠粘劑或二組分封閉劑(sealant)根據(jù)Immuno AG產(chǎn)品插頁(yè)按如下方式結(jié)合。
實(shí)施例3軟骨細(xì)胞在含有HAM F12和15mM Hepes緩沖液及5-7.5％自體血清的極限必需培養(yǎng)基中在37℃的CO2孵箱生長(zhǎng)，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的100級(jí)實(shí)驗(yàn)室(Class 100laboratory)操作。其它培養(yǎng)基組合物可被用于培養(yǎng)所述軟骨細(xì)胞。在Burker-Turk室中用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化所述細(xì)胞5-10分鐘并用臺(tái)盼蘭(Trypan Blue)生存力染色計(jì)數(shù)。將所述細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整到7.5×105細(xì)胞/ml。在100級(jí)實(shí)驗(yàn)室中一個(gè)NUNCLONTM平板不蓋蓋。
將所述Surgicel止血屏障切割為適宜尺寸裝入NUNCLONTM組織培養(yǎng)盤的孔底。在此是一個(gè)尺寸約為4cm(但可以是任何可能尺寸)的環(huán)并且在無(wú)菌環(huán)境中被置于NUNCLONTMDelta 6-孔無(wú)菌一次性平板的孔底用于細(xì)胞研究工作(NUNC，Intered，Roskilde，Denmark)。如實(shí)施例1所述對(duì)置于孔底的止血屏障進(jìn)行預(yù)處理。該處理顯著延遲了所述Surgicel的吸收。然后在蒸餾水中洗滌此止血屏障多次然后再洗滌多次直到不反應(yīng)的戊二醛被洗脫干凈。用含血清的少量細(xì)胞培養(yǎng)基使其被止血屏障吸收同時(shí)使止血屏障在孔底保持濕潤(rùn)。
將1ml培養(yǎng)基中大約106個(gè)細(xì)胞直接置于所述止血屏障的頂部，在如上所述用0.4％戊二醛預(yù)處理的止血屏障表面分散。然后在37℃的CO2孵箱中培養(yǎng)所述平板60分鐘。將含5-7.5％血清的2-5ml的量的組織培養(yǎng)基小心加入到含有所述細(xì)胞的孔中，在排出培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)使所持的吸管端與孔側(cè)面成切角以避免所述細(xì)胞濺出。此時(shí)所述培養(yǎng)基表現(xiàn)為pH值太低(pH值～6.8)。之后將pH值調(diào)整到7.4-7.5。隔日一些軟骨細(xì)胞已經(jīng)以群狀(cluster)排列開(kāi)始在止血屏障上生長(zhǎng)。一些所述細(xì)胞由于在調(diào)整pH值前接觸太低的pH值已經(jīng)死亡。孵育所述平板3-7天，在第3天置換培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)末期倒出培養(yǎng)基，冷藏加入含有0.1M二甲胂酸的鈉鹽(也稱為二甲胂酸鈉，pH值用HCl調(diào)整到7.4)的2.5％戊二醛作為固定劑，用于制備后來(lái)用于電鏡檢查的所述細(xì)胞和支持物(止血屏障)制品。
實(shí)施例4軟骨細(xì)胞在含有HAM F12和15mM Hepes緩沖液及5-7.5％自體血清的極限必需培養(yǎng)基中在37℃的CO2孵箱生長(zhǎng)，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的100級(jí)實(shí)驗(yàn)室(Class 100laboratory)操作。其它培養(yǎng)基組合物可被用于培養(yǎng)所述軟骨細(xì)胞。在Burker-Turk室中用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化所述細(xì)胞5-10分鐘并用臺(tái)盼蘭生存力染色計(jì)數(shù)。將所述細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整到7.5×105細(xì)胞/ml。在100級(jí)實(shí)驗(yàn)室中一個(gè)NUNCLONTM平板不蓋蓋。
如實(shí)施例1所述用0.6％戊二醛處理Surgicel(用作止血屏障)1分鐘，然后用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液或，優(yōu)選，緩沖液如PBS緩沖液或所述培養(yǎng)基如MEM/F12洗滌，因?yàn)槲於┨幚砗蟮膒H值為6.8并應(yīng)該優(yōu)選為7.0-7.5。用DUPLOJECT系統(tǒng)將Tisseel用于Surgicel的兩面，然后用纖維蛋白粘合劑來(lái)包被要用的貼片，Surgicel的兩面。在無(wú)菌條件下令所述粘干燥至少3-5分鐘。將所述“包被的”止血屏障置于NUNCLONTMDelta 6-孔無(wú)菌一次性平板的孔底用于細(xì)胞研究工作。用含血清的少量細(xì)胞培養(yǎng)基使其被止血屏障吸收。將1ml含血清組織培養(yǎng)基中大約106個(gè)細(xì)胞直接置于所述止血?jiǎng)┑捻敳?，分散于所述止血屏障的表面。然后?7℃的CO2孵箱中培養(yǎng)所述平板60分鐘。將含5-7.5％血清的2-5ml組織培養(yǎng)基小心加入到含有所述細(xì)胞的孔中，在排出培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)使所持的吸管端與孔側(cè)面成切角以避免所述細(xì)胞濺出。3-6天后，顯微鏡檢查顯示所述細(xì)胞以滿意的方式附著并生長(zhǎng)進(jìn)入Surgicel，這表明Surgicel對(duì)軟骨細(xì)胞不顯示毒性并且所述軟骨細(xì)胞以滿意方式生長(zhǎng)進(jìn)入Surgicel。
孵育所述平板3-7天，在第3天置換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)末期倒出培養(yǎng)基，冷藏，加入含有0.1M二甲胂酸的鈉鹽(也稱為二甲胂酸鈉，pH值用HCl調(diào)整到7.4)的2.5％戊二醛作為固定劑，用于制備后來(lái)用于電鏡檢查的所述細(xì)胞和支持物(止血屏障)制品。
實(shí)施例5軟骨細(xì)胞在含有HAM F12和15mM Hepes緩沖液及5-7.5％自體血清的極限必需培養(yǎng)基中在37℃的CO2孵箱生長(zhǎng)，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的100級(jí)實(shí)驗(yàn)室(Class 100laboratory)操作。在Burker-Turk室中用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化所述細(xì)胞5-10分鐘并用臺(tái)盼蘭生存力染色計(jì)數(shù)。將所述細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整到7.5×105到2×106細(xì)胞/ml。在100級(jí)實(shí)驗(yàn)室中一個(gè)NUNCLONTM平板不蓋蓋。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Bio-Gide可被用作重吸收的雙層膜，它將作為貼片或繃帶被用于覆蓋所培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和止血屏障所移植進(jìn)入的關(guān)節(jié)缺損區(qū)域。所述Bio-Gide是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化控制制造過(guò)程(由E.D.Geistlich Sohne AG，CH-6110Wolhusen)獲得的純膠原蛋白膜。所述膠原蛋白從獸醫(yī)檢驗(yàn)的豬提取并且被小心純化來(lái)避免抗原反應(yīng)，還通過(guò)γ輻射在兩重水皰(double blisters)中滅菌。該雙層膜具有一有孔表面和一致密表面。該膜由I型和III型膠原蛋白制成不需要進(jìn)一步交聯(lián)或化學(xué)處理。所述膠原蛋白在24星期內(nèi)被重吸收。該膜保持其結(jié)構(gòu)完整性甚至當(dāng)它是濕的，它仍可通過(guò)縫合線或釘子被固定。該膜也可以或者用纖維蛋白粘合劑如Tisseel或者與縫合線一起“膠著”到鄰近的軟骨或組織。
所述Bio-Gide在100級(jí)實(shí)驗(yàn)室中不蓋蓋并且在無(wú)菌條件下置于NUNCLONTMDelta 6-孔無(wú)菌一次性平板的孔底用于細(xì)胞研究工作，該雙層膜的有孔表面或者致密表面朝上。將1ml含血清的組織培養(yǎng)基中大約106個(gè)細(xì)胞直接置于所述Bio-Gide的頂部，分散于所述Bio-Gide的有孔表面或致密表面。然后在37℃的CO2孵箱中培養(yǎng)所述平板60分鐘。將含5-7.5％血清的2-5ml組織培養(yǎng)基小心加入到含有所述細(xì)胞的孔中，在排出培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)使所持的吸管端與孔側(cè)面成切角以避免所述細(xì)胞濺出。
在軟骨細(xì)胞被置于含有Bio-Gide的孔的第2天，在Nikon倒置顯微鏡下檢查所述細(xì)胞。我們注意到一些軟骨細(xì)胞已經(jīng)粘附到所述Bio-Gide的邊緣。當(dāng)然用此顯微鏡不可能透視Bio-Gide自身。
孵育所述平板3-7天，在第3天置換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)末期倒出培養(yǎng)基，冷藏加入含有0.1M二甲胂酸的鈉鹽(也稱為二甲胂酸鈉，pH值用HCl調(diào)整到7.4)的2.5％戊二醛作為固定劑，用于制備所述細(xì)胞和在其有孔表面或致密表面有細(xì)胞培養(yǎng)的Bio-Gide支持物。然后將所述Bio-Gide貼片送到Department of Pathology，Herlev Hospital，Denmark進(jìn)行電鏡檢查。
該電鏡檢查顯示在Bio-Gide致密表面培養(yǎng)的所述軟骨細(xì)胞并不生長(zhǎng)進(jìn)入所述Bio-Gide的膠原蛋白結(jié)構(gòu)，而在Bio-Gide有孔表面培養(yǎng)的所述細(xì)胞的確生長(zhǎng)進(jìn)入該膠原蛋白結(jié)構(gòu)并且，顯示出存在蛋白聚糖但無(wú)成纖維結(jié)構(gòu)的跡象。此結(jié)果顯示當(dāng)所述膠原蛋白貼片，例如Bio-Gide貼片作為覆蓋軟骨缺損的貼片被縫合，其有孔表面應(yīng)當(dāng)朝下面對(duì)要注入所培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的缺損。然后它們能夠穿入所述膠原蛋白并產(chǎn)生符合完整表面的光滑軟骨表面，并且在這個(gè)區(qū)域?qū)?huì)構(gòu)建一層光滑的蛋白聚糖。然而，如果所述膠原蛋白的致密表面朝下面對(duì)植入所述軟骨細(xì)胞的缺損，將不會(huì)與所述膠原蛋白整合，并且所述細(xì)胞將不會(huì)如上述產(chǎn)生相同的光滑表面。
實(shí)施例6軟骨細(xì)胞在含有HAM F12和15mM Hepes緩沖液及5-7.5％自體血清的極限必需培養(yǎng)基中在37℃的CO2孵箱生長(zhǎng)，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的100級(jí)實(shí)驗(yàn)室(Class 100laboratory)操作。在Burker-Turk室中用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化所述細(xì)胞5-10分鐘并用臺(tái)盼蘭生存力染色計(jì)數(shù)。將所述細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整到7.5×105到2×106細(xì)胞/ml。在100級(jí)實(shí)驗(yàn)室中一個(gè)NUNCLONTM平板不蓋蓋。
如產(chǎn)品插頁(yè)所述，用作重吸收雙層膜的Bio-Gide也可與有機(jī)膠如比一般在Tisseel中發(fā)現(xiàn)的抑酶肽含量額外明顯較高的Tisseel一起作用。通過(guò)將抑酶肽的量增加到大約25,000KIU/ml，所述材料的重吸收將會(huì)延遲數(shù)周而不是通常的幾天。
為在體外檢測(cè)該特性，將Tisseel用到NUNCLONTM平板的孔底，并使其不完全固化。然后將一膠原蛋白貼片如Bio-Gide應(yīng)用到Tisseel上并膠著到孔底。此Bio-Gide和Tisseel的組合物被設(shè)計(jì)為會(huì)抑制或阻止血管發(fā)展或浸潤(rùn)到所述軟骨細(xì)胞移植區(qū)域的止血屏障?，F(xiàn)在此混合(hybrid)膠原蛋白貼片既能用作所述損傷底部的止血屏障(離待修復(fù)表面最近)也能用作軟骨形成的支持，因?yàn)榇诉h(yuǎn)端表面可以是所述膠原蛋白貼片的有孔面并進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)的浸潤(rùn)。因而，此混合膠原蛋白貼片也可用于覆蓋所述植入物的頂部，其膠原蛋白有孔表面朝下面對(duì)所植入的軟骨細(xì)胞，并且該屏障形成頂部。此抑酶肽成分提高的混合膠原蛋白貼片也可在沒(méi)有任何有機(jī)膠如Tisseel時(shí)使用并且直接置于缺損內(nèi)，以自然力粘附。因此，所述膠原蛋白貼片既可被用作止血屏障，也被用作所述修復(fù)/移植位點(diǎn)的無(wú)細(xì)胞覆蓋物，該貼片的有孔表面朝向所移植的軟骨細(xì)胞/軟骨。另一變體將會(huì)使用由II型膠原蛋白(例如從Geistlich Sohne AG，CH-6110 Wolhusen)組成的膠原蛋白貼片。
因此本發(fā)明提供了混合膠原蛋白貼片，其中所述貼片為抑酶肽組分水平升高，優(yōu)選大約25,000KIU/ml，與有機(jī)基質(zhì)膠連接(in association with)的膠原蛋白基質(zhì)，其中所述膠原蛋白組分與所述Bio-Gide重吸收雙層材料或II型膠原蛋白類似，并且所述有機(jī)膠與所述Tisseel材料類似。在另一實(shí)施方案中，所述混合膠原蛋白貼片不使用任何有機(jī)膠來(lái)粘附到所述修復(fù)位點(diǎn)。
實(shí)施例7因?yàn)楣顷P(guān)節(jié)炎軟骨的衰弱(weakened)結(jié)構(gòu)，可以抑制移植到缺損軟骨內(nèi)移植位點(diǎn)的所培養(yǎng)自體軟骨細(xì)胞的粘附，從而在新植入的軟骨/軟骨細(xì)胞和圍繞建立的軟骨之間產(chǎn)生邊緣區(qū)(分界區(qū))。如果以線性方式創(chuàng)造直的，光滑的壁切口來(lái)為移植物準(zhǔn)備移植位點(diǎn)，此邊緣區(qū)將會(huì)非常顯著。當(dāng)以線性方式切割所述移植位點(diǎn)時(shí)，此邊緣區(qū)的剪切和壓縮力(如圖3A所示)將會(huì)施加強(qiáng)大的力量移去該移植物。此邊緣區(qū)，以及沿此區(qū)的材料差別運(yùn)動(dòng)會(huì)抑制所述移植材料和環(huán)繞材料之間的會(huì)合痊愈。在很多例子中，所述移植物材料通常比環(huán)繞材料輕柔，然而，在一些骨關(guān)節(jié)炎疾病案例中，事實(shí)上所述環(huán)繞軟骨可以比植入的軟骨細(xì)胞/軟骨更柔軟。
所以，為了解決這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明方法教授了應(yīng)用外科器械來(lái)塑型所述移植位點(diǎn)的壁從而使此壁為非線性，并且因而提供了波動(dòng)形表面。同樣也可塑型所述移植物位點(diǎn)從而使臨近骨表面位點(diǎn)的直徑比遠(yuǎn)離骨，并位于軟骨表面的開(kāi)口尺寸大。然而，優(yōu)選實(shí)施方案描述了以類似于穿線開(kāi)口的方式來(lái)塑型移植位點(diǎn)的壁來(lái)接受螺釘或螺絲(如圖3B所述)，從而提供了來(lái)自所述移植位點(diǎn)對(duì)所述移植材料壓縮和或排出的機(jī)械抗拒，其被稱為“雄性(male)”和“雌性(female)”穿線(threading)。
本發(fā)明構(gòu)思的外科器械可用適合制造一次性使用，或多次使用的重復(fù)使用外科器械的金屬和/或塑料制造。當(dāng)軟骨是相對(duì)柔軟的材料，制造能夠塑型軟骨而不會(huì)損壞骨的較硬的塑料切割邊緣將是有利的。能夠制造此切割器械來(lái)引入(incorporate)給予液體，吸取除去切割殘?jiān)鸵后w，和用于缺損位點(diǎn)的照明和可視的光導(dǎo)纖維線的開(kāi)口。在某些器械的實(shí)施方案中，器械的基底可能具有突出的點(diǎn)或針狀結(jié)構(gòu)，它會(huì)幫助指導(dǎo)并且將所述器械置于移植位點(diǎn)。當(dāng)然，可將此針設(shè)計(jì)成對(duì)其下的骨損傷最小化。
當(dāng)所述器械的切割表面可能是單齒，或多齒，或被描述為如用在金屬水龍頭的螺絲樣形狀從而在金屬部分產(chǎn)生穿線孔時(shí)，所述切割器械需要的特性可能是所得移植位點(diǎn)的塑型表面是波動(dòng)型，并且非線性的。例如，在某些實(shí)施方案中，所述器械的切割邊緣能夠以圖4A，或如圖4B所示相似的方式塑型。所述切割邊緣可能是扁平，或環(huán)狀的因?yàn)樗@所述切割器械的直徑。可以設(shè)計(jì)很多其它達(dá)到本發(fā)明方法目的的形狀來(lái)產(chǎn)生提供機(jī)械抵抗的界面，此抵抗是對(duì)于在移植材料及周圍材料上的壓縮和剪切力的差別反應(yīng)。
實(shí)施例8一只四個(gè)月的混血Yorkshire種豬被全身麻醉并躺倒放置。將此豬清洗并用布包裹置于Harrington Arthritis Research Center，Phoenix，Ariz的外科套間。無(wú)菌完成所有的外科步驟。用碘酒清潔其左后腿和臨接的腹部及腹股溝區(qū)域。定位其膝關(guān)節(jié)及其髕。從距離髕的后部大約3cm進(jìn)行內(nèi)側(cè)切口，并大致切割多處皮下組織，肌肉層和韌帶來(lái)到達(dá)內(nèi)側(cè)股骨髁。用環(huán)狀切割器在內(nèi)側(cè)髁內(nèi)側(cè)部分上的白色軟骨制備損傷，在距離覆蓋所述髁后內(nèi)側(cè)部分的軟骨邊緣留下0.5到1cm間隔(左髁，圖6A)。所述0.5到1cm的缺損被置于內(nèi)側(cè)髁承受尾重的部分。在左股骨無(wú)止血帶完成整個(gè)外科手術(shù)。適當(dāng)縫合不同層和皮膚。
在第3天，將該動(dòng)物再次送到手術(shù)套間并如上被放置在手術(shù)臺(tái)上并給予全身麻醉。如上用碘酒清潔其左后腿，腹部和腹股溝區(qū)域。切開(kāi)縫合線打開(kāi)所述區(qū)域?？勺⒁獾皆谙リP(guān)節(jié)里存在一中等的血腫。除去血凝塊檢查缺損。缺損內(nèi)的血凝塊被除去。將一設(shè)計(jì)為具有雄性穿線切割邊緣，尺寸對(duì)應(yīng)，或略大于所述損傷圓周的無(wú)菌外科器械小心旋入(screwed)所述缺損。將Bio-Gide墊切割為等于所述缺損底部的尺寸。將所用的第一膠，稱作Adhesive Protein(A-2707，Sigma Chemical，USA)用到所剪齊的(trimmed)止血屏障墊的致密面，并且將該墊以致密面朝下放入所述損傷底部，如上所述將其用作屏障。發(fā)現(xiàn)此膠看起來(lái)不會(huì)干燥很快。所述缺損底部輕微的出血立即停止。如上所述，將第二Bio-Gide切割為圓周稍大于所述缺損并以致密面朝上放置(于是所述有孔面朝下對(duì)所述移植物)。
然后縫合此無(wú)細(xì)胞蓋片(covering-pad)來(lái)覆蓋腔，留下一邊緣打開(kāi)，其中可以注入要移植的軟骨細(xì)胞。所述墊邊緣的環(huán)繞部分用第二膠CowComing Medical Adhesive B(Cat.#895-3，DowCorning，USA)覆蓋。第二膠比第一膠干燥更快并且更有效。據(jù)發(fā)現(xiàn)在此特定過(guò)程中，當(dāng)試圖縫合所述帽時(shí)，第一膠沒(méi)有完全干燥來(lái)將所述止血屏障保持在位。因而，在所述移植位點(diǎn)近表面上形成的屏障主要是通過(guò)膠自身。
用一1ml注射器和計(jì)量注射針16，將所述軟骨細(xì)胞懸液(大約0.6ml)吸入所述注射器的針筒中。用計(jì)量注射短針23替換計(jì)量注射針16，并將所述細(xì)胞懸液從所述縫合蓋片下注入所述移植位點(diǎn)(大約10×106細(xì)胞)。然后在除去所述針之前膠著所述帽的開(kāi)口邊緣，再小心抽出針。未見(jiàn)到任何漏出的細(xì)胞。如上縫合所述傷口并未用止血帶，沒(méi)有見(jiàn)到出血?？p合最后的皮膚層。在縫合后沒(méi)出現(xiàn)皮膚的突出，這表明沒(méi)有血腫。手術(shù)后的恢復(fù)無(wú)事故。
如所希望的那樣，所移植的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的軟骨基質(zhì)足以修復(fù)在受試豬膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨表面所產(chǎn)生的缺損。圖6A是表明在膝蓋產(chǎn)生軟骨缺損的豬膝蓋的MRI影像(左髁，內(nèi)側(cè)髁)，圖6B是同一豬膝蓋在處理后三個(gè)月顯示所述缺損修復(fù)的MRI影像。
實(shí)施例9包含用于操作本發(fā)明方法的成份的試劑盒，可使得在外科裝置中便利操作本發(fā)明方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒將提供適于在外科手術(shù)環(huán)境簡(jiǎn)單操作的無(wú)菌組分，并將提供適合的止血屏障，適合的蓋片，和如果需要的有機(jī)膠。本發(fā)明的試劑盒也可提供無(wú)菌，無(wú)細(xì)胞基質(zhì)材料，其適合用來(lái)支持自體軟骨細(xì)胞被植入關(guān)節(jié)膝蓋表面缺損。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含適當(dāng)包被了有機(jī)膠Tisseel的Bio-Gide蓋片和Surgical止血屏障，其中所述Surgical及Bio-Gide已根據(jù)本發(fā)明教授被處理來(lái)延長(zhǎng)直至重吸收的時(shí)間。例如，當(dāng)Tisseel被預(yù)包被時(shí)，在一實(shí)施方案中向所述Tisseel補(bǔ)充附加的抑酶肽來(lái)延長(zhǎng)直至重吸收的時(shí)間。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述止血屏障和蓋片都是半滲透性膠原蛋白基質(zhì)，處理它們可延長(zhǎng)所述材料直至被重吸收的時(shí)間。也可以提供強(qiáng)化形式的Tisseel膠作為需要時(shí)應(yīng)用的分離組分，因?yàn)槊看涡迯?fù)/移植過(guò)程都會(huì)面對(duì)遺傳變化和特定環(huán)境。
所述試劑盒的進(jìn)一步實(shí)施方案將包括如上實(shí)施例7所述的外科器械。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解對(duì)本發(fā)明所示具體實(shí)施方案可以做大量變化和/或修改而不會(huì)背離本發(fā)明大致所述的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.通過(guò)植入動(dòng)物用于軟骨修復(fù)的植入物件，包含支持基質(zhì)，和粘附在所述支持基質(zhì)邊緣的軟骨細(xì)胞及生物相容性粘合劑，其中所述支持基質(zhì)可被所述動(dòng)物吸收。
2.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)為能夠支持所述軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)并賦予所述植入物件物理完整性來(lái)方便對(duì)其處理的片狀膜。
3.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)包含多肽或蛋白。
4.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)是膠原蛋白。
5.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述膠原蛋白主要選自馬，豬，牛，羊和雞膠原蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)是固體。
7.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)是凝膠樣的。
8.權(quán)利要求4所述的植入物件，其中所述膠原蛋白是I型膠原蛋白。
9.權(quán)利要求4所述的植入物件，其中所述膠原蛋白是II型膠原蛋白。
10.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述植入物件是可逆變形的。
11.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)具有粗糙面。
12.權(quán)利要求11所述的植入物件，其中所述粗糙面是有孔的。
13.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)具有光滑面。
14.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述支持基質(zhì)具有粗糙和光滑面。
15.權(quán)利要求1所述的植入物件，其中所述軟骨細(xì)胞和所述生物相容性膠合劑是混合的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過(guò)植入動(dòng)物用于軟骨修復(fù)的植入物件。所述植入物件包括支持基質(zhì)，和粘附在支持基質(zhì)邊緣的軟骨細(xì)胞和生物相容性膠合劑，其中所述支持基質(zhì)可為動(dòng)物吸收。所述支持基質(zhì)是一種生物相容性材料，如膠原蛋白，并且所述膠合劑是自體纖維蛋白。
文檔編號(hào)A61B17/00GK1612715SQ02824025
公開(kāi)日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2002年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月3日
發(fā)明者塞繆爾·S·阿斯卡萊, 阿邁德·伊杜雷恩, 布魯諾·M·詹內(nèi)蒂 申請(qǐng)人:維里根股份公司