專利名稱：一種新型g蛋白偶聯(lián)受體:gave10的制作方法
背景技術(shù)：
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)大的整合膜蛋白家族。GPCRs對多種胞外信號包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素、有味物質(zhì)和光發(fā)生反應(yīng)，并且可轉(zhuǎn)導(dǎo)信號以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的第二信使反應(yīng)。許多治療藥物靶向GPCRs，因?yàn)檫@些受體可介導(dǎo)多種生理反應(yīng)，包括炎癥、血管舒張、心率、支氣管擴(kuò)張、內(nèi)分泌和蠕動(dòng)。
GPCRs的特征表現(xiàn)為具有胞外結(jié)構(gòu)域、七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。此類受體行使的一些功能如結(jié)合配體和與G蛋白相互作用的功能與關(guān)鍵位置處某些氨基酸的存在有關(guān)。例如，許多研究表明GPCRs中氨基酸序列的差異導(dǎo)致了與天然配體或小分子激動(dòng)劑或拮抗劑親和性的差異。換句話說，序列中小的差異可導(dǎo)致不同的結(jié)合親和性和活性。(參見如Meng等人，生物化學(xué)雜志(J Bio Chem)(1996)271(50)32016-20；Burd等人，生物化學(xué)雜志(J Bio Chem)(1998)273(51)34488-95；和Hurley等人，神經(jīng)化學(xué)雜志(J Neurochem)(1999)72(1)413-21)。具體地說，研究表明在第三胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的差異可導(dǎo)致不同的活性。Myburgh等人發(fā)現(xiàn)促性腺素釋放激素受體的第3胞內(nèi)環(huán)中的丙氨酸261對于G蛋白偶聯(lián)和受體內(nèi)化是關(guān)鍵的(生物化學(xué)雜志(Biochem J)(1998)331(第3部分)893-6)。Wonerow等人研究了促甲狀腺素受體并證明第3胞內(nèi)環(huán)中的基因缺失可導(dǎo)致組成型受體活性(生物化學(xué)雜志(J Bio Chem)(1998)273(14)7900-5)。
一般而言，內(nèi)源配體與受體的結(jié)合作用導(dǎo)致該受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，使得胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)組分G蛋白之間可偶聯(lián)。存在幾種G蛋白，如Gq、Gs、Gi、Gz和Go(參見如Dessauer等人，臨床科學(xué)(Clin Sci)(Colch)(1996)91(5)527-37)。受體的第三胞內(nèi)環(huán)(IC-3環(huán))及羧基末端與G蛋白相互作用(Pauwels等人，分子神經(jīng)生物學(xué)(Mol Neurobiol)(1998)17(1-3)109-135和Wonerow等人，見上文)。有些GPCRs相對于G蛋白而言是“泛主結(jié)合的”，即一種GPCR可與一種以上的G蛋白相互作用(參見如Kenakin，生命科學(xué)(Life Sciences)(1988)431095)。
配體激活的GPCR與G蛋白偶聯(lián)起始了信號級聯(lián)過程(稱為“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”)。此類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞抑制。
在細(xì)胞膜中的GPCRs以兩種不同的構(gòu)象平衡存在“無活性”狀態(tài)和“活性”狀態(tài)。處于無活性狀態(tài)的受體不能與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑連接來產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)(存在例外，如在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中受體過表達(dá)時(shí)，參見如www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。構(gòu)象向活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變使得受體與轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(通過G蛋白)相連并產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)。激動(dòng)劑結(jié)合并更可能使活性構(gòu)象產(chǎn)生。但有時(shí)如果在不存在任何激動(dòng)劑時(shí)已有相當(dāng)強(qiáng)的反應(yīng)，則稱此類受體具有組成型活性(即已處于活性構(gòu)象或配體不依賴的或自發(fā)的活性狀態(tài))。當(dāng)激動(dòng)劑加至此類體系中時(shí)，通?？捎^察到增強(qiáng)的反應(yīng)。但是，當(dāng)加入經(jīng)典的拮抗劑時(shí)，此類分子的結(jié)合不對受體產(chǎn)生作用。另一方面，某些拮抗劑可引起受體組成型活性的抑制，這暗示了后一類藥物在技術(shù)上不為拮抗劑，而為具有相反內(nèi)在活性的激動(dòng)劑。這些藥物稱為反向激動(dòng)劑(www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。
對受體的常規(guī)研究基于這樣的設(shè)想首先從內(nèi)源配體的鑒定開始，然后繼續(xù)向前推進(jìn)以確定拮抗劑和其它受體效應(yīng)分子。即使在首先發(fā)現(xiàn)了拮抗劑的情況下，教條式的反應(yīng)仍是須確定內(nèi)源配體(WO 00/22131)。但由于活性狀態(tài)對于測試篩選目的是最有用的，獲得此類組成型受體尤其是組成型GPCRs將允許在缺少內(nèi)源配體信息時(shí)易于分離激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑和拮抗劑。而且，對于由于受體活性紊亂而導(dǎo)致的疾病，通過使用處于自發(fā)活化狀態(tài)的受體進(jìn)行測試更易于發(fā)現(xiàn)引起組成型活性抑制的藥物，或更具體地降低有效活化受體濃度的藥物。例如作為可被轉(zhuǎn)染入患者體內(nèi)用于治療疾病的受體，此類受體的活性可用通過上述測試發(fā)現(xiàn)的反向激動(dòng)劑精細(xì)調(diào)節(jié)。
通常認(rèn)為疾病如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)具有炎性病因，其中涉及到T輔助細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。當(dāng)前用皮質(zhì)類固醇進(jìn)行的抗炎治療對哮喘是有效的，但伴有代謝和內(nèi)分泌方面的副作用?？赏ㄟ^肺或鼻粘膜吸收的吸入制劑也可能有同樣問題。對RA或COPD目前尚缺乏滿意的經(jīng)口療法。
嗜酸性粒細(xì)胞在過敏及哮喘中介導(dǎo)大部分的呼吸道紊亂。白介素-5(IL-5)是嗜酸性粒細(xì)胞生長及活化的細(xì)胞因子。研究顯示IL-5對組織嗜酸性粒細(xì)胞增生及對嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷而造成呼吸道過分反應(yīng)是必要的(Chang等人，J Allergy Clin Immunol(1996)98(5 pt 1)922-931及Duez等人，Am J Respir Crit Care Med(2000)161(1)200-206)。在遺傳過敏性哮喘中，當(dāng)暴露于過敏原(例如，屋中塵螨抗原)后，T-輔助細(xì)胞-2(Th2)產(chǎn)生產(chǎn)生IL-5。
認(rèn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是由激活的巨噬細(xì)胞在受侵襲的滑膜中聚集所造成的。γ干擾素(IFNγ)是由T-輔助細(xì)胞-1(Th1)所分泌的具有許多促炎特性的細(xì)胞因子。它是最有效的巨噬細(xì)胞激活細(xì)胞因子并且可引起MHCII類基因轉(zhuǎn)錄而形成樹突細(xì)胞樣表型。
脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中引起炎性反應(yīng)的成分，其中包括腫瘤壞死因子α(TNFα)的釋放。靜脈注射抗TNFα對治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效能已在臨床上得到證明。認(rèn)為肺部巨噬細(xì)胞的聚集也是造成慢性阻塞性肺病的原因，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘劑(例如IL-8de Boer等人，J Pathol(2000)190(5)619-626)。巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞均釋放組織蛋白酶而造成肺泡壁的降解。認(rèn)為肺上皮細(xì)胞是炎性細(xì)胞化學(xué)引誘劑及其它炎性細(xì)胞活化劑的重要來源(參看例如，Thomas等，J Virol(2000)74(18)8425-8433；Lamkhioued等，Am J Respir Crit Care Med(2000)162(2 Pt.1)723-732；及Sekiya等，J Immunol(2000)165(4)2205-2213)。鑒于GPCRs在疾病中起作用并可通過調(diào)節(jié)GPCRs的活性來治療疾病，對以前未知的GPCRs的鑒定和描述可為開發(fā)新組合物和方法，用于治療涉及GPCR活性的疾病提供條件。本發(fā)明鑒定并描述了一種新的組成型活性GPCRGAVE10的表達(dá)，并提供了應(yīng)用該發(fā)現(xiàn)來鑒定和治療相關(guān)疾病的組合物和方法。例如，GAVE10在THP-1細(xì)胞(一種單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株)可被脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生并在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中與正常人的滑膜相比有較高水平的表達(dá)。在巨噬細(xì)胞中，γ-干擾素上調(diào)GAVE10的表達(dá)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種新鑒定的G蛋白偶聯(lián)受體，此處稱為GAVE10。在一個(gè)實(shí)施方案中，GAVE10來自一個(gè)無內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)基因，該基因編碼約330個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO2中所示。在一個(gè)相關(guān)方面，給出了如SEQ IDNO1所示的多核苷酸，其對應(yīng)于包含約1586堿基對(bp)的核酸。
在另一方面，本發(fā)明涉及這樣的分離核酸，其選自編碼具有如SEQID NO2所示氨基酸的脊椎動(dòng)物蛋白、保留了GAVE10活性的該蛋白的變體、突變體和片段的分離核酸，和包含如SEQ ID NO1所示核苷酸序列、其編碼具GAVE10活性的多肽的變體、突變體和片段的分離核酸。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及可與SEQ ID NO1結(jié)合的核酸雜交探針和互補(bǔ)片段，或可與編碼如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核酸結(jié)合的核酸雜交探針和互補(bǔ)片段。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO1具有約30％至約99％同一性的核酸，包括與編碼如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的分離核酸具有約30％至約99％同一性的核酸。在一個(gè)相關(guān)方面，寡核苷酸包含至少8個(gè)核苷酸，且考慮這樣的雜交方法，其包括將互補(bǔ)寡核苷酸和包含如SEQ ID NO1所示核苷酸的核酸或其基本等同物接觸的步驟，雜交條件為允許互補(bǔ)序列與該核酸雜交的條件。而且，互補(bǔ)片段可作為反義寡核苷酸用于體內(nèi)和體外抑制GAVE10表達(dá)的方法。此類方法可包括以下步驟提供由SEQ ID NO1所示核苷酸的互補(bǔ)序列組成的寡核苷酸序列、提供包含含有如SEQ IDNO1所示核苷酸序列的mRNA的人類細(xì)胞并將該寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中GAVE10的表達(dá)可通過如下的機(jī)制抑制，所述機(jī)制包括抑制翻譯、形成三股螺旋和/或激活核酸酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)mRNA的降解。
本發(fā)明也涉及這樣的分離多肽，其選自具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的純化多肽、其變體、突變體和片段；以及具有額外氨基酸殘基但提供GAVE10功能特性的純化多肽。
本發(fā)明還涉及可操作地連接表達(dá)調(diào)控元件的核酸，包括含有該分離核酸的載體。本發(fā)明還涉及經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化而包含本發(fā)明核酸的培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生多肽的方法，其包括以下步驟培養(yǎng)包含本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，允許在表達(dá)調(diào)控元件下表達(dá)，并從細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化多肽。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面包括可結(jié)合本發(fā)明多肽的分離抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。而且，在一個(gè)相關(guān)的方面，公開了產(chǎn)生抗體的方法和使用可與GAVE10結(jié)合的抗體治療GAVE10-相關(guān)疾病的方法?？贵w也可用于鑒定在不結(jié)合配體時(shí)可活化GAVE10的分子。
本發(fā)明的另一方面包括用于診斷目的，在生物和/或組織樣本中確定GAVE10存在與否的方法。在另一實(shí)施方案中，可監(jiān)測或確定暴露于LPS。在本發(fā)明的另一方面，公開了用于調(diào)節(jié)GAVE10信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療方法，包括將肽、激動(dòng)劑、拮抗劑、反向激動(dòng)劑和/或抗體施與需要其的患者。
在本發(fā)明的另一方面，公開了用于鑒定GAVE10調(diào)節(jié)劑的方法，其包括以下步驟提供化學(xué)分子，提供表達(dá)GAVE10的細(xì)胞，以及確定該化學(xué)分子是否能調(diào)節(jié)GAVE10的信號活性，包括該調(diào)節(jié)是否是在內(nèi)源配體存在或缺乏時(shí)進(jìn)行的。在一個(gè)相關(guān)的方面，化學(xué)分子可包括但不限于肽、抗體、激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑和拮抗劑。
在另一方面，本發(fā)明描述了用于確定侯選化合物是否為反向激動(dòng)劑的方法，其中將所述侯選物在不存在內(nèi)源配體、經(jīng)典激動(dòng)劑或經(jīng)典拮抗劑時(shí)暴露于組成型受體，且此類組成型活性被所述反向激動(dòng)劑抑制。
本發(fā)明的另一方面包括治療組合物，其中此類組合物包括核酸、抗體、多肽、激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑和拮抗劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明的方法也包括通過將此類治療組合物施與需要其的患者來治療疾病和調(diào)節(jié)GAVE10信號活性的方法。
通過參考下列詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將變得更加明顯。此外，在下面給出了較詳細(xì)地描述某些方法或組合物的多篇參考文獻(xiàn)。每一參考文獻(xiàn)均在此引入作為參考就如同一一指明進(jìn)行引入一樣。
附圖簡述

圖1為hGAVE10的DNA序列(SEQ ID NO1)和hGAVE10的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于對編碼人GAVE10(hGAVE10)的cDNA分子的發(fā)現(xiàn)，其中所述GAVE10是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員。
此處所用的術(shù)語“激動(dòng)劑”是指當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)激活胞內(nèi)反應(yīng)或加強(qiáng)GTP與膜結(jié)合的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。
此處所用的術(shù)語“部分激動(dòng)劑”是指當(dāng)其與受體結(jié)合時(shí)，與激動(dòng)劑相比只在較小程度上激活胞內(nèi)反應(yīng)或只在較小程度上加強(qiáng)GTP與膜結(jié)合的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。
此處所用的術(shù)語“拮抗劑”是指與激動(dòng)劑在同一位點(diǎn)競爭性結(jié)合受體的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。但拮抗劑不激活由受體的活性形式啟動(dòng)的胞內(nèi)反應(yīng)，并因此可抑制激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑引起的胞內(nèi)反應(yīng)。在一個(gè)相關(guān)的方面，當(dāng)不存在激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑時(shí)，拮抗劑不降低基線胞內(nèi)反應(yīng)。
此處的術(shù)語“侯選化合物”是指易接受篩選技術(shù)處理的分子(例如但不限于化學(xué)化合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語不包括公知的選自激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物。那些化合物是通過傳統(tǒng)的藥物開發(fā)方法鑒定的，所述方法涉及受體特異的內(nèi)源配體的鑒定和/或拮抗受體的侯選化合物的篩選，其中此篩選需用競爭試驗(yàn)來評估功效。
此處所用術(shù)語“組成型活化受體”或“自發(fā)活化受體”可互換，是指在不存在配體時(shí)被活化的受體。
在一個(gè)相關(guān)的方面，此類組成型活化受體可為內(nèi)源的(如GAVE10)或非內(nèi)源的；即可通過重組方法修飾GPCRs，以產(chǎn)生野生型GPCRs的突變組成型(參見如EP 1071701；WO 00/22129；WO 00/22131；以及美國專利號6,150,393和6,140,509，此處引用作為參考)。
此處所用術(shù)語“組成型受體活化”是指通過非受體與內(nèi)源配體或其化學(xué)等同物結(jié)合的方式使受體穩(wěn)定在活性狀態(tài)。
此處術(shù)語“反向激動(dòng)劑”是指可結(jié)合組成型活化受體并抑制基線胞內(nèi)反應(yīng)的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。基線反應(yīng)由受體的活性形式啟動(dòng)，該反應(yīng)低于當(dāng)缺乏激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑或減少GTP與膜結(jié)合時(shí)所觀察到的活性的正?；姿?。
此處術(shù)語“配體”是指結(jié)合另一分子的分子，其中所述結(jié)合另一分子的分子為例如但不限于激素或神經(jīng)遞質(zhì)，且進(jìn)一步地其中所述分子立體選擇性地與受體結(jié)合。
編碼人GAVE10蛋白質(zhì)的核苷酸序列如圖1所示(SEQ ID NO1)。GAVE10蛋白質(zhì)的氨基酸序列如圖1所示(SEQ ID NO2)。
圖1中GAVE10 cDNA(SEQ ID NO1)長約1586個(gè)核苷酸，其包括非翻譯區(qū)，編碼長約330個(gè)氨基酸的無內(nèi)含子的蛋白質(zhì)，分子量約為35kD。
通過Northern印跡檢測，約1.8kb的GAVE10 mRNA轉(zhuǎn)錄本在某些組織中表達(dá)。RT-PCR顯示GAVE10在暴露于脂多糖的THP-1中表達(dá)。此受體在經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中也顯示在不存在激動(dòng)劑的情況下的有組成型活化。此外，Northern印跡結(jié)果顯示在腦、骨骼肌或胰臟中未測得GAVE10的表達(dá)。相反的，GAVE10有在胎盤、肝臟及腎臟中表達(dá)，并在心臟中有微弱的表達(dá)。相關(guān)的，TaqMan RT-PCR實(shí)驗(yàn)被用來進(jìn)一步評估GAVE10的表達(dá)。對組織進(jìn)行的一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GAVE10在脾臟中表達(dá)，也在腎臟、心臟、胸腺及肝臟中表達(dá)。GAVE10的表達(dá)也在下列細(xì)胞中增加例如暴露在IFNγ之下被激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞及激活的巨噬細(xì)胞，及激活的CD19細(xì)胞。GAVE10的表達(dá)在以暴露到IL-1或TNF來激活的成纖維樣滑膜細(xì)胞中增加。GAVE10的表達(dá)在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中增加。
當(dāng)談到本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸分子時(shí)術(shù)語“家族”是指兩種或多種具有表面上共同的結(jié)構(gòu)域并具有此處所定義的足夠的氨基酸或核苷酸序列同一性的蛋白質(zhì)或核酸分子。此類家族成員可天然存在并可來自相同或不同的物種。例如，一個(gè)家族可包含人源的第一種蛋白質(zhì)和鼠源的該蛋白質(zhì)的同系物(homolgue)，以及人源的第二種不同的蛋白質(zhì)和該第二種蛋白質(zhì)的鼠源同系物。家族成員也可具有共同的功能特征。
在一個(gè)實(shí)施方案中，GAVE10蛋白質(zhì)包括與具GAVE10活性的SEQ IDNO2的第三胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域有至少約65％，優(yōu)選地至少約75％且更優(yōu)選地約85％，95％，98％或100％氨基酸序列同一性的第三胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域。
此處術(shù)語“等同的氨基酸殘基”是指當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列對比分析時(shí)，所述氨基酸占據(jù)的基本上是蛋白質(zhì)序列中的同一位置。本發(fā)明的優(yōu)選GAVE10多肽具有與SEQ ID NO2的第三胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列有足夠的同一性的氨基酸序列。此處所用術(shù)語“足夠的同一性”是指第一種氨基酸或核苷酸序列與第二種氨基酸或核苷酸序列具有足夠的或最小數(shù)量的相同或等同(如具有相似側(cè)鏈)的氨基酸殘基或核苷酸。第一種和第二種氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如包含共同結(jié)構(gòu)域的、具GAVE10活性的、有約55％的同一性，優(yōu)選地65％同一性，更優(yōu)選地75％，85％，95％或98％同一性的氨基酸或核苷酸序列在此處定義為足夠的同一性。
其它目的結(jié)構(gòu)域包括但不限于跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域(如SEQ ID NO2所示，TM1從氨基酸殘基的第約15位至約39位；TM2從氨基酸殘基的第約50位至約71位；TM3從氨基酸殘基的第約84位至約107位；TM4從氨基酸殘基的第約124位至約144位；TM5從氨基酸殘基的第約159位至約192位；TM6從氨基酸殘基的第約227位至約250位；以及TM7從氨基酸殘基的第約259位至約282位)，胞質(zhì)(胞內(nèi))(IC)結(jié)構(gòu)域(如SEQ ID NO2所示，ICl從氨基酸殘基的第約40位至約49位；IC2從氨基酸殘基的約108位至約123位；IC3從氨基酸殘基的第約193位至約226位；以及IC4從氨基酸殘基的第約283位至約330位)和胞外(EC)結(jié)構(gòu)域(如SEQ ID NO2所示，EC1從氨基酸殘基的第約1位至約4位；EC2從氨基酸殘基的第約72位至約83位；EC3從氨基酸殘基的第約145位至約158位；以及EC4從氨基酸殘基的第約251位至約258位)。在一個(gè)相關(guān)的方面，目的結(jié)構(gòu)域也包括但不限于共有的糖基化位點(diǎn)、脂類結(jié)合位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。天冬酰胺殘基位于N-端及EC2及EC3環(huán)上。激酶磷酸化位點(diǎn)，例如絲氨酸，位于IC3及C-端上。在TM3下游GAVE10具有ERY基序而不是典型的DRY基序。
此處可互換的“GAVE10活性”、“GAVE10的生物活性”或“GAVE10的功能活性”是指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體內(nèi)或體外測得的由GAVE10蛋白質(zhì)、多肽或核酸分子對GAVE10效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的活性。GAVE10活性可為直接活性或間接活性，其中所述直接活性如與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合活性或?qū)Φ诙鞍踪|(zhì)的酶活性，其中所述間接活性如由GAVE10蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞信號活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GAVE10活性包括至少一種或多種下列活性(i)與GAVE10信號途徑中的蛋白質(zhì)相互作用的能力；(ii)與GAVE10配體相互作用的能力；和(iii)與胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)相互作用的能力。
因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案描述了具有GAVE10活性的分離GAVE10蛋白質(zhì)和多肽。
在下列的子部分中對本發(fā)明的各方面進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
分離的核酸分子本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的分離核酸分子。該核酸分子或其部分足以用作雜交探針來鑒定編碼GAVE10的核酸(如GAVE10 mRNA)。也可用相關(guān)核酸作為PCR引物來擴(kuò)增或突變GAVE10核酸分子。此處所用的術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(如mRNA)和用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA。
“分離的”核酸分子是與存在于該核酸的天然源中的其它核酸分子相分離的核酸分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸沒有該核酸所來自的生物體的基因組DNA中編碼GAVE10的核酸的天然側(cè)翼序列(即位于該核酸5′和3′端的序列)。例如，由于GAVE10位于人第12條染色體(即143兆堿基)上，在不同的實(shí)施方案中，分離的GAVE10核酸分子可包含該核酸所來自的細(xì)胞基因組DNA中天然存在于該核酸分子側(cè)翼的小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。而且，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，“分離的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，“分離的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子，如具有SEQ ID NO1核苷酸序列或該核苷酸序列的任一個(gè)片段或互補(bǔ)體的核酸分子，可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及此處提供的序列信息進(jìn)行分離。通過標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技術(shù)(如Sambrook等人，編輯，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989一書中所描述技術(shù))，用SEQ ID NO1的全部或部分核酸序列作為雜交探針，可將GAVE10核酸分子分離。
用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，并使用合適的寡核苷酸引物，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，可擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子。例如此類引物可包括但不限于5’-ATGACGCCCAACAGCACT-3’(SEQ ID NO3)及5’-TTAGTTCAAGTCCAGGTC-3’(SEQ ID NO4)?？蓪U(kuò)增的核酸克隆入合適的載體并通過DNA序列分析表征。而且，對應(yīng)于GAVE10核苷酸序列的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)如通過DNA自動(dòng)合成儀制備。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子包含與SEQ IDNO1中所示的核苷酸序列或其GAVE10-特異性部分互補(bǔ)的核酸分子。與給定的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子為這樣的核酸分子，其與給定的核苷酸序列充分互補(bǔ)以致可以與該給定的核苷酸序列雜交，從而形成可分離的或可檢測的雙鏈體。
而且，本發(fā)明的核酸分子可僅包含編碼GAVE10的核酸序列的一部分，如可用作探針或引物的片段或編碼GAVE10生物活性部分的片段。例如，此片段可包括但不限于編碼SEQ ID NO2氨基酸殘基的第約1位至約14位的區(qū)域。從克隆人GAVE10基因而確定的核苷酸序列使得可以產(chǎn)生探針和引物，用于鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型(如來自其它組織)中的GAVE10同系物以及來自其它哺乳動(dòng)物的GAVE10同系物。探針/引物一般包含基本純化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，該區(qū)域在嚴(yán)緊條件下可雜交至SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的天然突變體的有意或反義序列中的至少約12個(gè)，優(yōu)選地約25個(gè)，更優(yōu)選地約50個(gè)，75個(gè)，100個(gè)，125個(gè)，150個(gè)，175個(gè)，200個(gè)，250個(gè)，300個(gè)，350個(gè)或400個(gè)連續(xù)的核苷酸上。基于人GAVE10核苷酸序列的探針可用于檢測編碼相似或相同蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列。探針可包含與其連接的標(biāo)記基團(tuán)，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔因子。此類探針可用作診斷檢測試劑盒的部分，用于鑒定沒有適當(dāng)表達(dá)GAVE10蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織，例如，這可通過如下方式完成測定來自受試者的細(xì)胞樣本中編碼GAVE10的核酸的水平，如檢測GAVE10 mRNA水平或確定基因組GAVE10基因是否已突變或缺失。
編碼“GAVE10的生物活性部分”的核酸片段可通過分離SEQ ID NO1的編碼具有GAVE10生物活性的多肽的部分、表達(dá)此GAVE10蛋白質(zhì)的編碼部分(如體外重組表達(dá))并評估GAVE10的該編碼部分的活性而制備。例如編碼GAVE10的生物活性部分的核酸片段包括第三胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域，如在SEQ ID NO2中氨基酸殘基的第約202位至約219位。本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO1核苷酸序列并因此與SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列編碼相同的GAVE10蛋白質(zhì)。
除了在SEQ ID NO1中所示的人GAVE10核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解在群體(如人群)中存在導(dǎo)致GAVE10氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性。由于天然的等位基因變異，在群體中的個(gè)體之間存在GAVE10基因的此類遺傳多態(tài)性。一個(gè)等位基因是在特定基因座處可選擇存在的一組基因中的一個(gè)。此處所用術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼GAVE10蛋白質(zhì)，優(yōu)選地編碼哺乳動(dòng)物GAVE10蛋白質(zhì)的開放讀碼框的核酸分子。此處所用短語“等位基因變體”是指位于GAVE10基因座的核苷酸序列或指由該核苷酸序列編碼的多肽。備選的等位基因能通過對一些不同個(gè)體進(jìn)行目的基因測序而鑒定。這可以通過在多個(gè)個(gè)體中使用雜交探針鑒定相同的基因座容易地實(shí)施。GAVE10中的源于天然等位基因變異且不改變GAVE10功能活性的任一及所有此類核苷酸變異和所導(dǎo)致的氨基酸多態(tài)性或變異均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
而且，來自其它物種的編碼GAVE10蛋白質(zhì)(GAVE10同系物)的、具有不同于人GAVE10的核苷酸序列的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對應(yīng)于本發(fā)明GAVE10 cDNA的天然等位基因變體和同系物的核酸分子可基于與此處公開的人GAVE10核酸的同一性，使用人cDNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)在嚴(yán)緊的雜交條件下分離。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子長度為至少300，325，350，375，400，425，450，500，550，600，650，700，800，900，1000或1100個(gè)核苷酸，并且可在嚴(yán)緊條件下雜交包含SEQ ID NO1核苷酸序列優(yōu)選地其編碼序列的核酸分子或其互補(bǔ)序列。
此處所用術(shù)語“在嚴(yán)緊條件下雜交”是對雜交和洗滌條件的描述，在此條件下，當(dāng)核苷酸序列相互間具有至少55％，60％，65％，70％和優(yōu)選地75％或更高互補(bǔ)性時(shí)一般仍保持雜交。此類嚴(yán)緊條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并可在“分子生物學(xué)最新技術(shù)”(“Current Protocols in MolecularBiology”)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6一書中找到。嚴(yán)緊雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性實(shí)例為在約45℃，于6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后在50-65℃，于0.2×SSC，0.1％SDS中洗一次或多次。優(yōu)選地，在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1的序列或其互補(bǔ)序列雜交的本發(fā)明分離核酸分子對應(yīng)于天然存在的核酸分子。此處所用“天然存在的”核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如編碼天然蛋白質(zhì))。熟練的技術(shù)人員能理解可根據(jù)序列特異性變量(如長度、G-C豐度等)修正條件。
本發(fā)明考慮包括這樣的GAVE10核酸片段，其可用于診斷具有相似特性的GAVE10樣分子。診斷片段可來自GAVE10基因的任一部分，包括側(cè)翼序列。此片段可運(yùn)用公知方法來作為文庫探針。此片段可用公知的方法制備。
除了在群體中可能天然存在的GAVE10序列的等位基因變體外，熟練的技術(shù)人員還可以理解通過對SEQ ID NO1的核苷酸序列突變可導(dǎo)入變化，由此導(dǎo)致所編碼的GAVE10蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變，同時(shí)基本不改變GAVE10蛋白質(zhì)的生物活性。例如，可通過核苷酸替換在“非必需”氨基酸殘基處引起氨基酸替換?！胺潜匦琛卑被釟埢鶠檫@樣的殘基，其在野生型GAVE10序列(如SEQ ID NO2的序列)中可被改變，但基本上不改變生物活性?！氨匦琛卑被釟埢腔旧锘钚运枰臍埢?。例如，在不同種屬的GAVE10中不保守或僅半保守的氨基酸殘基對活性可為非必需的，因此將可能成為改造的靶標(biāo)。另外，在不同種屬的GAVE10蛋白質(zhì)中保守的氨基酸殘基對活性可為必需的，因此將不可能成為改造的靶標(biāo)。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼在活性非必需的氨基酸殘基處含有變化的GAVE10蛋白質(zhì)的核酸分子。此類GAVE10蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同于SEQ ID NO2，但保留了生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子包括這樣的核苷酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少約55％相同，65％，75％，85％，95％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
可通過向SEQ ID NO1核苷酸序列中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失以使所編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失，由此創(chuàng)建編碼具有不同于SEQ ID NO2的序列的GAVE10蛋白質(zhì)的分離核酸分子。
可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變來導(dǎo)入突變。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸替換。“保守氨基酸替換”是將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。本領(lǐng)域定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的組別。這些組別包括具堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)，具酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)，具不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，具無極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)，具分支側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)以及具芳族側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸)。這樣，GAVE10中預(yù)測的非必需氨基酸可優(yōu)選地用來自同一側(cè)鏈組別的另一氨基酸殘基替換?；蛘撸稍谌L或部分的GAVE10編碼序列中隨機(jī)導(dǎo)入突變，如通過飽和誘變導(dǎo)入，并且通過對所得的突變體篩選GAVE10生物活性來鑒定保留活性的突變體。誘變后，可重組表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)并可確定蛋白質(zhì)的活性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可測定突變的GAVE10蛋白質(zhì)(1)與GAVE10信號途徑中的蛋白質(zhì)作用形成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用體的能力；(2)結(jié)合GAVE10配體的能力；或(3)結(jié)合胞內(nèi)靶蛋白的能力。又在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可測定突變的GAVE10調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或細(xì)胞分化的能力。
本發(fā)明包括反義核酸分子，即與編碼蛋白質(zhì)的有意核酸互補(bǔ)的分子，如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈或與mRNA序列互補(bǔ)的分子。因此反義核酸可通過氫鍵結(jié)合有意核酸。反義核酸可與全長GAVE10編碼鏈或僅與其一部分互補(bǔ)，如與該蛋白質(zhì)編碼區(qū)域(或開放讀碼框)的全部或部分互補(bǔ)。反義核酸分子可與編碼GAVE10的核苷酸序列所在的編碼鏈的非編碼區(qū)反義。非編碼區(qū)(“5′和3′非翻譯區(qū)”)是在編碼區(qū)側(cè)翼的5′和3′序列，其不被翻譯為氨基酸。
已知此處公開的編碼GAVE10的編碼鏈序列(例如，SEQ ID NO1)，本發(fā)明的反義核酸可根據(jù)Watson和Crick堿基配對原則設(shè)計(jì)。反義核酸分子可與GAVE10 mRNA的全長編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選地為僅與GAVE10mRNA的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可與GAVE10 mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的區(qū)域互補(bǔ)。例如，可使用具有序列5’-CTGTTGGGCGTCATCTTGGTC-3’(SEQ ID NO5)的寡核苷酸。反義寡核苷酸可長例如約5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可通過本領(lǐng)域公知的步驟用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)產(chǎn)生。例如可用天然存在的核苷酸或多種經(jīng)修飾的核苷酸來化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸被設(shè)計(jì)用來增加分子的生物穩(wěn)定性或增加反義和有意核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，如可使用硫代磷酸酯衍生物、磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。
可用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、雙氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黃苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤?；蛘撸捎帽磉_(dá)載體生物學(xué)產(chǎn)生反義核酸，在該載體中核酸以反義方向亞克隆(即插入的核酸所轉(zhuǎn)錄的RNA與目的靶核酸為反義方向)。
本發(fā)明的反義核酸分子一般被施與受試者或原位產(chǎn)生，以便與編碼GAVE10蛋白質(zhì)的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而通過如抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來抑制該蛋白質(zhì)的表達(dá)?？赏ㄟ^常規(guī)的核苷酸互補(bǔ)性來雜交形成穩(wěn)定的雙鏈體，或例如當(dāng)用反義核酸分子結(jié)合DNA雙鏈體時(shí)，通過在雙螺旋體大溝中的特異性相互作用來雜交，或雜交至GAVE10的調(diào)節(jié)區(qū)。
本發(fā)明反義核酸分子施用方式的例子包括在組織位點(diǎn)處直接注射。另外，可修飾反義核酸分子以靶向所選擇的細(xì)胞，然后全身施用。例如，對于全身施用來說，可修飾反義分子，以使該分子與所選細(xì)胞表面上表達(dá)的受體或抗原特異結(jié)合，其中所述修飾如將反義核酸分子連接至可結(jié)合細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體上。也可用此處描述的載體將反義核酸分子遞送至細(xì)胞。為了達(dá)到足夠的胞內(nèi)反義分子濃度，可以將反義核酸分子置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制下，優(yōu)選pol II或pol III啟動(dòng)子。
本發(fā)明的反義核酸分子可為α-異頭核酸(α-anomeric nucleic acid)分子。α-異頭核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜交體，其中的鏈走向相互平行(Gaultier等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1987)156625-6641)。反義核酸分子也可包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，核酸研究(1987)156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等人，F(xiàn)EBS Lett(1987)215327-330)。
本發(fā)明也包括核酶。核酶為具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其可切割與該核酶雜交的單鏈核酸如mRNA。因此，核酶(如錘頭狀核酶(Haselhoff等人，在自然(Nature)(1988)334585-591)中所描述)可用于催化性切割GAVE10 mRNA轉(zhuǎn)錄本，由此抑制GAVE10 mRNA的翻譯?？苫诖颂幑_的GAVE10 cDNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO1)設(shè)計(jì)對編碼GAVE10的核酸具特異性的核酶。例如可構(gòu)建四膜蟲L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列與編碼GAVE10的mRNA中欲切割的核苷酸序列互補(bǔ)，參見如美國專利號4,987,071和5,116,742，或者，可用GAVE10 mRNA從一群RNA分子中選擇具有特異核糖核酸酶活性的催化RNA，參見如Bartel等人，科學(xué)(Science)(1993)2611411-1418。
本發(fā)明還包括可形成三股螺旋結(jié)構(gòu)的核酸分子。例如，GAVE10的基因表達(dá)可通過如下方式抑制，即，將核苷酸序列定向互補(bǔ)到GAVE10的調(diào)節(jié)區(qū)域(如GAVE17啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)上以形成三股螺旋結(jié)構(gòu)來防止GAVE17基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，通常參見Helene，抗癌藥物設(shè)計(jì)(Anticancer Drug Des)(1991)6(6)569；Helene Ann NY Acad Sci(1992)66027；和Maher，生物鑒定(Bioassays)(1992)14(12)807。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸酯骨架處進(jìn)行修飾，以提高如分子的穩(wěn)定性、可雜交性或溶解性。例如，可修飾核酸的磷酸脫氧核糖骨架以產(chǎn)生肽核酸(參見Hyrup等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)45)。此處所用術(shù)語“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模擬物，如DNA模擬物，其中磷酸脫氧核糖骨架被假肽骨架替換并僅保留了四種天然核苷堿基。已顯示中性PNA骨架使得可以在低離子強(qiáng)度條件下與DNA和RNA進(jìn)行特異性雜交。如Hyrup等人(1996)見上文；Perry-O’Keefe等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad SciUSA)(1996)9314670所述，可通過標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成法進(jìn)行PNA寡聚體的合成。
GAVE10的PNAs可用于治療和診斷應(yīng)用。例如，PNA可作為反義或反基因藥劑，通過如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯停滯或抑制復(fù)制用于基因表達(dá)的序列特異性調(diào)控。也可使用GAVE10的PNA。例如，PNA可通過如PNA-指導(dǎo)的PCR鉗夾術(shù)用于分析基因中的單堿基對突變；當(dāng)與其它酶如S1核酸酶組合使用時(shí)PNA可用作人工限制性酶(Hyrup等人，(1996)見上文)；或PNA可用作DNA序列和雜交的探針或引物(Hyrup等人，(1996)見上文；Perry-O’Keefe等人，(1996)見上文)。
在另一實(shí)施方案中，可通過將親脂基團(tuán)或其它輔助基團(tuán)與PNA連接、通過形成PNA-DNA嵌合體或通過使用脂質(zhì)體或其它本領(lǐng)域公知的藥物遞送技術(shù)來修飾GAVE10的PNA以便如增強(qiáng)穩(wěn)定性、特異性或細(xì)胞攝入?？扇鏗yrup等人(1996)見上文；Finn等人，核酸研究(1996)24(17)3357-63；Mag等人，核酸研究(1989)175973；和Peterser等人，Bioorganic MedChem Lett(1975)51119所述進(jìn)行PNA-DNA嵌合體的合成。
分離的GAVE10蛋白質(zhì)和抗GAVE10抗體本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的GAVE10蛋白質(zhì)和其生物活性部分，以及適用作免疫原產(chǎn)生抗GAVE10抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過合適的純化策略可自細(xì)胞或組織源分離天然的GAVE10蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，GAVE10蛋白質(zhì)是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。除了重組表達(dá)外，可用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成GAVE10蛋白質(zhì)或多肽。
“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含有GAVE10蛋白質(zhì)所來自的細(xì)胞或組織源中的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染蛋白質(zhì)，或當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。短語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括這樣的GAVE10蛋白質(zhì)制品，其中該蛋白質(zhì)從細(xì)胞的細(xì)胞組分中被分離出來，所述細(xì)胞為用于分離或重組產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的GAVE10蛋白質(zhì)包括這樣的GAVE10蛋白質(zhì)制品，其具有少于約30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的非GAVE10蛋白質(zhì)(此處也稱為“污染蛋白質(zhì)”)。當(dāng)GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分是重組產(chǎn)生的時(shí)，還優(yōu)選其基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基在蛋白質(zhì)制品中所占有的體積少于約20％、10％、5％或更少。當(dāng)GAVE10蛋白質(zhì)通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，優(yōu)選地基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)，即該蛋白質(zhì)從參與其合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)中分離出來。因此，此類GAVE10蛋白質(zhì)制品具有少于約30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的化學(xué)前體或非GAVE10的化學(xué)物質(zhì)。
GAVE10蛋白質(zhì)的生物活性部分包括這樣的肽，其包含的氨基酸序列與GAVE10蛋白質(zhì)的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列)具有足夠的同一性或衍生自后者，并且該肽包含少于全長GAVE10蛋白質(zhì)的氨基酸并顯示GAVE10蛋白質(zhì)的至少一種活性。一般來說，生物活性部分包含具有GAVE10蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。GAVE10蛋白質(zhì)的生物活性部分可為如長10個(gè)、25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或更多氨基酸的多肽。優(yōu)選的生物活性多肽包括一個(gè)或多個(gè)已鑒定的GAVE10結(jié)構(gòu)域，如包含第三胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域(如SEQ ID NO2)。
而且，可通過重組技術(shù)制備其它生物活性部分(其中該蛋白質(zhì)的其它區(qū)域已缺失)并針對其評估天然GAVE10蛋白質(zhì)的一種或多種功能活性。
優(yōu)選GAVE10蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。其它有用的GAVE10蛋白質(zhì)基本上與SEQ ID NO2相同并保留了SEQ ID NO2蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變，其氨基酸序列與SEQ ID NO2存在差異。例如，此類GAVE10蛋白質(zhì)和多肽具有至少一種此處描述的生物活性。
因此，有用的GAVE10蛋白質(zhì)為這樣的蛋白質(zhì)，其包括與SEQ IDNO2的氨基酸序列至少約45％，優(yōu)選地55％，65％，75％，85％，95％，99％或100％相同的氨基酸序列，并保留了SEQ ID NO2的GAVE10蛋白質(zhì)的功能活性。在其它例子中，GAVE10蛋白質(zhì)為這樣的蛋白質(zhì)，其具有與GAVE10第三胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2)55％，65％，75％，85％，95％，99％或100％相同的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該GAVE10蛋白質(zhì)保留了SEQ ID NO2的GAVE10蛋白質(zhì)的功能活性。
為了確定兩條氨基酸序列或兩條核酸的百分同一性，對序列進(jìn)行對比排列以優(yōu)化比較(如可在第一條氨基酸或核酸序列中導(dǎo)入缺口(gap)，以優(yōu)化序列對比并使其與第二條氨基酸或核酸序列具最大的序列同一性)。然后在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置比較氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列中的某個(gè)位置與第二條序列中的相應(yīng)位置被同一氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，則認(rèn)為這些分子在那個(gè)位置是相同的。兩條序列間的百分同一性為兩條序列共有相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即百分同一性＝相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)(如重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩條序列長度相同。
可用數(shù)學(xué)算法完成對兩條序列間百分同一性的確定。用于比較兩條序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)優(yōu)選非限制性例子是Karlin等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1990)872264提供的算法，改進(jìn)算法見Karlin等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1993)905873-5877。此算法被引入Altschul等人，分子生物學(xué)雜志(J Mol Bio)(1990)215403的NBLAST和XBLAST程序中?？捎肗BLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，設(shè)置例如記分＝100，字長＝12，來獲得與本發(fā)明GAVE10核酸分子同源的核苷酸序列?？捎肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，設(shè)置記分＝50，字長＝3，來獲得與本發(fā)明的GAVE10蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得有缺口的對比序列用于比較，可使用Altschul等人，核酸研究(1997)253389中描述的GappedBLAST?；蛘撸捎肞SI-Blast進(jìn)行迭代檢索來檢測分子間較遠(yuǎn)的關(guān)系。Altschul等人(1997)見上文。應(yīng)用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)，參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選非限制性實(shí)例為Myers等人，CABIOS(1988)411-17提供的算法。此算法被引入GCG序列比較軟件包的ALIGN程序(版本2.0)部分中。應(yīng)用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分為12且缺口罰分為4。
可用類似于上面所描述的技術(shù)在允許或不允許缺口的情況下確定兩條序列間的百分同一性。在計(jì)算百分同一性時(shí)，只計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的匹配。
本發(fā)明也提供了GAVE10嵌合體或融合蛋白質(zhì)。如此處所用，GAVE10“嵌合蛋白質(zhì)”或“融合蛋白質(zhì)”包括可操作地連接非GAVE10多肽的GAVE10多肽。“GAVE10多肽”是指多肽具有對應(yīng)于GAVE10的氨基酸序列。“非GAVE10多肽”是指多肽具有的氨基酸序列對應(yīng)于基本上不同于GAVE10蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，如不同于GAVE10蛋白質(zhì)且來自相同或不同生物體的蛋白質(zhì)。在GAVE10融合蛋白質(zhì)中，GAVE10多肽可對應(yīng)于GAVE10蛋白質(zhì)的全部或部分，優(yōu)選GAVE10蛋白質(zhì)的至少一個(gè)生物活性部分。在融合蛋白質(zhì)中，術(shù)語“可操作地連接”是指GAVE10多肽和非GAVE10多肽相互間融合在讀碼框內(nèi)?？蓪⒎荊AVE10多肽融合在GAVE10多肽的N-端或C-端。一種有用的融合蛋白是GST-GAVE10，其中GAVE10序列融合至谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的C-端。此融合蛋白質(zhì)使得重組GAVE10的純化易于進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的第三胞內(nèi)環(huán)(IC3或IL3)(即SEQ ID NO2的約202至約219位氨基酸)與GST融合，方法為通過PCR擴(kuò)增IL3并亞克隆該產(chǎn)物入載體如pGEX-2T中。可將所得的構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(如大腸桿菌(E.coli))并通過合適的小分子(如異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)所述構(gòu)建體的表達(dá)并接下來純化(參見如Lee等人，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)(1996)271(19)11272-11279)。
在某些宿主細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，通過使用異源信號序列可提高GAVE10的表達(dá)和/或分泌。例如，可使用桿狀病毒包膜蛋白的gp6分泌序列作為異源信號序列(分子生物學(xué)最新方法，Ausubel等人，編輯，John Wiley & Sons，1992)。其它真核異源信號序列的實(shí)例包括蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。又在另一實(shí)例中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等人，見上文)和蛋白A分泌信號(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。
又在另一實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)為GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，其中全部的GAVE10或其一部分被融合至來自免疫球蛋白家族成員的序列上。可將本發(fā)明的GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)摻入藥物組合物并施與受試者以抑制GAVE10配體和細(xì)胞表面的GAVE10蛋白質(zhì)間的相互作用，由此體內(nèi)抑制GAVE10-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)可用于影響GAVE10相關(guān)配體的生物利用度。GAVE10配體-GAVE10相互作用的抑制在治療上是有用的，可用于治療增生和分化紊亂并用于調(diào)節(jié)(如促進(jìn)或抑制)細(xì)胞存活。而且，本發(fā)明的GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)可用作免疫原以在受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗GAVE10抗體、以純化GAVE10配體和進(jìn)行篩選測試來確定可抑制GAVE10與GAVE10配體間相互作用的分子。
優(yōu)選地，本發(fā)明的GAVE10嵌合或融合蛋白質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，將編碼不同多肽序列的DNA片段按照常規(guī)技術(shù)連接在讀碼框內(nèi)，如用鈍末端或粘末端連接、限制性酶消化以提供合適的末端、根據(jù)需要補(bǔ)平粘末端、堿性磷酸酶處理以避免不想要的連接和酶促連接。在另一實(shí)施方案中，可通過常規(guī)技術(shù)包括DNA自動(dòng)合成儀合成融合基因。另外，可用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，這樣在兩個(gè)連續(xù)的基因片段間產(chǎn)生互補(bǔ)的突出端，接下來可退火并再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見如Ausubel等人，見上文)。而且，許多已編碼融合部分(如GST多肽)的表達(dá)載體可通過商業(yè)途徑得到?？蓪⒕幋aGAVE10的核酸克隆入此類表達(dá)載體，這樣融合部分與GAVE10蛋白質(zhì)連接在讀碼框內(nèi)。
本發(fā)明也涉及GAVE10蛋白質(zhì)變體(即具有不同于GAVE10氨基酸序列的序列的蛋白質(zhì))。此類變體可起GAVE10激動(dòng)劑(模擬物)的作用或起GAVE10拮抗劑的作用。GAVE10蛋白質(zhì)的變體可通過誘變產(chǎn)生，如GAVE10蛋白質(zhì)的不連續(xù)點(diǎn)突變或截短。GAVE10蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑可保留與天然存在的GAVE10蛋白質(zhì)基本上相同的生物學(xué)活性或其中一部分的生物活性。GAVE10蛋白質(zhì)的拮抗劑可通過如競爭性結(jié)合包括GAVE10蛋白質(zhì)的細(xì)胞信號級聯(lián)的下游或上游成員來抑制GAVE10蛋白質(zhì)天然存在形式的一種或多種活性。因此，用功能局限的變體來處理可產(chǎn)生特定的生物學(xué)作用。用如下變體處理受試者較用GAVE10蛋白質(zhì)的天然存在形式處理可對受試者產(chǎn)生較小的副作用，其中所述變體具有該蛋白質(zhì)天然存在形式的一部分生物活性。
作為GAVE10激動(dòng)劑(模擬物)或GAVE10拮抗劑起作用的GAVE10蛋白質(zhì)變體可通過針對GAVE10激動(dòng)劑或拮抗劑活性篩選GAVE10蛋白質(zhì)突變體如截短突變體的組合文庫而鑒定。在一個(gè)實(shí)施方案中，GAVE10變體的多樣化文庫通過核酸水平的組合誘變產(chǎn)生并由多樣化基因文庫編碼。例如，多樣化GAVE10變體文庫可通過如下方式制備將合成的寡核苷酸混合物酶促連接入基因序列中，以使一組簡并的潛在GAVE10序列可表達(dá)為單獨(dú)的多肽，或備選地，表達(dá)為其中含有該組GAVE10序列的一組較大融合蛋白(例如，噬菌體展示)。有許多方法可用于從簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在的GAVE10變體文庫?？稍贒NA自動(dòng)合成儀上進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成的基因連接入合適的表達(dá)載體?；蚝啿⒓系氖褂檬沟每稍谝粋€(gè)混合物中提供編碼所需的潛在GAVE10序列集合的所有序列。用于合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域公知(參見如Narang，四面體(Tetrahedron)(1983)393；Itakura等人，生物化學(xué)年鑒(Ann RevBiochem)(1984)53323；Itakura等人，科學(xué)(Science)(1984)1981056；Ike等人，核酸研究(1983)11477)。
此外，GAVE10蛋白質(zhì)編碼序列的片段文庫可用于產(chǎn)生多樣化的GAVE10片段群體，用來篩選和接下來選擇GAVE10蛋白質(zhì)變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼序列片段的文庫可如下產(chǎn)生用核酸酶處理GAVE10編碼序列的雙鏈PCR片段(在所述處理進(jìn)行的條件下，在每個(gè)分子中僅發(fā)生大約一次切割)，變性該雙鏈DNA，復(fù)性所得DNA以形成可能包含來自不同缺口產(chǎn)物的有意/反義對的雙鏈DNA，重新形成的雙鏈體用S1核酸酶處理去除單鏈部分并將所得的片段文庫連接入表達(dá)載體。通過此方法，可獲得編碼GAVE10蛋白質(zhì)N-端和不同大小內(nèi)部片段的表達(dá)文庫。
用于篩選通過點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫以獲得具有所選特性的基因產(chǎn)物的一些技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。此類技術(shù)適用于快速篩選通過組合誘變GAVE10蛋白質(zhì)產(chǎn)生的基因文庫。適于高通量分析篩選大基因文庫的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆入復(fù)制型表達(dá)載體，用所得的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞并在一定的條件下表達(dá)組合基因，其中對所需活性的檢測有利于分離編碼基因的載體，其中所述基因的表達(dá)產(chǎn)物已得以檢測。遞歸整體誘變(recursive ensemblemutagenesis；REM)為在文庫中增加功能突變體的頻率的技術(shù)，該技術(shù)可用于與篩選測試結(jié)合來鑒定GAVE10變體(Arkin等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1992)897811-7815；Delgrave等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)(1993)6(3)327-331)。
分離的GAVE10蛋白質(zhì)或其部分或其片段可用作免疫原，使用標(biāo)準(zhǔn)的多克隆和單克隆抗體制備技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合GAVE10的抗體?？墒褂萌L的GAVE10蛋白質(zhì)，或者，作為備選方案本發(fā)明提供了GAVE10的抗原性肽片段用作免疫原。GAVE10的抗原性肽包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的至少8個(gè)(優(yōu)選地10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)或更多的)氨基酸殘基并含有GAVE10表位，這樣所產(chǎn)生的針對該肽的抗體可與GAVE10形成特異的免疫復(fù)合物。
在一個(gè)相關(guān)的方面，抗原性肽所包含的表位是位于GAVE10蛋白質(zhì)表面的區(qū)域如親水性區(qū)域。對人GAVE10蛋白質(zhì)序列的疏水性分析表明位于SEQ ID NO2的約1和約14位氨基酸之間，約72和約83位氨基酸之間，約145和約158位氨基酸之間以及約251和約258位氨基酸之間的這些區(qū)域尤其親水，并因此可能編碼可用于產(chǎn)生靶向抗體的表面殘基。
GAVE10免疫原一般通過用該免疫原免疫合適的受試對象(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)被用于制備抗體。合適的免疫原性制品可包含如重組表達(dá)的GAVE10蛋白質(zhì)或化學(xué)合成的GAVE10多肽。該制品還可包含佐劑，諸如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。用免疫原性GAVE10制品免疫合適的受試對象可誘導(dǎo)多克隆的抗GAVE10抗體反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及抗GAVE10抗體。此處所用術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合抗原如GAVE10。特異性結(jié)合GAVE10的分子是在天然含有GAVE10的樣本如生物樣本中結(jié)合GAVE10而不結(jié)合其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括用酶如胃蛋白酶處理抗體可產(chǎn)生的F(ab)和F(ab′)2片段。本發(fā)明提供了結(jié)合GAVE10的多克隆和單克隆抗體。此處所用術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指一群這樣的抗體分子，其只包含一種可與GAVE10特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這樣單克隆抗體組合物一般顯示出與特定的GAVE10蛋白質(zhì)表位的單一結(jié)合親和性。
多克隆抗GAVE10抗體可如上所述通過用GAVE10免疫原免疫合適的受試對象而制備?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用固定化GAVE10的酶聯(lián)免疫吸附測試法(ELISA)，在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測接受免疫的受試對象體內(nèi)的GAVE10抗體效價(jià)。如果需要，可從哺乳動(dòng)物(如從血液)分離直接針對GAVE10的抗體分子，并用公知的技術(shù)如蛋白A層析法進(jìn)一步純化，以獲得IgG級分。免疫后在合適的時(shí)間，如當(dāng)抗GAVE10抗體效價(jià)最高時(shí)，可從受試對象獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)利用此細(xì)胞制備單克隆抗體，所述技術(shù)有例如Kohler等人，自然(Nature)(1975)256495-497最初描述的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kohler等人，今日免疫學(xué)(ImmunolToday)(1983)472)，EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，單克隆抗體和癌治療(Monoclonal Antibodies and C ancer Therapy)，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)或trioma技術(shù)。產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)是公知的(一般參見免疫學(xué)最新技術(shù)(Current Protocols in Immunology)(1994)Coligan等人編輯，John Wiley & Sons，Inc.，紐約，NY)。簡而言之，將永生細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與來自如上所述的GAVE10免疫原免疫過的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)融合，并篩選所得雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清來鑒定產(chǎn)生結(jié)合GAVE10的單克隆抗體的雜交瘤。
可使用任一熟知的用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的方法產(chǎn)生抗GAVE10單克隆抗體(參見如免疫學(xué)最新技術(shù)，見上文；Galfre等人，自然(1977)266550-552；Kenneth，單克隆抗體生物學(xué)分析中的新方面(Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses)，Plenum Publishing Corp.，紐約，N.Y.(1980)；和Lerner，耶魯生物醫(yī)學(xué)雜志(Yale J Biol Med)(1981)54387-402)。而且，普通技術(shù)人員可以理解也可用此類方法的諸多改變后的方法。一般永生細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系)來自與淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物種類。例如，鼠雜交瘤可通過用本發(fā)明免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與永生小鼠細(xì)胞系如骨髓瘤細(xì)胞系融合而制備，其中骨髓瘤細(xì)胞系對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感。許多骨髓瘤細(xì)胞系中的任一種都可按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伙伴(partner)，如P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可從ATCC獲得。一般，用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞融合。融合所得的雜交瘤細(xì)胞然后用HAT培養(yǎng)基選擇，其中HAT培養(yǎng)基殺死未融合的和非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞由于未被轉(zhuǎn)化幾天后死去)。本發(fā)明的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可通過篩選骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中結(jié)合GAVE10的抗體進(jìn)行檢測(例如應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn))。
作為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的備選方案，可以應(yīng)用GAVE10篩選重組組合免疫球蛋白質(zhì)文庫(如抗體噬菌體展示文庫)，由此得以分離結(jié)合GAVE10的免疫球蛋白文庫成員，從而鑒定和分離到抗-GAVE10的單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可從供應(yīng)商處獲得(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01；以及StratageneSurfZAP噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。
此外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實(shí)例可在以下文獻(xiàn)中查詢，例如美國專利號5,223,409；PCT公開號WO 92/18619；PCT公開號WO 91/17271；PCT公開號WO 92/20791；PCT公開號WO 92/15679；PCT公開號WO 93/01288；PCT公開號WO 92/01047；PCT公開號WO 92/09690；PCT公開號WO 90/02809；Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等，科學(xué)(Science)(1989)2461275-1281和Griffiths等，EMBO J(1993)25(12)725-734。
此外，重組抗GAVE10抗體，如嵌合的和人源化的單克隆抗體(同時(shí)包含人的和非人的部分)可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。該嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如使用如下文獻(xiàn)中描述的方法產(chǎn)生PCT公開號WO 87/02671；歐洲專利申請?zhí)?84,187；歐洲專利申請?zhí)?71,496；歐洲專利申請?zhí)?73,494；PCT公開號WO 86/01533；美國專利號4,816,567；歐洲專利申請?zhí)?25,023；Better等，科學(xué)(1988)2401041-1043；Liu等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1987)843439-3443；Lin等，免疫學(xué)雜志(1987)1393521-3526；Sun等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1987)84214-218；Nishimura等，癌研究(Canc Res)(1987)47999-1005；Wood等，自然(1985)314446-449；Shaw等，國家癌研究所雜志(J Natl Cancer Inst)(1988)801553-1559；Morrison，科學(xué)(1985)2291202-1207；Oi等，生物/技術(shù)(Bio/Techniques)(1986)4214；美國專利號5,225,539；Jones等，自然(1986)321552-525；Verhoeyan等，科學(xué)(1988)2391534；和Beidler等，免疫學(xué)雜志(JImmunol)(1988)1414053-4060。
特別需要完全人抗體以用于治療人類患者。該抗體可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠制備，所述轉(zhuǎn)基因小鼠不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，而能夠表達(dá)人的重鏈和輕鏈基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠可以用選擇的抗原(如GAVE10的全部或一部分)以標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行免疫。直接針對該抗原的單克隆抗體可由常規(guī)的雜交瘤技術(shù)獲得。位于轉(zhuǎn)基因小鼠中的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過程中進(jìn)行重排，并隨后經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。這樣，應(yīng)用該表位可鑒定出抑制GAVE10活性的抗體?？寺》侨丝贵w的重鏈和輕鏈并用于構(gòu)建噬菌體展示的Fab片段。例如，可將重鏈基因克隆到質(zhì)粒載體中，以使細(xì)菌分泌重鏈?？蓪⑤p鏈基因克隆到噬菌體外殼蛋白基因中以使其可表達(dá)于噬菌體表面。使用與人輕鏈庫(隨機(jī)收集的)融合的噬菌體感染表達(dá)非人重鏈的細(xì)菌。產(chǎn)生的后代噬菌體展示雜合抗體(人輕鏈/非人重鏈)。利用選擇的抗原淘選能結(jié)合所選抗原的噬菌體。為鑒定出該噬菌體可能需要幾輪篩選。
從選出的可結(jié)合所選抗原的噬菌體中分離人輕鏈基因。然后利用選出的人輕鏈基因指導(dǎo)人重鏈基因的篩選，方法如以下所述。將選出的人輕鏈基因插入細(xì)菌表達(dá)載體。表達(dá)所選人輕鏈的細(xì)菌用融合了人重鏈庫的噬菌體進(jìn)行感染。產(chǎn)生的子代噬菌體展示人抗體(人輕鏈/人重鏈)。
接著，使用選出的抗原淘選可結(jié)合選擇抗原的噬菌體。選出的噬菌體展示出完全人抗體，該抗體識別的表位與最初選擇的非人單克隆抗體所識別的表位相同。分離編碼重鏈和輕鏈的基因，并可進(jìn)一步操作用于制備人抗體。該技術(shù)參見Jespers等的描述(生物/技術(shù)(Bio/Technology)(1994)12899-903)。
抗-GAVE10抗體(如單克隆抗體)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如親和層析或免疫沉淀)用來分離GAVE10。抗-GAVE10抗體可以幫助從細(xì)胞中純化天然的GAVE10和表達(dá)于宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生的GAVE10。此外，抗-GAVE10抗體可用于檢測GAVE10蛋白質(zhì)(如在細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液中)以評估GAVE10蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度和表達(dá)方式?？?GAVE10抗體可用于診斷中作為臨床試驗(yàn)方法的一部分來監(jiān)測組織中的蛋白質(zhì)水平，以便例如，確定特定治療方案的療效。將抗體與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)可促進(jìn)檢測的進(jìn)行?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶。合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合適的熒光材料的實(shí)例包括散形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白。發(fā)光材料的實(shí)例為魯米諾。生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、蟲螢光素和水母發(fā)光蛋白。合適的放射性材料的實(shí)例包括125I、131I、35S或3H。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明另一方面涉及含編碼GAVE10(或其一部分)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。如此處所用，術(shù)語“載體”指能夠運(yùn)輸與其相連的另一核酸的核酸分子。載體的一個(gè)類型為“質(zhì)?！保侵缚蛇B入額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA。載體的另一類型為病毒載體，其中可以將額外的DNA區(qū)段連入病毒基因組中。某些載體可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其他的載體(如非游離型的哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)整合到宿主細(xì)胞基因組中，并因此隨宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體(表達(dá)載體)能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的表達(dá)。一般，重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒(載體)形式。然而，本發(fā)明意在包括其他形式的表達(dá)載體，如可執(zhí)行等同功能的病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸以適于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式存在。這意味著重組表達(dá)載體包括一段或多段基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選出的調(diào)控序列，該序列與待進(jìn)行表達(dá)的核酸可操作地連接。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“可操作地連接”意指目的核苷酸序列連接到調(diào)控序列上，其連接方式允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中后在該宿主細(xì)胞中表達(dá))。術(shù)語“調(diào)控序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如多聚腺苷酸化信號)。該調(diào)控序列在如Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，185卷，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列在多種宿主細(xì)胞中進(jìn)行組成型表達(dá)的序列(如組織特異的調(diào)控序列)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)將取決于選擇進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生此處描述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(如GAVE10蛋白質(zhì)、突變體形式的GAVE10和融合蛋白等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)GAVE10，所述細(xì)胞有例如，細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞在之前的Goeddel的文獻(xiàn)中有討論。備選地，重組表達(dá)載體可應(yīng)用如噬菌體的調(diào)控元件和蛋白質(zhì)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其中所述元件和蛋白質(zhì)如T7啟動(dòng)子和/或T7聚合酶。
蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)大都在大腸桿菌中使用載體進(jìn)行，所述載體含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。融合載體可在其編碼的蛋白質(zhì)上添加一些氨基酸，這些氨基酸通常添加到重組蛋白的氨基端。此類融合載體一般有三種用途1)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的溶解度；和3)在親和純化中作為配體協(xié)助重組蛋白的純化。通常，融合表達(dá)載體中在融合部分和重組表達(dá)蛋白的連接處導(dǎo)入有一個(gè)蛋白水解切割位點(diǎn)，從而使得可以在純化融合蛋白后使重組蛋白得以和融合部分分離。此類酶和關(guān)聯(lián)識別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith等，基因(Gene)(1988)6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，三者分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合到靶重組蛋白上。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等，基因(Gene)(1988)69301-315)和pET 11d(Studier等，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，AcademicPress，San Diego，California(1990)18560-89)。pTrc載體上靶基因的表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。
使大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)最大化的一個(gè)策略是在蛋白水解切割重組蛋白的能力被削弱的宿主中表達(dá)蛋白(Gottesman，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法，Academic Press，San Diego，California(1990)185119-128)。另一策略是改變待插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，以使編碼每一氨基酸的各密碼子都為優(yōu)選在大腸桿菌中應(yīng)用的密碼子(Wada等，核酸研究(1992)202111-2118)。對本發(fā)明核酸序列進(jìn)行此類改變可通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)完成。
在另一實(shí)施方案中，GAVE10表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在酵母(如釀酒酵母(S.cerevisiae))中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等，細(xì)胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
備選地，可應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)GAVE10?，F(xiàn)有可用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如Sf 9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol)(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等，病毒學(xué)(Virology)(1989)17031-39)。
而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體的控制功能常由病毒調(diào)控元件提供。例如，通常應(yīng)用的啟動(dòng)子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿病毒40。對于其他適用于原核和真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，見之前Sambrook等的文獻(xiàn)的第16和17章。
在另一實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)選地在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，應(yīng)用組織特異的調(diào)控元件來表達(dá)核酸)。組織特異的調(diào)控元件在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限定實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異；Pinkert等，基因進(jìn)展(Genes Dev)(1987)1268-277)，淋巴特異的啟動(dòng)子(Calame等，Adv Immunol(1988)43235-275)，特別是T細(xì)胞受體(Winoto等，EMBO J(1989)8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等，細(xì)胞(Cell)(1983)33729-740；Queen等，細(xì)胞(Cell)(1983)33741-748)的啟動(dòng)子，神經(jīng)元特異的啟動(dòng)子(如神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1989)865473-5477)，胰腺特異的啟動(dòng)子(Edlund等，科學(xué)(Science)(1985)230912-916)和乳腺特異的啟動(dòng)子(如奶乳清蛋白啟動(dòng)子；美國專利號4,873,316和歐洲申請?zhí)?64,166)。發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子也包括在內(nèi)，如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel等，科學(xué)(Science)(1990)249374-379)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes等，基因進(jìn)展(Genes Dev)(1989)3537-546)。
本發(fā)明還提供含本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體，其中該DNA分子以反義方向克隆在表達(dá)載體中。也就是，DNA分子可操作地連接到調(diào)控序列上，該連接方式使得可以表達(dá)(通過轉(zhuǎn)錄該DNA分子)產(chǎn)生與GAVE10mRNA反義的RNA分子?？梢詫εc反義方向克隆的核酸可操作連接的調(diào)控序列進(jìn)行選擇以指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)。例如，可選擇病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或調(diào)控序列以指導(dǎo)反義RNA實(shí)現(xiàn)組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體的形式可為重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒，其中反義核酸被置于高效調(diào)控區(qū)域的控制下，其活性由載體所導(dǎo)入的細(xì)胞的類型決定。使用反義基因進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的討論見Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。
本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在此處可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語不僅指特定的受試細(xì)胞，也指該細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境影響在傳代過程中可發(fā)生某些改變，這樣，后代實(shí)際上可能并非與親代細(xì)胞相同，但其仍包括在此處所用術(shù)語的范圍之內(nèi)。
宿主細(xì)胞可為任意的原核或真核細(xì)胞。例如，GAVE10蛋白質(zhì)可在細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、293細(xì)胞或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知。載體DNA可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如此處所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種將外源核酸(如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、轉(zhuǎn)導(dǎo)、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。
對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知根據(jù)應(yīng)用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合到基因組中。為鑒定和篩選整合體，一般將編碼選擇標(biāo)記的基因(如抗生素抗性基因)與目的基因一同導(dǎo)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些可賦予藥物抗性的基因，所述藥物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸可與編碼GAVE10的基因位于同一載體上被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或可以位于不同的載體上導(dǎo)入。被導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過藥物篩選進(jìn)行鑒定(例如，摻入了選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死亡)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞)可用于產(chǎn)生(即表達(dá))GAVE10蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過應(yīng)用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生GAVE10蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(編碼GAVE10的重組表達(dá)載體已經(jīng)導(dǎo)入了該細(xì)胞)，由此使GAVE10蛋白質(zhì)得以產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離GAVE10。
在另一實(shí)施方案中，GAVE10被包含在誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)中，用于其他亞克隆到修飾表達(dá)載體上的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。例如，包含突變G蛋白的宿主細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞、Y2腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞和cyc-S49，見美國專利號6,168,927 B1,5,739,029和5,482,835；Mitchell等，美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatl Acad USA)(1992)89(19)8933-37和Katada等，生物化學(xué)雜志(J BiolChem)(1984)259(6)3586-95)用含有編碼GAVE10的核酸序列的第一表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中該GAVE10在宿主細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。盡管表達(dá)的GAVE10具有組成型活性，但突變的存在不允許信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生；即，不能激活G蛋白指導(dǎo)的下游級聯(lián)放大(例如，不能激活腺苷酰環(huán)化酶)。隨后，用第二表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含GAVE10的宿主細(xì)胞。除待通過此誘導(dǎo)型系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的目的基因外，第二載體還包含與宿主細(xì)胞G蛋白突變體互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)基因(即，哺乳動(dòng)物或酵母的功能性Gs、Gi、Go或Gq，例如，見PCT公開號WO 97/48820；美國專利號6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。第二載體的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因?yàn)榭烧T導(dǎo)的；即，處于外源添加的化合物(如四環(huán)素、IPTG、小分子等，見之前的Sambrook等的文獻(xiàn))的控制下，所述化合物可以激活與所述互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因可操作連接的啟動(dòng)子。加入誘導(dǎo)劑后，該互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性表達(dá)，結(jié)果具有組成型活性的GAVE10將形成復(fù)合體，導(dǎo)致適當(dāng)?shù)南掠瓮返募せ?例如，形成第二信使)。第二載體包含的目的基因具有可操作連接的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可以由合適的第二信使(如CREB和AP1元件)激活。這樣，當(dāng)?shù)诙攀狗e聚時(shí)，目的基因上游的啟動(dòng)子被激活以表達(dá)所述基因的產(chǎn)物。缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)，目的基因的表達(dá)關(guān)閉。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于此誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞包括但不限于，S49(cyc-)細(xì)胞。盡管本發(fā)明考慮包含G-蛋白突變的細(xì)胞系，但也可以人工制備/構(gòu)建出合適的突變體(見針對酵母細(xì)胞的美國專利號6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。
在相關(guān)的方面，細(xì)胞用與如下cDNA可操作連接的載體轉(zhuǎn)化，所述cDNA包含編碼SEQ ID NO2中所示蛋白質(zhì)的序列。該系統(tǒng)包含的第一和第二載體可以考慮包括但不限于，pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)、pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan.，細(xì)胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
又，宿主細(xì)胞可通過適宜的方法轉(zhuǎn)染，其中轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致功能性GAVE10蛋白質(zhì)的表達(dá)(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室指南(Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual)，Stockton Press，New York，NY，1990)。該“功能性蛋白質(zhì)”包括但不限于，一經(jīng)表達(dá)即可與G-蛋白形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)，其中該G-蛋白調(diào)節(jié)第二信使的形成。
在再一相關(guān)的方面，可考慮用于目的基因的啟動(dòng)子包括但不限于，那些來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿病毒40的啟動(dòng)子。其他的表達(dá)構(gòu)建體組合也適用于此誘導(dǎo)型系統(tǒng)(見，Sambrook等，同上和Kriegler，同上)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可用于制備非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為受精的卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入編碼GAVE10的序列。然后該宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生基因組中導(dǎo)入了外源GAVE10序列的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或產(chǎn)生其內(nèi)源GAVE10序列已被改變的同源重組動(dòng)物。該動(dòng)物可用以研究GAVE10的功能和/或活性，以及用于鑒定和/或評估GAVE10活性的調(diào)節(jié)劑。如此處所用，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為嚙齒類動(dòng)物如大鼠或小鼠，其中動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他實(shí)例包括非人靈長類、綿羊、狗、牛、山羊、雞和兩棲動(dòng)物等。
轉(zhuǎn)基因是外源DNA，其被導(dǎo)入細(xì)胞且一般導(dǎo)入細(xì)胞基因組中，并在細(xì)胞發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后保留在成熟動(dòng)物的基因組內(nèi)。轉(zhuǎn)基因指導(dǎo)編碼的基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞類型或組織中表達(dá)。如此處所用，“同源重組動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為小鼠，其內(nèi)源GAVE10基因已通過同源重組發(fā)生改變。這在動(dòng)物發(fā)育之前，在內(nèi)源基因以及導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(如動(dòng)物的胚胎細(xì)胞)的外源DNA分子間完成。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過將編碼GAVE10的核酸導(dǎo)入(如通過顯微注射或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染)受精卵母細(xì)胞的雄性原核、并允許卵母細(xì)胞在假孕的雌性代孕動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育來產(chǎn)生。GAVE10 cDNA序列(如(SEQ ID NO1)中的序列)可作為轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的基因組中。備選地，人GAVE10基因的非人同系物(如小鼠GAVE10基因)可基于與人GAVE10cDNA的雜交進(jìn)行分離，并用作轉(zhuǎn)基因。內(nèi)含子序列和聚腺苷酸化信號也可包括在轉(zhuǎn)基因內(nèi)，以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。組織特異的調(diào)控序列可以以可操作方式連接GAVE10轉(zhuǎn)基因以指導(dǎo)GAVE10蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。用于通過胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(特別是諸如小鼠等動(dòng)物)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)操作，且可參見如美國專利號4,736,866和4,870,009、美國專利號4,873,191和Hogan，小鼠胚胎的操作(Manipulating the Mouse Embryo)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)?？梢允褂孟嗨频姆椒óa(chǎn)生在基因組中存在轉(zhuǎn)基因和/或在動(dòng)物的組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GAVE10 mRNA的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。起始的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用來繁殖其它的攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。此外，攜帶編碼GAVE10的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可進(jìn)一步被培育成攜帶其他轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
為生成同源重組動(dòng)物，制備出含至少部分GAVE10基因(例如，人或非人GAVE10基因同系物，如鼠GAVE10基因)的載體，所述部分GAVE10基因中已經(jīng)導(dǎo)入缺失、添加或替代因而可以改變(如功能性破壞)GAVE10基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)載體，以致在同源重組后可破壞內(nèi)源GAVE10基因的功能(即，不再編碼功能蛋白質(zhì)；也稱為“敲除”載體)。
備選地，可設(shè)計(jì)載體，以便在同源重組后內(nèi)源GAVE10基因發(fā)生突變或改變但仍編碼功能蛋白質(zhì)(例如，可改變上游調(diào)控區(qū)域由此改變內(nèi)源GAVE10蛋白質(zhì)的表達(dá))。
在此同源重組載體中，改變的GAVE10基因部分在5′和3′端被GAVE10基因的其它核酸包圍，從而允許在載體攜帶的外源GAVE10基因和存在于胚胎干細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源GAVE10基因之間發(fā)生同源重組。此其它的兩翼GAVE10核酸的長度應(yīng)足以使與內(nèi)源基因的重組成功進(jìn)行。一般地，載體內(nèi)包括幾千堿基的側(cè)翼DNA(5′及3′端)(例如參見，Thomas等，細(xì)胞(Cell)(1987)51503中對同源重組載體的描述)。
將載體導(dǎo)入(如通過電穿孔)胚胎干細(xì)胞系，且篩選出導(dǎo)入的GAVE10基因與內(nèi)源GAVE10基因發(fā)生同源重組的細(xì)胞(例如參見，Li等，細(xì)胞(Cell)(1992)69915)。然后將篩選出的細(xì)胞注射到動(dòng)物(如小鼠)的胚泡中以形成嵌合集合體(例如參見，Bradley，畸胎癌和胚胎干細(xì)胞實(shí)用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach)，Robertson編輯，IRL，Oxford，(1987)，113-152頁)。然后將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物，并使胚胎生長足月。在生殖細(xì)胞中帶有同源重組DNA的子代可用于繁殖動(dòng)物，通過轉(zhuǎn)基因的生殖系傳送，所繁殖的動(dòng)物的所有細(xì)胞都將含有同源重組的DNA。
用于構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法可以進(jìn)一步參見Bradley，生物/技術(shù)中的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Bio/Technology)(1991)2823-829和PCT公開號WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中的描述。
在另一實(shí)施方案，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可含有所選系統(tǒng)以允許調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。該系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例為噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。對cre/loxP重組酶系統(tǒng)的描述參見如Lakso等，美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatl Acad USA))(1992)896232-6236。重組酶系統(tǒng)的另一實(shí)例為釀酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)(O′Gorrnan等，科學(xué)(Science)(1991)2511351-1355)。如果cre/loxP重組酶系統(tǒng)被用于調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，則需要同時(shí)含有編碼cre重組酶和選定蛋白的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。該動(dòng)物可通過構(gòu)建“雙重”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如通過兩轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的交配(所述動(dòng)物中一個(gè)含有編碼選定蛋白的轉(zhuǎn)基因而另一個(gè)含有編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因)來提供。
此處描述的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆可根據(jù)以下文獻(xiàn)描述的方法制備，Wilmut等，自然(Nature)(1997)385810-813和PCT公開號WO 97/07668和WO 97/07669。簡言之，可以分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞如體細(xì)胞，誘導(dǎo)其脫離生長周期并進(jìn)入G0期。然后，通過應(yīng)用如電脈沖將此靜止細(xì)胞與去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞融合，所述去核卵母細(xì)胞與分離的靜止細(xì)胞來自同一動(dòng)物物種。然后培養(yǎng)重建的卵母細(xì)胞以使其發(fā)育成桑椹胚或胚細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移到假孕的雌性代孕動(dòng)物體內(nèi)。雌性代孕動(dòng)物生育的后代即是分離細(xì)胞(如體細(xì)胞)所來源的動(dòng)物的克隆。
藥物組合物本發(fā)明的GAVE10核酸分子、GAVE10蛋白質(zhì)和抗-GAVE10抗體(此處也稱作“活性化合物”)可摻入到適于施用的藥物組合物中。該組合物一般包含此核酸分子、蛋白質(zhì)或抗體，以及可藥用載體。如此處所用，術(shù)語“可藥用載體”意在包括任何及所有適合藥物施用的溶劑、分散介質(zhì)、賦形劑、載體、稀釋劑、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。對藥物活性物質(zhì)應(yīng)用這些介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域熟知的。除了與活性化合物不相容的外，任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑均可考慮應(yīng)用在組合物內(nèi)。還可以將輔助活性化合物摻入組合物中。
將本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行配制以使其適合于預(yù)定的施用途徑。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外用藥，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)和皮下、經(jīng)口(如吸入)、經(jīng)皮(局部的)、經(jīng)粘膜和直腸用藥。用于腸胃外、皮內(nèi)和皮下給藥的溶液或混懸液可包括以下成分無菌稀釋劑(如用于注射的水)、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如芐基醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如EDTA；緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)整滲透壓的試劑如氯化鈉或葡萄糖。pH的調(diào)整可應(yīng)用酸或堿，如HCl或NaOH進(jìn)行。腸胃外制劑可封閉在安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶(玻璃或塑料制成)中用以存儲(chǔ)。
適于注射用藥的藥物組合物包括無菌水性溶液(水可混溶的)或分散液，以及用于隨時(shí)制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。在所有的情況中，組合物必須無菌且應(yīng)是易于注射的流體。組合物在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定，且必須避免微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)和其適宜的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可通過例如使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散劑的情況下保持所需的粒子大小和應(yīng)用表面活性劑來維持。多種抗菌劑和抗真菌劑可用來預(yù)防微生物的作用，如對羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如糖、聚醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延時(shí)吸收可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑實(shí)現(xiàn)，所述試劑如單硬脂酸鋁和明膠。
無菌注射溶液的制備可以按如下進(jìn)行將活性化合物(如GAVE10蛋白質(zhì)或抗-GAVE10抗體)以所需數(shù)量與以上所列成分中的一種或其組合(按需要)摻入到適當(dāng)?shù)娜軇┲?，之后過濾除菌。一般地，分散劑的制備方式是將活性化合物摻入到含堿性分散介質(zhì)和所需其他成分(來自以上列舉的成分)的無菌賦形藥中。對于用于配制無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從預(yù)先過濾除菌的溶液產(chǎn)生含有活性成分及任何額外所需成分的粉末。
口服組合物一般包括惰性稀釋液或可食用的載體。組合物可密封于明膠膠囊中或壓成片劑。為用于口服治療性施用目的，可以將活性化合物加入賦形劑中并以片劑、錠劑或膠囊形式使用?？诜M合物也可用流體載體制備以用作漱劑，其中化合物在流體載體中經(jīng)口應(yīng)用、漱口然后吐出或咽下。
可包括藥學(xué)相容的粘合劑和/或輔藥作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以下任一種成分或具有類似性質(zhì)的化合物粘合劑，如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸，Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲基酯或橙味調(diào)味品。用于吸入施用時(shí)，化合物以氣溶膠噴霧形式遞送，氣溶膠可由含合適拋射劑(例如，氣體如二氧化碳)的加壓容器或給藥器(dispenser)或噴霧器產(chǎn)生。
全身施用也可通過經(jīng)皮或經(jīng)粘膜途徑進(jìn)行。對于經(jīng)皮或經(jīng)粘膜施用，可將對待滲透的屏障而言適宜的滲透劑用于制劑中。該滲透劑一般在本領(lǐng)域內(nèi)公知，且包括如用于經(jīng)粘膜施用的去污劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過應(yīng)用鼻噴霧或栓劑完成。對于經(jīng)皮施用，活性化合物的劑型可以為本領(lǐng)域內(nèi)公知的軟膏、油膏、凝膠或霜?jiǎng)?br> 化合物也可以制備成栓劑(例如，應(yīng)用常規(guī)栓劑基質(zhì)，熔融溫度為哺乳動(dòng)物體溫的潤滑材料，如可可油或其他甘油酯)或灌腸滯留劑形式直腸遞送。
在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物應(yīng)用可以保護(hù)化合物避免其從體內(nèi)被快速清除的載體進(jìn)行配制，例如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)。可以應(yīng)用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。
用于制備這些制劑的方法對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言是顯而易見的。材料也可從供應(yīng)商處獲得，如Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc.。也可用脂質(zhì)體懸液(包括帶有單克隆抗體靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)作為可藥用載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的方法制備，如參見美國專利號4,522,811中的描述。
配制單位劑量形式的口服或腸道外用藥組合物是特別有利的，這可以利于施用及劑量的一致性。此處應(yīng)用的單位劑量形式指在物理上不連續(xù)的適用于作為整體給予待治療患者的單位；每一單位含預(yù)定量的活性化合物，該數(shù)量的活性化合物經(jīng)計(jì)算與所需的藥物載體聯(lián)合可產(chǎn)生所需的治療效應(yīng)。根據(jù)疾病的類型及嚴(yán)重程度，施用給患者的起始候選劑量為約1μg/kg到15mg/kg(如0.1-20mg/kg)的抗體，無論是通過例如一次或多次單獨(dú)施用或是通過連續(xù)輸注。根據(jù)以上提及的因素，典型的每日劑量可為約1μg/kg到100mg/kg或更大。對于超過幾天或更長時(shí)間的重復(fù)施用，根據(jù)疾病，治療可持續(xù)進(jìn)行直到獲得了所需的對疾病癥狀的抑制。但是，也可以使用其他給藥方案。治療的進(jìn)程由常規(guī)的技術(shù)和試驗(yàn)可以容易地進(jìn)行監(jiān)測。一示例性劑給藥方案在WO 94/04188中公開。用于本發(fā)明單位劑量形式的規(guī)格決定于且直接取決于活性化合物的獨(dú)特特性、待獲得的具體治療效果以及復(fù)合該活性化合物用于個(gè)體治療時(shí)本領(lǐng)域所固有的限制。
可將本發(fā)明的核酸分子插入載體并用作基因治療載體。將基因治療載體遞送給患者可通過如靜脈注射、局部施用(美國專利號5,328,470)或通過立體定位注射(例如參見，Chen等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl AcadUSA)(1994)913054-3057)進(jìn)行?；蛑委熭d體的藥物制劑可以在可接受稀釋劑中包括基因治療載體；或可以包含其中埋植有基因遞送工具的緩釋基質(zhì)。備選地，當(dāng)整個(gè)基因遞送載體可以從重組細(xì)胞中完整產(chǎn)生時(shí)，例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物制劑可包括一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生此基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。
藥物組合物可與施用說明書一起包括在容器、包裝或分配器內(nèi)。
本發(fā)明的應(yīng)用和方法此處描述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同系物和抗體可用于一種或多種以下的方法中a)篩選試驗(yàn)；b)檢測試驗(yàn)(例如，染色體作圖、組織分型、法醫(yī)生物學(xué))；c)預(yù)測醫(yī)學(xué)(例如，診斷試驗(yàn)、預(yù)后試驗(yàn)、臨床監(jiān)測試驗(yàn)和藥物基因組學(xué))；和d)治療方法(如治療性和預(yù)防性的)。GAVE10蛋白質(zhì)與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，因此可用于(i)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖；(ii)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化；和(iii)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。本發(fā)明的分離的核酸分子可用于表達(dá)GAVE10蛋白質(zhì)(例如，在基因治療應(yīng)用中在宿主細(xì)胞中通過重組表達(dá)載體表達(dá))，用于檢測GAVE10 mRNA(如在生物樣本中)或用于檢測 GAVE10基因中的遺傳損傷以及用于調(diào)節(jié)GAVE10活性。此外，GAVE10蛋白質(zhì)可用于篩選能調(diào)節(jié)GAVE10活性或表達(dá)的藥物或化合物；以及用于治療紊亂，所述紊亂的特征為GAVE10蛋白質(zhì)產(chǎn)生不足或過量，或產(chǎn)生的GAVE10蛋白質(zhì)形式與GAVE10野生型蛋白質(zhì)相比活性降低或異常。此外，本發(fā)明抗-GAVE10抗體可用于檢測和分離GAVE10蛋白質(zhì)，以及用于調(diào)節(jié)GAVE10活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過以上描述的篩選試驗(yàn)鑒定到的新型藥劑，及其在此處描述的治療中的用途。
A.篩選試驗(yàn)存在內(nèi)源配體時(shí)激活G蛋白受體將允許G蛋白受體復(fù)合體形成，由此導(dǎo)致GTP結(jié)合G蛋白。G蛋白的GTPase結(jié)構(gòu)域可以將GTP緩慢水解為GDP，在正常情況下導(dǎo)致受體失活。但組成型激活的受體會(huì)持續(xù)將GDP轉(zhuǎn)變成GTP。
G蛋白的不可水解底物[35S]GTPγS可用于監(jiān)測G蛋白與如下胞膜增強(qiáng)的結(jié)合作用，其中所述胞膜表達(dá)組成型激活的受體。Traynor和Nahorski報(bào)道，[35S]GTPγS可用于監(jiān)測在存在和缺乏配體時(shí)與膜偶聯(lián)的G蛋白(MolPharmacol(1995)47(4)848-54)。該試驗(yàn)系統(tǒng)優(yōu)選用于候選化合物的起始篩選，因?yàn)樵撓到y(tǒng)可通用于所有G蛋白偶聯(lián)受體，而不必考慮與受體結(jié)合的具體G蛋白的種類。
Gs20刺激腺苷酰環(huán)化酶，而Gi和Go抑制該酶。如在本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，腺苷酰環(huán)化酶催化ATP向cAMP轉(zhuǎn)化；因而，偶聯(lián)Gs蛋白的組成型活化GPCR將與提高的cAMP細(xì)胞水平相關(guān)聯(lián)。備選地，偶聯(lián)Gi(或Go)蛋白的組成型活化GCPRs將與降低的cAMP細(xì)胞水平相關(guān)聯(lián)，參見“突觸傳導(dǎo)的間接機(jī)制(Indirect Mechanism of Synaptic Transmission)”，第8章，從神經(jīng)元到腦(第三版)，Nichols等編，Sinauer Associates，Inc.，1992。因此，檢測cAMP的試驗(yàn)可用于判定候選化合物是否為受體的反向激動(dòng)劑。本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種測定cAMP的方法均可以使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-cAMP抗體用于基于ELISA的試驗(yàn)中。在另一實(shí)施方案中，則考慮全細(xì)胞第二信使報(bào)告系統(tǒng)(見PCT公開號WO 00/22131)。
在一個(gè)相關(guān)的方面，環(huán)AMP通過促進(jìn)cAMP效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合而驅(qū)使基因表達(dá)，其中cAMP效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)然后在稱為cAMP效應(yīng)元件的特異性位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。因此可構(gòu)建這樣的報(bào)告體系，其在報(bào)告基因如β-半乳糖苷酶或螢光素酶之前具有包含多個(gè)cAMP效應(yīng)元件的啟動(dòng)子。進(jìn)一步地，當(dāng)組成型活化的Gs-連接受體引起cAMP的累積時(shí)，則可激活基因并表達(dá)報(bào)告蛋白。然后可用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)試驗(yàn)檢測報(bào)告蛋白如β-半乳糖苷酶或螢光素酶(PCT公開號WO 00/22131)。
其它G蛋白，如Go和Gq，與磷脂酶C的激活相關(guān)，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2釋放出兩個(gè)胞內(nèi)信使甘油二酯(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3積聚的增加與Gq-相關(guān)受體和Go-相關(guān)受體的激活相關(guān)聯(lián)(PCT公開號WO 00/22131)。檢測IP3積聚的試驗(yàn)可用于判定候選化合物是否為Gq-相關(guān)受體或Go-相關(guān)受體的反向激動(dòng)劑。Gq-相關(guān)受體還可用AP1報(bào)告試驗(yàn)檢測，該試驗(yàn)在于檢測Gq-依賴的磷脂酶C是否引起了含AP1元件的基因的激活。這樣，激活的Gq-相關(guān)受體將顯示為該基因表達(dá)的增強(qiáng)，而反向激動(dòng)劑將顯示為該表達(dá)的減弱。
本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(此處也稱作“篩選試驗(yàn)”)，所述調(diào)節(jié)劑即能結(jié)合GAVE10蛋白質(zhì)或?qū)鏕AVE10表達(dá)或GAVE10活性具有刺激或抑制效應(yīng)的候選或測試化合物或試劑(例如，肽、肽模擬物(peptidomimetics)、小分子或其他藥物)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于篩選如下候選或測試化合物的試驗(yàn)，所述化合物能結(jié)合膜結(jié)合形式的GAVE10蛋白質(zhì)、多肽或其生物活性部分或調(diào)節(jié)其活性。本發(fā)明的測試化合物可應(yīng)用眾多手段之任一種在本領(lǐng)域內(nèi)公知的組合文庫方法中獲得，包括生物文庫；可空間尋址的平行固相或液相文庫；需要去回旋(deconvolution)的合成文庫方法；“單珠單化合物”文庫方法；和應(yīng)用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫方法限于肽文庫，而其他四種方法適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(Lam，抗癌藥物研究(Anticancer Drug Des)(1997)12145)。
用于合成分子文庫的方法的實(shí)例可在本領(lǐng)域內(nèi)找到，例如DeWitt等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1993)906909；Erb等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1994)9111422；Zuckermann等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J Med Chem)(1994)372678；Cho等，科學(xué)(Science)(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332061和Gallop等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(JMed Chem)(1994)371233。
化合物文庫可呈現(xiàn)在溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)或珠子上(Lam，自然(Nature)(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，自然(Nature)(1993)364555-556)、或細(xì)菌(美國專利號5,223,409)、孢子(美國專利號5,571,698；5,403,484和5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等，美國國家科學(xué)院院刊(Proe Natl Acad USA)(1992)891865-1869)或噬菌體上(Scott等，科學(xué)(Science)(1990)249386-390；Devlin，科學(xué)(Science)(1990)249404-406；Cwirla等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876378-6382；和Felici，分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol)(1991)222301-310)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)為基于細(xì)胞的試驗(yàn)，其中使細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的GAVE10蛋白質(zhì)(或其生物活性部分)的細(xì)胞與受試化合物接觸，并測定受試化合物結(jié)合GAVE10蛋白質(zhì)的能力。例如，細(xì)胞可為酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞。測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)的結(jié)合能力的測定可以通過例如以下方式進(jìn)行將測試化合物與放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)，這樣測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的結(jié)合可通過檢測復(fù)合物中的標(biāo)記化合物進(jìn)行確定。例如，測試化合物可直接或間接標(biāo)記125I、35S、14C或3H，放射性同位素的檢測可通過直接計(jì)數(shù)放射量或通過閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行。備選地，測試化合物可應(yīng)用如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶進(jìn)行酶標(biāo)記，且酶標(biāo)記的檢測可通過測定適宜的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)包括將在細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與可以結(jié)合GAVE10的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測試化合物接觸并測定測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中對測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)相互作用的能力的測定包括測定測試化合物與已知化合物相比優(yōu)先與GAVE10或其生物活性部分結(jié)合的能力。
在另一實(shí)施方案中，試驗(yàn)為基于細(xì)胞的試驗(yàn)，包括使細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與測試化合物接觸，并測定測試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力。測試化合物調(diào)節(jié)GAVE10或其生物活性部分的活性的能力可通過，例如，測定GAVE10蛋白質(zhì)結(jié)合GAVE10靶分子或與其相互作用的能力來確定。如此處所用，“靶分子”是指天然與GAVE10蛋白質(zhì)結(jié)合或作用的分子，如表達(dá)GAVE10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的表面分子、在第二細(xì)胞的表面上的分子、在細(xì)胞外周圍區(qū)域中的分子、與胞膜內(nèi)表面關(guān)聯(lián)的分子或細(xì)胞質(zhì)分子。GAVE10靶分子可不為本發(fā)明的GAVE10分子或GAVE10蛋白質(zhì)或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，GAVE10靶分子為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分，所述途徑促進(jìn)胞外信號(例如由化合物結(jié)合膜結(jié)合形式的GAVE10分子所產(chǎn)生的信號)通過胞膜向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，靶分子可為具有催化活性的第二胞內(nèi)蛋白質(zhì)或促進(jìn)下游信號分子與GAVE10關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。
GAVE10蛋白質(zhì)與GAVE10靶分子結(jié)合或作用的能力可通過以上描述的用于測定直接結(jié)合的其中一種方法來測定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，GAVE10蛋白質(zhì)與GAVE10靶分子結(jié)合或作用的能力可通過測定靶分子的活性來確定。靶分子活性的測定方法有例如檢測靶分子對胞內(nèi)第二信使(如胞內(nèi)Ca2+、甘油二酯、IP3等)的誘導(dǎo)、檢測靶分子對合適底物的催化/酶促活性、檢測報(bào)告基因(例如可操作地連接編碼可檢測標(biāo)記(如螢光素酶)的核酸的GAVE10效應(yīng)調(diào)控元件)的誘導(dǎo)或檢測細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖。
而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試驗(yàn)為無細(xì)胞試驗(yàn)，包括將GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測試化合物接觸，并測定測試化合物結(jié)合GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的能力。測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)的結(jié)合可以如以上所描述的方式直接或間接進(jìn)行檢測。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)包括將GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分與能結(jié)合GAVE10的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測試化合物接觸并測定測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中對測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)相互作用的能力的測定包括測定測試化合物與已知化合物相比優(yōu)先結(jié)合GAVE10或其生物活性部分的能力。
在另一實(shí)施方案中，試驗(yàn)為無細(xì)胞試驗(yàn)，包括將GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測試化合物接觸并測定測試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力。對測試化合物調(diào)節(jié)GAVE10的活性的能力的測定可通過，例如利用以上描述的用于測定直接結(jié)合的其中一種方法測定GAVE10蛋白質(zhì)結(jié)合GAVE10靶分子的能力來實(shí)現(xiàn)。在備選的實(shí)施方案中，對測試化合物調(diào)節(jié)GAVE10活性的能力的測定可通過測定GAVE10蛋白質(zhì)進(jìn)一步調(diào)節(jié)GAVE10靶分子的能力來實(shí)現(xiàn)。例如，可以按前述測定靶分子對適當(dāng)?shù)孜锏拇呋?酶促活性。
而在另一實(shí)施方案中，無細(xì)胞試驗(yàn)包括將GAVE10蛋白質(zhì)或其生物活性部分與能結(jié)合GAVE10的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測試化合物接觸并測定測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中對測試化合物與GAVE10蛋白質(zhì)相互作用的能力的測定包括測定GAVE10蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合GAVE10靶分子或調(diào)節(jié)GAVE10靶分子的活性的能力。
受體可由非配體分子激活，所述非配體分子并不一定抑制配體結(jié)合但可引起受體結(jié)構(gòu)改變以致造成G蛋白結(jié)合或，可能的受體聚集、二聚化或簇集，從而引起激活作用。
因此，可以由暴露于細(xì)胞表面的GAVE10的多個(gè)部位產(chǎn)生抗體。然后，可篩選出經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(如監(jiān)測cAMP水平或胞內(nèi)Ca2+水平)測定能通過G蛋白級聯(lián)激活細(xì)胞的抗體。
抗體可用公知的技術(shù)制備。由于涉及分子作圖，特別是表位作圖，單克隆抗體可能是優(yōu)選的。單克隆抗體可由表達(dá)于細(xì)胞表面的完整受體以及已知形成在細(xì)胞表面的肽引起?？蓱?yīng)用Geysen等，美國專利號5,998,577的方法以獲得大量的相關(guān)肽。
所發(fā)現(xiàn)的可激活GAVE10的抗體可經(jīng)過修飾以最小化與激活GAVE10無關(guān)的活性，如補(bǔ)體結(jié)合。這樣，可對抗體分子實(shí)行截短或突變以使激活GAVE10以外的活性最小或喪失。例如，對某些抗體，僅需要抗原結(jié)合部分。這樣，可去除抗體的Fc部分。
將表達(dá)GAVE10的細(xì)胞暴露于抗體以激活GAVE10。然后使激活的細(xì)胞暴露于多種分子以期鑒定出那些改變受體活性(無論是提高激活水平還是降低激活水平)的分子。然后可對達(dá)此目的的分子在無抗體的情況下在表達(dá)GAVE10的細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)，以觀察對非激活細(xì)胞的效應(yīng)。然后可以用公知的技術(shù)檢測靶分子并將其修飾為候選藥物，用于治療與GAVE10代謝改變相關(guān)的紊亂。
本發(fā)明的無細(xì)胞試驗(yàn)適于應(yīng)用可溶形式和膜結(jié)合形式的GAVE10。對于包括膜結(jié)合形式的GAVE10的無細(xì)胞試驗(yàn)，可能需要利用增溶劑以使膜結(jié)合形式的GAVE10維持在溶液中。該增溶劑的實(shí)例包括非離子去污劑，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸?；?N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、異三癸基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸。
在本發(fā)明以上試驗(yàn)方法的不止一個(gè)實(shí)施方案中，可能需要固定GAVE10或其靶分子以易于從非復(fù)合形式的一種或全部兩種所述蛋白質(zhì)中分離出復(fù)合形式，以及適于試驗(yàn)的自動(dòng)化。在存在或缺乏候選化合物時(shí)測試化合物與GAVE10的結(jié)合或GAVE10與靶分子的相互作用可在任何適用于容納反應(yīng)物的容器內(nèi)完成。該容器的實(shí)例包括微滴板、試管和微離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可提供融合蛋白，該融合蛋白質(zhì)添加有允許其中一種或全部兩種上述蛋白質(zhì)結(jié)合到基質(zhì)上的結(jié)構(gòu)域。例如可將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/GAVE10融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sephares珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上。備選地，可應(yīng)用谷胱甘肽衍生的微滴板，然后使微滴板接觸測試化合物，或測試化合物和非吸附靶蛋白或GAVE10蛋白質(zhì)，且在利于形成復(fù)合物的條件下孵育混合物(例如在生理性鹽和pH條件下)。孵育后，洗滌珠子或微滴板孔以移去任何未結(jié)合成分，且直接或間接地測定復(fù)合體的形成，參見以上描述。備選地，可以使復(fù)合物與基質(zhì)解離，且用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定GAVE10的結(jié)合或活性水平。
其他用于固定蛋白質(zhì)于基質(zhì)上的技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選試驗(yàn)。例如，可利用生物素或鏈霉親和素固定GAVE10或其靶分子。生物素化的GAVE10或靶分子可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，PierceChemicals，Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基-丁二酰亞胺)制備產(chǎn)生，并固定在鏈霉親和素包被的96孔板(Pierce Chemicals)的孔內(nèi)。備選地，可使用與GAVE10或靶分子反應(yīng)但不阻礙GAVE10蛋白質(zhì)結(jié)合靶分子的抗體對平板的孔進(jìn)行衍生，通過抗體結(jié)合，將未結(jié)合的靶標(biāo)或GAVE10捕獲在孔內(nèi)。除了以上描述的用于檢測GST-固定的復(fù)合物的方法外，用于檢測復(fù)合物的方法還包括應(yīng)用與GAVE10或靶分子反應(yīng)的抗體對復(fù)合物進(jìn)行的免疫檢測以及依賴于檢測與GAVE10或靶分子連結(jié)的酶促活性的酶聯(lián)試驗(yàn)。
在另一實(shí)施方案中，GAVE10表達(dá)的調(diào)節(jié)劑可通過如下方法鑒定，其中，使細(xì)胞與候選化合物接觸并測定胞內(nèi)GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。將存在候選化合物時(shí)GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與缺乏候選化合物時(shí)GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。然后，基于該比較，可以鑒定候選化合物是否為GAVE10表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。例如，當(dāng)GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)在存在候選化合物時(shí)的表達(dá)大于(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著大于)缺乏該化合物時(shí)的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的刺激劑或激動(dòng)劑。備選地，當(dāng)GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)在存在候選化合物時(shí)的表達(dá)低于(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著低于)缺乏該化合物時(shí)的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制劑或拮抗劑。如果GAVE10活性在存在配體或激動(dòng)劑時(shí)減少，或在組成型GAVE10的情況下低于基線，則候選化合物被鑒定為反向激動(dòng)劑。胞內(nèi)GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可由此處描述的用于檢測GAVE10 mRNA或蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行測定。
而在本發(fā)明另一方面，GAVE10蛋白質(zhì)可在雙雜交或三雜交試驗(yàn)中用作“誘餌蛋白”(例如參見美國專利號5,283,317；Zervos等，細(xì)胞(Cell)(1993)72223-232；Madura等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)(1993)26812046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，癌基因(Oncogene)(1993)81693-1696；和PCT公開號WO 94/10300)，以鑒定其他與GAVE10結(jié)合或作用(“GAVE10結(jié)合蛋白”或“GAVE10-bp”)并調(diào)節(jié)GAVE10活性的蛋白質(zhì)。該GAVE10-結(jié)合蛋白也可能通過GAVE10蛋白質(zhì)作為如GAVE10途徑的上游或下游元件參予信號傳播。
由于可制備出大量的純GAVE10，故可以確定出可能功能區(qū)域的構(gòu)象的物理特征，用于合理的藥物設(shè)計(jì)。例如，該分子的IC3區(qū)域和EC結(jié)構(gòu)域?yàn)樘貏e有意義的區(qū)域。一旦確定了區(qū)域的形狀和離子構(gòu)型，可與這些區(qū)域作用的候選藥物即可成型，然后可以在完整細(xì)胞、動(dòng)物和患者中進(jìn)行試驗(yàn)。能夠獲得此3-D結(jié)構(gòu)信息的方法包括X射線晶體學(xué)、NMR光譜學(xué)、分子模建等。3-D結(jié)構(gòu)也可導(dǎo)致鑒定出其他已知蛋白中的類似構(gòu)象位點(diǎn)，而對于所述蛋白已存在作用于此位點(diǎn)的已知藥物。這些藥物或其衍生物可能能用于GAVE10。
本發(fā)明還涉及由以上篩選試驗(yàn)鑒定到的新藥劑，以及其在此處描述的治療中的應(yīng)用。
B.檢測試驗(yàn)此處鑒定的cDNA序列的部分或片段(以及相應(yīng)的完整基因序列)可在多個(gè)方面用作多核苷酸試劑。例如，序列可用于(i)在染色體上對相應(yīng)的基因繪圖并，由此定位與遺傳疾病相關(guān)的基因區(qū)域；(ii)從微小量生物樣本中對個(gè)體實(shí)施鑒定(組織分型)；和(iii)為生物樣本的法醫(yī)鑒定提供幫助。這些應(yīng)用在以下的分段中描述。
1.染色體作圖一旦分離出基因的序列(或序列的一部分)，則該序列可用于在染色體(如2號染色體)上定位GAVE10基因。因此，此處描述的GAVE10核酸分子或其片段可用于在2號染色體上作圖定位GAVE10。2號染色體上GAVE10序列的作圖定位是確定該序列與疾病相關(guān)基因(例如HLA復(fù)合體)之間的關(guān)系的重要第一步。
簡言之，通過從GAVE10序列中制備PCR引物(優(yōu)選的長度為15-25bp)，可以對GAVE10基因在2號染色體上作圖。該引物可用于對包含單個(gè)人染色體的體細(xì)胞雜合體進(jìn)行PCR篩選。僅有包含與GAVE10序列對應(yīng)的人類基因的那些雜合體能產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
通過融合不同哺乳動(dòng)物來源的體細(xì)胞(例如，人和小鼠的細(xì)胞)制備體細(xì)胞雜合體。人和小鼠細(xì)胞的雜合體在生長和分裂時(shí)，一般人的染色體會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)丟失，而小鼠染色體保留。通過應(yīng)用小鼠細(xì)胞(由于缺乏特定的酶)不能但人細(xì)胞可以在其中生長的培養(yǎng)基，含編碼所需酶的基因的一條人染色體將得以保留。通過應(yīng)用多種培養(yǎng)基，可以建立一組雜合細(xì)胞系。組內(nèi)每一細(xì)胞系含單一的人染色體或小數(shù)目的人染色體及一整套鼠染色體，從而使得可以容易地將單獨(dú)的基因作圖定位于特定的人染色體上(D′Eustachio等，科學(xué)(Science)(1983)220919-924)。還可通過應(yīng)用帶有易位和缺失的人染色體制備僅含人染色體片段的體細(xì)胞雜合體。
體細(xì)胞雜合體的PCR作圖是一種將特定序列定位于特定染色體上的快速方法。每臺(tái)熱循環(huán)儀每天可定位三段或更多的序列。用GAVE10序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用一組2號染色體的片段或涉及其的易位體可進(jìn)行亞定位。其他作圖策略可同樣用于在2號染色體上對GAVE10序列進(jìn)行作圖定位，包括原位雜交(描述于Fan等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl AcadUSA)(1990)876223-27)、用標(biāo)記的流式分揀染色體預(yù)篩選和通過與染色體特異的cDNA文庫雜交進(jìn)行預(yù)選擇。
可使用DNA序列與中期染色體鋪展物的熒光原位雜交(FISH)一步提供精確的染色體定位。染色體鋪展物的制備可應(yīng)用被化學(xué)物阻滯在分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行，所述化學(xué)物如可破壞有絲分裂紡錘體的秋水仙堿。染色體可以用胰蛋白酶短暫處理然后進(jìn)行Giemsa染色。每條染色體上會(huì)出現(xiàn)亮帶和暗帶圖案，由此可鑒定出各染色體。FISH技術(shù)可應(yīng)用500或600個(gè)堿基的DNA序列進(jìn)行。但是，大于1,000個(gè)堿基的克隆更有可能結(jié)合獨(dú)特的染色體位置并產(chǎn)生足夠的信號強(qiáng)度以便簡單檢測。優(yōu)選地1,000個(gè)堿基且更優(yōu)選地2,000個(gè)堿基將足以在合理的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生好的結(jié)果。參見Verma等的有關(guān)該技術(shù)的綜述(人類染色體基礎(chǔ)操作手冊(Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques)(Pergamon Press，New York，1988))。染色體作圖可以在硅片上(in silico)考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)因素，如優(yōu)勢對數(shù)得分或單純接近度(mere proximity)進(jìn)行推斷。例如，通過硅片上作圖GAVE10被暫時(shí)繪制在12q24.23。
用于染色體作圖的試劑可單個(gè)應(yīng)用以標(biāo)記2號染色體或染色體上的單一位點(diǎn)，或可應(yīng)用一組試劑標(biāo)記多個(gè)位點(diǎn)和/或多條染色體。對作圖目的，實(shí)際上優(yōu)選對應(yīng)于GAVE10基因兩翼區(qū)域的試劑。編碼序列在基因家族內(nèi)更可能保守，因此增加了染色體作圖中交叉雜交的機(jī)會(huì)。
一旦將序列繪制在精確的染色體位置，則可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(該數(shù)據(jù)存放在例如McKusick，人類的孟德爾遺傳(Mendelian Inheritance in Man)中，可在線從Johns Hopkins大學(xué)的Welch醫(yī)學(xué)圖書館獲得)。然后，基因和繪圖定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的關(guān)系，可通過連鎖分析進(jìn)行確定(物理上鄰近的基因的共遺傳)，如參見Egeland等，自然(Nature)(1987)325783-787中的描述。
此外，可測定受到或未受到GAVE10相關(guān)疾病影響的個(gè)體之間DNA序列的差異。如果在一些或全部的受影響個(gè)體中觀察到突變而未在任何未受影響的個(gè)體中觀察到此突變，則該突變可能為特定疾病的致病因子。對受到影響和未受到影響的個(gè)體的比較一般包括首先在染色體中尋找結(jié)構(gòu)的改變，如缺失或易位，所述改變可在染色體鋪展物中觀察到或可應(yīng)用基于該DNA序列的PCR檢測到。最終，可對來自幾個(gè)個(gè)體的基因進(jìn)行完整測序，以證實(shí)突變的存在并將突變與多態(tài)性區(qū)分開來。
2.組織分型本發(fā)明的GAVE10序列也可用于從少量生物樣本出發(fā)對個(gè)體進(jìn)行鑒定。例如，美國部隊(duì)正考慮將限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)用于人員的鑒定。該技術(shù)中，用一種或多種限制性酶消化個(gè)體的基因組DNA，在Southern印跡中用探針探測以產(chǎn)生獨(dú)特的條帶用于鑒定。該方法避免了目前身份識別標(biāo)識(Dog Tags)方法的局限性，所述局限性為可丟失、轉(zhuǎn)換或被竊，這使得陽性鑒定變得困難。本發(fā)明的序列可用作RFLP的額外DNA標(biāo)記(在美國專利號5,272,057中描述)。
此外，本發(fā)明的序列可用于提供備選的技術(shù)以逐個(gè)堿基確定個(gè)體基因組中選定部位的實(shí)際DNA序列。這樣，此處描述的GAVE10序列可用于制備針對序列的5’和3′末端的兩段PCR引物。然后可以使用所述引物擴(kuò)增個(gè)體的DNA并隨后提供其序列。
由此方式從個(gè)體得到的相應(yīng)DNA序列組將提供獨(dú)特的個(gè)體身份辨識方法，這是因?yàn)橛捎诘任换虻牟町愂沟妹恳粋€(gè)體將具有獨(dú)特的一套該DNA序列。可應(yīng)用本發(fā)明的序列從個(gè)體和組織獲得此身份辨識序列。本發(fā)明的GAVE10序列是人類基因組中的一個(gè)獨(dú)特部分。在該序列的編碼區(qū)有一定程度的等位基因變異，且在非編碼區(qū)有程度更高的變異。據(jù)估計(jì)人類個(gè)體間等位基因變異的頻率為每500個(gè)堿基約發(fā)生一次。此處描述的每個(gè)序列均可在某種程度上作為標(biāo)準(zhǔn)，與來自個(gè)體的DNA比較用于鑒定的目的。由于非編碼區(qū)有更多數(shù)目的多態(tài)性，故區(qū)分個(gè)體只需要較少的序列。應(yīng)用一組約10到1,000個(gè)引物(每條引物產(chǎn)生100個(gè)堿基的非編碼擴(kuò)增序列)，SEQ ID NO1的非編碼序列可提供陽性的個(gè)體鑒定。如果應(yīng)用預(yù)測的編碼序列如SEQ ID NO1中的那些，對于陽性個(gè)體鑒定，更為合適的引物數(shù)目將為500-2,000。
如果使用來自GAVE10序列的一組試劑(如此處所描述)來產(chǎn)生個(gè)體的獨(dú)特身份辨識數(shù)據(jù)庫，則同樣的試劑可隨后用于鑒定來自該個(gè)體的組織。應(yīng)用此獨(dú)特身份辨識數(shù)據(jù)庫，可從極其少量的組織樣本出發(fā)實(shí)現(xiàn)個(gè)體(存活的或死亡的)的陽性鑒定。
3.GAVE10部分序列在法醫(yī)生物學(xué)中的應(yīng)用基于DNA的鑒定技術(shù)也可用于法醫(yī)生物學(xué)中。法醫(yī)生物學(xué)為應(yīng)用對犯罪現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的生物證據(jù)進(jìn)行遺傳分型來作為陽性鑒定(如犯罪者)手段的一個(gè)科學(xué)領(lǐng)域。為進(jìn)行鑒定，可應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增取自很少量生物樣本的DNA序列，所述生物樣本如發(fā)現(xiàn)于犯罪現(xiàn)場的組織(如頭發(fā)或皮膚)或體液(如血液、唾液或精液)。然后可與標(biāo)準(zhǔn)品比較擴(kuò)增序列，由此允許鑒定出生物樣本的來源。
本發(fā)明的序列可用于提供靶向人類基因組特定位點(diǎn)的多核苷酸試劑如PCR引物，可增加基于DNA的法醫(yī)鑒定的可靠性。例如，目的核酸可提供另一“鑒定標(biāo)記”(即，特定個(gè)體所特有的另一DNA序列)。如以上提到的，實(shí)際的堿基序列信息可作為由限制性酶產(chǎn)生的片段圖形的一個(gè)精確備選方案用于鑒定目的。靶向SEQ ID NO1非編碼區(qū)的序列特別適用于此用途，因?yàn)樵摲蔷幋a區(qū)存在大量數(shù)目的多態(tài)性，從而提高了應(yīng)用該技術(shù)區(qū)分個(gè)體的辨別力。多核苷酸試劑的實(shí)例包括GAVE10序列或其部分，例如來自SEQ ID NO1非編碼區(qū)且長度為至少20到30個(gè)堿基的片段。
此處描述的GAVE10序列還可用于提供如下多核苷酸試劑，如被標(biāo)記的探針或標(biāo)記探針，所述試劑可用于如原位雜交技術(shù)中以鑒定特定的組織(如腦組織)。當(dāng)提供給法醫(yī)病理學(xué)家的是未知來源的細(xì)胞或降解組織時(shí)，這會(huì)十分有用。該GAVE10探針組可用于鑒定組織的物種和/或器官類型。
以類似的方式，諸如GAVE10引物或探針等試劑可用于篩選受污染的組織培養(yǎng)物(即在培養(yǎng)物中甄別不同類型細(xì)胞混合物的存在)。
C.預(yù)測醫(yī)學(xué)本發(fā)明也涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中診斷試驗(yàn)、預(yù)后試驗(yàn)、藥物基因組學(xué)和臨床監(jiān)測試驗(yàn)被用于預(yù)后(預(yù)測性)目的以預(yù)防性治療個(gè)體。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及診斷試驗(yàn)，該試驗(yàn)用于在生物樣本(如血、尿、糞、痰、血清、細(xì)胞和組織)環(huán)境中測定GAVE10蛋白質(zhì)和/或核酸的表達(dá)以及GAVE10的活性?？蓱?yīng)用此試驗(yàn)確定個(gè)體是否患有與異常GAVE10表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或紊亂或存在疾病發(fā)生危險(xiǎn)性。
本發(fā)明也提供預(yù)后(或預(yù)測性)試驗(yàn)，以確定個(gè)體是否存在罹患與GAVE10蛋白質(zhì)、核酸表達(dá)或活性有關(guān)的紊亂的危險(xiǎn)。例如，可以在生物樣本中測試GAVE10基因中的突變。該試驗(yàn)可用于預(yù)后或預(yù)測性的目的，由此可以在以GAVE10蛋白質(zhì)、核酸的表達(dá)或活性為特征或與其相關(guān)的紊亂發(fā)作之前預(yù)防性治療個(gè)體。
本發(fā)明另一方面提供了用于測定個(gè)體的GAVE10蛋白質(zhì)、核酸的表達(dá)或GAVE10的活性以便由此選擇合適的治療性或預(yù)防性藥劑用于該個(gè)體的方法(此處稱為“藥物基因組學(xué)”)。藥物基因組學(xué)允許基于個(gè)體的基因型(如檢查個(gè)體基因型以判定個(gè)體對特定藥劑的反應(yīng)能力)選擇藥劑(如藥物)用于治療性或預(yù)防性治療個(gè)體。
而在本發(fā)明另外的方面，涉及到在臨床試驗(yàn)中監(jiān)測藥劑(如藥物或其他化合物)對GAVE10表達(dá)或活性的影響。
這些以及其他的藥劑在以下的部分中作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
1.診斷試驗(yàn)用于檢測生物樣本中GAVE10存在與否的示例性方法包括從受試對象中獲得生物樣本，并將生物樣本與可檢測GAVE10蛋白質(zhì)或編碼GAVE10蛋白質(zhì)的核酸(如mRNA或基因組DNA)的化合物或試劑接觸，以檢測生物樣本中GAVE10的存在。用于檢測GAVE10 mRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑為能夠與GAVE10 mRNA或基因組DNA雜交的標(biāo)記核酸探針。核酸探針可為，例如全長GAVE10核酸，如SEQ ID NO1的核酸或其部分，如長度為至少15、30、50、100、250、500或更多個(gè)核苷酸并且足于在嚴(yán)緊的條件下足以特異雜交到GAVE10 mRNA或基因組DNA上的寡核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明診斷試驗(yàn)的其它合適探針在本文中有描述。
用于檢測GAVE10蛋白質(zhì)的優(yōu)選試劑為能夠結(jié)合GAVE10蛋白質(zhì)的抗體，優(yōu)選地為帶有可檢測標(biāo)記的抗體?？贵w可為多克隆的或更優(yōu)選地為單克隆的?？蓱?yīng)用完整的抗體或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。對探針或抗體而言，術(shù)語“標(biāo)記”意在包括通過將可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)到探針或抗體上直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與直接被標(biāo)記的另一試劑反應(yīng)間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括用熒光標(biāo)記的二級抗體檢測一級抗體和用生物素末端標(biāo)記DNA探針以便可以使用熒光標(biāo)記的鏈霉親合素進(jìn)行檢測。術(shù)語“生物樣本”意在包括從受試對象分離的組織、細(xì)胞和生物體液，以及存在于受試對象體內(nèi)的組織、細(xì)胞和體液。即，本發(fā)明的檢測方法可用于在體外及體內(nèi)檢測生物樣本中的GAVE10 mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，用于體外檢測GAVE10 mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。用于在體外檢測GAVE10蛋白質(zhì)的技術(shù)包括ELISA、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。用于體外檢測GAVE10基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。此外，用于體內(nèi)檢測GAVE10蛋白質(zhì)的技術(shù)包括向受試者體內(nèi)導(dǎo)入標(biāo)記的抗-GAVE10抗體。例如，可給抗體標(biāo)記上放射活性標(biāo)志，其在受試者體內(nèi)的存在和部位可通過標(biāo)準(zhǔn)成象技術(shù)檢測。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣本含有來自受試對象的蛋白質(zhì)分子?；蛘?，生物樣本可以含有來自受試對象的mRNA分子或來自受試對象的基因組DNA分子。優(yōu)選的生物樣本是利用常規(guī)手段從受試對象分離到的外周血白細(xì)胞樣本。
因此，在開發(fā)預(yù)后或診斷實(shí)驗(yàn)時(shí)，將鑒定核酸或蛋白質(zhì)的多態(tài)性與疾病聯(lián)系起來用于診斷攜帶者或患者可能是有益的。例如，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、節(jié)段性回腸炎等，進(jìn)行預(yù)后或診斷試驗(yàn)將是有益的。GAVE10表達(dá)水平在激活或炎性狀態(tài)的細(xì)胞中上升。與炎性有關(guān)的紊亂包括過敏性疾病、結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、水腫、接觸性過敏、過敏反應(yīng)、其他形式的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎及其中免疫系統(tǒng)對損害產(chǎn)生反應(yīng)的其它疾病，所述反應(yīng)為通過血管擴(kuò)張、發(fā)熱、細(xì)胞聚集、體液等而在某位點(diǎn)造成腫脹等。因此，GAVE10代謝的紊亂可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷。而且，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制可能是可檢測的，例如，可能存在可以在組織樣本(如血液樣本)中進(jìn)行檢測的診斷性SNP、RFLP、表達(dá)水平的變化性、功能的變化性等等。
在另一實(shí)施方案中，這些方法還包括從對照受試者獲得生物樣本；使對照樣本與能夠檢測GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，以便檢測生物樣本中GAVE蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和數(shù)量；和將對照樣本中GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和數(shù)量與測試樣本中GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和數(shù)量進(jìn)行比較。
本發(fā)明還包括檢測生物樣本(測試樣本)中GAVE10存在的試劑盒。該試劑盒可以用于確定受試者是否患有或有增加的危險(xiǎn)性患有與GAVE10異常表達(dá)有關(guān)的疾病(例如惡性腫瘤)。例如，該試劑盒可以包含能夠檢測生物樣本中的GAVE10蛋白質(zhì)或mRNA的標(biāo)記化合物或試劑以及用于檢測樣本中GAVE10數(shù)量的手段(例如，抗GAVE10抗體或能與GAVE10的編碼DNA(例如SEQ ID NO1)結(jié)合的寡核苷酸探針)。當(dāng)GAVE10蛋白質(zhì)或mRNA的數(shù)量高于或低于正常水平時(shí)，試劑盒還可以用于得出受試對象是否患有或有危險(xiǎn)患有與GAVE10異常表達(dá)相關(guān)的疾病的結(jié)果。
對于基于抗體的試劑盒，其可以包含例如(1)可與GAVE10蛋白質(zhì)結(jié)合的第一抗體(例如附著在固相支持物上)；和，任選地，(2)可與GAVE10蛋白質(zhì)或與第一抗體結(jié)合并綴合有可檢測試劑的不同第二抗體。如果不存在第二抗體，則可以使用能與第一抗體結(jié)合并可以被標(biāo)記的另一分子，或標(biāo)記該第一抗體。正如本領(lǐng)域已知的，無論如何都應(yīng)包括已標(biāo)記的結(jié)合部分以充當(dāng)可檢測報(bào)道分子。
對于基于寡核苷酸的試劑盒，其可以包含，例如(1)可與GAVE10核酸序列雜交的寡核苷酸，例如可檢測標(biāo)記的寡核苷酸或(2)可用于擴(kuò)增GAVE10核酸分子的引物對。
試劑盒還可以包含例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包含在探測可檢測試劑(例如酶或底物)時(shí)所必需的成分。試劑盒還可以含有可以進(jìn)行分析和與測試樣本進(jìn)行比較的對照樣本或一系列對照樣本。試劑盒的每一個(gè)成分通常裝在不同的容器中，并且所有這些不同容器與用于觀察受試對象是否患有或有危險(xiǎn)患有GAVE10表達(dá)異常相關(guān)疾病的說明書一起被放在一個(gè)包裝中。
2.預(yù)后實(shí)驗(yàn)本文中所描述的方法可進(jìn)一步用作診斷或者預(yù)后試驗(yàn)以鑒定受試者是否患有或有危險(xiǎn)患有與異常GAVE10表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥。例如，本文中所描述的試驗(yàn)，例如前瞻性診斷試驗(yàn)或后隨試驗(yàn)，可用于鑒定患有或者有危險(xiǎn)患有與GAVE10蛋白、核酸的表達(dá)或活性有關(guān)的病癥的受試者。例如，近來與細(xì)菌的接觸或患有與哮喘、慢性阻塞性肺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎癥易于用這個(gè)試驗(yàn)來檢驗(yàn)。作為一種備選方案，可以使用預(yù)后試驗(yàn)鑒定患有或有危險(xiǎn)患有此疾病或病癥的受試者。
因此，本發(fā)明提供了一個(gè)方法，其中從受試者獲得測試樣本，并檢測GAVE10蛋白或核酸(例如mRNA或基因組DNA)。GAVE10蛋白或核酸的存在可以用于診斷患有或有危險(xiǎn)患有與異常GAVE10表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥的受試者。本文中所用的“測試樣本”指來自目的受試者的生物樣本。例如，測試樣本可以是生物液體(例如血清)、細(xì)胞樣本或組織。
此外，此處所描述的預(yù)后試驗(yàn)可用于判定能否給受試者施用藥劑(例如，激動(dòng)劑，拮抗劑，肽模擬物，蛋白質(zhì)，肽，核酸，小分子或其他候選藥物)以治療與異常GAVE10表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥。例如，這些方法可用于判定特定藥劑或藥劑類(例如降低GAVE10活性的藥劑類)能否有效地治療受試者。因此，本發(fā)明提供了一種方法，由此可以判定藥劑是否能有效地治療患者的與異常GAVE10表達(dá)或活性相關(guān)的病癥，其中獲取測試樣本，并檢測GAVE10蛋白或核酸(例如，其中，GAVE10蛋白或核酸的存在可以用于診斷受試者是否可以通過給予藥劑治療與異常GAVE10表達(dá)或活性有關(guān)的病癥)。
本發(fā)明的方法還可用于檢測GAVE10基因的遺傳損傷或者突變，由此確定帶有損傷基因的受試者是否有出現(xiàn)如下病癥的危險(xiǎn)性，所述病癥的特征在于異常細(xì)胞增殖和/或分化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此方法包括在來自受試者的細(xì)胞樣本中檢測如下遺傳損傷或突變存在與否，所述損傷或突變的特征在于存在至少一個(gè)影響編碼GAVE10蛋白的基因的完整性的改變或者造成GAVE10基因錯(cuò)誤表達(dá)的改變。例如，這些遺傳損傷或突變可以通過確定至少一種如下情況的存在來檢測1)GAVE10基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失；2)GAVE10基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加；3)GAVE10基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換；4)涉及GAVE10基因的染色體重排；5)GAVE10基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄本水平的改變；6)GAVE10基因的異常修飾，例如基因組DNA的甲基化模式的異常改變；
7)GAVE10蛋白的非野生型水平；8)GAVE10基因的等位基因丟失；9)GAVE10蛋白的不恰當(dāng)?shù)姆g后修飾。
如本文所述，在本領(lǐng)域中有大量已知的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可用于檢測GAVE10基因中的損傷。優(yōu)選的生物樣本是用常規(guī)方法從受試者分離得到的外周血白細(xì)胞樣本。
在某些實(shí)施方案中，損傷的檢測涉及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(見，例如美國專利號4,683,195和4,683,202)，例如錨定PCR或RACE PCR中，或者，作為一種選擇，在連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(見，例如Landegran等，科學(xué)(Science)(1988)2411077-1080；和Nakazawa等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1994)91360-364)中使用探針/引物，其中后者在檢測GAVE10基因中的點(diǎn)突變時(shí)尤其有用(見，例如Abravaya等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1995)23675-682)。該方法可以包括如下步驟從患者收集細(xì)胞樣本，分離樣本細(xì)胞的核酸(例如，基因組，mRNA或者兩者)，在一定條件下使核酸樣本與一個(gè)或多個(gè)可與GAVE10基因特異雜交的引物接觸以實(shí)現(xiàn)GAVE10基因(如果存在的話)的雜交和擴(kuò)增，然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否或者檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小并將此長度與對照樣本比較。預(yù)期可能有利的是將PCR和/或LCR用作初始擴(kuò)增步驟與本文中描述的用于檢測突變的任何技術(shù)相結(jié)合。
可選擇的擴(kuò)增方法包括自動(dòng)維持的序列擴(kuò)增(Guatelli等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1990)871874-1878)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)861173-1177)，Q-β復(fù)制酶(Lizardi等，Bio/Technology(1988)61197)或任何其他核酸擴(kuò)增方法，之后可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)檢測擴(kuò)增的分子。這些檢測方案對檢測以非常低數(shù)量存在的核酸分子尤其有用。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，樣本細(xì)胞中GAVE10基因的突變可以通過限制性酶切割式樣的改變而得以鑒定。例如，可以分離樣本和對照DNA，進(jìn)行擴(kuò)增(任選地)，用一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶消化，通過凝膠電泳來測定片段的長度尺寸并進(jìn)行對比。在樣本與對照DNA之間片段長度的差異指示出樣本DNA中有突變。另外，序列特異的核酶(見，例如美國專利號5,498,531)也可以用于通過核酶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生或丟失評判特異突變的存在。
在其他實(shí)施方案中，可通過樣本和對照核酸(例如DNA或RNA)與含有成百或上千的寡核苷酸探針的高密度陣列(Cronin等，HumanMutation(1996)7244-255；Kozal等，自然醫(yī)藥(Nature Medicine)(1996)2753-759)雜交的方法來鑒定GAVE10的遺傳突變。例如，GAVE10的遺傳突變可以用含有發(fā)光DNA探針的二維陣列來鑒定，參見如Cronin等，同上。簡言之，第一雜交探針陣列可用于對樣本和對照中的長鏈DNA進(jìn)行掃描，通過產(chǎn)生順序重疊探針線形陣列來鑒定兩序列間的堿基改變。該步驟允許鑒定點(diǎn)突變。這個(gè)步驟之后為第二雜交陣列，它通過使用能與所有檢測的變體或突變體互補(bǔ)的較小特異化探針的陣列，可以對具體突變進(jìn)行表征。每個(gè)突變陣列都由平行探針組構(gòu)成，一個(gè)與野生型基因互補(bǔ)而另一個(gè)與突變基因互補(bǔ)。
又在另一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng)域已知的任何一種測序反應(yīng)都可用于直接地對GAVE10基因測序，以及通過樣本GAVE10序列與相應(yīng)野生型(對照)序列的比較來檢測突變。測序反應(yīng)的實(shí)例包括以Maxam和Gilbert(美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)74560)或者Sanger(美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)745463)開發(fā)的技術(shù)為基礎(chǔ)的那些反應(yīng)。也可以考慮利用任何一種自動(dòng)測序方法實(shí)施診斷試驗(yàn)(Bio/Techniques(1995)19448)，包括用質(zhì)譜進(jìn)行測序(見，例如，PCT公開號WO 94/16101；Cohen等，Adv Chromatogr(1996)36127-162；和Griffin等，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(Appl BiochemBiotechnol)(1993)38147-159)。
其他可用于檢測GAVE10基因中的突變的方法包括如下方法，在該方法中通過保護(hù)作用防止切割劑的切割，得以檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈體中的堿基錯(cuò)配(Myers等，科學(xué)(Science)(1985)2301242)。一般，“錯(cuò)配切割”技術(shù)中必須提供由含有野生型GAVE10序列的(標(biāo)記的)RNA或DNA與獲自組織樣本的潛在突變RNA或DNA雜交形成的異源雙鏈體。用切割雙鏈體中的單鏈區(qū)域的試劑處理此雙鏈體，所述雙鏈體中的單鏈區(qū)域可以因?yàn)槔鐚φ张c樣本鏈之間的堿基對錯(cuò)配而存在。RNA/DNA雙鏈體可以用RNAase來處理以消化錯(cuò)配區(qū)域，DNA/DNA雜合體可以用S1核酸酶來處理以消化錯(cuò)配區(qū)域。在其他實(shí)施方案中，DNA/DNA或者RNA/DNA雙鏈體可以用羥胺或鋨酸及哌啶來處理以消化錯(cuò)配區(qū)域。消化錯(cuò)配區(qū)域之后，所得物質(zhì)在變性聚丙烯酰胺凝膠上根據(jù)大小分離，從而確定出突變的位點(diǎn)，參見例如Cotton等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1988)854397；Saleeba等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol)(1992)217286-295。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以標(biāo)記對照DNA或RNA以利于檢測。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，錯(cuò)配切割反應(yīng)使用一個(gè)或多個(gè)能識別雙鏈DNA中錯(cuò)配堿基對的蛋白(所謂的“DNA錯(cuò)配修復(fù)酶”)在規(guī)定系統(tǒng)中檢測從樣本細(xì)胞獲得的GAVE10 cDNA中的點(diǎn)突變并對其作圖。例如，大腸桿菌的mutY酶切割G/A錯(cuò)配處的A，來自Hela細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶切割G/T錯(cuò)配處的T(Hsu等，Carcinogenesis(1994)151657-1662)。根據(jù)一個(gè)示范實(shí)施方案，基于GAVE10序列(例如野生型GAVE10序列)的探針與來自測試細(xì)胞的cDNA或其他DNA產(chǎn)物雜交。用DNA錯(cuò)配修復(fù)酶處理雙鏈，切割產(chǎn)物(如果有的話)可以在電泳方案或類似的方案中檢測到，參見，例如美國專利號5,459,039。
在其他實(shí)施方案中，可以使用電泳遷移率的改變鑒定GAVE10基因中的突變。例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可用于檢測突變與野生型核酸之間電泳遷移率的差異(Orita等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad SciUSA)(1989)862766；也見Cotton，突變研究(Mutat Res)(1993)285125-144；Hayashi，Genet Anal Tech Appl(1992)973-79)。使樣本和對照GAVE10核酸的單鏈DNA片段變性然后使之復(fù)性。單鏈核酸的二級結(jié)構(gòu)會(huì)因序列不同而不同，由此導(dǎo)致的電泳遷移率的改變使得即使單個(gè)堿基變化也可得以檢測。可以標(biāo)記DNA片段或者用標(biāo)記的探針對其進(jìn)行檢測。使用RNA(比DNA)可以增強(qiáng)試驗(yàn)的靈敏度，因?yàn)镽NA二級結(jié)構(gòu)對序列的改變更為敏感。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此主題方法利用異源雙鏈分析基于電泳遷移率的改變來分離異源雙鏈分子。(Keen等，Trends Genet(1991)75)在另一個(gè)實(shí)施方案中，用變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Myers等，自然(Nature)(1985)313495)來分析突變型或野生型片段在含有梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中的運(yùn)動(dòng)。當(dāng)DGGE用作分析方法時(shí)，DNA將被修飾以保證它不會(huì)完全變性，例如，用PCR添加約40bp的高熔點(diǎn)富含GC的DNA，即GC夾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用溫度梯度代替變性梯度來鑒定對照與樣本DNA的遷移率差異(Rosenbaum等，Biophys Chem(1987)26512753)。
其他可用于檢測點(diǎn)突變的技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴(kuò)增或選擇性引物延伸。例如，可以制備寡核苷酸引物，其中將已知的突變置于中央，然后在只有完全匹配才可發(fā)生雜交的條件下，使引物與靶DNA雜交(Saiki等，自然(Nature)(1986)324163；Saiki等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)866230)。在使這些等位特異性寡核苷酸與PCR擴(kuò)增的靶DNA或者許多不同的突變體雜交時(shí)，可以將寡核苷酸結(jié)合在雜交膜上然后與標(biāo)記的靶DNA雜交。
或者，可以在本發(fā)明中使用依賴于選擇性PCR擴(kuò)增的等位特異性擴(kuò)增技術(shù)。在特異擴(kuò)增中用作引物的寡核苷酸可以在分子中央(以致擴(kuò)增依賴于差異雜交)(Gibbs等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1989)172437-2448)或在一個(gè)引物的3’最末端(此時(shí)，在適合的條件下，錯(cuò)配能阻止或延緩聚合酶的延伸)(Prossner，Tibtech(1993)11238)攜帶令人感興趣的突變。另外，也可能期望向突變區(qū)域中引入新的限制性位點(diǎn)以創(chuàng)造基于切割的檢測(Gasparini等，Mol Cell Probes(1992)61)。預(yù)期，在某些實(shí)施方案中擴(kuò)增也可以使用Taq連接酶進(jìn)行(Barany，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc NatlAcad Sci USA)(1991)88189)。在這種情況下，只有在5’序列的3’末端有完全的匹配時(shí)，連接反應(yīng)才可以發(fā)生，這就使得可以通過尋找擴(kuò)增物的有無來檢測特異位點(diǎn)處已知突變的存在。
此處所描述的方法可以，例如，使用含有此處所描述的至少一個(gè)探針核酸或抗體試劑的預(yù)先包裝診斷試劑盒來執(zhí)行。此方法和試劑盒可以方便的應(yīng)用于，例如，臨床條件下，對顯示出GAVE10基因有關(guān)疾病或病癥的征兆的患者或具有該疾病家族史的患者進(jìn)行診斷。
另外，表達(dá)GAVE10的任何細(xì)胞類型和組織都可以在此處所描述的預(yù)后試驗(yàn)中使用。
3.藥物基因組學(xué)通過本文描述的篩選試驗(yàn)鑒定的對GAVE10活性(例如GAVE10基因表達(dá))具有刺激或抑制影響的試劑或調(diào)節(jié)劑，可以施用給個(gè)體以治療(預(yù)防性或治療性)與GAVE10活性有關(guān)的疾病(例如，與哮喘、慢性阻塞性肺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎癥)。可以考慮將此治療與個(gè)體的藥物基因組學(xué)結(jié)合起來，所述藥物基因組學(xué)研究的是個(gè)體基因型與個(gè)體對外來化合物或藥物的反應(yīng)性之間的關(guān)系。對治療物代謝的差異可以通過改變藥理學(xué)活性藥物的血液濃度和劑量之間關(guān)系，導(dǎo)致嚴(yán)重毒性或治療失敗。因此，個(gè)體的藥物基因組學(xué)使得可以基于對個(gè)體基因型的考慮來選擇有效的預(yù)防或治療劑(例如藥物)。此藥物基因組學(xué)還可以用于確定適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨浮Ｒ虼?，可以通過確定個(gè)體的GAVE10蛋白質(zhì)的活性、GAVE10核酸的表達(dá)或GAVE10基因的突變內(nèi)容，選擇對個(gè)體適宜的治療或預(yù)防藥劑。
藥物基因組學(xué)所處理的問題是患者在藥物應(yīng)答方面存在的臨床顯著遺傳差異，這種差異是由患者體內(nèi)藥物處置的不同和異常作用導(dǎo)致的。見，例如，Linder，臨床化學(xué)(Clin Chem)(1997)43(2)254-266。一般，可以區(qū)分兩類藥理學(xué)遺傳情況(pharmacogenetic conditions)。作為能改變藥物作用于身體的途徑的單因素而傳遞的遺傳情況，稱作“改變的藥物作用”。作為能改變身體對藥物的作用途徑的單因素而傳遞的遺傳情況，稱作“改變的藥物代謝”。這些藥理學(xué)遺傳情況可以以罕見缺陷或多態(tài)性的形式存在。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷是常見的遺傳酶病，其中主要的臨床并發(fā)癥是吞食氧化劑藥物(抗瘧疾藥物、磺酰胺、止痛劑或硝基呋喃)和食用蠶豆后出現(xiàn)的溶血。
作為舉例說明性實(shí)施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的一個(gè)主要決定因素。對藥物代謝酶(例如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)和細(xì)胞色素P450酶，CYP2D6和CYP2Cl 9)遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)解釋了，為什么服用標(biāo)準(zhǔn)和安全藥物劑量后，一些患者不能獲得預(yù)期的藥物效果或表現(xiàn)出過度的藥物反應(yīng)和嚴(yán)重毒性。在群體中這些多態(tài)性表現(xiàn)為兩種表型，強(qiáng)代謝者(extensive metabolizer，EM)和弱代謝者(PM)。PM的普遍性在不同群體之間是不同的。例如，編碼CYP2D6的基因具有高度多態(tài)性，在PM中已鑒定到幾種突變，所有均導(dǎo)致CYP2D6功能的缺乏。CYP2D6和CYP2Cl 9的弱代謝者在接受標(biāo)準(zhǔn)劑量后十分頻繁地出現(xiàn)過度藥物反應(yīng)和副反應(yīng)。正如通過可待因的止痛作用(由CYP2D6形成的代謝物嗎啡介導(dǎo)的)所證實(shí)的，如果代謝物是活性治療部分，則PM將不會(huì)表現(xiàn)出治療反應(yīng)。另一極端是對標(biāo)準(zhǔn)劑量不起反應(yīng)的所謂超快代謝者。近來，超快代謝的分子基礎(chǔ)已得以鑒定，其是由CYP2D6基因擴(kuò)增導(dǎo)致的。
因此，通過確定個(gè)體中GAVE10蛋白質(zhì)的活性、GAVE10核酸的表達(dá)或GAVE10基因的突變內(nèi)容，可以選擇出對于預(yù)防或治療個(gè)體適宜的藥劑。此外，可以使用藥物基因組學(xué)研究，通過對編碼藥物代謝酶的多態(tài)性等位基因進(jìn)行基因分型鑒定個(gè)體的藥物應(yīng)答表型。當(dāng)使用GAVE10調(diào)節(jié)劑(如，通過本文所述其中一種示例性篩選試驗(yàn)鑒定的調(diào)節(jié)劑)治療對象時(shí)，在給藥或選擇藥物方面，此信息可以避免不良反應(yīng)或治療失敗，由此增強(qiáng)治療或預(yù)防的功效。
4.在臨床試驗(yàn)過程中監(jiān)測療效監(jiān)測藥劑(例如，藥物或化合物)對GAVE10表達(dá)或活性的影響(例如，調(diào)節(jié)異常細(xì)胞增殖和/或分化的能力)既可以應(yīng)用于基礎(chǔ)藥物篩選中也可以應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。例如，可以在表現(xiàn)出降低的GAVE10基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性的對象的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測藥劑(通過本文描述的篩選試驗(yàn)確定的)在增加GAVE10基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性方面的有效性?；蛘撸梢栽诒憩F(xiàn)出增加的GAVE10基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性的對象的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測藥劑(通過本文描述的篩選試驗(yàn)確定的)在降低GAVE10基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性方面的有效性。在這些臨床試驗(yàn)中，GAVE10的表達(dá)或活性以及，優(yōu)選地，其它基因的表達(dá)或活性(例如，細(xì)胞增殖疾病所涉及的基因)可以用作特定細(xì)胞的免疫應(yīng)答性的標(biāo)志。
例如，但不限于，可以鑒定當(dāng)用調(diào)節(jié)GAVE10活性的藥劑(例如，化合物、藥物或小分子)(例如，本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的藥劑)處理時(shí)細(xì)胞中可以被調(diào)節(jié)的基因(包括GAVE10)。因此，例如，在臨床試驗(yàn)中，為了研究藥劑對細(xì)胞增殖疾病的作用，可以分離細(xì)胞，制備RNA并分析GAVE10及參與該疾病的其它基因的表達(dá)水平?；虮磉_(dá)水平(即，基因表達(dá)式樣)可以通過如下方式定量按本文所述進(jìn)行Northern印跡分析或RT-PCR，或者，作為備選方案，利用本文所述方法之一測量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量或測量GAVE10或其它基因的活性水平。以此方式，基因表達(dá)式樣可以作為標(biāo)志指示細(xì)胞對藥劑的生理反應(yīng)。由此，可以在使用藥劑治療個(gè)體之前以及治療過程中的不同點(diǎn)上，確定反應(yīng)狀態(tài)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，由此可以監(jiān)測使用藥劑(例如，通過本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的激動(dòng)劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其它候選藥物)治療受試者的療效，該方法包括步驟(i)在施用藥劑前從受試者獲得用藥前樣本；(ii)檢測用藥前樣本中GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)用藥后樣本；(iv)檢測用藥后樣本中GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平；(v)對用藥前樣本中GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平與一個(gè)或多個(gè)用藥后樣本中GAVE10蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平進(jìn)行比較；和(vi)據(jù)此改變患者的藥劑施用方案。例如，可能期望增加藥劑施用以增加GAVE10的表達(dá)或活性水平，使之超過所檢測到的水平，即，增加藥劑的效力。或者，可能期望降低藥劑施用以降低GAVE10的表達(dá)或活性水平，使之低于所檢測到的水平，即，降低藥劑的效力。
D.治療方法本發(fā)明為有危險(xiǎn)患有(或易感)或已患有與異常GAVE10表達(dá)或活性相關(guān)的疾病的患者提供了預(yù)防和治療方法。所述疾病包括但不限于如炎性疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
1.預(yù)防方法一方面，本發(fā)明提供預(yù)防方法，該方法通過給受試者施用調(diào)節(jié)GAVE10表達(dá)或至少一種GAVE10活性的藥劑，預(yù)防受試者患上與異常GAVE10表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥?？梢酝ㄟ^，例如，本文所述任一種診斷或預(yù)后試驗(yàn)或其組合，鑒定個(gè)體是否有危險(xiǎn)罹患可由異常GAVE10表達(dá)或活性引起的或促成的疾病?？梢栽谝訥AVE10異常為特征的癥狀顯現(xiàn)之前施用預(yù)防劑，以便預(yù)防疾病或病癥，或作為備選方案阻滯疾病或病癥的進(jìn)程。例如，根據(jù)GAVE10異常的類型，可以使用GAVE10激動(dòng)劑或GAVE10拮抗劑治療個(gè)體。適宜的藥劑可以根據(jù)本文所述篩選試驗(yàn)確定。
2.治療方法本發(fā)明另一方面涉及調(diào)節(jié)GAVE10表達(dá)或活性用于治療目的的方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法涉及使細(xì)胞與能調(diào)節(jié)和細(xì)胞有關(guān)的一種或多種GAVE10蛋白質(zhì)活性的藥劑接觸。能夠調(diào)節(jié)GAVE10蛋白質(zhì)活性的藥劑可以是本文所述的藥劑，例如核酸或蛋白質(zhì)、GAVE10蛋白質(zhì)的天然關(guān)聯(lián)配體、肽、GAVE10肽模擬物或其它小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥劑刺激GAVE10蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)活性。此刺激劑的實(shí)例包括活性GAVE10蛋白質(zhì)和已導(dǎo)入細(xì)胞中的編碼GAVE10的核酸分子。在另一實(shí)施方案中，該藥劑抑制GAVE10蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)活性。此抑制劑的實(shí)例包括反義GAVE10核酸分子和抗GAVE10抗體。可以體外(例如，通過使用藥劑培養(yǎng)細(xì)胞)或，作為備選方案，體內(nèi)(例如，通過向患者施用藥劑)執(zhí)行此調(diào)節(jié)方法。由此，本發(fā)明提供治療罹患疾病或病癥(其特征在于GAVE10蛋白質(zhì)或核酸分子的異常表達(dá)或活性)的個(gè)體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法涉及施用可調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))GAVE10表達(dá)或活性的藥劑(例如，通過本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的藥劑)或藥劑組合。在另一實(shí)施方案中，本方法涉及施用GAVE10蛋白質(zhì)或核酸分子作為治療物以彌補(bǔ)降低的或異常的GAVE10表達(dá)或活性。
當(dāng)GAVE10被異常下調(diào)和/或當(dāng)增加的GAVE10活性可能具有有益作用時(shí)，刺激GAVE10活性是有利的。相反，當(dāng)GAVE10被異常上調(diào)和/或當(dāng)降低的GAVE10活性可能具有有益作用時(shí)，抑制GAVE10活性是有利的。
本發(fā)明進(jìn)一步通過如下實(shí)施例進(jìn)行舉例說明，這些實(shí)施例不應(yīng)理解為是限制性的。在整個(gè)申請中引用的所有文獻(xiàn)、專利和出版的專利申請的內(nèi)容特此并入作為參考。
實(shí)施例1 克隆hGAVE10 cDNA在人類基因組庫中尋找GPCR基序。選擇了人類基因組DNA，AC021016.3，gi7630969。這個(gè)基因組DNA及其片段在Northern印跡中用作探針。
對人腎、胸腺和胎盤cDNA文庫匯合物進(jìn)行PCR篩查。用以下序列設(shè)計(jì)PCR引物正向引物5’-CAGGACCAAGATGACGCCCA-3’(SEQ ID NO6)巢式正向引物5’-CGAAGCTTCAGGACCAAGATGAGC-3’(SEQ ID NO7)上述巢式正向引物包含一HindIII限制性酶位點(diǎn)，之后有一Kozak序列。巢式反向引物包含一XhoI限制性酶位點(diǎn)。PCR在BiometraTrio-Thermoblock熱循環(huán)儀中進(jìn)行，使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，在加入模板cDNA、引物、Pfu緩沖溶液及dNTP后將此聚合酶加入PCR反應(yīng)中。50μl反應(yīng)中包含5μl 10×Pfu DNA緩沖液，2μl(2500單位/ml)Pfu DNA聚合酶，1.0μl NTP混合液(每種核苷酸含10mM)；2.0μl正向引物(10mM)；2.0μl反向引物(10mM)；5μl cDNA模板及33μl無菌水。在熱循環(huán)儀中使用下列循環(huán)94℃反應(yīng)2分鐘，隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃反應(yīng)45秒，58℃反應(yīng)45秒，72℃反應(yīng)3分鐘，72℃反應(yīng)10分鐘；然后在4℃冷卻。
PCR之后，把3μl dNTP(每種核苷酸各10mM)(Clontech目錄號.7404-i)和1μl(5單位)Taq DNA聚合酶(Qiagen，目錄號201223)加入到PCR產(chǎn)物中，混合物在72℃溫育10分鐘。然后PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。從凝膠上切下含有所要片段的大約1Kb長度的條帶，使用Qiaquick凝膠抽提試劑盒及制造商提供的方案(Qiagen，目錄號28704)純化。然后將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆入pCR2.1載體(Invitrogen，目錄號K2000-01/40/J10及K2030-01/40/J10)。為了把PCR產(chǎn)物亞克隆入載體，使用Invitrogen TA克隆載體試劑盒準(zhǔn)備連接反應(yīng)。連接反應(yīng)包括5μl無菌水；1μl Invitrogen 2X連接緩沖液；2μl pCR2.1載體(25ng/μl)；4μlPCR產(chǎn)物DNA(10ng)；4μl(5X)稀釋緩沖液；和1μl T4 DNA連接酶(5單位)。在14℃溫育此反應(yīng)18小時(shí)。使2μl連接反應(yīng)混合物與200μl INVαF′感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen目錄號C658-00)混合，在冰上溫育30分鐘，在37℃熱休克45秒，再在冰上溫育2分鐘，之后加入800μl LB，由此用連結(jié)反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。然后細(xì)胞在細(xì)菌搖床/培養(yǎng)箱中振動(dòng)下37℃過夜溫育(空氣為再循環(huán)的)。過夜溫育后，將200μl轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上并37℃溫育過夜。
溫育之后，挑取菌落并且每個(gè)單菌落分別在含有500μl LB(含有100μg/ml氨芐青霉素)的不同試管中在搖床/培養(yǎng)箱中過夜生長。為了用PCR篩選菌落，使用如下反應(yīng)41.5μl含有一個(gè)菌落的LB；5μl Taq緩沖液(10X)；1.0μl dNTP(每種核苷酸各10mM)；1.0μl正向引物(10mM)；1.0μl反向引物(10mM)；及0.5μl Taq DNA聚合酶(5單位/μl)。使用如下的循環(huán)在熱循環(huán)儀中溫育反應(yīng)94℃2分鐘，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，及72℃10分鐘，之后冷卻到4℃。
為了檢查PCR反應(yīng)的結(jié)果，在1％TAB瓊脂糖凝膠上用5μl PCR反應(yīng)液電泳。陽性克隆顯示約1kb的插入片段。在細(xì)菌搖床/培養(yǎng)箱中，使陽性克隆在5ml LB+100μg/ml氨芐青霉素中37℃過夜生長。用Qiagen DNA純化柱(Qiagen目錄號12143)根據(jù)制造商推薦的方案純化質(zhì)粒。用T7正向引物(5′-GGCTCCCAACTTCTCTTC-3′)(SEQ ID NO8)和M13反向引物(5′-GGGCAGTGGCCAGCACGC-3′)(SEQ ID NO9)對陽性克隆測序。DNA測序鑒定分離出含有如圖1所示的DNA序列(SEQ ID NO1)和如圖2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的cDNA。
實(shí)施例2 制備過量表達(dá)hGAVE10的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為了制備大量的hGAVE10用于進(jìn)一步試驗(yàn)，將編碼bGAVE10的cDNA克隆入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如293細(xì)胞。
為了產(chǎn)生過量表達(dá)hGAVE10的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，于6孔35mm組織培養(yǎng)板中，在含有10％胎牛血清(Gibco/BRL目錄號1600-044)的2mlDMEM培養(yǎng)基(Gibco/BRL，目錄號11765-054)中接種細(xì)胞(每孔3×105個(gè)細(xì)胞(ATCC目錄號CRL-1573))。
然后，在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育細(xì)胞直到細(xì)胞達(dá)到50-80％的匯合。hGAVE10的克隆cDNA核酸序列用上述的方法插入到pcDNA3.1克隆載體(Invitrogen，目錄號V790-20)中。將2μg DNA稀釋在100μl無血清的F12 HAM培養(yǎng)基中。獨(dú)立地，將25μl Lipofectamine試劑(LifeTechnologies，目錄號18324-020)稀釋在100μl無血清F12 HAM培養(yǎng)基中。然后把DNA溶液與Lipofectamine溶液輕輕地混合，并在室溫下溫育45分鐘以產(chǎn)生DNA-脂復(fù)合體。
用2ml無血清F12 HAM培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，對于每個(gè)轉(zhuǎn)染(6-孔板中6個(gè)轉(zhuǎn)染)，將0.8ml無血清F12 HAM培養(yǎng)基加入含有DNA-脂復(fù)合體的溶液(總體積0.2ml)中，并輕輕混合。然后將得到的混合物(此后稱“轉(zhuǎn)染混合物”)鋪在(0.8ml+0.2ml)洗過的細(xì)胞上。不加入抗細(xì)菌試劑。然后在CO2培養(yǎng)箱中將細(xì)胞與脂-DNA復(fù)合體在37℃一起溫育16小時(shí)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
在溫育期完成后，在沒有首先去除轉(zhuǎn)染混合物的情況下，將1ml含有10％胎牛血清的F12 HAM培養(yǎng)基鋪在細(xì)胞上。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，吸出鋪在細(xì)胞上的培養(yǎng)基。然后用PBS(pH2-4)(Gibco/BRL目錄號10010-023)洗細(xì)胞，然后將PBS換成含有5％血清的F12 HAM培養(yǎng)基(“選擇培養(yǎng)基”)。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，在含有400μg/ml抗細(xì)菌劑遺傳霉素(LifeTechnologies，目錄號11811)的選擇培養(yǎng)基中10倍稀釋細(xì)胞。
實(shí)施例3 激動(dòng)劑試驗(yàn)為了篩選人GAVE10的激動(dòng)劑，人為地使hGAVE10與Gq機(jī)制偶聯(lián)，Gq機(jī)制的激活刺激胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)小泡釋放Ca2+。Ca2+釋放入胞質(zhì)，在這里它可以用Ca2+螯合劑染料來檢測?？梢允褂脽晒獬上衿桨彘喿x器或者FLIPR儀器(Molecular Devices)監(jiān)測導(dǎo)致的任何熒光改變?？梢酝ㄟ^熒光的增強(qiáng)反映激動(dòng)劑的活性。
預(yù)改造表達(dá)hGAVE10的CHO-K1細(xì)胞，以表達(dá)Gq蛋白的不加區(qū)別形式(Gα16)。為了制備這樣的細(xì)胞，從商業(yè)途徑獲得偶聯(lián)Gα16的CHO細(xì)胞(Molecular Devices LIVEWARETM細(xì)胞，目錄號RD-HGA16)，之后使用實(shí)施例2的方案以便在這些細(xì)胞中表達(dá)hGAVE10。
37℃及5％CO2下F12 Ham培養(yǎng)基中使細(xì)胞保持在生長對數(shù)期，所述F12 HAM培養(yǎng)基(Gibco/BRL，目錄號11765-054)中含有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素(Gibco/BRL，目錄號15140-148)、100μg/ml鏈霉素(目錄號15140-148，Gibco/BRL)、400μg/ml遺傳霉素(G418)(Gibco/BRL，目錄號10131-035)和200μg/ml Zeocin(Invitrogen，目錄號R250-05)。試驗(yàn)前一天，用96/384 Multidrop裝置(Labsystems，Type 832)以12,500細(xì)胞/孔把CHO-K1細(xì)胞鋪在384-孔底部透明的試驗(yàn)板(Greiner/Marsh，目錄號N58102)上，板孔體積為50μl。在潮濕的5％CO2培養(yǎng)箱(FormaScientific CO2水夾套型培養(yǎng)箱3110型)中37℃溫育細(xì)胞。
制備如下的母液HEPES(pH7.5)(Gibco/BRL，目錄號15630-080)的1M母液；1N NaOH中丙磺舒(probenicid)(Sigma，目錄號P8761)的250mM母液；DMSO(Sigma D2650)中Fluo 4-AM染料(Molecular Probes，目錄號F1 4202)的1mM母液。用1000ml Hank平衡鹽溶液(Fisher/Mediatech，目錄號MT21023)、20ml 1M HEPES母液和10ml250mM丙磺舒母液制備反應(yīng)緩沖液。為了制備上樣緩沖液，把1.6ml的1mM Fluo 4-AM染料母液與0.32ml pluronic acid(Molecular Probes，目錄號P6866)混合，然后與400ml上述反應(yīng)緩沖液及4ml胎牛血清混合。
試驗(yàn)前1小時(shí)，用96/384 Multidrop裝置把50μl新制備的上樣緩沖液加到384-孔板的各個(gè)孔中。在潮濕培養(yǎng)箱中37℃溫育細(xì)胞以使染料吸收最大化。在試驗(yàn)即將開始之前，用384 EMBLA細(xì)胞洗滌儀(Skatron；型號為12386)用90μl反應(yīng)緩沖液洗滌細(xì)胞2次，吸頭設(shè)置在平板底部上方至少10mm的位置，在每個(gè)孔中留45μl緩沖液。
FLIPRII(Molecular Devices)儀器的CCD相機(jī)(PrincetonInstruments)設(shè)定為2.0的f-stop，0.4秒的曝光。相機(jī)用于監(jiān)測細(xì)胞平板，以得到染料荷載的精確量。
于生理鹽緩沖液中測試10μM濃度的含有可能激動(dòng)劑的化合物文庫。加入化合物之前，測量熒光變化10秒。加入化合物后，第一分鐘內(nèi)每秒測一次熒光，之后在3分鐘的全部試驗(yàn)分析時(shí)間中每6秒曝光一次。在第10次掃描后加入100μM化合物原液的5μl等分試樣，使細(xì)胞上的最終化合物濃度為10μM。記錄前80次掃描的最大熒光變化作為激活劑活性的測量值，并與10μM ATP(Sigma A9062)所誘導(dǎo)的最大熒光變化比較。
實(shí)施例4 拮抗劑試驗(yàn)為了篩選人GAVE10的拮抗劑，人為地使hGAVE10與Gq機(jī)制相偶聯(lián)。如實(shí)施例3中，利用FLIPR儀器探測導(dǎo)致的任何熒光改變。熒光的減弱反映拮抗劑的活性。
如實(shí)施例3中所述，預(yù)改造表達(dá)hGAVE10的CHO-K1細(xì)胞，以表達(dá)Gq蛋白的不加區(qū)別形式(Gα16)。37℃及5％CO2下F12HAM培養(yǎng)中使細(xì)胞維持在生長對數(shù)期。所述F12 HAM培養(yǎng)基(Gibco/BRL，目錄號11765-054)中含有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素(Gibco/BRL，目錄號15140-148)、100μg/ml鏈霉素(目錄號.15140-148，Gibco/BRL)、400μg/ml遺傳霉素(G418)(Gibco/BRL，目錄號10131-035)和200μg/ml Zeocin(Invitrogen，目錄號R250-05)。試驗(yàn)前一天，用96/384 Multidrop裝置以12,500個(gè)細(xì)胞/孔將CHO-K1細(xì)胞鋪在384-孔底部黑色/透明的試驗(yàn)板(Greiner/Marsh，目錄號N58102)上，板孔體積為50μl。細(xì)胞在潮濕5％CO2中37℃溫育。
制備如下的母液HEPES(pH7.5)(Gibco/BRL，目錄號15630-080)的1M母液；1N NaOH中丙磺舒(Sigma，目錄號P8761)的250mM母液；DMSO(Sigma D2650)中Fluo 4-AM染料(Molecular Probes，目錄號F14202)的1mM母液；和配體或拮抗劑的母液。用1000ml Hank平衡鹽溶液(Fisher/Mediatech，目錄號MT21023)、20ml 1M HEPES母液、10ml的250mM丙磺舒母液和1mM CaCl2制備反應(yīng)緩沖液。為了制備上樣緩沖液，把80μl的1mM Fluo 4-AM染料母液與16μl pluronic acid(MolecularProbes，目錄號P6866)混合，然后與20ml上述反應(yīng)緩沖液及0.2ml胎牛血清混合。
試驗(yàn)前30分鐘，用96/384 Multidrop裝置把30μl新制備的上樣緩沖液加到384-孔板的每個(gè)孔中。在潮濕CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育細(xì)胞以使染料吸收最大化。在試驗(yàn)即將開始之前，用384 EMBLA細(xì)胞洗滌儀及100μl反應(yīng)緩沖液洗滌細(xì)胞3次，吸頭設(shè)置在平板底部上方至少40mm處，在每個(gè)孔中留45μl緩沖液。
用Platemate-384移液器(Matrix)將5μl 100μM拮抗劑化合物母液加入到細(xì)胞中。在溫育步驟中，化合物的濃度約為10μM。將細(xì)胞鋪在FLIPRII上，在第一分鐘內(nèi)每秒測一次板熒光，之后在3分鐘的全部試驗(yàn)分析時(shí)間內(nèi)每6秒曝光一次。在第10次掃描后加入拮抗劑或配體(10μM)。每次加入之后，384個(gè)吸頭用20μl的0.01％DMSO水溶液洗滌10次。
實(shí)施例5 受體結(jié)合試驗(yàn)為了制備含有hGAVE10受體的膜組分，在含有1mM EDTA的磷酸緩沖鹽溶液(10ml)中孵育以收獲表達(dá)或者過量表達(dá)hGAVE10的CHO細(xì)胞系。在用5ml緩沖液A(50mM Tris-HCl(pH7.8)(Sigma T6791)，5mMMgCl2(Sigma M8266)和1mM EGTA(Sigma 0396))重懸細(xì)胞之前，細(xì)胞在含有1mM EDTA的磷酸緩沖鹽溶液(10ml)中再洗3次。
然后，在組織勻漿器(Polytron，Kinemetica，Model PT 10/35)中破碎細(xì)胞1分鐘。得到的勻漿物在Sorvall儀器RC3B冷凍離心機(jī)中49,000xg，4℃離心20分鐘。得到的沉淀在25ml的緩沖液A中重懸，離心步驟重復(fù)3次。最后一次離心之后，沉淀再一次在5ml緩沖液A中重懸，等分試樣，并在-70℃保存。
使用膜組分和放射性標(biāo)記的配體或激動(dòng)劑作為示蹤者，進(jìn)行受體結(jié)合試驗(yàn)。在96-孔板(Beckman儀器)中進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)合反應(yīng)物由含有放射性配體或激動(dòng)劑(0.01nM-25nM)、18μg CHO細(xì)胞制品，及0.1％牛血清白蛋白(Sigma，目錄號34287)的終體積為0.2ml的緩沖液A組成(見Im等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)(2000)275(19)14281-14286)。在室溫下溫育此反應(yīng)物1小時(shí)。通過多通道收獲器(Brandell)上的Whatman GF/C濾紙過濾終止反應(yīng)，所述濾紙之前用0.3％聚乙烯亞胺(Sigma，目錄號P3143)和0.1％牛血清清蛋白(BSA)處理1小時(shí)。將混合物加于濾紙上并溫育1小時(shí)。用1ml冰冷的50mM Tris-HCl，(pH7.6)洗滌濾紙6次。通過測量放射性，對于每個(gè)示蹤者濃度基于總結(jié)合與非特異結(jié)合(背景)的差別，計(jì)算特異結(jié)合。獲取8-16個(gè)濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)以便確定在配體和受體之間達(dá)平衡狀態(tài)時(shí)配體與受體的結(jié)合(平衡結(jié)合參數(shù))和與放射性配體或激動(dòng)劑競爭結(jié)合受體所需的非放射性配體或激動(dòng)劑的量(競爭結(jié)合值)。制作抑制曲線以確定抑制50％的結(jié)合所需的濃度(IC50)。
實(shí)施例6 Northern印跡試驗(yàn)在來自幾個(gè)人組織樣本的總RNA或poly A+RNA上進(jìn)行Northern印跡分析，以測定這些組織是否表達(dá)hGAVE10。所用的探針是標(biāo)有P32的隨機(jī)引發(fā)的hGAVE10 cDNA或其部分。
制備探針標(biāo)有P32的hGAVE10 cDNA按如下方法制備25ng如上所述制備的hGAVE10 cDNA在微量離心管中于45μl 10mM Tris-HCl，pH7.5；1mMEDTA中重懸，在95℃加熱5分鐘。然后使管子在冰上驟冷5分鐘。冷卻之后，管中的混合物用45μl GAVE10 cDNA和上面描述的緩沖液重懸，并與RTS Rad Prime Mix(提供有RTS Rad Prime DNA標(biāo)記系統(tǒng))(LifeTechnologies，目錄號10387-017)混合。邊輕輕地徹底混合，邊加入5μl標(biāo)有P32的α-dCTP(比活性3000 Ci/mM)(Amersham，AA0005)。得到的混合物在37℃溫育10分鐘。通過加入5μl的0.2M EDTA(pH8.0)來終止溫育。取混合物的5μl等分試樣并通過計(jì)數(shù)放射性來估計(jì)摻入hGAVE10cDNA的放射性α-dCTP。
RNA抽提在培養(yǎng)皿中加入1ml Trizol試劑(Life Technologies，目錄號15596)直接裂解感興趣的細(xì)胞。用吸管吹吸細(xì)胞裂解液幾次以勻漿化裂解液(之后，把細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入試管中)。勻漿之后，30℃溫育裂解液5分鐘以允許核蛋白復(fù)合體完全解離。溫育之后，以每1ml Trizol試劑0.2ml氯仿(Sigma，目錄號C53 12)的量將氯仿加入裂解液中，劇烈震蕩試管15秒。然后裂解液在30℃溫育3分鐘。溫育之后，在4℃以12,000xg離心裂解液15分鐘。得到的水相轉(zhuǎn)移到新管中并按每1ml Trizol試劑0.5ml異丙醇的量加入異丙醇。然后水相樣本在30℃溫育10分鐘，并在4℃，12,000xg離心10分鐘，離心之后，棄去上清。用70％乙醇洗滌剩下的RNA沉淀。洗滌過的樣本在4℃，7500xg離心10分鐘，棄去產(chǎn)生的上清。然后干燥剩下的RNA沉淀，并在無Rnase的水(Life Technologies，目錄號10977-015)中重懸。將總RNA(例如來自外周組織的樣本)或poly A+RNA(例如不同腦區(qū)的樣本)用于Northern或者Taqman(下面有描述)試驗(yàn)?？梢再徺I已知的標(biāo)準(zhǔn)品，例如Perkin-Elmer的人腦肌動(dòng)蛋白。
凝膠電泳在水、5X甲醛凝膠電泳緩沖液(描述如下)和2.2M甲醛(Sigma，目錄號P82031)中融化2g瓊脂糖(Sigma，目錄號A0169)，制備瓊脂糖凝膠。
凝膠電泳的樣本制備如下RNA4.5μl(共5μg)5X甲醛凝膠電泳緩沖液 2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺(Sigma，目錄號F9037) 10.0μl甲醛凝膠電泳緩沖液(5X)是0.1M的3-(N-碼啉代)丙磺酸(MOPS)(pH7.0)(Sigma，目錄號M5162)；40mM乙酸鈉(Sigma，目錄號S7670)；和5mM EDTA(pH8.0)(Sigma，目錄號E7889)。
樣本在65℃溫育15分鐘，之后在冰上驟冷卻。冷卻之后，樣本離心5秒。然后向樣本中加入2μl甲醛凝膠上樣緩沖液；50％甘油(Sigma，目錄號G5516)；1mM EDTA(pH8.0)；0.25％溴酚藍(lán)(Sigma，目錄號18046)；0.25％二甲苯青FF(Sigma，目錄號335940)。
表1列出在一些實(shí)驗(yàn)中使用的一些RNA的來源。
表1
在5V/cm下預(yù)電泳凝膠5分鐘。預(yù)電泳之后，將樣本加載到凝膠上。在4V/cm電泳1X甲醛凝膠電泳緩沖液淹沒的凝膠。2小時(shí)時(shí)更換緩沖液進(jìn)行電泳。
將RNA從凝膠向硝化纖維素轉(zhuǎn)移用溴化乙錠(Sigma，目錄號El 385)(在0.1M乙酸銨(Sigma，目錄號09689)中，0.5μg/ml)對凝膠染色30分鐘，以保證RNA不被降解。然后用Sambrook等所描述的方案(Sambrook等編輯，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第1卷，7.46-7.51頁，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))把RNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上(Schleicher & Schuell Inc.，目錄號74330-026)。
標(biāo)有P32的cDNA的雜交在68℃溫育Clontech ExpressHyb雜交液(Clontech，目錄號8015-1)2小時(shí)。溫育之后，將15ml溫的雜交液倒在多組織樣本Northern(MTN)膜上。搖動(dòng)下，使MTN膜在68℃浸在雜交液中。1小時(shí)過去后，加入之前95℃煮沸變性5分鐘的hGAVE10 cDNA探針，濃度為106計(jì)數(shù)/ml。然后，使雜交液覆蓋凝膠在68℃繼續(xù)溫育2小時(shí)至過夜，其間不停地?fù)u動(dòng)。
從Clontech ExpressHyb雜交液中取出MTN膜，并使用Clontech洗液1(2×SSC；0.05％SDS)，將膜于室溫浸入15ml溶液并搖動(dòng)40分鐘，每40分鐘更換溶液，連續(xù)清洗三次。將Clontech洗液2(0.1×SSC；0.1％SDS)在55℃加熱保溫1小時(shí)。然后使用Clontech洗液2(0.1×SSC；0.1％SDS)，將膜于浸入15ml溶液并在55℃搖動(dòng)60分鐘。每15分鐘更換洗液。
顯像膜在-70℃過夜曝光Kodak X-OMAT AR(Kodak，目錄號165 1579)膠片，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法顯像。篩選許多不同組織，在所選組織(例如脾和肺)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)獨(dú)特的大約2.3kb的mRNA。
實(shí)施例7 PCR試驗(yàn)TaqMan或?qū)崟r(shí)RT-PCR可檢測樣本中的信使RNA。在PCR過程中，試驗(yàn)利用AmpliTaq GoldDNA聚合酶的5′核酸酶活性切割TaqMan探針。TaqMan探針在探針5′端包括報(bào)告染料，例如6-FAM(6-羧基熒光素)，并在探針3′端包括淬滅染料(例如，TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基羅丹明))。設(shè)計(jì)TaqMan探針使其特異地與正向引物和反向引物位點(diǎn)之間的目的靶cDNA雜交。當(dāng)探針是完整時(shí)，3′端淬滅染料使5′端報(bào)告染料的熒光熄滅。PCR過程中，AmpliTaq GoldDNA聚合酶的5′→3′活性導(dǎo)致了5′端報(bào)告染料和3′端淬滅染料之間的探針被切割，從而報(bào)告染料被置換出來。一旦被置換出來后，報(bào)告染料的熒光就不再被淬滅染料熄滅。因此，可以通過監(jiān)測報(bào)告染料的熒光增強(qiáng)來檢測從靶cDNA模板產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的積累。
來自Perkin Elmer Applied Biosystems的ABI Prism序列檢測儀系統(tǒng)(型號為ABI7700)可用于監(jiān)測PCR過程中報(bào)告熒光的增強(qiáng)。相對無源參照物的釋放標(biāo)化報(bào)告信號。
cDNA模板的制備可以商業(yè)上獲得幾種組織的總RNA和poly A+RNA，例如從Clontech獲得(見上表1和下表2)。
表2
5μg的總RNA與2μl(50ng/μl)的隨機(jī)6聚體引物(Life Technologies，目錄號18090)混合，使總反應(yīng)體積為7μl。得到的混合物在70℃加熱10分鐘，并在冰上快速冷卻。把以下試劑加入混合物中4μl的5X第一鏈緩沖液，2μl 0.1mM DTT，1μl 10mM dNTP和1μl水?；旌衔镙p輕混合并在37℃溫育2分鐘，溫育之后，加入5μl的Superscript RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies，目錄號18090)。然后混合物在37℃溫育60分鐘。通過加入1μl的2.5mM EDTA終止反應(yīng)。然后混合物在65℃溫育10分鐘。
PCR和TaqMan試驗(yàn)在96孔板MicroAmp光學(xué)試管(Perkin Elmer，目錄號N801-0933)中，進(jìn)行PCR和TaqMan試驗(yàn)。反應(yīng)混合物包括25μl的TaqManPCR混合物(Perkin Elmer，目錄號N808-0230)，1μl正向引物(5′-TGCTCTTTGCCAGTCTGCC-3′)(SEQ ID NO10)，1μl反向引物(5’-AAGATAGCCTGGGAGCTGCA-3’)(SEQ ID NO11)，1μl的TaqMan探針(5′-TGGAACCACTGGACCCCTGGTGC-3’)(SEQ ID NO12)，1μl cDNA和21μl水，將其加入各孔中。在不同cDNA模板濃度(例如，5，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625ng/μl(模板cDNA濃度為終濃度))下，對每個(gè)組織樣本重復(fù)配制兩份TaqMan樣本。然后用MicroAmp光學(xué)8-條帶盤蓋(PerkinElmer，目錄號N801-0935)密封平板。
用人β肌動(dòng)蛋白(Perkin Elmer，目錄號401846)重復(fù)兩次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個(gè)cDNA模板濃度，均獲得了大量的擴(kuò)增分子。一旦獲得已知基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增即允許對每個(gè)未知靶基因擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA分子的數(shù)量進(jìn)行確定以及用內(nèi)對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
來自上述TaqMan反應(yīng)的結(jié)果可以表示為相對于任選組織的調(diào)控倍數(shù)(例如，用GAVE10在脾中的表達(dá)值除以GAVE10在腦中的表達(dá)值)。作為備選方案，不同組織的已知反應(yīng)性，例如β肌動(dòng)蛋白可用作參考框架。觀察到高水平的GAVE10 mRNA。
實(shí)施例7 用[35S]GTPγS鑒定反向激動(dòng)劑與激動(dòng)劑制備含有組成型活性受體的膜，方式是首先吸出鋪滿的單層真核細(xì)胞(表達(dá)GAVE10)中的培養(yǎng)基(細(xì)胞可以在瓶中或多孔板中)，之后用10ml冷PBS沖洗，再吸出。加入含有20mM HEPES和10mM EDTA(pH7.4)的5ml緩沖液，從基底上刮下細(xì)胞。將細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)移到50ml離心管中(4℃，20000轉(zhuǎn)/分鐘離心17分鐘)。之后吸出上清液，得到的沉淀在含有20mM HEPES和0.1mM EDTA(pH7.4)的30ml緩沖液中重懸。之后進(jìn)行如上的離心。吸出上清液，得到的沉淀在含有20mM HEPES、100mM NaCl和10mM MgCl2的緩沖液(結(jié)合緩沖液)中重懸。然后，懸液用Brinkman polytron勻漿器勻漿(15～20秒的多次沖擊直到所有物質(zhì)成為均一懸液)以產(chǎn)生膜蛋白制品。用Bradford方法(見PCT公開號WO 00/22131)測定蛋白濃度。
候選化合物優(yōu)選使用96孔板形式篩選。在結(jié)合緩沖液中將膜蛋白制品稀釋到0.25mg/ml以在50μl體積中提供終濃度12.5μg/孔。將100μl GDP緩沖液(37.5ml結(jié)合緩沖液和2mg GDP，Sigma目錄號G-7127)加入到每個(gè)孔中，之后加入Wallac ScintistripTM(Wallac)。將5μl候選化合物轉(zhuǎn)移到每個(gè)孔中(即，在總試樣體積200μl中的5μl，導(dǎo)致1∶40的比率，從而候選物的終濃度為10μM)。將50μl膜蛋白加入每孔中(包括不含受體的膜對照)并在室溫下預(yù)溫5-10分鐘。之后，每孔中加入50μl含有[35S]GTPγS(0.6nM)的結(jié)合緩沖液，之后室溫下在搖床上溫育60分鐘。22℃下4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心平板15分鐘終止試驗(yàn)。然后板用8道多孔管吸出上清，用板蓋將板封住并在Wallac 1450TM上讀數(shù)(參見制造商的說明書)。由與帶子結(jié)合的物質(zhì)的量的變化可以測定出候選者是反向激動(dòng)劑(與基線相比降低)還是激動(dòng)劑(與基線相比升高)。
盡管參照以上的實(shí)施例已經(jīng)詳盡地描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解能進(jìn)行多種改變而不背離本發(fā)明精神。因此，本發(fā)明只被下述權(quán)利要求所限制。本申請中提及的所有引用專利和出版物完整地并入此處作為參考。
權(quán)利要求
1.分離的核酸，其包含GAVE10(SEQ ID NO1)或GAVE10變體的核苷酸序列。
2.分離的核酸，其包含的序列編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的GAVE10多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸選自RNA、基因組DNA、合成DNA和cDNA。
4.分離的核酸，其包含GAVE10(SEQ ID NO1)的核苷酸序列的等位基因變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述變體編碼添加、缺失或替代突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的核酸，其編碼替代突變，其中所述突變在所述序列中提供至少一個(gè)功能等同的氨基酸殘基。
7.分離的核酸，其包含在嚴(yán)緊條件下可與雜交探針雜交并且與SEQID NO1互補(bǔ)或與編碼SEQ ID NO2的核酸互補(bǔ)的序列，其中所述探針包含SEQ ID NO1或編碼SEQ ID NO2的核酸的片段。
8.分離的核酸，其包含的序列編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1至少30％一致。
9.純化的多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO2。
10.純化的多肽，其包含如SEQ ID NO2中所示的第三胞內(nèi)環(huán)。
11.表達(dá)載體，其包含與表達(dá)控制元件可操作地連接的權(quán)利要求1的核酸。
12.權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)控制元件選自組成型、細(xì)胞特異性和誘導(dǎo)型調(diào)控序列。
13.包含權(quán)利要求11的載體的培養(yǎng)細(xì)胞。
14.培養(yǎng)細(xì)胞，其包含與表達(dá)控制元件可操作地連接的權(quán)利要求1的核酸。
15.用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞或所述細(xì)胞的后代，其中所述細(xì)胞表達(dá)所述載體包含的核酸所編碼的多肽。
16.權(quán)利要求13的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自真核細(xì)胞和原核細(xì)胞。
17.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括在允許所述載體包含的核酸所編碼的多肽實(shí)現(xiàn)表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求13的細(xì)胞。
18.特異性結(jié)合GAVE10的抗體。
19.權(quán)利要求18的抗體，其是單克隆抗體或多克隆抗體。
20.治療方法，其用于對需要治療的患者調(diào)節(jié)GAVE10的信號活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述治療方法包括給所述患者施用GAVE10的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
21.用于鑒定GAVE10的激動(dòng)劑的方法，其包括使?jié)撛诘募?dòng)劑與表達(dá)GAVE10的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在激動(dòng)劑存在時(shí)GAVE10的信號活性是否相對于無所述潛在激動(dòng)劑時(shí)GAVE10的活性增加。
22.用于鑒定GAVE10的反向激動(dòng)劑的方法，其包括使?jié)撛诘姆聪蚣?dòng)劑與表達(dá)GAVE10的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在反向激動(dòng)劑存在時(shí)，GAVE10的活性是否相對于無所述潛在反向激動(dòng)劑時(shí)GAVE10的活性降低，并且在存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑時(shí)也降低。
23.用于鑒定GAVE10的拮抗劑的方法，其包括使?jié)撛诘霓卓箘┡c表達(dá)GAVE10的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在拮抗劑存在時(shí)GAVE10的信號活性是否相對于存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑時(shí)GAVE10的活性降低。
24.治療組合物，其包含能夠調(diào)節(jié)GAVE10的信號活性或轉(zhuǎn)導(dǎo)的GAVE10的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
25.治療疾病的方法，其包括對需要治療的患者施用治療組合物，其中所述治療組合物包含能夠調(diào)節(jié)GAVE10的信號活性或轉(zhuǎn)導(dǎo)的GAVE10的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了新型GAVE10多肽、蛋白質(zhì)和核酸分子。除了分離的全長GAVE10蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還教導(dǎo)了分離的GAVE10融合蛋白、抗原性肽和抗GAVE10抗體。本發(fā)明教導(dǎo)GAVE10的重組表達(dá)載體、其中導(dǎo)入了此表達(dá)載體的宿主細(xì)胞以及其中引入了GAVE10基因或GAVE10基因被破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明組合物進(jìn)行的診斷、篩選和治療方法。
文檔編號A61K48/00GK1596269SQ02823899
公開日2005年3月16日 申請日期2002年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月1日
發(fā)明者H·艾施因德雷羅, A·阿爾達(dá)提, 蔡濟(jì)東 申請人:安萬特藥物公司