專利名稱：一種乙型肝炎疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗，特別是一種含有胞壁酰二肽的乙型肝炎疫苗。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)為嗜肝DNA病毒，具有雙層殼結(jié)構(gòu)，外殼含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、前S1蛋白(PreS1)和前S2蛋白(PreS2)，內(nèi)核的表面為乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，內(nèi)核內(nèi)含雙鏈環(huán)狀DNA和DNA多聚酶(DNA-P)。
自1985年中國開展乙型肝炎疫苗接種工作以后，在免疫兒童中乙型肝炎病毒攜帶率已由10％左右降低為1％左右。北京、上海等地由于新生兒乙型肝炎疫苗接種率高，學(xué)齡前兒童的乙型肝炎病毒攜帶率已降低至0.5％以下。實(shí)踐證明，如同其它疫苗可預(yù)防疾病一樣，接種乙型肝炎疫苗及聯(lián)合使用乙型肝炎免疫球蛋白是預(yù)防和控制乙型肝炎最有效的武器。接種乙型肝炎疫苗不僅可以預(yù)防乙型肝炎，而且可以預(yù)防與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝癌，同時還可以預(yù)防丁型肝炎。
現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗主要含有HbsAg和鋁佐劑，如目前中國大量使用的乙型肝炎疫苗中，每劑量含5μg、10μg酵母表達(dá)的HBsAg或10μg、20μg CHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg，以及0.5～1.0mg鋁佐劑。這些疫苗能較好的誘導(dǎo)一定水平的體液免疫，但難于誘發(fā)高水平的體液免疫。
胞壁酰二肽(英文名Muramyl-dipeptide，簡寫為MDP)是一種免疫佐劑，主要用作疫苗的添加物，具有增強(qiáng)蛋白類抗原免疫原性的作用。
目前沒有將HbsAg和胞壁酰二肽結(jié)合制成乙型肝炎疫苗的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的乙型肝炎疫苗，該疫苗的組成除包括HbsAg和鋁佐劑外，還包括胞壁酰二肽或其衍生物。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗基于胞壁酰二肽(英文名Muramyl-dipeptide，簡寫為MDP)免疫佐劑的作用，胞壁酰二肽可有效地激活T細(xì)胞，產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫，在試驗(yàn)動物中能誘生高水平的抗-HBs。采用此種特定類型的免疫佐劑可以進(jìn)行各種類型HBV感染的免疫治療及對免疫抑制藥物使用者進(jìn)行有效的免疫，可將目前較難治療的無癥狀HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者轉(zhuǎn)陰并出現(xiàn)抗-HBs。疫苗中加入MDP可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性免疫應(yīng)答，本發(fā)明中使用的乙型肝炎表面抗原為基因工程重組抗原或其片段或含preS1/Pre S2成分的抗原，而不是來源于乙型肝炎病人血漿的乙型肝炎表面抗原。由酵母菌或CHO細(xì)胞表達(dá)的基因工程表面抗原由226個氨基酸組成。重組酵母菌或CHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg均可形成22nm顆粒，已用于人群免疫十余年，均表現(xiàn)出良好的預(yù)防乙型肝炎病毒感染的效果。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗每劑中各主成分的含量范圍如下MDP 5～200μg、HBsAg 5～20μg、鋁佐劑(按鋁離子計(jì)算)0.25～1.20mg。
優(yōu)選的范圍如下MDP 10～150μg、HBsAg 10～100μg、鋁佐劑(按鋁離子計(jì)算)0.5～1.0mg。
最優(yōu)選的范圍如下MDP 25～75μg、HBsAg 25～75μg、鋁佐劑(按鋁離子計(jì)算)0.5～1.0mg。
以上說述每劑是指每一疫苗制劑，如每一注射針劑，或每支注射劑，或每次使用量的注射用藥劑。
本發(fā)明的疫苗使用方法與現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗使用方法相同。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗可以通過以下方法制備組成胞壁酰二肽(MDP)或其衍生物乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)。
氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑制備乙型肝炎病毒表面抗原中加入鋁佐劑，混勻后，加入MDP或其衍生物溶液，混勻，即得疫苗液，該疫苗液經(jīng)過分裝可制成單位劑量的注射用的疫苗制劑。
本發(fā)明的疫苗制劑中還可含有其它可提高機(jī)體免疫的人體或微生物蛋白質(zhì)、多糖或小分子化合物。
本發(fā)明的疫苗制劑可作為成人、腎透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群的免疫治療的藥物。也可作為慢性乙型肝炎病人的免疫治療的藥物。
本發(fā)明的疫苗還可與其他含鋁佐劑的疫苗制劑組成聯(lián)合疫苗。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗與現(xiàn)有乙型肝炎疫苗的不同之處在于，加入了免疫增強(qiáng)劑MDP，將MDP加入到疫苗中，可有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平體液免疫及細(xì)胞免疫，該疫苗將會給慢性乙型肝炎的治療帶來光明的前景。
動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗明顯優(yōu)于現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗。應(yīng)用于人體后可大輻度的提高人體抗乙型肝炎病毒的體液免疫/細(xì)胞免疫，可用于慢性乙型肝炎病人的治療。
動物試驗(yàn)表明該新型乙型肝炎疫苗是安全的，對試驗(yàn)動物無可見的毒性。可有效的刺激動物產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗采用的配方，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。該疫苗可用于成人、其它類型乙型肝炎疫苗免疫失敗者、腎透析病人、器官移植病人的免疫，以及慢性乙型肝炎病人的免疫治療。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
CHO細(xì)胞表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)，112μg/ml，為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。
磷酸鋁佐劑1.0mg/ml(按鋁離子計(jì)算)。
疫苗的制備方法取CHO細(xì)胞表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原9.0ml于一無菌玻璃瓶內(nèi)，加入磷酸鋁佐劑10ml，充分混勻后，加入MDP溶液1.0ml，混勻后放置于2-8℃。配成20ml疫苗溶液，所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50μg、鋁佐劑0.5mg(按鋁離子計(jì)算)、MDP 100μg，該溶液分裝后，制成20瓶每瓶1ml的疫苗注射劑。實(shí)施例2乙型肝炎疫苗注射劑的制備方法原料及來源胞壁酰二肽(MDP)用純水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌濾膜過濾除菌，凍存于-20℃。
CHO細(xì)胞表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)，112μg/ml，為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。
氫氧化鋁佐劑1.0mg/ml(按鋁離子計(jì)算)。
疫苗的制備方法取CHO細(xì)胞表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原9.0ml于一無菌玻璃瓶內(nèi)，加入氫氧化鋁佐劑10ml，充分混勻后，加入MDP溶液1.0ml，混勻后放置于2-8℃。配成20ml疫苗溶液，所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50μg、鋁佐劑0.5mg(按鋁離子計(jì)算)、MDP 100μg，該溶液分裝后，制成20瓶每瓶1ml的疫苗注射劑。
單磷脂A(MPL)購自美國SIGMA公司。用純水配制成2mg/ml，超聲波處理后以0.22μm的除菌濾膜過濾除菌，凍存于-20℃。
CHO細(xì)胞表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原(CHOHB)，100μg/ml，為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。
酵母表達(dá)的乙型肝炎表面抗原(YHB)，200μg/ml，北京天壇生物制品股份有限公司產(chǎn)品。
氫氧化鋁佐劑1.0mg/ml(按鋁離子計(jì)算)。
磷酸鋁佐劑1.0mg/ml(按鋁離子計(jì)算)。
本發(fā)明的疫苗(表中的H4，見表1)的制備方法取CHO細(xì)胞表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原2.0ml于一無菌玻璃瓶內(nèi)，加入磷酸鋁佐劑10ml，充分混勻后，加入MDP溶液0.2ml及磷酸鹽緩沖液8.0ml，混勻后放置于2-8℃。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原10μg、鋁佐劑0.5mg(按鋁離子計(jì)算)、MDP20μg。
其他各對照組疫苗的配方如下(表1)，制備方法同上。
表1、動物實(shí)驗(yàn)用乙型肝炎疫苗的配制

對比實(shí)驗(yàn)的方法動物免疫雌性SPF級BALB/c小鼠，體重16～18克，每組8只。于第0、21天腹腔免疫，免疫劑量0.1ml，第1次免疫后20天采集血液0.1ml，第28天自心臟采集全血，分離血清，測定前凍存于-20℃。
鼠抗-HBs測定抗-HBs EIA定量測定試劑盒購自北京萬泰生物工程有限公司。為雙抗原夾心法測定抗-HBs滴度的試劑盒。以1∶25倍稀釋的鋁佐劑組鼠血清A450/650值的平均值的2.1倍作為(Cut off)界值，同時以中國藥品生物制品檢定所提供的抗-HBs定量測定標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待檢血清A450/650值高于界值的計(jì)算血清抗-HBs含量。各組實(shí)驗(yàn)動物血清抗-HBs的幾何平均滴度見表2。
表2、不同佐劑乙型肝炎疫苗免疫BALB/c小鼠后血清抗-HBs的幾何平均滴度(GMT，mIU/ml)


第1次免疫后20天，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明H4組的抗-HBs GMT明顯高于H1、H2、H3組，H5組的抗-HBs GMT明顯高于H1、H2組，H4與H5組相比，抗-HBsGMT的差異無顯著性。
第2次免疫后7天(即第1次免疫后28天)，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明H4組的抗-HBsGMT明顯高于H1、H2、H3、H5組，H5組的抗-HBs GMT顯著高于H3組。H4組的GMT分別為H2、H3組12倍和13.5倍。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎疫苗制劑，其特征在于，含有乙型肝炎病毒表面抗原，鋁佐劑和胞壁酰二肽或其衍生物。
2.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其特征在于，其中的乙型肝炎表面抗原為基因重組乙型肝炎表面抗原或其片段或含pre S1/Pre S2成分的抗原。
3.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其特征在于，其中的胞壁酰二肽衍生物是指具有和胞壁酰二肽結(jié)構(gòu)相似，具有免疫佐劑作用的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其特征在于，其中的鋁佐劑是氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑。
5.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其特征在于，每劑中含有胞壁酰二肽5-200μg，乙型肝炎病毒表面抗原5-120μg，鋁佐劑(以鋁離子的量計(jì)算)0.25～1.2mg。
6.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其特征在于，制劑中還含有其它可提高機(jī)體免疫的人體或微生物蛋白質(zhì)、多糖或小分子化合物。
7.用權(quán)利要求1的疫苗制劑制備一種可用于成人、腎透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群的免疫治療的藥物。
8.用權(quán)利要求1的疫苗制劑制備用于慢性乙型肝炎病人的免疫治療的藥物。
9.一種聯(lián)合疫苗，其特征在于，該疫苗是由權(quán)利要求1的疫苗制劑與其他含鋁佐劑的疫苗制劑組成的。
10.權(quán)利要求1的疫苗制劑的制備方法，其特征在于，將乙型肝炎病毒表面抗原，鋁佐劑和胞壁酰二肽或其衍生物混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗，該疫苗的主要成分為基因工程乙型肝炎病毒表面抗原、胞壁酰二肽(MDP)、鋁佐劑等。該乙型肝炎疫苗可用于成人、腎移植病人、腎透析病人等的免疫，以預(yù)防乙型肝炎病毒的感染，該乙型肝炎疫苗亦可用于慢性乙型肝炎患者的免疫治療，該疫苗的免疫原性優(yōu)于目前使用的鋁佐劑乙型肝炎疫苗。
文檔編號A61K39/29GK1404875SQ0214887
公開日2003年3月26日 申請日期2002年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日
發(fā)明者孔健, 蔣先敏 申請人:北京綠竹生物技術(shù)有限責(zé)任公司