專利名稱：一種角燕有效成份提取物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類有效成份提取物及制備方法，具體涉及一種角燕有效成份提取物及制備方法和應(yīng)用。
角燕為晚近藥材，在我國(guó)多種本草中提到了其藥用價(jià)值。1976年林呂何編著的《廣西藥用動(dòng)物》和1977年由中國(guó)人民解放軍海軍后勤部衛(wèi)生部，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院編寫的《中國(guó)藥用海洋生物》中最早收載了雙吻前口角燕，其后在《中國(guó)動(dòng)物藥》、《中國(guó)有毒魚類和藥用魚類》、《中國(guó)動(dòng)物藥志》、《海洋趣談》、《中藥藥名詞典》等書籍均有收載。在上述著作中，對(duì)角燕的尾刺、肝、腦、鰓等的藥用價(jià)值進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
角燕具有活血化瘀、消腫散結(jié)、清熱透疹、解毒等功效，其尾刺可用來治療牙痛、婦科疾病、療瘡、治乳腺炎、咽喉炎、痢疾等；肝可以制魚肝油；腦可以浸酒服，治療跌打損傷。特別是角燕鰓具有活血化淤、消腫散結(jié)、清熱透疹、解毒等功效，在治療小兒麻疹上有相當(dāng)好的效果，還可治瘡癤。但到目前為止，關(guān)于角燕的研究?jī)H限于其分布、形態(tài)、解剖、化學(xué)成分分析等。關(guān)于角燕治療各種疾病的作用機(jī)制的研究報(bào)道很少，僅有關(guān)于角燕鰓的藥理作用研究，角燕鰓提取液具有明顯的耐缺氧效應(yīng)，能使缺氧條件下的小鼠平均存活時(shí)間延長(zhǎng)。
本發(fā)明公開的角燕有效成份提取物是選用角燕頭部部位，用鹽溶液抽提，有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀，分子篩層析后獲取的主要成份為分子量1萬左右的蛋白質(zhì)提取物。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述角燕有效成份提取物的制備方法。
本發(fā)明角燕有效成份提取物是通過下述技術(shù)方案獲得的取角燕頭部，清洗干凈后勻漿于2～5倍體積的含鹽酸鹽的緩沖溶液中，高速離心，上清液用40％～80％的無水乙醇分級(jí)沉淀，收集40％～80％的無水乙醇沉淀組分，真空冷凍干燥，干燥物溶解后進(jìn)行分子篩層析，收集活性峰，濃縮，凍干，即得到角燕抗腫瘤有效成份，簡(jiǎn)稱SJ。
本發(fā)明所述的含鹽酸鹽的緩沖溶液可選用10mmol/L PB溶液或其他磷酸緩沖液，其中含1～2mol/L鹽酸鹽和1～5mmol/L EDTA，所述的鹽酸鹽可選自NaCI、KCI等。
本發(fā)明分子篩層析的層析介質(zhì)可選用葡聚糖凝膠如SephadexG-50、G-100、G-150，Sephacryl S-300等。
本發(fā)明所述活性峰可以電泳、細(xì)胞抑制試驗(yàn)鑒定活性。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述角燕有效成份提取物在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明選用Hela細(xì)胞、QGY7721人肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，人肺成纖維細(xì)胞HLF為正常對(duì)照細(xì)胞，采用MTT測(cè)定法測(cè)定了不同劑量的SJ制劑對(duì)上述三種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示SJ制劑顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并有明顯的劑量依賴關(guān)系；而對(duì)人肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯的影響。采用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定了SJ制劑對(duì)Hela細(xì)胞、QGY7721人肝癌細(xì)胞和HLF細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，結(jié)果顯示SJ制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒作用，對(duì)HLF細(xì)胞無明顯影響。提示SJ制劑在細(xì)胞水平上能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)。選用小鼠lewis肺癌模型、HAC肝癌模型，S-180肉瘤模型，評(píng)價(jià)SJ制劑的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示SJ制劑在劑量0.25g/kg～1.00g/kg的范圍內(nèi)對(duì)小鼠Lewis肺癌、HAC肝癌、S-180肉瘤的生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用，且呈較好的劑量依賴關(guān)系，在劑量為1.00g/kg時(shí)，對(duì)小鼠Lewis肺癌、HAC肝癌、S-180肉瘤的抑瘤率為59.11％、55.50％、54.67％。提示SJ制劑能夠有效抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。
本發(fā)明角燕有效成份提取物可作為抗腫瘤藥物的活性成份，根據(jù)治療需要，與藥用輔料制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑。
下面通過本發(fā)明角燕有效成份提取物的詳細(xì)藥效試驗(yàn)，進(jìn)一步描述本發(fā)明角燕提取物的抗腫瘤作用。1、原料與方法1.1原料與試劑MES，SDS，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，臺(tái)盼藍(lán)，Sigma公司；胰蛋白酶1∶250，Difco進(jìn)口分裝；RPMI-1640培養(yǎng)基，Scientific產(chǎn)品；小牛血清，胎牛血清，上海華美生物工程公司；其余為一般常用試劑。C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，昆明種小鼠，上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；Lewis肺癌，HAG肝癌、S-180肉瘤瘤株，購(gòu)自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；Hela細(xì)胞，HLF人肺成纖維細(xì)胞，均購(gòu)自中科院細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。角燕原料購(gòu)自上海遠(yuǎn)洋漁業(yè)公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 SJ制劑的制備角燕1kg，用清水清洗干凈，勻漿于5000ml 10mmol/L PB溶液(含2mol/L NaCl，3mmol/L EDTA)。室溫抽提48h，8000rpm離心30min，上清液用40％～80％的無水乙醇分級(jí)沉淀，收集40％～80％的無水乙醇沉淀組分，真空冷凍干燥，將干燥物溶解于PBS溶液中，進(jìn)行Sephacryl S-300分子篩層析，收集第3峰，濃縮，凍干即得。1.2.2 SJ制劑的SDS-PAGE分析采用Sambrook報(bào)道的方法。5％的濃縮膠，10％的分離膠，0.8mm膠厚的SDS-PAGE電泳。1mg SJ制劑溶解于1ml的H2O中，離心取上清100μl加100μl2×上樣緩沖液，水浴煮沸3min，冰浴后離心，取上清100μl上樣。100V電泳1h后，樣品進(jìn)入分離膠，增加電壓至200V，電泳4h?？捡R斯亮藍(lán)染液染色過夜，10％的冰醋酸10％甲醇溶液脫色4h，掃描記錄結(jié)果。1.2.3 SJ制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的測(cè)定采用MTT測(cè)定法。Hela細(xì)胞、QGY7721肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，HLF人肺成纖維細(xì)胞為正常對(duì)照。1×104個(gè)細(xì)胞懸浮于200μl含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加到96孔板中，培養(yǎng)12h后，加入10μl不同濃度的SJ制劑作用24h，加入100μl 0.5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5h，傾去培養(yǎng)基，加入100μl DMSO，振蕩10min，用Bio-Rad酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3-8個(gè)平行樣品。對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析各處理組差異。
同樣方法培養(yǎng)和SJ制劑處理Hela細(xì)胞、QGY7721肝癌細(xì)胞和HLF細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染液染色，照相記錄結(jié)果。10min內(nèi)在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)死活細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果。1.2.4 SJ制劑對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制的測(cè)定根據(jù)付生法報(bào)道的方法加以改進(jìn)。采用三種動(dòng)物模型，C57BL/6小鼠接種Lewis肺癌，昆明種小鼠接種S-180肉瘤，BALB/c小鼠接種HAC肝癌。無菌操作取生長(zhǎng)良好的小鼠瘤組織，用滅菌生理鹽水以1∶4勻漿制備成癌細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色檢查活細(xì)胞數(shù)，應(yīng)大于95％。于每只小鼠前腋皮下接種0.2ml，隨機(jī)分成5組，每組動(dòng)物數(shù)10個(gè)，設(shè)生理鹽水對(duì)照組和環(huán)磷酰胺(CTX)陽(yáng)性對(duì)照組(40mg/kg，ip×7)；SJ制劑設(shè)1.00g/kg、0.50g/kg、0.25g/kg三個(gè)劑量組，給藥體積為0.5ml/只，于接種瘤株后次日起灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥七天，接種后10日脫頸椎處死動(dòng)物，稱體重后，解剖取出每只小鼠瘤塊，稱瘤塊重量，比較各劑量組瘤重之大小，根據(jù)下列公式判定結(jié)果抑瘤率(％)＝(對(duì)照組平均瘤重—給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100％2、結(jié)果2.1 SJ制劑的SDS-PAGE電泳分析電泳結(jié)果如

圖1所示，SJ制劑有其特征的電泳圖譜，在分子量1萬左右有一明顯的特征條帶。見圖1。2.2 SJ制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的研究結(jié)果如表1所示。較低劑量的SJ制劑對(duì)Hela細(xì)胞及QGY7721人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制效應(yīng)，并有顯著的劑量依賴關(guān)系，而對(duì)人肺成纖維細(xì)胞(HLF)的的生長(zhǎng)無明顯抑制效應(yīng)。結(jié)果提示SJ制劑具有較高的抗腫瘤生物效應(yīng)，具有顯著的開發(fā)應(yīng)用前景。
表1 ST制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)濃度 A570nm(x±s)(μg/ml)HLF cell QGY7721 cell Hela cell0 1.570±0.347 1.558±0.128 1.685±0.0421 1.791±0.032 1.472±0.017 1.646±0.01110 1.814±0.038 0.980±0.074**1.222±0.057*50 1.845±0.060 0.643±0.110**0.534±0.006**1001.799±0.055 0.694±0.028**0.558±0.036***P＜0.05 **P＜0.01SJ制劑對(duì)HLF細(xì)胞的細(xì)胞毒作用如圖2所示。其中圖2-1為HLF對(duì)照組，圖2-2為HLF SJ處理組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)也無明顯差異，說明SJ制劑對(duì)HLF細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，對(duì)其生長(zhǎng)也無明顯影響。SJ制劑對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用如圖3所示。其中圖3-1為Hela對(duì)照組，圖3-2為Hela SJ處理組。對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)明顯多于實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的死亡細(xì)胞數(shù)所占的比例明顯高于對(duì)照組，說明SJ制劑對(duì)Hela細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒作用，并明顯抑制其生長(zhǎng)。統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果如表2所示。
表2 SJ制劑對(duì)Hela細(xì)胞、QGY7721肝癌細(xì)胞和HLF細(xì)胞的細(xì)胞毒作用濃度 死亡比*(x±s)(μg/ml) Hela cell QGY7721 cellHLF cell0 1.000±0.302 1.000±0.2111.000±0.0311 0.891±0.025**0.972±0.0311.646±0.02910 0.714±0.051**0.880±0.069** 1.222±0.038
50 0.545±0.045** 0.643±0.109**1.134±0.0261000.299±0.023** 0.494±0.034**0.958±0.046*死亡比＝處理組死細(xì)胞百分比/對(duì)照組死細(xì)胞百分比2.3 SJ制劑對(duì)小鼠Lewis肺癌的療效研究SJ制劑在劑量為1.00、0.50、0.25g/kg時(shí)，對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤率分別為59.11、41.38和32.51％，與生理鹽水組比較具有顯著性差別，試驗(yàn)結(jié)果見圖4和表3。
表3 SJ制劑對(duì)C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用組別 劑量 給藥 動(dòng)物數(shù)動(dòng)物體重(g)瘤重(g)抑瘤率(g/kg)方案 始 終始 終 (x±s)％生理鹽水組 --- po×730 3018.4 23.42.03±0.45CTX 0.04ip×730 3018.5 20.30.16±0.05**92.120.25po×730 3018.3 25.51.37±0.30* 32.51SJ制劑 0.50po×730 3018.6 24.01.19±0.26**41.381.00po×730 3018.2 24.10.83±0.19**59.11與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.012.4 SJ制劑對(duì)小鼠肝癌HAC的療效研究SJ制劑在劑量為0.25、0.50、1.00g/kg時(shí)，對(duì)小鼠肝癌HAC實(shí)體瘤的抑瘤率分別為36.36、43.54和55.50％，與生理鹽水組比較具有顯著性差別，試驗(yàn)結(jié)果見圖5和表4。
表4 SJ制劑對(duì)小鼠肝癌HAC的抑瘤作用組別 劑 量給藥 動(dòng)物數(shù) 動(dòng)物體重(g)瘤重(g) 抑瘤率(g/kg)方案 始 終 始 終 (x±s) ％生理鹽水組 --- po×730 30 18.126.22.09±0.34CTX 0.04 ip×730 30 18.320.60.14±0.07**93.300.25 po×730 30 18.026.31.33±0.34**36.36SJ制劑0.50 po×730 30 18.425.81.18±0.27**43.541.00 po×730 30 18.225.90.93±0.19**55.50與生理鹽水組比較**P＜0.012.5 SJ制劑對(duì)小鼠S-180肉瘤的療效研究SJ制劑在劑量為0.25、0.50、1.00g/kg時(shí)，對(duì)小鼠S-180肉瘤(實(shí)體瘤)的抑瘤率分別為29.78、39.56和54.67％，與生理鹽水組比較具有顯著性差別，試驗(yàn)結(jié)果見下表5和圖6。
表5 SJ制劑對(duì)小鼠S180肉瘤(實(shí)體瘤)的抑瘤作用組別 劑 量給藥動(dòng)物數(shù) 動(dòng)物體重(g)瘤重(g)抑瘤率(g/kg)方案始 終始 終 (x±s) ％生理鹽水組 --- po×7 30 3018.2 27.32.25±0.39CTX 0.04 ip×7 30 3018.4 20.10.23±0.06**89.770.25 po×7 30 3018.1 26.31.58±0.24**29.78SJ制劑 0.50 po×7 30 3018.5 25.91.36±0.38**39.561.00 po×7 30 3018.3 25.41.02±0.16**54.67與生理鹽水組比較**P＜0.01以上藥效學(xué)試驗(yàn)表明，用三種瘤株(Lewis肺癌，HAC肝癌及S-180肉瘤)以同樣的皮下接種方式和給藥劑量分別進(jìn)行三批實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明SJ制劑對(duì)Lewis肺癌，HAC肝癌及S-180肉瘤荷瘤小鼠具有明顯的抑瘤作用，且呈良好的量效關(guān)系，請(qǐng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理研究室重復(fù)上述抑瘤試驗(yàn)亦取得類似的抑瘤效果，提示SJ制劑對(duì)不同類型的實(shí)體瘤具有較確切的抑制作用。3.討論腫瘤是常見病，發(fā)病率在不斷上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球52億人口中，每年的腫瘤發(fā)病人數(shù)約為900萬，年死亡數(shù)在700萬以上，占全球總死亡人口的10％。我國(guó)癌癥死亡率(癌癥死亡人口占總死亡人口的比例)已由70年代的11.72％上升到90年代的18.14％。上升形勢(shì)十分嚴(yán)峻，已成為我國(guó)人口的第二位死因。目前，雖然有了手術(shù)療法、放射療法、化學(xué)療法和生物療法等，但腫瘤的防治問題遠(yuǎn)未解決。我國(guó)許多現(xiàn)代本草都有角燕的藥物價(jià)值記載，也已將其作為中藥材收載。因此，將SJ制劑開發(fā)成保健食品或中II類新藥，具備理論基礎(chǔ)，也實(shí)際可行。
實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無死亡細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)也無明顯差異。圖3 SJ制劑對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組明顯減少，實(shí)驗(yàn)組死亡細(xì)胞所占的比例也比對(duì)照組明顯增加。圖4 SJ制劑對(duì)Lewis肺癌生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)圖5 SJ制劑對(duì)HAC肝癌生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)圖6 SJ制劑對(duì)小鼠S180肉瘤(實(shí)體瘤)的抑瘤作用。
權(quán)利要求
1.一種角燕有效成份提取物，其特征在于該提取物是選用角燕頭部部位，用鹽溶液抽提，有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀，分子篩層析后獲取的主要成份為分子量1萬左右的蛋白質(zhì)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的角燕有效成份提取物的制備方法，其特征在于該提取物通過下述方法獲得取角燕頭部，清洗干凈后勻漿于2～5倍體積的含鹽酸鹽的緩沖溶液中，高速離心，上清液用40％～80％的無水乙醇分級(jí)沉淀，收集40％～80％的無水乙醇沉淀組分，真空冷凍干燥，干燥物溶解后進(jìn)行分子篩層析，收集活性峰，濃縮，凍干，即得。
3.一種如權(quán)利要求2所述的角燕有效成份提取物的制備方法，其特征在于其中所述的含鹽酸鹽的緩沖溶液選用10mmol/L PB溶液或其他磷酸緩沖液，其中含1～2mol/L鹽酸鹽和1～5mmol/L EDTA，所述的鹽酸鹽選自NaCI、KCI等。
4.一種如權(quán)利要求2所述的角燕有效成份提取物的制備方法，其特征在于其中所述分子篩層析的層析介質(zhì)可選用葡聚糖凝膠如Sephadex G-50、G-100、G-150，Sephacryl S-300等。
5.一種如權(quán)利要求2所述的角燕有效成份提取物的制備方法，其特征在于其中所述活性峰以電泳、細(xì)胞抑制試驗(yàn)鑒定活性。
6.一種如權(quán)利要求1所述的角燕有效成份提取物在制備治療抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，其特征在于該提取物可作為抗腫瘤藥物的活性成份，根據(jù)治療需要，與藥用輔料制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種角燕有效成份提取物及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開的角燕有效成份提取物是選用角燕頭部部位,用鹽溶液抽提,有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀,分子篩層析后獲取的主要成份為分子量1萬左右的蛋白質(zhì)提取物。該提取物能夠有效抑制體內(nèi)外腫瘤的生長(zhǎng),可作為抗腫瘤藥物的活性成份,制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1389216SQ02136089
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2002年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者沈先榮, 賈福星, 蔣定文, 儲(chǔ)智勇, 陳美華 申請(qǐng)人:上海澳博海洋生物技術(shù)開發(fā)有限公司, 中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所