專利名稱：抗血栓形成的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及抑制或預(yù)防凝血酶形成或活性的組合物及方法。
硫酸皮膚素(DS)，一種在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(6-9)和人體(10-13)中具有抗血栓形成活性的硫酸化糖胺聚糖，通過(guò)僅催化肝素輔因子II(HCII)而用作抗凝劑。由于凝血酶是HCII在血漿內(nèi)的專一靶體，因此DS被認(rèn)為是凝血酶的選擇性抑制劑(14)。盡管結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶能夠防護(hù)肝素-HCII復(fù)合體避免致失活作用(15)，血漿系統(tǒng)中進(jìn)行的間接研究提示結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶對(duì)DS-HCII復(fù)合體的致失活作用是敏感的(16)。然而，由于其低特異性的生物學(xué)活性以及高粘度使硫酸皮膚素的臨床應(yīng)用受到限制。
商業(yè)上可獲得的低分子量肝素(無(wú)論是伊諾肝素還是替地肝素)中添加硫酸皮膚素在體外對(duì)血栓具有加和的抑制作用(17)。然而，實(shí)驗(yàn)性聯(lián)合用藥沒(méi)有臨床價(jià)值，因?yàn)樗鼘?duì)結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶無(wú)效，并且DS效價(jià)低且溶解度小。
本發(fā)明簡(jiǎn)述已經(jīng)證實(shí)，將從肝素獲得的寡糖級(jí)分(oligosaccharide fraction)(本文也稱之為“肝素寡糖級(jí)分”)與從硫酸皮膚素獲得的寡糖級(jí)分(本文也稱之為“硫酸皮膚素寡糖級(jí)分”)聯(lián)合使用對(duì)于流體相和結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶都能夠產(chǎn)生良好的抑制作用。肝素寡糖級(jí)分和皮膚素寡糖級(jí)分的選擇性聯(lián)合使用產(chǎn)生超出預(yù)見(jiàn)的遠(yuǎn)大于加和的抑制作用，即協(xié)同性抑制作用。本發(fā)明的新概念是在不增加出血的危險(xiǎn)下聯(lián)合使用寡糖級(jí)分以確保肝素和硫酸皮膚素的最大的抗凝活性。
期望聯(lián)合治療中的各寡糖級(jí)分通過(guò)不同的機(jī)理抑制凝血酶。在希望不受理論上的作用機(jī)理束縛下，肝素寡糖級(jí)分可以通過(guò)激活抗凝血酶而抑制結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶以及流體相凝血酶，并且它可通過(guò)抗凝血酶催化Xa因子失活而抑制凝血酶生成。硫酸皮膚素寡糖級(jí)分可以通過(guò)激活HCII而抑制結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶。在其活化的構(gòu)象中，HCII的氨基端結(jié)構(gòu)域與外切位點(diǎn)I(exosite)結(jié)合。由于凝血酶通過(guò)外切位點(diǎn)I結(jié)合于纖維蛋白，活化的HCII與纖維蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合凝血酶并從纖維蛋白上置換出凝血酶。而后被置換出的凝血酶被肝素/HCII、硫酸皮膚素/HCII或肝素/抗凝血酶滅活。
通過(guò)不同機(jī)理達(dá)到抑制凝血酶最大效果的聯(lián)合治療，將改善對(duì)治療的耐受性，并且使得在單一治療時(shí)高劑量和長(zhǎng)期使用這些藥物可引起的不利毒性作用的危險(xiǎn)降低。因此，本發(fā)明的聯(lián)合治療能夠使所采用的各組分的劑量降低(例如，如實(shí)施例2所述至少使劑量降低5-10倍)，并降低各組分的不利的毒性作用。與各組分作為單一藥物使用的安全范圍相比，較低的劑量能夠使安全范圍擴(kuò)大。此外，當(dāng)向患者提供方便的單一的聯(lián)合用藥劑量單位時(shí)，它一般能夠被接受，因?yàn)楸憷蕴岣邔?dǎo)致依從性提高，并且使患者通常與藥物的多種單位劑量形式有關(guān)的精神錯(cuò)亂的可能性減少。
大致說(shuō)來(lái)，本發(fā)明涉及抑制或預(yù)防患者凝血酶生成或活性的聯(lián)合治療，包括使患者服用有效劑量的(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分；及(b)一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供協(xié)同活性的聯(lián)合治療。另一個(gè)方面是提供抑制或預(yù)防患者凝血酶生成或活性的方法，包括對(duì)有需要的患者聯(lián)合給予有效量(優(yōu)選產(chǎn)生協(xié)同作用的有效量)的至少一種肝素寡糖級(jí)分，以及至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分。
“聯(lián)合治療”或“聯(lián)合給予”意思是將活性成分同時(shí)給予所治療的患者。當(dāng)聯(lián)合給藥時(shí)，各組分可以在同一時(shí)間或以任何順序相繼給藥、以及在不同的時(shí)間點(diǎn)給藥。因此，各組分可以分別給藥，但時(shí)間應(yīng)充分接近以獲得所希望的作用(優(yōu)選協(xié)同作用)。
本發(fā)明還提供包括聯(lián)合使用的(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分；和(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分，以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或媒介物的組合物。本發(fā)明還構(gòu)思了在分開(kāi)的容器中以及適于同時(shí)或順序給藥目的的藥用組合物，它包括肝素寡糖級(jí)分和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分，兩者都任選與藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或媒介物混合在一起。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥用組合物，它包括一個(gè)單位劑量的至少一種肝素寡糖級(jí)分；以及一個(gè)單位劑量的硫酸皮膚素寡糖級(jí)分，以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或媒介物。
上述組合物還包括肝素寡糖及硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的藥學(xué)上可接受的鹽，例如鈉、鉀、銨、鎂及鈣鹽。
根據(jù)它的一個(gè)方面，所提供的藥用組合物包括在預(yù)防或抑制凝血酶生成或活性中存在有效的協(xié)同作用的(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分；及(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的組合。該方法還提供藥用組合物，它包括以產(chǎn)生協(xié)同作用的有效量的至少一種肝素寡糖級(jí)分與至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分，及藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或媒介物的組合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥用組合物所包括的肝素寡糖級(jí)分及硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的劑量至少比各自級(jí)分在預(yù)防或抑制患者凝血酶生成或活性中所需的劑量低5至10倍。
另一個(gè)方面本發(fā)明涉及包括(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分與(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的組合的組合物在用于預(yù)防或抑制凝血酶生成或活性的藥物制備中的用途。另一方面本發(fā)明涉及產(chǎn)生協(xié)同作用的有效量的至少一種肝素寡糖級(jí)分，與至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分在用于抑制或預(yù)防患者凝血酶生成或活性的藥用組合物的制備中的用途。
由于本發(fā)明涉及的治療方法包括可以分別給予活性藥物的組合，因此本發(fā)明還涉及以試劑盒形式組合的分別含活性成分的組合物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的寡糖級(jí)分，以及如本文一般描述的采用這些級(jí)分的組合物和治療方法。
本發(fā)明還構(gòu)思了本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的聯(lián)合療法在預(yù)防，和/或改善與過(guò)量的凝血酶生成或活性有關(guān)的疾病的嚴(yán)重性、疾病癥狀，和/或疾病復(fù)發(fā)周期中的用途。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠從下文附圖及詳細(xì)描述中容易地理解本發(fā)明的這些和其它方面、特征及優(yōu)點(diǎn)。
圖的描述參照附圖可以更好地理解本發(fā)明，其中

圖1表示可溶性纖維蛋白(Fm)對(duì)DS催化(圖A)的或肝素催化的(圖B)HCII抑制凝血酶的二級(jí)速率常數(shù)的影響。在有或無(wú)Fm存在下DS-或肝素-催化的100nM HCII對(duì)10hM凝血酶抑制的二級(jí)速率常數(shù)在準(zhǔn)一級(jí)(pseudo first-order)條件下測(cè)定。各個(gè)點(diǎn)代表四次測(cè)定的平均值，而短線代表標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖2的柱形圖表示在由肝素酶誘導(dǎo)的分子量遞增的肝素寡糖級(jí)分存在下4μM纖維蛋白單體對(duì)凝血酶的抗凝血酶(AT)抑制作用的影響。
圖3表示肝素和DS對(duì)凝血酶與纖維蛋白結(jié)合的影響。在濃度遞增的肝素(·)或DS(o)存在下測(cè)定凝血酶與纖維蛋白凝塊的結(jié)合。各個(gè)點(diǎn)代表兩次測(cè)定的平均值而條線(bars)代表標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖4的曲線圖表示肝素或由肝素酶誘導(dǎo)的級(jí)分對(duì)凝血酶與纖維蛋白凝塊結(jié)合的影響。
圖5是表示在DS或標(biāo)準(zhǔn)肝素(SH)存在下HCII從纖維蛋白凝塊上置換凝血酶的曲線圖。
圖6A是表示在兔動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型中聯(lián)合使用的肝素寡糖級(jí)分∶硫酸皮膚素寡糖級(jí)分(5∶1)與單用肝素寡糖級(jí)分對(duì)累計(jì)血管開(kāi)放(patency)的影響的圖。
圖6B是表示在兔動(dòng)脈血栓形成模型中聯(lián)合使用的肝素寡糖級(jí)分∶硫酸皮膚素寡糖級(jí)分(5∶1)與單用肝素寡糖級(jí)分對(duì)累計(jì)失血的影響的圖。
圖7是表示肝素、LMWH、肝素寡糖級(jí)分及水蛭素對(duì)血管開(kāi)放的影響(圖A)以及對(duì)失血的影響(圖B)的比較圖。
圖8是表示肝素寡糖級(jí)分對(duì)狒狒動(dòng)脈血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影響的圖。
圖9是表示硫酸皮膚素寡糖級(jí)分對(duì)狒狒動(dòng)脈血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影響的圖。
圖10是表示肝素寡糖級(jí)分與硫酸皮膚素寡糖級(jí)分聯(lián)合使用對(duì)狒狒動(dòng)脈血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影響的圖。
發(fā)明詳述肝素寡糖級(jí)分“得自肝素的寡糖級(jí)分”或“肝素寡糖級(jí)分”是指以體外具有抗凝血酶和HCII相關(guān)的抗凝血活性為特征的來(lái)源于肝素的寡糖的混合物。這些級(jí)分所包含的肝素鏈太短而不能橋接凝血酶與纖維蛋白，但是其長(zhǎng)度足以橋接抗凝血酶或HCII與凝血酶。
這些級(jí)分可包含衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七或更多項(xiàng)特征(a)具有體外抗凝血酶和肝素輔因子II(HCII)相關(guān)的抗凝血活性；(b)這些寡糖由于太短而不能橋接凝血酶和纖維蛋白，但是其長(zhǎng)度足以橋接抗凝血酶或HCII與凝血酶；(c)有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的寡糖具有一個(gè)或一個(gè)以上的五糖序列；(d)富含分子量范圍從約6000至約12000、6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)這些寡糖具有約7000至10000、7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少有30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道爾頓的分子量；(h)多分散性為1.1至1.8，優(yōu)選1.2至1.7；以及(i)具有類似抗Xa因子和抗IIa因子的活性，優(yōu)選抗Xa因子活性與抗IIa因子活性的比值從約2∶1至約1∶1。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明所采用的級(jí)分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
“富含寡糖”是指在所定義或限定的分子量范圍內(nèi)包含至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的寡糖的級(jí)分。
“五糖序列”是指由三個(gè)D-葡萄糖胺和兩個(gè)糖醛酸殘基組成的肝素的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單位(見(jiàn)下圖結(jié)構(gòu))。中心D-葡萄糖胺殘基含有獨(dú)特的3-O-硫酸根部分。 該五糖序列代表對(duì)抗凝血酶具有高度親和性的肝素最小結(jié)構(gòu)(Choay，J.等，Biochem Biophys Res Comm 1983；116492-499)。肝素通過(guò)該五糖序列結(jié)合抗凝血酶導(dǎo)致活性中心環(huán)的構(gòu)象改變而使抗凝血酶由緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖僖种苿?br> 肝素寡糖級(jí)分所包括的肝素序列太短而不能橋接凝血酶與纖維蛋白，但其長(zhǎng)度足以使抗凝血酶與凝血酶橋接。因此，本發(fā)明所選用的級(jí)分能夠通過(guò)催化抗凝血酶而抑制與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶以及流體相中凝血酶，并且通過(guò)抗凝血酶催化的Xa因子失活而抑制凝血酶生成。優(yōu)選用于本發(fā)明的級(jí)分為能夠同等抑制結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶及流體相中的凝血酶的片段。
表1和表2列舉了可以被本發(fā)明采用的合適的肝素寡糖級(jí)分的特征。
本發(fā)明所采用的肝素寡糖級(jí)分可能具有類似的抗Xa因子和抗IIa因子的活性。在一種實(shí)施方案中，抗Xa因子活性與抗IIa因子活性的比例范圍從約2∶1至約1∶1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗Xa因子活性范圍從約80IU/mg至約155IU/mg，優(yōu)選90IU/mg至約140IU/mg。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗IIa因子的活性范圍從約20IU/mg至約150IU/mg；更優(yōu)選從40IU/mg至約130IU/mg。
本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒可以用于改進(jìn)PCT/CA98/00548(WO98/55515，1998年12月10日公布)、1999年6月30日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/141865的，或1999年9月17日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/154744所描述的肝素組合物，這些文獻(xiàn)均通過(guò)參考結(jié)合于本說(shuō)明書(shū)。
應(yīng)該理解，有可能制備具有更多的特殊特征的本發(fā)明所用的肝素寡糖級(jí)分，這些特征在上述(d)、(e)、(h)及(i)所確立的范圍內(nèi)。例如，這些級(jí)分所具有的分子量范圍可以從約7000至10000；7500至10000；7800至10000；7800至9800；7800至9600；7800至9000；7800至8800；7800至8600；7800至8500；或8000至8500。采用具有7800至10000；7800至9800；7800至9600；7800至9000；7800至8800；7800至8600；7800至8500；或8000至8500的峰分子量的肝素寡糖級(jí)分也是可能的?？梢蚤_(kāi)發(fā)用于本發(fā)明組合物或方法的具有1.3-1.6的多分散性的級(jí)分。此外，開(kāi)發(fā)用于本發(fā)明組合物或方法的級(jí)分可以具有下列一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的特殊特征(i)抗Xa因子活性對(duì)抗IIa因子活性的比例范圍從約1.5∶1至約1∶1；(ii)從約95IU/mg至約120IU/mg或從約100至110IU/mg的抗Xa因子活性；(iii)從約80IU/mg至約100IU/mg或從約90至110IU/mg的抗IIa因子活性。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，肝素寡糖級(jí)分具有下列一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的特征(a)富含分子量范圍從6000至10000道爾頓，且平均值約為8500的寡糖；(b)白色至黃白色的結(jié)晶固體；(c)室溫下穩(wěn)定；以及(d)約1.2至1.5，優(yōu)選1.5的多分散性。
用于本發(fā)明的肝素寡糖級(jí)分可以用制備這些肝素寡糖的常規(guī)方法從組織中獲得，或者也可以合成它。特別地，肝素寡糖級(jí)分可以由未分級(jí)分離的肝素，或者，由低分子量肝素(LMWH)制備。
舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)首先使未分級(jí)分離的肝素解聚產(chǎn)生低分子量肝素，并且分開(kāi)或分離出所需的肝素寡糖級(jí)分可由未分級(jí)分離的肝素獲得肝素寡糖級(jí)分。未分級(jí)分離的肝素既可以是藥用質(zhì)量的商業(yè)肝素制品，也可以是粗制肝素制品，例如從哺乳動(dòng)物組織或器官提取活性肝素獲得。商業(yè)肝素產(chǎn)品(美國(guó)藥典肝素)可以從數(shù)種來(lái)源(例如，SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri)獲得，通常是作為堿金屬或堿土金屬鹽(最常見(jiàn)的是肝素鈉)。此外，未分級(jí)分離的肝素可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種方法(參見(jiàn)，例如，Coyne，Erwin，Chemistry and Biology of Heparin(《肝素化學(xué)和生物學(xué)》)(Lundblad，R.L.等(主編)，9-17頁(yè)，Elsevier/North-Holland，紐約(1981))，從哺乳動(dòng)物，例如，牛、豬和羊的組織或器官，特別是從小腸粘膜或肺中提取。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，未分級(jí)分離的肝素是豬小腸肝素。
已知有多種肝素解聚的方法，而且它們通常以化學(xué)或酶反應(yīng)為基礎(chǔ)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)芐基化繼而以強(qiáng)堿解聚；亞硝酸解聚；用肝素酶進(jìn)行酶促解聚；過(guò)氧化解聚等，可以從標(biāo)準(zhǔn)的、未分級(jí)分離的肝素制備本發(fā)明之肝素寡糖級(jí)分。尤其是，可以采用PCT/CA98/00548(WO98/55515)所述的亞硝酸解聚法或高碘酸氧化水解法制備肝素寡糖級(jí)分。
在一種實(shí)施方案中，采用肝素酶解聚反應(yīng)(例見(jiàn)，U.S.3766167，及U.S.4396762)而從未分級(jí)分離的肝素制備肝素寡糖級(jí)分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中通過(guò)控制肝素酶解聚反應(yīng)制備肝素寡糖級(jí)分。硫酸皮膚素寡糖級(jí)分“得自硫酸皮膚素的寡糖級(jí)分”或“硫酸皮膚素寡糖級(jí)分”是指以體外具有很少甚或沒(méi)有抗凝血酶相關(guān)活性、但具有HCII相關(guān)抗凝血活性為特征的衍生自硫酸皮膚素的寡糖混合物。硫酸皮膚素由交替的糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖殘基組成。許多葡萄糖醛酸殘基在C-5位出現(xiàn)差向異構(gòu)而產(chǎn)生艾杜糖醛酸。因此，O-硫酸化可能發(fā)生在GalNAc的C-4或C-6位或IdoA的C-2位。本發(fā)明所采用的這些級(jí)分比未分級(jí)分離的天然硫酸皮膚素顯示出對(duì)HCII的更高的親和性。
選用于本發(fā)明的硫酸皮膚素寡糖級(jí)分具有下列一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的，優(yōu)選全部的特征(a)6.0％至10.0％(w/w)的硫含量；例如從6.0％至8.0％(w/w)，優(yōu)選6.5％至8％(w/w)；(b)1.2至2.5的硫酸根/羧基比率，例如從1.2至2.0，例如從1.3至1.8，優(yōu)選從1.3-1.6；(c)20％至60％(w/w)的焦硫酸化(disulfated)二糖含量，優(yōu)選30％至60％(w/w)的單硫酸化二糖含量；(d)肝素輔因子II介導(dǎo)的抗凝血酶活性在20-60IU/mg范圍內(nèi)，優(yōu)選30-60IU/mg。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，被選擇的硫酸皮膚素寡糖級(jí)分所包括的硫酸皮膚素寡糖混合物中有90％或以上的分子量范圍在約1600至約20000道爾頓之間并且峰分子量從約4500至約8000道爾頓。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，硫酸皮膚素寡糖級(jí)分具有下列一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的特征(a)富含分子量范圍從5000至8000道爾頓的寡糖；(b)白色至黃白色的結(jié)晶固體；(c)室溫下穩(wěn)定；以及(d)磺化重量大于6.2％。
硫酸皮膚素寡糖級(jí)分可以用制備這些寡糖的常規(guī)方法從組織中的未分級(jí)分離的硫酸皮膚素獲得，或者它也可以從相關(guān)的單糖從頭開(kāi)始合成。優(yōu)選采用保護(hù)未分級(jí)分離的硫酸皮膚素之高電荷區(qū)并使之易于分離的解聚方法以提供用于本發(fā)明的級(jí)分，其溶解性和效價(jià)比未分級(jí)分離的硫酸皮膚素有改善。例如，可以按照下列步驟制備硫酸皮膚素寡糖級(jí)分硫酸皮膚素用高碘酸氧化反應(yīng)氧化和解聚，氫硼化物還原，酸水解，以及離子交換層析。
可以用于制備這些級(jí)分的硫酸皮膚素來(lái)源包括哺乳動(dòng)物組織，例如哺乳動(dòng)物皮膚，包括來(lái)源于豬或牛的血管化組織和皮膚。優(yōu)選采用腸粘膜作為硫酸皮膚素來(lái)源。
本發(fā)明的組合物、方法及試劑盒優(yōu)選采用硫酸皮膚素寡糖混合物，以及制備這些混合物的方法，它描述于PCT/EP98/03007(1998年12月10日公開(kāi)的WO98/55514)，它通過(guò)參考結(jié)合于本文中。
測(cè)定寡糖級(jí)分的性質(zhì)用于本發(fā)明的肝素和皮膚素寡糖級(jí)分的分子量特征可以采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟悉和采用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定。這些技術(shù)包括，例如，GPC-HPLC、粘度測(cè)量、光散射、解聚過(guò)程中形成的功能基團(tuán)的化學(xué)或物理化學(xué)測(cè)定等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡糖級(jí)分的分子量特征通過(guò)高效分子排阻層析(high performance size exclusive chromatography)測(cè)定。
特別地，可以采用下列方法確認(rèn)用于本發(fā)明的肝素或皮膚素寡糖級(jí)分的性質(zhì)和特征(a)按照Dedem，Pharmeuropa，3，202-218，1991的方法以GPS-HPLC測(cè)定分子量；(b)按照歐洲藥典，第2版，V.3.5.3.測(cè)定硫含量；(c)硫酸鹽/羧酸鹽比例按照歐洲藥典，19970828測(cè)定；(d)以國(guó)際肝素標(biāo)準(zhǔn)4(編碼號(hào)82/502)為標(biāo)準(zhǔn)在游離血漿系統(tǒng)中通過(guò)顯色分析法(Diagnostica Stago，法國(guó))測(cè)定HCII介導(dǎo)的抗凝血酶活性；(e)按照歐洲藥典1997:0828測(cè)定抗Xa因子與抗IIa因子，兩種方法均采用斜率比分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法校正。
組合物和方法本發(fā)明的組合物和方法在預(yù)防或治療以過(guò)量的凝血酶生成或活性和/或過(guò)強(qiáng)的補(bǔ)體激活為特征的癥狀或疾病的臨床應(yīng)用中是有益的。這些癥狀在受到過(guò)創(chuàng)傷的患者，例如接受手術(shù)的患者中經(jīng)常發(fā)生。傷口或手術(shù)所致的創(chuàng)傷導(dǎo)致血管損傷以及繼發(fā)性的血液凝固激活。這些不良作用可發(fā)生于常規(guī)及矯形手術(shù)、婦科手術(shù)、心臟或血管手術(shù)，或其它手術(shù)過(guò)程中。凝血酶過(guò)量還可能使正常疾病的發(fā)展惡化例如動(dòng)脈粥樣硬化，它可以導(dǎo)致心臟病發(fā)作、中風(fēng)或肢端壞疽。因此，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療、預(yù)防，或抑制多種重要的心血管并發(fā)癥，包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、腦血管意外(中風(fēng))、肺栓塞、深靜脈血栓形成、動(dòng)脈血栓形成等。本發(fā)明的組合物和方法還可以用于減少或預(yù)防透析過(guò)程中的凝血及減少或預(yù)防開(kāi)胸心臟手術(shù)過(guò)程中的血管內(nèi)凝血。它們還可以用于保持醫(yī)療設(shè)備如靜脈注射裝置的開(kāi)放。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，所提供的方法和組合物用于預(yù)防或抑制由于止血紊亂性醫(yī)學(xué)病情(例如，冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化，等)所致的血栓形成危險(xiǎn)性升高的患者的凝血酶生成或活性。在另一個(gè)方面，所提供的組合物和方法用于醫(yī)學(xué)處理后的血栓形成危險(xiǎn)性增高的患者，例如心臟手術(shù)、血管手術(shù)，或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入療法。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明之方法和組合物用于心肺旁路。本發(fā)明方法中的組合物，或寡糖級(jí)分，可以在醫(yī)學(xué)處理之前、期間或之后給藥。
可以用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法以細(xì)胞培養(yǎng)或以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定療效和毒性，例如統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算ED50(在50％群體中取得治療效果的劑量)或LD50(50％群體致死的劑量)。治療指數(shù)是治療與毒性作用劑量的比值且它可以表示為ED50/LD50之比值。優(yōu)選表現(xiàn)出較大治療指數(shù)的藥用組合物。
可以接受聯(lián)合治療或給予本發(fā)明的組合物的患者包括動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，特別是人類。動(dòng)物還包括飼養(yǎng)動(dòng)物，包括馬、牛、羊、家禽、魚(yú)、豬、貓、狗和動(dòng)物園動(dòng)物。
本發(fā)明的組合物，肝素寡糖級(jí)分，或硫酸皮膚素寡糖級(jí)分，可以通過(guò)任何使活性藥物與患者體內(nèi)的藥物作用位點(diǎn)產(chǎn)生接觸的途徑給藥。肝素和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分可以同時(shí)或按任何次序相繼，或在不同的時(shí)間點(diǎn)給藥，以產(chǎn)生所需作用。選擇本發(fā)明的組合物及治療的最佳作用的給藥方案在熟練的醫(yī)師或獸醫(yī)的能力范圍內(nèi)。這些組合物可以用口服劑型如片劑、膠囊(每一種都包括緩釋或定時(shí)釋放制劑)、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、混懸液、糖漿劑及乳劑給藥。它們還可以通過(guò)靜脈內(nèi)(大劑量注射或輸注)、腹腔內(nèi)、皮下或肌內(nèi)劑型給藥，所采用的所有劑型都是藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的組合物還可以采用合適的鼻內(nèi)媒介物的鼻內(nèi)劑型，或者通過(guò)透皮途徑，例如采用常規(guī)透皮貼劑以局部給藥。透皮釋藥系統(tǒng)的劑量給予是連續(xù)的而不是間歇性的全程給藥方案。
本發(fā)明包括提供協(xié)同作用或釋放協(xié)同作用有效量的硫酸皮膚素和肝素寡糖級(jí)分的聯(lián)合療法。適合用于本發(fā)明的藥用組合物包括在其中含有協(xié)同作用有效量的活性成分的組合物。而“協(xié)同作用”和“協(xié)同作用有效量”是指肝素寡糖級(jí)分和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分以足夠的劑量存在以達(dá)到大于各級(jí)分自身所能達(dá)到的效果的所需結(jié)果，例如，在治療血栓相關(guān)性心血管病癥時(shí)增強(qiáng)對(duì)凝血酶的抑制，如上文所述，例如，促進(jìn)結(jié)合于血塊的凝血酶失活，通過(guò)抗凝血酶催化Xa因子的滅活而增強(qiáng)對(duì)凝血酶生成的抑制作用等。
本發(fā)明之給藥方案將根據(jù)已知因素如特定藥物的藥效學(xué)特性及其給藥方式和途徑；患者的種屬、年齡、性別、健康狀況、醫(yī)療狀況、以及體重；癥狀的性質(zhì)和程度；并行的治療種類、治療次數(shù)、給藥途徑、患者的肝腎功能、以及所希望的療效而變化。具有常規(guī)技術(shù)的醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定預(yù)防、對(duì)抗，或終止病情發(fā)展所需的藥物有效劑量。
本發(fā)明的組合物或治療可以包括單位劑量的至少一種肝素寡糖級(jí)分和單位劑量的至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分?！皢挝粍┝俊笔侵改軌?qū)颊呓o藥的單元即單次劑量，所述單位劑量可易于處理和包裝，以保持在物理和化學(xué)上的穩(wěn)定的單位劑量，它包含活性成分本身或其與固體或液體藥用賦形劑、載體或媒介物的混合物。
通常，活性藥物，即，肝素寡糖級(jí)分和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分，可以以約每劑量2mg至每劑量1000mg的濃度范圍內(nèi)分別以藥用組合物存在(或用于本發(fā)明的治療中)，且更優(yōu)選在約每劑量5mg至每劑量500mg的濃度范圍內(nèi)。日劑量可以有較大變化，但通常以每天每劑量約20mg至每天每劑量約100mg的濃度范圍存在，更優(yōu)選在每天每劑量約40mg至每天每劑量約80mg的濃度范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的組合物或治療方法中肝素寡糖級(jí)分對(duì)硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的比例可以是1∶1至10∶1，優(yōu)選1∶1至8∶1，更優(yōu)選2∶1至6∶1，最優(yōu)選5∶1。
本發(fā)明的組合物或其級(jí)分通常包括根據(jù)擬用的給藥劑型選擇的合適的藥用稀釋劑、賦形劑、媒介物或載體，并與常規(guī)制藥慣例一致?？刹捎眠@些載體、媒介物等以提供協(xié)同作用有效量的活性級(jí)分，以抑制或預(yù)防患者的凝血酶活性或其生成。
合適的藥用稀釋劑、賦形劑、媒介物和載體描述于標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)，雷明頓氏藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack出版社。作為口服給藥的膠囊和片劑劑型之實(shí)例，活性成分可以與口服、無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的惰性載體如乳糖、淀粉、蔗糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、葡萄糖、硫酸鈣、磷酸鈣、甘露醇、山梨糖醇等混合。對(duì)于口服液體劑型，藥用成分可以與任何口服、無(wú)毒、藥學(xué)上可接受的隋性載體如乙醇、甘油、水等混合。合適的粘合劑(例如明膠、淀粉、玉米甜料、包括葡萄糖的天然糖；天然和合成樹(shù)膠，以及蠟質(zhì))，潤(rùn)滑劑(例如油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉和氯化鈉)，崩解劑(例如淀粉、甲基纖維素、瓊脂、皂土和黃原膠)，矯味劑，及著色劑也可以與這些組合物或其成分混合。
本發(fā)明組合物的腸道外給藥制劑可以包括水溶液、糖漿劑、水或油懸液以及采用食用油如棉籽油、椰子油或花生油的乳劑?？梢杂糜谒畱乙旱臄U(kuò)散或混懸劑包括合成或天然樹(shù)膠，如黃蓍膠、藻酸鹽、阿拉伯膠、右旋糖酐、羧甲基纖維素鈉、明膠、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。
腸道外給藥的組合物可包括無(wú)菌水或非水溶劑，如水、等滲生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖溶液，或其它常規(guī)用于治療活性藥物的腸道外給藥的溶劑。擬用于腸道外給藥的組合物還可以包括常規(guī)添加劑如穩(wěn)定劑、緩沖劑或防腐劑，例如抗氧化劑如甲基羥基苯甲酸酯或類似的添加劑。
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)，例如，細(xì)菌截留過(guò)濾器過(guò)濾、在組合物中添加滅菌劑、照射組合物，或加熱組合物滅菌。此外，本發(fā)明的級(jí)分可以作為無(wú)菌固體制劑如凍干粉末來(lái)提供，它可以在臨用前容易地溶解于無(wú)菌溶劑中。
除上述制劑外，組合物還可以配制為植入制劑。這些長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)植入(例如，皮下或肌肉內(nèi))或通過(guò)肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如，這些級(jí)分可以用合適的聚合物或疏水性物質(zhì)(例如，作為可接受的油乳劑)，或離子交換樹(shù)脂來(lái)配制，或者作為微溶性衍生物，例如，微溶性的鹽。
本發(fā)明的組合物及其成分可以包括可溶性聚合物作為靶向藥物載體。
藥用組合物制備后，可以將它們放入合適的容器并標(biāo)示所治療的適應(yīng)癥。對(duì)于本發(fā)明的組合物的用藥，這樣的標(biāo)鑒應(yīng)包括用量、次數(shù)、以及用藥方法。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的組合物與一種或一種以上的其它治療藥聯(lián)合使用的方法，它包括但不限于抗血小板藥或血小板抑制劑如阿司匹林、prioxicam、氯吡格雷、噻氯匹定，或糖蛋白IIb/IIIa受體拮抗劑，凝血酶抑制劑如boropeptide、水蛭素或阿加曲班；或溶栓藥或纖溶劑例如纖溶酶原激活物(如組織纖溶酶原激活物)，阿尼普酶，尿激酶，或鏈激酶；或它們的組合。
除用于治療上述心血管病癥的藥用組合物中外，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員容易理解其活性產(chǎn)物，可以用作體外揭示血液凝固機(jī)理的試劑。
通過(guò)特定實(shí)施例可以更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。為說(shuō)明的目的，給出下列實(shí)施例，而無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，可以改變或調(diào)整非關(guān)鍵性參數(shù)，以達(dá)到基本相同的結(jié)果。
實(shí)施例1表2總結(jié)了本發(fā)明所采用的幾個(gè)區(qū)段(lots)的肝素寡糖級(jí)分以及其它肝素級(jí)分(來(lái)源于Sigma的UFH和來(lái)源于Rhne-Poulenc Rorer的伊諾肝素)的特征。所列特征包括平均分子量、活性、抗-IIa活性、多分散性和Kd值。多分散性為Mw/Mn(平均分子量重量除以平均分子量數(shù)目)并通過(guò)肝素樣品的凝膠過(guò)濾峰分布積分表中的數(shù)據(jù)分析確定。通過(guò)以肝素樣品滴定AT或IIa時(shí)觀察測(cè)定熒光(280nm激發(fā)，340nm發(fā)射)的增加，將對(duì)肝素濃度I/I0的滴定曲線與結(jié)合等溫方程擬合，并且解出α(最大熒光變化值)、Kd(解離常數(shù))及n(與一摩爾配基結(jié)合所需的肝素摩爾數(shù))可獲得Kd值。獲得結(jié)合配基化學(xué)計(jì)量(l/n)并轉(zhuǎn)換成每種肝素級(jí)分中含五糖鏈的比例。
與肝素不同，所選肝素寡糖級(jí)分不能穩(wěn)定凝血酶與纖維蛋白的結(jié)合。在AT和HCII都存在的情況下添加纖維蛋白單體降低未分級(jí)分離的肝素對(duì)凝血酶的滅活率的研究證明了這一點(diǎn)。相反，在等摩爾濃度的肝素寡糖級(jí)分存在下纖維蛋白單體對(duì)AT或HCII的凝血酶抑制率僅有極小的抑制效果。進(jìn)一步的支持是在存在或不存在濃度范圍為0到7500nM的肝素寡糖級(jí)分或未分級(jí)分離的肝素下測(cè)定結(jié)合于纖維蛋白凝塊的125I標(biāo)記的凝血酶的量，得出所選肝素寡糖級(jí)分不增強(qiáng)凝血酶與纖維蛋白的結(jié)合。
實(shí)施例2肝素級(jí)分和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的抗血栓形成活性采用體外循環(huán)以比較肝素寡糖級(jí)分、硫酸皮膚素寡糖級(jí)分、以及肝素及硫酸皮膚素寡糖級(jí)分聯(lián)合使用的抗血栓形成活性。1999年Writz等詳細(xì)描述了這種循環(huán)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將不同濃度的被檢測(cè)化合物加入到摻有125I標(biāo)記的人纖維蛋白原并保持37C水浴的重新鈣化的人的全血中。蠕動(dòng)泵使血液循環(huán)于40μ血液過(guò)濾器中。通過(guò)環(huán)路中的壓力計(jì)測(cè)定的濾器鄰近處的壓力而確定濾器中的血液凝塊。從環(huán)路容器中取出系列血液樣品并計(jì)算剩余放射活性作為纖維蛋白原消耗及凝塊形成的指標(biāo)。此外，還測(cè)定起始激活的凝固時(shí)間。
兩項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)，開(kāi)放時(shí)間及凝固過(guò)程中消耗的纖維蛋白原百分率，被用于評(píng)價(jià)該模型檢測(cè)的化合物的效價(jià)。開(kāi)放期作為不能濾過(guò)的時(shí)間來(lái)測(cè)量。于90分鐘時(shí)停止該試驗(yàn)，由此確定開(kāi)放的最大時(shí)間。
用于研究的硫酸皮膚素級(jí)分(在實(shí)施例和表3中也稱為L(zhǎng)MWDS)具有下列特征Mp5000Da，Mw7600Da，而多分散性為1.4。由肝素酶衍生的肝素寡糖級(jí)分通過(guò)本文所述的肝素酶解聚作用獲得，且峰分子量為8000，抗IIa活性約為100IU/mg，抗Xa活性約為134IU/mg，而多分散性約為1.5。由一氧化氮產(chǎn)生的肝素寡糖級(jí)分通過(guò)PCT/CA98/00548所述之一氧化氮解聚法獲得，且其分子量為7700Da，抗IIa活性約為84IU/mg，抗Xa活性為123IU/mg，而多分散性為1.3。由高碘酸衍生的肝素寡糖級(jí)分通過(guò)PCT/EP98/03007(1998年12月10日公開(kāi)的WO98/55514)所述之高碘酸解聚法而獲得，且其峰分子量為7900Da，抗IIa活性為19IU/mg，抗Xa活性為43IU/mg，而多分散性為1.5。
由于它與包括約27個(gè)糖單位的鏈相符而選用峰分子量為約8000道爾頓的肝素級(jí)分。橋接凝血酶和抗凝血酶所需最小長(zhǎng)度為18個(gè)糖單位。由于這些級(jí)分中幾乎所有的鏈均由18個(gè)以上的糖單位組成，因此它們具有足夠的長(zhǎng)度以催化抗凝血酶對(duì)凝血酶的滅活作用。相反，這些級(jí)分太短而不能使凝血酶與纖維蛋白橋接，因?yàn)檫@種橋接反應(yīng)需要包括40或40個(gè)以上的糖單位的鏈(即，12000Da或更大)。所以，平均分子量為8000的肝素級(jí)分通過(guò)其激活抗凝血酶的能力而具有良好的抑制凝血酶的活性，并且能夠滅活結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶，因?yàn)樗鼈儾荒苁鼓笜蚪佑诶w維蛋白并使其抵抗經(jīng)肝素/抗凝血酶或肝素/HCII復(fù)合物的滅活。相反，伊諾肝素，一種平均分子量約為5000的商品化低分子量肝素(Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，PQ)包含的糖鏈大多數(shù)太短而不能橋接凝血酶和抗凝血酶，因此解釋了為什么它對(duì)凝血酶的抑制活性低于對(duì)Xa因子的抑制活性的原因。
如先前所述(Weitz JI等，Circulation 1999；99682-689)，將不同濃度的各種級(jí)分加入到摻有125I標(biāo)記的人纖維蛋白原并保持在37℃下水浴中的重新鈣化的人全血中。然后采用蠕動(dòng)泵使血液通過(guò)40μ血液過(guò)濾器循環(huán)。通過(guò)(a)用環(huán)路中的壓力計(jì)測(cè)量濾器鄰近處的壓力，以及(b)從容器中取出系列血液樣品并計(jì)算剩余放射活性作為纖維蛋白原消耗的指標(biāo)，來(lái)測(cè)定濾器中的血的凝固。起始的激活凝固時(shí)間也被測(cè)定。
如表3所示，在單獨(dú)使用時(shí)，需要250μg/ml濃度的硫酸皮膚素寡糖級(jí)分以保持濾器開(kāi)放并且使纖維蛋白原的消耗量降低到＜10％。這是值得注目的，因?yàn)樵缦鹊难芯繄?bào)道了未分級(jí)分離的硫酸皮膚素在這種循環(huán)中即使在4mg/ml的濃度下也是無(wú)效的(Weitz，等，Circulation，1999)。
低分子量硫酸皮膚素與肝素酶衍生的8000Da肝素級(jí)分或伊諾肝素的聯(lián)合使用也得到評(píng)價(jià)。當(dāng)與1μg/ml肝素酶衍生的8000Da肝素聯(lián)合使用時(shí)LMWDS在100μg/ml下有效，或與2μg/ml的這種肝素級(jí)分聯(lián)合使用時(shí)在50μg/ml下有效。相反，50μg/ml LMEDS在與3μg/ml的伊諾肝素聯(lián)合使用時(shí)無(wú)效，其濾器失效出現(xiàn)在80min時(shí)而纖維蛋白原消耗量為85％。這些結(jié)果表明肝素酶衍生的級(jí)分比伊諾肝素更有效。
當(dāng)LMWDS和肝素酶衍生的8000Da肝素級(jí)分聯(lián)合使用時(shí)，兩種藥物在分別比所述藥物單獨(dú)使用時(shí)保持開(kāi)放所需的劑量低5倍和10倍的劑量下有效(即，50比250μg/ml的LMWDS和1比10μg/ml肝素酶衍生的8000Da的級(jí)分)。
對(duì)LMWDS(50μg/ml)與肝素酶、亞硝酸及高碘酸衍生的肝素級(jí)分，以及伊諾肝素(全部為2μg/ml)的聯(lián)合使用進(jìn)行了比較。LMWDS與肝素酶或亞硝酸衍生的肝素級(jí)分聯(lián)合使用有效。另兩種聯(lián)合使用無(wú)效(見(jiàn)表4)。
為進(jìn)一步評(píng)價(jià)肝素酶衍生的級(jí)分和伊諾肝素，比較了這兩種藥物的重量分析等效劑量(表5)。即使在30μg/ml劑量下，伊諾肝素的藥效也低于10μg/ml的肝素酶衍生的級(jí)分。
實(shí)施例3纖維蛋白單體對(duì)肝素-和DS-催化的HCII抑制凝血酶的速率的比較在沒(méi)有或存在遞增濃度的DS或肝素下首先檢測(cè)可溶性纖維蛋白單體(其制備如先前所述(15))對(duì)HCII所抑制凝血酶的速率的影響。在沒(méi)有或存在3.3μM肝素或DS，或4μM SF，或兩者同時(shí)存在時(shí)在準(zhǔn)一級(jí)條件下檢測(cè)HCII抑制凝血酶的二級(jí)速率常數(shù)(K2)。在不同濃度的肝素或DS(0至11μM)、SF(0至4μM)、10mM GPRP-NH2及15mMTris-HCl(pH7.5)存在下，使凝血酶(10nM)在室溫下在含有0.6％PEG-8000的TBS中孵育5分鐘。將反應(yīng)混合物(10μl)等分量加入到96孔圓底微量滴定板中并以2秒至5分鐘范圍內(nèi)的時(shí)間間隔將等體積的HCII(其濃度至少比凝血酶高10倍)加入到每個(gè)孔中。加入含10mg/ml聚凝胺的200μl TBS中的200μM顯色底物(tGRP-pNA)終止所有反應(yīng)。在405nm下采用Spectra Max 340 Microplate Reader(微量滴定板讀出儀)(Molecular Divces，Menlo Park，CA)測(cè)定吸光度5分鐘而計(jì)算剩余凝血酶活性。將數(shù)據(jù)代入等式K1·t＝1n([P]0/[P]t)中，以測(cè)定凝血酶抑制的準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)(k1)，其中[P]0為起始凝血酶活性而[P]t為時(shí)間t時(shí)的凝血酶活性。然后以HCII濃度除K1確定其二級(jí)速率常數(shù)，k2(15)。如圖1(A圖)所示，在2或4μM濃度下，可溶性纖維蛋白(Fm)僅引起DS催化的HCII對(duì)凝血酶的抑制速率稍微下降3倍。相反，F(xiàn)m引起肝素催化的HCII對(duì)凝血酶的抑制速率呈劑量依賴性降低(B圖)。在1μM肝素和4μM Fm時(shí)，觀察到速率最大下降240倍，該數(shù)值與先前的報(bào)道一致(15)。
纖維蛋白單體對(duì)肝素及肝素酶衍生的級(jí)分通過(guò)抗凝血酶滅活凝血酶的速率的影響的比較采用類似的方法，比較在肝素或肝素酶衍生的8000Da的級(jí)分存在下纖維蛋白單體對(duì)抗凝血酶使凝血酶失活的速率的影響。如圖2所示，對(duì)于肝素，在4μM纖維蛋白單體存在下凝血酶失活速率降低約45倍。相反，對(duì)于肝素酶衍生的8000Da的級(jí)分，纖維蛋白單體僅使凝血酶失活速率降低10倍。
肝素、DS或肝素酶衍生的8000Da的級(jí)分對(duì)125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白結(jié)合的影響此前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝素促進(jìn)凝血酶與纖維蛋白的結(jié)合，無(wú)論肝素具有高還是低的AT親和力，該作用都發(fā)生，但僅當(dāng)肝素鏈為11200Da或更高時(shí)發(fā)生(18)。在本研究中，比較了DS和肝素對(duì)凝血酶與纖維蛋白結(jié)合的促進(jìn)能力。為完成該研究，按照所述(19)方法制備活性位點(diǎn)被阻斷的凝血酶(FPR-凝血酶)和125I-FPR-凝血酶。在沒(méi)有或存在肝素或DS下，在含有0.6％PEG-8000和0.01％吐溫-20的TBS中研究125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白凝塊的結(jié)合。將纖維蛋白原(7.5μM)在總體積40μl的一系列微沉淀試管(目錄號(hào)72.702，Sarstedt Inc.，St.Laurent，PQ)中與濃度遞增的肝素或DS(0至2.5μM)一起孵育。通過(guò)加入10μl含10mM氯化鈣、500nM125I-FPR-凝血酶及10μM凝血酶的貯備液A啟動(dòng)凝固。室溫下孵育45分鐘后，在15000xg下離心5分鐘使纖維蛋白沉淀，并取出等份上清液樣品進(jìn)行γ記數(shù)。計(jì)算結(jié)合于纖維蛋白的凝血酶比例，作為結(jié)合的125I-FPR-凝血酶的變化與沒(méi)有糖胺聚糖的對(duì)照組比較。如圖3所示，DS對(duì)125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白凝塊的結(jié)合沒(méi)有影響，即使在高達(dá)1μM的濃度下。相反，在高達(dá)250nM的濃度時(shí)，肝素以劑量依賴性方式促進(jìn)125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白凝塊的結(jié)合。當(dāng)肝素濃度高于250nM時(shí)，與凝塊結(jié)合的125I-FPR-凝血酶減少，可能反映了肝素-纖維蛋白及肝素-凝血酶數(shù)量的顯著聚集。當(dāng)用低分子量(LMW)肝素(伊諾肝素)滴定凝血酶和Fm-瓊脂糖時(shí)，與用DS所觀察到的相比，所發(fā)現(xiàn)的凝血酶的量?jī)H有少量增加。關(guān)于伊諾肝素的發(fā)現(xiàn)并不意外，因?yàn)樵摳嗡劓溙潭荒軜蚪幽负屠w維蛋白。
也對(duì)8000Da的肝素酶衍生的級(jí)分促進(jìn)凝血酶與纖維蛋白結(jié)合的能力與肝素進(jìn)行了比較。如圖4所示，肝素酶衍生的級(jí)分僅少量增加凝血酶的結(jié)合，而肝素則導(dǎo)致非常大的增加。這些發(fā)現(xiàn)表明類似于伊諾肝素，在肝素酶衍生的級(jí)分內(nèi)的鏈也太短而不足以橋接凝血酶和纖維蛋白。
通過(guò)HCII從Fm-瓊脂糖上置換IIa由于在DS存在下HCII對(duì)凝血酶抑制的催化作用不能被纖維蛋白修復(fù)，因此DS-HCII復(fù)合體必然能夠接近凝血酶上的外切位點(diǎn)I甚至通過(guò)該位點(diǎn)凝血酶結(jié)合于纖維蛋白。此發(fā)現(xiàn)提示DS-HCII復(fù)合體應(yīng)當(dāng)能夠從纖維蛋白上置換凝血酶。此項(xiàng)檢驗(yàn)是監(jiān)測(cè)在有或無(wú)DS的存在下濃度遞增的HCII從Fm-瓊脂糖上置換125I-FPR-凝血酶的量(圖5)。在最高可達(dá)生理濃度的三倍時(shí)，單用HCII從Fm-瓊脂糖上置換凝血酶的效力有限。當(dāng)存在2.5μM的DS時(shí)，發(fā)現(xiàn)凝血酶被劑量依賴性地置換。生理濃度的HCII達(dá)到最大置換，其半數(shù)最大作用是在約250nM HCII下。因此，在DS存在下，HCII的氨基端能夠有效地與纖維蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合凝血酶外切位點(diǎn)I。此發(fā)現(xiàn)表明DS/HCII復(fù)合體能夠從纖維蛋白上置換凝血酶，由此使其易于失活。
實(shí)施例4功效與失血研究兔動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型采用兔動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型(Green等，J.Lab Clin Med.127583-587，1996；Klement等，J.Lab Clin Med.132181-185，1998；Klement等，Blood.942735-2743)檢測(cè)本發(fā)明級(jí)分和組合物的功效和安全性。在該模型中，給兔注射被檢測(cè)的抗凝劑和少量125I纖維蛋白原。對(duì)照組動(dòng)物給予生理鹽水以代替抗凝劑。五分鐘后，將遠(yuǎn)端主動(dòng)脈經(jīng)氣壓式內(nèi)皮剝離器，一種用于減少血流的狹窄術(shù)(結(jié)扎狹窄)，且主動(dòng)脈壁被外部16號(hào)動(dòng)脈夾壓迫損傷。在沒(méi)有抗凝劑時(shí)，創(chuàng)傷性血管壁損傷以及血流減少聯(lián)合導(dǎo)致迅速凝血。采用放置于狹窄處之遠(yuǎn)端的超聲流量探針可以連續(xù)測(cè)量血流量而監(jiān)測(cè)凝血程度。該實(shí)驗(yàn)在注射抗凝劑后持續(xù)共90分鐘。其主要功效終點(diǎn)是血管在所觀察的共90分鐘的時(shí)間內(nèi)保持開(kāi)放的時(shí)間百分比。各種抗血栓形成藥的安全性可以在相同動(dòng)物中采用耳出血模型測(cè)定，此包括在兔耳部作5個(gè)全厚度切口并且測(cè)定在所觀察的30分鐘的時(shí)間段內(nèi)的累積失血量。這表示兩種動(dòng)物模型的合并(動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型和耳出血模型)，以使所需動(dòng)物數(shù)量減少50％。所設(shè)計(jì)的研究預(yù)防動(dòng)脈血栓形成的這種模型，模擬了臨床疾病如不穩(wěn)定性心絞痛或頸動(dòng)脈內(nèi)皮切除術(shù)后凝血。
肝素寡糖級(jí)分在兔動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型中比較了肝素寡糖級(jí)分(此處稱作“V21”)和未分級(jí)分離的肝素、LMWH、水蛭素，或?qū)φ丈睇}水的功效及安全性。在建立動(dòng)脈狹窄和損傷之前5分鐘給予被檢測(cè)化合物。藥效是測(cè)定90分鐘內(nèi)的血流(表示為開(kāi)放期％)，同時(shí)采用兔耳出血模型測(cè)定安全性。在沒(méi)有抗凝劑(SAL)以及在高劑量肝素(UFH)下觀察到迅速凝血。V21和水蛭素(HIR)在保持血管開(kāi)放方面遠(yuǎn)比LMWH更加有效。如圖7所示，V21在與最低失血量相關(guān)劑量下產(chǎn)生100％的開(kāi)放(底圖)，同時(shí)證明水蛭素在其藥效所需的劑量下有更大的出血傾向。
硫酸皮膚素寡糖級(jí)分在兔動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型和耳出血模型中檢測(cè)硫酸皮膚素寡糖級(jí)分(此處稱之為“H2403”)的功效。共20只兔被分為4個(gè)組。以表6指定的1mg/ml至10mg/ml濃度的H2403對(duì)兔給藥。
H2403使開(kāi)放期呈劑量依賴性地增加。對(duì)在2.5-10mg/kg之間的所有劑量的H2403均使開(kāi)放期在76-96％之間，但在1mg/kg劑量下僅為14％。H2403-123在2.5-10mg/kg劑量之間時(shí)，首次阻塞的平均時(shí)間為44-54分鐘，但在1mg/kg的劑量下僅為1分鐘。
與這些發(fā)現(xiàn)一致，H2403在2.5-10mg/kg之間的劑量時(shí)，主動(dòng)脈中的累計(jì)血流量為160-288ml/hr，但在1mg/kg劑量下則少于20ml/hr。從一只兔到另一只兔，其血流量和方式差異很大，因此標(biāo)準(zhǔn)差很大。然而，H2403劑量較低時(shí)，主動(dòng)脈血流量的減少趨勢(shì)可以容易地見(jiàn)于個(gè)體兔變化軌跡以及平均的變化軌跡。這些數(shù)據(jù)支持H2403在2.5mg/kg及更高劑量下出現(xiàn)開(kāi)放的一般性結(jié)論。
當(dāng)H2403劑量從5mg/kg降低至2.5mg/kg時(shí)可見(jiàn)栓塞血管壁放射活性少量增加(從參照值的15％至19％)，但當(dāng)H2403劑量降低到1mg/kg時(shí)則可見(jiàn)大幅度升高(達(dá)參照值的33％)。此數(shù)據(jù)也支持在該模型中2.5mg/kg及更高劑量的H2403顯著增加功效的一般性結(jié)論。
在相同兔中采用耳出血模型測(cè)定LMWDS的安全性。H2403給藥導(dǎo)致劑量依賴性的失血增加，而當(dāng)劑量高于2.5mg/kg時(shí)發(fā)生失血顯著增加(80μl及以上)。開(kāi)放及栓塞數(shù)據(jù)都提示LMWDS在劑量高于或等于2.5mg/kg時(shí)起效。
總之，基于開(kāi)放、阻塞時(shí)間、累計(jì)血流量及放射標(biāo)記的纖維蛋白原沉積量，通過(guò)所有參數(shù)的測(cè)定，在兔動(dòng)脈血栓形成模型中H2403在2.5mg/kg及更高的劑量下顯示其功效。然而，在大于2.5mg/kg的劑量下發(fā)生失血顯著增加。
V21和H2403-123聯(lián)合使用(矩陣研究)V2I+LMWDS制劑的安全性和功效都在兔動(dòng)脈血栓形成和預(yù)防模型中檢測(cè)。將100只雄性新西蘭兔分成各有5只兔的20個(gè)處理組(見(jiàn)表7)，并且每組在一次靜脈注射給予一個(gè)劑量的V-21/LMWDS制劑(劑量矩陣見(jiàn)表8)給藥后在90分鐘實(shí)驗(yàn)的剩余時(shí)間里連續(xù)滴注重復(fù)劑量。
V21和LMWDS組分的劑量反應(yīng)曲線與早先研究一致，而這些研究中的劑量范圍向下延伸。
V21的功效和安全性模式優(yōu)于LMWDS，并且在實(shí)驗(yàn)劑量下，V21和LMWDS均使出血的劑量反應(yīng)曲線壓低。
將LMWDS加入到V21中沒(méi)有顯著增加出血。
LMWDS對(duì)V21的加和或協(xié)同作用僅在其功效，而非出血。
同時(shí)檢測(cè)V21-LMWDS劑量組合下的凝塊重量、開(kāi)放時(shí)間及失血量以尋找最佳組合。發(fā)現(xiàn)下列比例的V21∶LMWDS是有用的1∶1，4∶1及5∶1。對(duì)5∶1的組合的功效和失血量進(jìn)行檢測(cè)。與單獨(dú)接受相同劑量的V21的兔相比，接受5∶1比例的V21∶LMWDS組合的兔中其功效更高(圖6A)，而失血沒(méi)有增加(圖6B)。
實(shí)施例5狒狒血栓形成模型進(jìn)行一項(xiàng)狒狒研究以檢測(cè)V21、LMWDS、以及這些藥物組合的效益與風(fēng)險(xiǎn)模式。該狒狒模型涉及測(cè)定在滌綸(Dacron)血管移植物放置于動(dòng)-靜脈旁路后的60分鐘的時(shí)間內(nèi)在移植物上的急性血栓形成(Hanson等，Arteriosclerosis 5595-603，1985)。
起初，所有動(dòng)物都有一個(gè)手術(shù)安放于股動(dòng)脈和靜脈之間的長(zhǎng)期外置的聚硅酮橡膠旁路。這些旁路不產(chǎn)生可檢測(cè)的血小板激活作用。為評(píng)價(jià)血栓形成，將中心鋪有滌綸移植物(2cm×4.0mm內(nèi)徑)的實(shí)驗(yàn)管段插入旁路系統(tǒng)并接觸血流1小時(shí)。其旁路管段為標(biāo)準(zhǔn)聚硅酮橡膠，內(nèi)徑為4.0mm，它為固有的非血栓形成性材料。通過(guò)放置于實(shí)驗(yàn)段遠(yuǎn)端的動(dòng)脈夾使血流保持在100ml/min并且采用超聲流量計(jì)連續(xù)測(cè)量。以1mCi-111-銦-8-羥基喹啉標(biāo)記狒狒自身血小板。平均標(biāo)記效率＞90％。采用γ閃爍相機(jī)(General Electric 400T)連續(xù)測(cè)量累積的111-In-標(biāo)記的血小板。以5分鐘的間隔儲(chǔ)存數(shù)據(jù)并采用連接于相機(jī)的計(jì)算機(jī)輔助的圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。以沉積的血小板放射活性(每分鐘的計(jì)數(shù))除以全血111-In-血小板活性(每分鐘的計(jì)數(shù)/ml)并乘以循環(huán)血小板計(jì)數(shù)(血小板數(shù)/ml)計(jì)算血小板沉積總數(shù)。
如下測(cè)定與血液接觸60分鐘后所形成的全部血栓中的纖維蛋白含量。在啟動(dòng)血栓形成前10分鐘，靜脈注射5μCi的125-I-標(biāo)記的同源狒狒纖維蛋白原。與血液接觸1小時(shí)后，用等滲生理鹽水徹底漂洗血栓形成性滌綸移植物。由于111-In和125-I發(fā)射譜之間相重疊，在采用γ計(jì)數(shù)器對(duì)血栓的125-I放射活性計(jì)數(shù)之前至少需要30天以使111-In衰竭(半衰期＝2.8天)。然后將各實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的沉積125-I-放射活性(每分鐘的計(jì)數(shù))除以可凝固的纖維蛋白原放射活性(每分鐘的計(jì)數(shù)/ml)并且乘以循環(huán)纖維蛋白原濃度(mg/ml)計(jì)算出累積的纖維蛋白總量。
如Hanson等，Arteriosclerosis 5595-603，(1985)所述，通過(guò)直接測(cè)量出血時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)安全性。
在6只未處理動(dòng)物中進(jìn)行平行對(duì)照研究。如上所述評(píng)定滌綸移植物上形成的血栓，并在移植物臨放前，以及移植物放置1小時(shí)后測(cè)量凝血時(shí)間(APTT、PT)、Xa因子活性(Spectrozyme assay；AmericanDiagnostica)、以及出血時(shí)間(BT)。此外，取0.5ml檸檬酸化的狒狒血漿(在各時(shí)間點(diǎn))以測(cè)定凝血酶時(shí)間。
V21及LMWDS的研究首先研究V21，起始總劑量為0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg(其總劑量的50％一次性大劑量(bolus)給予而余下的連續(xù)輸液65分鐘給予)。大劑量給藥5分鐘后，放入滌綸移植物并對(duì)血小板進(jìn)行圖象處理另外60分鐘，其后，撤去移植物并終止研究。
以相同的方式研究LMWDS，從2mg/kg、5mg/kg及10mg/kg劑量開(kāi)始。在2mg/kg的劑量下，將總劑量的50％為一次性大劑量給予而余下的連續(xù)輸液65分鐘給予。隨后調(diào)整一次性大劑量給予和輸液給予的LMWDS的相對(duì)比例以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的凝血時(shí)間。因此，在兩只狒狒中5mg/kg劑量下的一次性大劑量給藥/輸液給藥量的比例為50％/50％和33％/67％。在10mg/kg劑量下，所述比例為20-25％的一次性大劑量給藥對(duì)75-80的輸液給藥，此種輸液在60分鐘的輸液時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生恒定的APTT值。
隨后，以0.5mg/kg V21+0.5mg/kg LMWDS、1mg/kg V21+1mg/kgLMWDS、2mg/kg V21+5mg/kg LMWDS及2mg/kg V21+10mg/kgLMWDS的劑量聯(lián)合給予V21和LMWDS(其中50％的V21和20％的LMWDS的劑量為一次性大劑量注射給予，而剩余量則連續(xù)輸液65分鐘給藥)。這種給藥方案在60分鐘的輸液過(guò)程中產(chǎn)生幾乎恒定的APTT值。血小板血栓成像、出血時(shí)間及實(shí)驗(yàn)室測(cè)定也如本文所述進(jìn)行。
采用Student t-檢驗(yàn)(雙尾)比較接觸血液60分鐘后(或在任何較早的時(shí)間點(diǎn))測(cè)量的血小板血栓形成的結(jié)果。
結(jié)果V21對(duì)滌綸移植物血栓形成的作用見(jiàn)圖8所示。0.5mg/kg的低劑量的V21，不能使血小板沉積量降低到低于對(duì)照值，它在接觸血液60分鐘后平均為2.96±0.85×109個(gè)血小板。1mg/kg的中等劑量在60分鐘時(shí)使血小板沉積量降低24％，而2mg/kg的高劑量使血小板沉積量降低57％(圖8)。
V21使纖維蛋白以劑量依賴方式減少。在最高劑量下，總纖維蛋白的累積量減少59％(對(duì)照組為2.54±0.37mg，而2mg/kg處理組為1.05±0.52mg)。V21在2mg/kg劑量下還以劑量依賴性方式延長(zhǎng)APTT至＞200秒。PT的測(cè)定大多未受影響。V21沒(méi)有使出血時(shí)間顯著增加，在2mg/kg的研究組中平均僅為5.1分鐘。應(yīng)當(dāng)注意的是在0.5mg/kg組中記錄到一只動(dòng)物的出血時(shí)間為12分鐘；然而，根據(jù)該組及其它劑量組的其它發(fā)現(xiàn)考慮，該結(jié)果被認(rèn)為是假象。
LMWDS對(duì)滌綸移植物血栓形成的作用見(jiàn)圖9所示。在2-10mg/kg范圍內(nèi)，血小板沉積量都沒(méi)有降低。類似地，LMWDS不能減少在滌綸移植物上的纖維蛋白形成，或延長(zhǎng)出血時(shí)間。LMWDS使APTT凝血時(shí)間延長(zhǎng)，在10mg/kg劑量下約為兩倍(平均值60分鐘內(nèi)的59.1秒，對(duì)Pre的28.7秒)，PT凝血時(shí)間不受影響。
圖10給出了V21和LMWDS聯(lián)合使用時(shí)，在滌綸移植物處血栓形成的結(jié)果。與2mg/kg V21聯(lián)合使用時(shí)，兩只狒狒被輸入10mg/kg的LMWDS而另一只狒狒接受了5mg/kg的LMWDS。在2mg/kgV21+(5-10mg/kg)LMWDS劑量下發(fā)現(xiàn)血小板沉積量顯著減少；然而，此作用可以與相同劑量下的V21單獨(dú)使用所產(chǎn)生的作用相比較(見(jiàn)圖8和10)。類似地，聯(lián)合治療所見(jiàn)的纖維蛋白沉積減少可以與V21單獨(dú)使用所產(chǎn)生的作用相比較。大部分出血時(shí)間不受影響。同時(shí)大部分PT值不受影響(在高劑量下PT延長(zhǎng)2秒鐘)，APTT值平均＞500秒(而2mg/kg的V21單獨(dú)使用時(shí)平均為269秒)。
這些研究中所采用的狒狒模型是一種快速血流(它促進(jìn)血小板的快速轉(zhuǎn)運(yùn)及利用)與提供強(qiáng)烈起始刺激的較強(qiáng)的血栓形成表面(滌綸移植物)的組合。在這些條件下，纖維蛋白形成不是廣泛的且抗凝劑(例如，標(biāo)準(zhǔn)肝素、五糖、標(biāo)準(zhǔn)硫酸皮膚素)一般無(wú)效。但是，在這種模型中V21不減少動(dòng)脈血小板并且在不延長(zhǎng)出血時(shí)間下使纖維蛋白血栓形成減少＞50％。
表1
表2肝素寡糖級(jí)分與肝素及LMWH的特征比較
表3低分子量硫酸皮膚素(LMWDS)單獨(dú)使用或與8.0Kda肝素酶級(jí)分或伊諾肝素聯(lián)合使用在體外循環(huán)中的抗血栓形成活性LMWDS 肝素酶伊諾肝素 不能濾過(guò)纖維蛋白起始ACT時(shí)間 原消耗量μg/mlμg/mlμg/ml min ％ sec250 ----＞90 9 349220 ----＞90 15336200 ---- 65 82342100 1 --＞90 9 32080 1 --＞90 1331660 1 -- 70 8127350 2 --＞90 7 30850 1 -- 45 8529625 3 -- 85 6233925 2 -- 75 7228850 --3 80 85294表4LMWDS(50μg/ml)與2μg/ml的肝素酶、亞硝酸或高碘酸產(chǎn)生的級(jí)分或與2μg/ml伊諾肝素聯(lián)合使用在體外循環(huán)中的抗血栓形成活性制劑不能濾過(guò) 纖維蛋白原 起始時(shí)間 消耗量 ACTmin ％ secLMWDS和肝素酶8450＞9011.2292LMWDS和亞硝酸7700＞9016.6299LMWDS和高碘酸1010045 85.4256LMWDS和伊諾肝素 85 80.5260
表5伊諾肝素和肝素酶衍生的級(jí)分在體外循環(huán)中的抗血栓形成活性比較藥物 劑量不能濾過(guò)纖維蛋白原時(shí)間 消耗μg/ml min ％伊諾肝素 1025 822070 6530 ＞90 33肝素酶(8450Da) 10 ＞90 11表6處理組組別 H2403 H2403 動(dòng)物數(shù)一次性大劑量靜注 靜脈輸液1 10mg/kg 10mg/kg 52 5mg/kg 5mg/kg53 2.5mg/kg 2.5mg/kg 54 1mg/kg 1mg/kg5
表7處理組
表8劑量矩陣
本發(fā)明之范圍不受本說(shuō)明書(shū)描述的具體實(shí)施方案的限制，因?yàn)檫@些實(shí)施方案的目的是僅對(duì)本發(fā)明的某一方面作單一性的描述，而且所有功能等價(jià)的實(shí)施方案均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠從前文描述及附圖中弄清在本說(shuō)明書(shū)所示及所述之外的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的各種修飾。這些修飾將被包括在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本說(shuō)明書(shū)所參考的所有出版物、專利及專利申請(qǐng)均以其全文通過(guò)參考結(jié)合到本文中，如同具體和單獨(dú)指定的每件獨(dú)立的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)均以其全文通過(guò)參考結(jié)合到本文中一樣。本說(shuō)明書(shū)引用的任何參考文獻(xiàn)均不表示所述參考文獻(xiàn)是可作為本發(fā)明的先有技術(shù)而加以利用的。
指出在用于本說(shuō)明書(shū)以及所附的權(quán)利要求時(shí)，單數(shù)形式“一(a，an)”和“該(the)”包括相關(guān)的復(fù)數(shù)，除非上下文中另有清楚說(shuō)明。
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權(quán)利要求
1.一種用作藥物的組合物，它包括(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分和(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的組合。
2.權(quán)利要求1所要求的組合物，其中肝素寡糖級(jí)分包括衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七項(xiàng)或更多項(xiàng)特征(a)具有與抗凝血酶及肝素輔因子II(HCII)-相關(guān)的體外抗凝血活性；(b)所述寡糖由于太短而不能將凝血酶與纖維蛋白橋接，但具有足夠的長(zhǎng)度使抗凝血酶或HCII與凝血酶橋接；(c)具有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的含有一個(gè)或多個(gè)五糖序列的寡糖；(d)富含具有分子量范圍約6000至約12000，6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)所述寡糖具有約7000至10000，7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道爾頓的分子量；(h)多分散性為1.1-1.8；和(i)具有類似的抗Xa因子和抗IIa因子活性。
3.權(quán)利要求2所要求的組合物，其中肝素寡糖級(jí)分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
4.權(quán)利要求2所要求的組合物，其中肝素寡糖級(jí)分具有一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的下列特征(a)富含具有分子量范圍為6000至10000道爾頓，而均值為約8500的寡糖；(b)白色至黃白色的結(jié)晶固體；(c)在室溫下穩(wěn)定；及(d)多分散性為約1.2至1.5。
5.權(quán)利要求2、3或4所要求的組合物，其中硫酸皮膚素寡糖級(jí)分具有一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的下列特征(a)硫含量為6.0％至10％(w/w)，優(yōu)選6.0％至8.0％(w/w)，更優(yōu)選6.5％至8％(w/w)；(b)硫酸根/羧基比例為1.2至2.5，優(yōu)選1.2至2.0，更優(yōu)選1.3至1.8，最優(yōu)選1.3-1.6；(c)焦硫酸化二糖含量為20％至60％(w/w)，優(yōu)選單硫酸化二糖含量為30％至60％(w/w)；(d)肝素輔因子II介導(dǎo)的抗凝血酶活性在20-60IU/mg，優(yōu)選30-60IU/mg范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求2、3或4所要求的組合物，其中硫酸皮膚素寡糖級(jí)分具有一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的下列特征(a)富含具有分子量在5000至8000道爾頓范圍內(nèi)的寡糖；(b)白色至黃白色的結(jié)晶固體；(c)在室溫下穩(wěn)定；及(d)磺化大于6.2％重量。
7.權(quán)利要求2、3或4所要求的組合物，其中硫酸皮膚素寡糖級(jí)分包含具有90％或90％以上的分子量范圍在約1600至約20000道爾頓之間且峰分子量為約4500至約8000道爾頓的皮膚素聚合鏈的混合物。
8.權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)所要求的組合物，其中(a)和(b)的量在預(yù)防或抑制凝血酶生成或活性方面有效產(chǎn)生協(xié)同作用。
9.權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)所要求的組合物，其中肝素寡糖級(jí)分和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的劑量比每種級(jí)分預(yù)防或抑制患者凝血酶生成或活性的所需劑量低至少5至10倍。
10.一種藥用組合物，它含有協(xié)同作用有效量的在藥學(xué)上可接受的載體中的至少一種肝素寡糖級(jí)分和至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的組合。
11.權(quán)利要求10所要求的藥用組合物，其中藥學(xué)上可接受的載體適合于提供協(xié)同作用有效量的所述級(jí)分以抑制或預(yù)防患者的凝血酶生成或活性。
12.一種預(yù)防或抑制患者凝血酶生成或活性的聯(lián)合治療，它包括給予患者有效量的(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分；和(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分。
13.權(quán)利要求12所要求的聯(lián)合治療，其中該方法提供協(xié)同作用。
14.權(quán)利要求12或13所要求的聯(lián)合治療，其中肝素寡糖級(jí)分和硫酸皮膚素寡糖級(jí)分是同時(shí)給予或分別給予。
15.權(quán)利要求12、13或14所要求的聯(lián)合治療，其中肝素寡糖級(jí)分包括衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七項(xiàng)或更多項(xiàng)特征(a)具有與抗凝血酶及肝素輔因子II(HCII)-相關(guān)的體外抗凝血活性；(b)所述寡糖由于太短而不能將凝血酶與纖維蛋白橋接，但具有足夠的長(zhǎng)度使抗凝血酶或HCII與凝血酶橋接；(c)具有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的含有一個(gè)或多個(gè)五糖序列的寡糖；(d)富含具有分子量范圍約6000至約12000，6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)所述寡糖具有約7000至10000，7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道爾頓的分子量；(h)多分散性為1.1-1.8；和(i)具有類似的抗Xa因子和抗IIa因子活性。
16.權(quán)利要求15所要求的聯(lián)合治療，其中肝素寡糖級(jí)分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
17.權(quán)利要求12至16之任何一項(xiàng)所要求的聯(lián)合治療，其中硫酸皮膚素寡糖級(jí)分具有下列一項(xiàng)或一項(xiàng)以上的特征(a)硫含量為6.0％至10％(w/w)，優(yōu)選6.0％至8.0％(w/w)，更優(yōu)選6.5％至8％(w/w)；(b)硫酸根/羧基比例為1.2至2.5，優(yōu)選1.2至2.0，更優(yōu)選1.3至1.8，最優(yōu)選1.3-1.6；(c)焦硫酸化二糖含量為20％至60％(w/w)，優(yōu)選單硫酸化二糖含量為30％至60％(w/w)；(d)抗凝血酶活性在20-60IU/mg，優(yōu)選30-60IU/mg范圍內(nèi)。
18.權(quán)利要求12至16中任何一項(xiàng)所要求的聯(lián)合治療，其中硫酸皮膚素寡糖級(jí)分包含具有90％或90％以上的分子量范圍在約1600至約20000道爾頓之間且峰分子量為約4500至約8000道爾頓的皮膚素聚合鏈的混合物。
19.一種在患者中抑制或預(yù)防凝血酶生成或活性的方法，它包括對(duì)有這種需要的患者聯(lián)合給予協(xié)同作用有效量的至少一種肝素寡糖級(jí)分和至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分。
20.上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所要求的組合物或聯(lián)合治療在預(yù)防和/或緩解與過(guò)量凝血酶生成或活性有關(guān)的疾病嚴(yán)重性、疾病癥狀和/或疾病復(fù)發(fā)周期中的用途。
21.包括(a)至少一種肝素寡糖級(jí)分及(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分的組合的組合物在用于預(yù)防或抑制凝血酶生成或活性的藥物制備中的用途。
22.協(xié)同作用有效量的至少一種肝素寡糖級(jí)分及至少一種硫酸皮膚素寡糖級(jí)分在用于抑制或預(yù)防患者凝血酶生成或活性的藥用組合物的制備中的用途。
23.一種藥劑盒形式的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所要求的組合物。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及預(yù)防或抑制凝血酶生成或活性的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61P7/02GK1473061SQ01818447
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者J·希爾斯, K·約翰森, J·I·維茨, J 希爾斯, 維茨, 采 申請(qǐng)人:漢密爾頓市醫(yī)院研究發(fā)展有限公司, 利奧藥品股份有限公司