專利名稱：用于靶向運(yùn)送治療癌癥的藥物的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物運(yùn)送，藥理學(xué)和癌癥化療領(lǐng)域。
大多數(shù)用于癌癥化療的細(xì)胞毒藥物化療用途窄并且在高劑量時(shí)有嚴(yán)重的副作用。因此，開(kāi)發(fā)了藥物運(yùn)送系統(tǒng)以改變細(xì)胞毒藥物的生物分布，改進(jìn)其對(duì)腫瘤的選擇性或減輕其對(duì)正常組織的損傷。在這方面，脂質(zhì)體得到了廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)體作為藥物運(yùn)送系統(tǒng)提供了一種改進(jìn)傳統(tǒng)藥物治療用途的方式[7，19]。由于許多脂質(zhì)體被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞吞噬[12，20]，脂質(zhì)體在運(yùn)送指向RES系統(tǒng)的器官的藥物中有效。但是，脂質(zhì)體在血液中的快速清除也限制了其在RES位點(diǎn)以外的疾病的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
最近當(dāng)用聚乙二醇首基穩(wěn)定脂質(zhì)體時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體在血液中循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)和減少RES對(duì)脂質(zhì)體的吞噬[12，21]。循環(huán)效價(jià)的增加使增加抗癌活性稱為可能[7]。另一種方式是將脂質(zhì)體和與腫瘤細(xì)胞特異的抗體偶聯(lián)，以修飾脂質(zhì)體獲得對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向活性[11，22]?？贵w包囊的脂質(zhì)體的一個(gè)潛在的問(wèn)題是其免疫原性可能更強(qiáng)，使循環(huán)半壽期更短。很明顯，在設(shè)計(jì)脂質(zhì)體藥物運(yùn)送系統(tǒng)時(shí)，需要多方面的考慮。
因此，需要提供組織特異性，特別是惡性肝組織的藥物運(yùn)送的組合物和方法。本發(fā)明滿足這些需求并提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還提供了向表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體的組織靶向運(yùn)送治療藥劑的方法，具體方法是向該組織運(yùn)送有效量的含有效量的包囊化于脂質(zhì)體中的藥劑的組合物，其中脂質(zhì)體是和脫唾液酸化的糖蛋白例如脫唾液酸化的糖蛋白α1相偶聯(lián)的。
本發(fā)明還提供了通過(guò)給有需求的主體施用此類(lèi)治療有效量的含有阿霉素的組合物抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其中阿霉素被包囊化于和脫唾液酸化的糖蛋白α1相偶聯(lián)的脂質(zhì)體中。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種靶向肝臟的用脂質(zhì)體包囊化的治療藥劑的運(yùn)送系統(tǒng)以用于治療癌癥。特別是，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供脂質(zhì)體化的阿霉素以用于癌癥化療。
本發(fā)明的一個(gè)目的是減輕與使用游離阿霉素治療肝癌相關(guān)的心臟毒性。
本發(fā)明的一個(gè)目的是增強(qiáng)傳統(tǒng)癌癥治療方法的抗腫瘤活性，包括改進(jìn)藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在體內(nèi)施用時(shí)免疫原性最低的組合物和方法。
可以通過(guò)向表達(dá)脫唾液酸化糖蛋白受體的提供用于組織靶向運(yùn)送含有治療藥劑的組合物而實(shí)現(xiàn)上述的目的。該組合物含有有效量的包囊化于脂質(zhì)體中的藥劑，其中脂質(zhì)體是和脫唾液酸化的糖蛋白如脫唾液酸化糖蛋白α1相偶聯(lián)的。
本發(fā)明還提供了向表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體的組織靶向運(yùn)送治療藥物的方法，具體方法是向組織中運(yùn)送有效量的含有有效量的被包囊化于脂質(zhì)體中的藥劑的組合物，其中脂質(zhì)體和脫唾液酸化的糖蛋白如糖蛋白α1相偶聯(lián)。
本發(fā)明還提供了通過(guò)向有需要的主體施用治療有效量的含有阿霉素的組合物來(lái)抑制肝癌的增殖的方法，其中阿霉素被包囊化于和脫唾液酸化的糖蛋白α1偶聯(lián)的脂質(zhì)體中。
圖2示肝癌細(xì)胞對(duì)Dox的攝取。HePG2細(xì)胞用20μM等量的D，DL，DLG在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)后，去掉培養(yǎng)基收獲細(xì)胞。用FACSort流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞樣品的Dox含量(FL2高度)。
圖3示Dox在裸鼠中的組織分布。裸鼠靜脈注射1mg/kg等量的D，DL或DLG。對(duì)照組注射鹽水。注射2小時(shí)后殺死小鼠。取下器官，稱重和勻漿。用熒光測(cè)定法測(cè)定勻漿液中Dox的濃度(λex＝480nm，λem＝580nm)。每個(gè)柱代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝4)。
圖4示Dox對(duì)裸鼠腫瘤體積的影響。在第0天對(duì)裸鼠皮下接種4×106HepG2細(xì)胞。第2天，對(duì)每組中的5只小鼠靜脈注射1mg/kg等量的D，DL或DLG。對(duì)照組注射鹽水。每隔一天注射一次。每周測(cè)定一次腫瘤大小，用公式0.52×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算腫瘤體積。每個(gè)點(diǎn)代表一組5只小鼠的平均值。
圖5示Dox對(duì)裸鼠腫瘤重量的影響。在第0天對(duì)裸鼠皮下接種4×106HepG2細(xì)胞。第2天，對(duì)每組中的5只小鼠靜脈注射1mg/kg等量的D，DL或DLG。對(duì)照組注射鹽水。每隔一天注射一次。第35天殺死所有小鼠。取腫瘤并稱重。每個(gè)柱代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝5)。*p＜0.05，與對(duì)照相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(Student t檢驗(yàn))。
圖6示Dox對(duì)心肌損傷的影響。在第0天對(duì)裸鼠皮下接種4×106HepG2細(xì)胞。第2天，對(duì)每組中的4只小鼠靜脈注射1mg/kg等量的D或DLG。對(duì)照組注射鹽水。每隔一天注射一次。第35天乙醚麻醉小鼠心臟穿刺得到肝素化血樣。使用Sigma的試劑盒，通過(guò)測(cè)定血漿乳酸脫氫酶(LDH)的活性測(cè)定心肌損傷。
圖7示Dox對(duì)心肌結(jié)構(gòu)的影響。在第0天對(duì)裸鼠皮下接種4×106HepG2細(xì)胞。第2天，對(duì)每組中的5只小鼠靜脈注射1mg/kg等量的D或DLG。對(duì)照組注射鹽水。每隔一天注射一次。第35天殺死所有小鼠。小心取心臟并立即固定在布安氏固定液中。心臟切片并用HE染色。用光學(xué)顯微鏡觀察切片并照相。A-對(duì)照；B-D處理；C-DLG處理。
實(shí)施發(fā)明的方式除非特別指明，本發(fā)明的實(shí)際操作中使用了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)，這些都是本領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的描述。如，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”，第二版(Sambrook等.，1989)；″寡核苷酸合成”(M.J.Gait，ed.，1984)；″動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)″(R.I.Freshney，ed.，1987)；“酶學(xué)方法”叢書(shū)(Academic Press，Inc.)；″免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(D.M.Weir&C.C.Blackwell，eds.)；″哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體”(J.M.Miller&M.P.Calos，eds.，1987)；″現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”(F.M.，Ausubel et al.，eds.，1987，和定期更新)；“PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(Mullis et al.，eds.，1994)；″現(xiàn)代免疫學(xué)方法”(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)。定義在本文中，一些術(shù)語(yǔ)的含義如下。
在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，單數(shù)形式的“一(a)″，″一個(gè)(an)″和“這個(gè)(the)”也指復(fù)數(shù)的含義，除非在上下文中有特別的指明。例如，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“包括”指所述的組合物和方法包括所引用的成分，但不排除其它。當(dāng)用于定義組合物和方法時(shí)，“基本上由...組成”指排除其它的對(duì)組合物必需的成分。因此，本文中所定義的基本上由...所組成的組合物不排除在分離和純化中的痕量雜質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體，如磷酸緩沖鹽溶液，防腐劑等?！坝?..組成”應(yīng)該指排除不僅僅是痕量成分的其它成分和排除施用本發(fā)明的方法必要步驟。限定這些過(guò)渡術(shù)語(yǔ)的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
“主體”或“宿主”是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選大鼠，小鼠，猴子，猿或人類(lèi)病人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于，鼠，病人，家畜，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”，“贅生物”和“腫瘤”，無(wú)論單數(shù)或復(fù)數(shù)都可以互換使用，都是指惡性轉(zhuǎn)化的使宿主生物體致病的細(xì)胞。原發(fā)癌細(xì)胞(即在惡性轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近得到的細(xì)胞)可以通過(guò)已知的技術(shù)，特別是組織學(xué)檢驗(yàn)與非癌癥細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。這包括轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，體外培養(yǎng)物和來(lái)源于癌細(xì)胞的細(xì)胞系。本發(fā)明中所定義的癌細(xì)胞不僅僅包括原發(fā)癌細(xì)胞，還包括任何的從癌細(xì)胞先祖細(xì)胞衍生而來(lái)的細(xì)胞。當(dāng)說(shuō)到通常是實(shí)體瘤時(shí)，“臨床上可檢測(cè)的”腫瘤指在腫瘤質(zhì)量上可以檢測(cè)；例如CAT掃描，磁共振成象(MRI)，X-射線，超聲或捫診。單獨(dú)的生物化學(xué)或免疫學(xué)證據(jù)不足以滿足該定義。
在本文中，“抑制”指延遲或減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖或細(xì)胞分裂。
“組合物”指活性藥物和其他惰性(可以檢測(cè)或標(biāo)記的)或活性的化合物或組分如佐劑的組合。
“藥物組合物”指活性藥物和惰性或活性的載體的組合，使其適于離體，體內(nèi)或體外的診斷或治療用途。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”包括了任何的標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，如磷酸緩沖鹽溶液，水和乳劑如油包水或水包油乳劑，和各種濕潤(rùn)劑。該組合物還包括穩(wěn)定劑和防腐劑。載體，穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例可以參見(jiàn)Martin Remington’s Pharm.Sci.，15th Ed.(MackPubl.Co.，Easton(1975))。
“有效量的”指對(duì)實(shí)現(xiàn)有益或期望結(jié)果來(lái)說(shuō)足夠的量。例如，治療量實(shí)現(xiàn)了期望的治療效果。該量和防止疾病或疾病癥狀發(fā)展的預(yù)防有效量可以相同或不同。有效量可以通過(guò)一或多次給藥，施用或劑量給藥。
阿霉素(Dox)是來(lái)源于真菌波賽鏈霉菌(Streptomycespeucetius)的恩霉素(anthracycline)抗生素[1]。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)阿霉素對(duì)多種人類(lèi)惡性腫瘤，包括急性白血病，乳腺癌和何杰金氏病有效。阿霉素通過(guò)酶促還原發(fā)揮其抗腫瘤作用，例如NADPH細(xì)胞色素P450還原酶產(chǎn)生活性醌中間體以抑制線粒體氧化磷酸化作用[2，3]，DNA修復(fù)酶類(lèi)[4]和拓?fù)洚悩?gòu)酶I[5]。在產(chǎn)氧多(well-oxygenated)的組織如心臟，醌中間體進(jìn)入氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生高活性的自由基，其中自由基可引起對(duì)附近和較遠(yuǎn)的生物分子的氧化損傷。阿霉素治療的主要障礙是心臟毒性，其形式是可引起充血性心臟衰竭的心肌病[6]。
本發(fā)明提供了用于向表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體靶向運(yùn)送治療藥劑的組合物。該組合物包括有效量的包囊化于脂質(zhì)體內(nèi)的藥劑，其中脂質(zhì)體和脫唾液酸糖蛋白如脫唾液酸化糖蛋白α1相偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥物是藥物或多核苷酸，例如編碼治療蛋白的cDNA，核酶和反義DNA或細(xì)胞毒性藥物或蛋白質(zhì)。當(dāng)治療劑是cDNA時(shí)，優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域中所熟知的技術(shù)將陽(yáng)離子脂類(lèi)如1，2，二油酰基-3-三甲基丙銨(″DOTPA″)摻入到脂質(zhì)體中。細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于阿霉素，長(zhǎng)春新堿，柔紅霉素和雙親胺類(lèi)[23，24]。在一方面，可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法用親和素-生物素或硫醇-馬來(lái)酰胺[27，28]鍵連的方法與脫唾液酸化糖蛋白α1項(xiàng)偶聯(lián)。
本發(fā)明還提供了通過(guò)向組織中運(yùn)送有效量的本發(fā)明的組合物從而向表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體的組織靶向運(yùn)送治療藥劑的方法。該方法可以離體，體外或體內(nèi)施行。當(dāng)離體施行使，該方法提供了簡(jiǎn)單的分析或篩選以確定藥物運(yùn)送的有效性或治療劑以實(shí)現(xiàn)所期望的治療或預(yù)防效果。該細(xì)胞可以從生物活檢或培養(yǎng)的細(xì)胞系分離和培養(yǎng)。該方法還可以進(jìn)一步修改以便被包括在高通量篩選中。
在動(dòng)物如大鼠或小鼠中體內(nèi)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供了常規(guī)的動(dòng)物模型系統(tǒng)，該模型系統(tǒng)可以在治療劑的臨床檢驗(yàn)之前使用。
當(dāng)在體內(nèi)施行時(shí)，給動(dòng)物使用有效量的組合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“施用”或“運(yùn)送”在體內(nèi)和離體(如果靶細(xì)胞群被回輸給同一(自體)或不同的病人(異體))指給受體提供有效量的組合物以達(dá)到所需的目的。在這種情況下，組合物可以和藥學(xué)上可以接受的載體一起施用。通過(guò)常規(guī)方法如將活性成分放于藥物組分中，本發(fā)明的組合物能用于制備藥物和用于治療人和其他動(dòng)物。
施用藥物組合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括但不限于顯微注射，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。本發(fā)明的組合物可以用于靜脈內(nèi)，皮下或肌內(nèi)給藥。在整個(gè)治療過(guò)程中，可以連續(xù)給藥或間歇給藥。確定最有效的給藥方式和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并根據(jù)治療藥物，治療目的和治療的對(duì)象的不同而不同。主治醫(yī)生可以根據(jù)所選的劑量水平和類(lèi)型進(jìn)行單次或多次給藥。
該組合物還可以給藥于懷疑或可能患病的主體或個(gè)體。在該實(shí)施方案中，給藥“預(yù)防有效量的”組合物以保持穩(wěn)態(tài)。
體內(nèi)或離體，本方法還提供了將治療劑運(yùn)送給靶細(xì)胞或組織的方式。例如，通過(guò)給有需要的受試者施用有效量的含阿霉素的組合物，該方法可以用于抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其中阿霉素被包囊化于含與脫唾液酸化的糖蛋白α1相偶聯(lián)的脂質(zhì)體的組合物中。
下面的實(shí)施例是為了解釋而不是為了限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例材料和方法材料L-α-磷酯酰膽堿(PC)，膽固醇(Chol)，α1酸性糖蛋白，鹽酸阿霉素(Dox)，N-羥基琥玻酰亞氨基-生物素(NHSB)和神經(jīng)氨酸酶購(gòu)自Sigma公司(St.Louis，MO)。親和素和二棕櫚酰基磷酯酰絲氨酸(PS)購(gòu)自Calbiochem(San Diego，CA)。RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購(gòu)自Gibco Life Techologies(Grand Island，NY)。
細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌母細(xì)胞(hepatoblastoma)(HepG2)獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)并維持在RPMI 1640培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)基中補(bǔ)充有5％的胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100μg/ml鏈霉素，在飽和濕度并含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板中或1×105細(xì)胞/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)18-22小時(shí)用于處理。
動(dòng)物將6-8周齡的近親交配的nu/nu BALB/c裸鼠在無(wú)病原體條件下喂養(yǎng)于香港中文大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)中心。用標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物飼料(PICOLABRodent Diet)和自由飲用自來(lái)水并圈養(yǎng)在帶有聚酯纖維濾網(wǎng)的高壓滅菌籠中。飼料和水在使用前也要進(jìn)行高壓滅菌。
脂質(zhì)體制劑用薄膜水合作用制備脂質(zhì)體[16]。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將摩爾比PC∶Chol∶PS為11∶4∶0.025的脂類(lèi)溶解在氯仿中。將氯仿(chlorophyll)在氮?dú)庵姓舭l(fā)和進(jìn)一步的將脂薄膜真空下脫水3-4小時(shí)。然后，用300mM的檸檬酸鹽緩沖液(pH 4)再水合。在5個(gè)凍-融循環(huán)后，將得到的多層小泡從100nm孔徑的聚碳酸酯膜(LipofastTM，Avestin Inc.，Ottawa，ON)中擠出以得到單層脂質(zhì)體。
包囊化作用為了包囊化Dox，通過(guò)使用500mM的碳酸鈉緩沖液將外部基質(zhì)的pH值增加到pH 7.5而建立一個(gè)pH梯度。在加入Dox之前將脂質(zhì)體在60℃加熱5分鐘，加入比例為20∶1(w∶w)并進(jìn)一步加熱10分鐘。這種方法的包囊化的效率大約為95％[16]。使用Sephadex G50柱排阻層析可以將脂質(zhì)體的Dox和游離的Dox分開(kāi)。用分光光度法在480nm測(cè)定脂質(zhì)體中Dox的含量，其中脂質(zhì)體樣品被溶解在酸化的異丙醇中(溶于90％異丙醇中的0.075M HCl)。
偶聯(lián)通過(guò)形成親和素-生物素橋?qū)崿F(xiàn)了α1酸性糖蛋白和脂質(zhì)體的偶聯(lián)，其中α1酸性糖蛋白用神經(jīng)氨酸酶消化脫唾液酸化分別用NHSB對(duì)脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化，并通過(guò)以摩爾比脂質(zhì)體(PS)∶蛋白質(zhì)∶親和素＝1∶1∶1加入親和素進(jìn)行偶聯(lián)。
體外研究細(xì)胞毒性測(cè)定HepG2細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，用5μM的等量的游離Dox(D)，Dox-脂質(zhì)體(DL)或與脫唾液酸α1糖蛋白偶聯(lián)的Dox-脂質(zhì)體(DLG)37℃培養(yǎng)24小時(shí)。用標(biāo)準(zhǔn)的MTT方法測(cè)定細(xì)胞毒性。
流式細(xì)胞術(shù)研究HepG2細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中，用10μM的等量的D，DL或DLG 37℃培養(yǎng)2小時(shí)。然后洗滌和收獲細(xì)胞。用FACSort流式細(xì)胞儀(Beckon Dickinson，San Jose，CA)分析樣品的Dox含量。
結(jié)果最初用HepG2細(xì)胞在體外檢驗(yàn)了偶聯(lián)了脫唾液酸α1酸性糖蛋白的Dox脂質(zhì)體(DLG)的抗腫瘤活性。對(duì)HepG2細(xì)胞來(lái)說(shuō)，游離Dox(D)的IC50是5μM，而且使用該濃度檢驗(yàn)了DL和DLG的細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DL和DLG的細(xì)胞毒性和Dox的相仿(

圖1)。
體內(nèi)研究抗腫瘤效率在第0天對(duì)裸鼠(體重20-25克；6-8周齡)；皮下(s.c.)接種HepG2細(xì)胞懸液(4×106/鼠)。第2天，每組5只小鼠靜脈注射1mg/kg等量的D，DL或DLG。對(duì)照組注射鹽水。每隔1天注射一次。用游標(biāo)卡尺連續(xù)檢測(cè)腫瘤體積。每周測(cè)定一次，并用公式(長(zhǎng)×寬×高×0.52)計(jì)算腫瘤體積。在第35天殺死所有的小鼠，取出腫瘤并稱重。
組織分布研究第35天，對(duì)4組小鼠再次分別注射鹽水，D，DL或DLG，2小時(shí)后殺死。立即取出肝臟，心臟和腫瘤并在10mM Na2HPO4緩沖液(pH 7.2)中勻漿。為了測(cè)定不同組織的Dox，取1ml的勻漿液加入到3ml的氯仿/異丙醇中(1∶1 v/v)并徹底混合。離心后(1200g，10分鐘)，在激發(fā)波長(zhǎng)480nm和發(fā)射波長(zhǎng)580nm用熒光分光光度法測(cè)定有機(jī)層中Dox的濃度。
心肌損傷第35天，乙醚麻醉小鼠，心臟穿刺獲得肝素化的血液樣品。使用Sigma的試劑盒測(cè)定血漿乳酸脫氫酶的活性(LDH)從而評(píng)價(jià)心肌損傷。
組織學(xué)研究從4組小鼠每1組中選1只小鼠，小心地取下心臟固定在布安氏液中。固定后，處理心臟并切片和進(jìn)行HE染色。用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察和照相。
結(jié)果和討論為了確證脂質(zhì)體制劑的攝取是否不同于游離藥物的攝取，用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)攝取過(guò)程。圖2表明HepG2細(xì)胞對(duì)包囊的Dox的攝取沒(méi)有任何增加，反而是有30％的下降。對(duì)DL和DLG的攝取沒(méi)有顯著的差異。
圖3示游離和包囊化的Dox的生物分布。注射2個(gè)小時(shí)后，和游離的Dox相比，包囊化在脂質(zhì)體中的Dox在心臟中的積聚降低。但是，在Dox和DL處理的動(dòng)物中，Dox在肝臟中的積聚是接近的。更重要地是，和注射游離的Dox的動(dòng)物相比，注射DLG的動(dòng)物肝臟中Dox的積聚高2倍。因此，這樣看來(lái)脫唾液酸α1糖蛋白在將Dox運(yùn)送到肝臟細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出靶向效應(yīng)。而在游離Dox和DLG處理小鼠的HepG2腫瘤中Dox的含量接近，在DL處理的小鼠中Dox的含量較低。相對(duì)于DL處理，DLG處理的較高的肝臟Dox含量提示脫唾液酸α1酸性糖蛋白有靶向作用。
腫瘤中Dox的含量還反應(yīng)了藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。因此，DL對(duì)抑制腫瘤無(wú)效(圖4)。相反地，D和DLG處理的小鼠對(duì)腫瘤的抑制都高達(dá)40％。DLG制劑的抗腫瘤活性和游離的Dox相仿，但大大高于DL。
當(dāng)將脫唾液酸AαG靶向的Dox脂質(zhì)體制劑給藥于攜帶HepG2腫瘤的裸鼠時(shí)，沒(méi)有任何靶向蛋白配體的對(duì)照Dox脂質(zhì)體抑制腫瘤生長(zhǎng)的程度很有限(圖4)。而脂質(zhì)體不是非常有效的藥物載體，它們?cè)谝恍┫到y(tǒng)中可以改進(jìn)Dox的抗腫瘤效率[10]。令人驚奇的是，當(dāng)脂質(zhì)體和脫唾液酸AαG偶聯(lián)時(shí)，Dox的抗腫瘤活性被大大增強(qiáng)，從而使其抗腫瘤效果和游離Dox相仿(圖5)。由于用DLG代替游離Dox進(jìn)行治療時(shí)，Dox所引起的心臟損傷被大大降低，因此靶向脂質(zhì)體Dox制劑在增強(qiáng)該抗腫瘤劑的治療效率中的應(yīng)用是值得考慮的。
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權(quán)利要求
1.一種用于向表達(dá)唾液酸糖蛋白受體的組織靶向運(yùn)送治療劑的組合物，包括有效量的包囊化于與脫唾液酸化糖蛋白α1相偶聯(lián)的脂質(zhì)體中的藥劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中治療劑是藥物或多核苷酸。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中多核苷酸是編碼治療蛋白的cDNA，核酶或反義DNA。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中治療劑選自細(xì)胞毒性藥物和蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中細(xì)胞毒性藥物選自阿霉素，長(zhǎng)春新堿，柔紅霉素和兩親性胺類(lèi)。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中脫唾液酸化糖蛋白α1通過(guò)親和素-生物素或硫醇-馬來(lái)酰胺鍵相偶聯(lián)。
7.一種向表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體的組織靶向運(yùn)送治療劑的方法，包括給該組織運(yùn)送有效量的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的組合物。
8.一種抑制肝癌細(xì)胞增殖的方法，包括向有需要的主體施用治療有效量的含阿霉素的組合物，其中阿霉素被包囊化于與脫唾液酸化的糖蛋白α1相偶聯(lián)的脂質(zhì)體中。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有有效量的包囊化于脂質(zhì)體中的治療藥劑的組合物,其中該脂質(zhì)體是和脫唾液酸化的糖蛋白,例如脫唾液酸糖蛋白α1相偶聯(lián)的。本發(fā)明還提供了向表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體的組織靶向運(yùn)送有效量的含有效量的包囊化于脂質(zhì)體中的藥劑的組合物的方法,其中脂質(zhì)體是和脫唾液酸化的糖蛋白例如脫唾液酸化的糖蛋白α1相偶聯(lián)的。本發(fā)明還提供了通過(guò)給有需求的主體施用此類(lèi)治療有效量的含有阿霉素的組合物抑制肝癌細(xì)胞的增殖的方法,其中阿霉素包囊化于和脫唾液酸化的糖蛋白α1相偶聯(lián)的脂質(zhì)體中。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1377707SQ0113579
公開(kāi)日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2001年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月5日
發(fā)明者王子暉, 曾瑞英 申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)