專利名稱：海狗油作為制備治前列腺增生的藥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治前列腺增生的藥的應(yīng)用，具體地講，本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治哺乳動(dòng)物以及人的前列腺增生的藥的應(yīng)用。
通常認(rèn)為，愛斯基摩人和日本沿海漁民患此類疾病的患者數(shù)量比一般人群要明顯的低，研究人員相信這種現(xiàn)象和與他們食用富含不飽和脂肪酸的海狗肉、油有關(guān)。
但是，至今并未有具體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者臨床結(jié)果加以證明。
在本發(fā)明中所述的海狗通常是指生活紐芬蘭、北大西洋地區(qū)、北極的一種哺乳動(dòng)物，它們體內(nèi)脂肪中不飽和脂肪酸含量高達(dá)25％，其分子結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)的脂肪酸分子結(jié)構(gòu)相似。
本發(fā)明所述的海狗油(又稱海豹油)是指由海狗的皮下脂肪提煉而成的純天然產(chǎn)品。
研究結(jié)果表明，海狗油中含有大量的人體必需的體內(nèi)不能自行合成的ω-3系長碳鏈多烯不飽和脂肪酸以及少量的角鯊烯(SPUALENE)。
本發(fā)明的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)采用的海狗油為海狗體內(nèi)提取而成的微黃色油狀液體，由加拿大的大西洋衛(wèi)生食品有限公司以軟膠囊(0.5g/粒)方式提供，批號為11656，所述的海狗油在實(shí)驗(yàn)室采用室溫保存。
為了進(jìn)一步明確上述海狗油的成份和含量，以下對本發(fā)明所使用的海狗油的成份進(jìn)行分析和確認(rèn)。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)表明，從海狗油中提取的ω-3系多烯不飽和脂肪酸的化學(xué)主成份為EPA、DHA和DPA，其中EPA是指二十碳五烯酸；DPA是指二十二碳五烯酸；DHA是指二十二碳六烯酸；本發(fā)明的研究人員對上述獲得的海狗油進(jìn)行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、氣相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用色譜等項(xiàng)目的測定，對所述樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)，具體如下本發(fā)明采用的海狗油樣品的檢測結(jié)果是
(1)紫外吸收光譜用氯仿(分析純)把樣品配成5.9mg/ml溶液后進(jìn)行全波長紫外掃描，所使用的儀器的型號是U-3210spectrophotometer(Japan制造)；參見附

圖1，其結(jié)果表明樣品在249.8nm處有最大吸收，可以證明樣品中含有大量的不飽和鍵；(2)紅外吸收光譜參見附圖2，其結(jié)果表明，在3010cm-1和1745cm-1處的強(qiáng)吸收分別是不飽和＝C-H和＞C＝O伸縮振動(dòng)的特征吸收；1655cm-1處的弱吸收符合順式雙鍵(R1-C＝C-R2)的伸縮振動(dòng)特征吸收(1665-1635cm-1，反式為1675-1665cm-1)，H/ \H722cm-1處的吸收峰符合順式雙鍵＝C-H彎曲振動(dòng)的特征吸收(730-665cm-1，反式為980-960cm-1)。
綜合紅外和紫外光譜分析，可以認(rèn)為樣品中主要為順式非共軛脂肪酸。
(3)氣相色譜在本項(xiàng)檢測中，采用的標(biāo)準(zhǔn)品由SIGMA公司提供，分別為Cis-5，8，11，14，17-EICOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十碳五烯酸甲酯；Cis-4，7，10，13，16，19-DOCOSAHEXAENOIC ACID ETHYL ESTER，二十二碳六烯酸乙酯；Cis-7，10，13，16，19-DOCOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十二碳五烯酸甲酯；樣品為上述獲得的海狗油，用GC法分析脂肪酸需要將其乙酯化以利氣化，具體是取所述的樣品80μl，加0.5ml/l的NaOH-乙醇液1ml，充N2，加塞，于50攝氏度水浴中振搖至小油滴完全消失，加三氟化硼乙醇液1.5ml?；旌暇鶆颍?0度水浴中放5min，取出冷卻，加正庚烷1ml、飽和NaCl為2ml混合均勻，分層。取上層液于另一試管中，加少量無水NA2SO4，充N2，于4度放置待GC分析。
所使用的儀器為HP6890；氣相色譜條件玻璃充填柱2m×3mm，10％DEGS酸洗，101白色擔(dān)體，載氣N2，流速25ml/min，檢測器FID，柱溫180度，氣化室210度，檢測器270度，進(jìn)樣量1ul。
將標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷定容，配置成2.5mg/ml溶液，精密量取1ul進(jìn)行氣相含量測定，同樣的方法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果是樣品和對照品的保留時(shí)間一致。
可參見附圖3-7。
(4)氣-質(zhì)聯(lián)用法采用的儀器為美國Trace 2000GC/Trace MS型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，所有試劑均為分析純。
實(shí)驗(yàn)條件為氣相色譜條件PEG-20M玻璃毛細(xì)管柱(2m×0.32mm)；柱溫40度保持1min，以10度/min升溫至200度，保持5min，再以30度/min升溫至210度，保持2min；載氣N2，柱前壓3.0kpa，分流比1∶30，進(jìn)樣口溫度250度；離子源溫度250度，電離電壓70Ev，質(zhì)量掃描范圍350AmU.S-1；進(jìn)樣量1ml。
經(jīng)質(zhì)譜圖分析，確定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的分子量相符。
至此，對本發(fā)明采用的海狗油的分子量、成份、含量和結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到確認(rèn)。
本發(fā)明的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中所用材料的準(zhǔn)備。
一、海狗油所述的海狗油在上述內(nèi)容中已經(jīng)詳細(xì)描述，試驗(yàn)時(shí)直接吸取原藥液或橄欖油稀釋后的藥液，小鼠每30g體重灌胃給予0.8ml(高劑量組使用原藥液)或0.6ml(中、低劑量組使用稀釋藥液)。
二、陽性對照藥本發(fā)明中采用的陽性對照藥為前列康，每片含量0.5g，批號00317-2，批準(zhǔn)文號浙衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第037501號，由浙江康恩貝集團(tuán)制藥有限公司生產(chǎn)，購于北京醫(yī)藥商店。試驗(yàn)前將藥片在乳缽中壓碎，邊研磨邊加入蒸餾水，制成濃度100mg/ml的混懸藥液，小鼠灌胃體積0.6ml/30g體重。
三、未植入和植入對照組小鼠每只灌胃0.6ml橄欖油。
四、生化試劑及其它試劑酸性磷酸酶試劑盒為北京化工廠臨床試劑分廠生產(chǎn)；戊巴比妥鈉、橄欖油、生理鹽水，購于北京醫(yī)藥商店。
五、試驗(yàn)動(dòng)物本發(fā)明中選用的試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級km種小鼠，體重24-26g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號京動(dòng)許字(2000)第012號，由中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前觀察2天，選健康、活潑的動(dòng)物用于試驗(yàn)。
為了確認(rèn)本發(fā)明所述的海狗油在治療前列腺增生方面的療效，進(jìn)行了以下的動(dòng)物試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖橇私馑龅暮９酚驮谥委熐傲邢僭錾矫娴乃幚韺W(xué)作用和效果，具體的方法與結(jié)果如下選擇性成熟小鼠60只，以雄∶雌＝1∶2同籠交配(共20籠)，連續(xù)交配5天，每天早、晚檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓的小鼠記為妊娠0天。孕鼠在飼養(yǎng)到妊娠16天，脫頸椎處死，剖腹取胎。將胚胎置生理鹽水中浸泡，在無菌條件下打開胎鼠腹腔，鑷取尿生殖竇。同時(shí)用3mg/ml戊巴比妥鈉溶液以60mg/kg ip麻醉雄性小鼠，無菌操作下切開下腹部0.8-1.0cm，在放大16倍的大視場工作儀下，分離雙側(cè)前列腺腹葉，用小號鐘表鑷子夾取兩個(gè)尿生殖竇分別植入到兩側(cè)前列腺腹葉內(nèi)，仔細(xì)檢查沒有滑出后，將前列腺小心送回腹腔并縫合腹壁。未植入對照組除未夾取尿生殖竇外，其余手術(shù)操作步驟相同。手述后觀察3天，未見雄鼠出現(xiàn)異常反應(yīng)，將植入尿生殖竇雄鼠隨機(jī)分組，每組10只。
試驗(yàn)共分6組即未植入對照組、植入對照組、陽性對照前列康2.0g/kg組，海狗油26.7ml/kg組(相關(guān)于臨床人用量322倍)；臨床用量0.5ml/粒，10粒/日，人體重按60kg計(jì)算，則攝入量0.083ml/kg)、13.3ml/kg組和6.7ml/kg組(相關(guān)于人體體表面積的1.29倍、體重的80倍)。每天灌胃給藥1次，連續(xù)5周。給藥期間小鼠精神好、活動(dòng)自如、被毛潤澤、飲食和體重增長均正常，糞便略稀修正成型，未見藥物引起的不良反應(yīng)。給藥滿5周，進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測1.酸性磷酸酶(ACP)的測定小鼠在禁食12小時(shí)后，從眼眶底靜脈叢取血0.4-0.5ml，靜置后離心，取血清用對硝基苯磷酸二鈉法在自動(dòng)生化分析儀上測定酸性磷酸酶。結(jié)果詳見表1。
表1海狗油對酸性磷酸酶的影響

與未植入對照組比較##P＜0.01。
結(jié)果表明，未植入對照組的酸性磷酸酶在正常值范圍內(nèi)；植入對照組的數(shù)值則升高非常明顯；而陽性對照組和海狗油各組的數(shù)值均有明顯降低。與植入對照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有非常顯著性差異(P＜0.01)。
2.主要生殖腺系數(shù)測定小鼠脫頸椎處死，逐一稱取體重后，剖腹并剪取睪丸、附睪、精囊及前列腺的腹葉、側(cè)葉和背葉，分離粘連的脂肪組織后，在電子天平上分別秤取重量，并計(jì)算小鼠生殖腺系數(shù)。結(jié)果詳見表2、3。
結(jié)果表明植入對照組的精囊、前列腺側(cè)葉、背葉和三葉總和共四項(xiàng)系數(shù)值明顯高于未植入對照組；植入對照組的睪丸、附睪、精囊及前列腺的腹葉三項(xiàng)系數(shù)值與未植入對照組相似。陽性對照組和海狗油各劑量組能夠明顯降低精囊、前列腺腹葉、側(cè)葉、背葉及三葉總和的部分系數(shù)值，并能夠明顯增加睪丸系數(shù)值，與植入對照組系數(shù)值比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異或非常顯著性差異(p＜0.05或＜0.01)。
表2 海狗油對主要生殖腺系數(shù)的影響組別 劑量 動(dòng)物數(shù) 生殖腺系數(shù)(x-±SD.mg/10g體重)ml/kg n 睪丸 附睪 精囊未植入對照 - 106.2±0.7 3.0±0.5 7.5±1.3植入對照 - 106.2±0.8 3.1±0.6 10.4±2.0##陽性對照 2.0g 107.4±0.9** 3.0±0.5 9.3±1.5海狗油 6.7106.7±0.7 2.8±0.4 8.4±1.8*13.3 106.9±1.2 2.8±0.4 7.8±1.7**26.7 106.8±0.6*2.8±0.4 8.3±1.8*與未植入對照組比較##P＜0.01。與植入對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01。
表3 海狗油對前列腺系數(shù)的影響(n＝10)組別 劑量 生殖腺系數(shù)(x-±SDmg/10g體重)ml/kg 側(cè)葉 腹葉 背葉 三葉總和未植入 - 0.90±0.190.66±0.16 0.44±0.12 2.01±0.30植入對照- 1.55±0.37## 0.80±0.17 0.60±0.13# 2.94±0.54##陽性對照2.0g 1.13±0.24** 0.62±0.12** 0.45±0.11* 2.20±0.30**海狗油 6.71.45±0.250.72±0.14 0.61±0.12 2.76±0.4013.3 1.25±0.290.51±0.13** 0.54±0.20 2.31±0.59*26.7 1.05±0.12** 0.67±0.17 0.40±0.15**2.12±0.27**與未植入對照組比較#P＜0.05；##P＜0.01。與植入對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01。
3.前列腺各葉干燥重量測定將秤取濕重后前列腺各葉置玻璃托盤，在45℃烤箱中干燥48小時(shí)，然后在電子天平上分別秤重。結(jié)果詳見表4。
結(jié)果表明植入對照組前列腺各葉干重?cái)?shù)值明顯高于未植入對照組；陽性對照組和海狗油中、高劑量組在前列腺腹葉、側(cè)葉、背葉及三葉總和的部分干重?cái)?shù)值有明顯降低，與植入對照組平均值比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異或非常顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。
4.病理組織學(xué)的觀察與測定前列腺組織經(jīng)Bouins液固定48小時(shí)，常規(guī)制片、HE染色，顯微鏡下觀察可見未植入對照組前列腺腺泡腔、皺壁及上皮細(xì)胞正常，胞質(zhì)內(nèi)和泡腔內(nèi)有少量分泌顆粒和分泌物；植入對照組前列腺腺泡腔壁明顯擴(kuò)大，腺皺壁增長，腺柱狀上皮細(xì)胞肥大、增生；陽性對照組和海狗油高劑量組前列腺增生明顯減輕，腺泡腔壁縮小，腺皺壁縮短、稀疏，腺上皮細(xì)胞呈立方形，腺泡腔內(nèi)稀薄分泌物增多；海狗油中、低劑量組前列腺增生也有較明顯的減輕，其治療效果次于高劑量組。詳見圖1-6(生物顯微鏡100倍鏡下照片)。對每組前列腺標(biāo)本片用5∶100目鏡測微尺在50倍顯微鏡下，測定20個(gè)腺上皮細(xì)胞高度和40個(gè)腺泡腔直徑(橫徑+豎徑÷2)。結(jié)果詳見表5。
表4 海狗油對干燥后的前列腺重量的影響組別 劑量 生殖腺系數(shù)(x-±SD.mg/10g 體重)ml/kg 側(cè)葉腹葉 背葉 三葉總和未植入-5.1±1.24.8±1.5 5.8±1.2 15.7±1.6植入對照 -13.8±4.3## 7.2±2.6## 8.2±1.9##29.2±4.9##陽性對照 2.0g 6.8±2.1** 4.3±1.6** 6.3±1.5* 17.4±3.2**海狗油6.7 11.5±2.1 6.3±2.9 11.4±2.4 29.3±4.813.3 9.5±2.8* 6.5±1.5 7.3±2.7 23.3±4.4*26.7 7.0±1.1** 5.5±1.6 5.6±1.9**18.1±2.6**與未植入對照組比較##P＜0.01。與植入對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01。
表5 海狗油對前列腺組織增生的影響組別 劑量 前列腺組織測量(x-±SD.um/個(gè))ml/kg 泡腔直徑 腺上皮高度未植入對照-20.5±8.8 5.3±3.5植入對照 -44.0±21.5## 18.0±8.1##陽性對照 2.0g 25.1±9.6**7.1±5.3**海狗油6.7 29.8±11.5** 16.3±7.813.3 27.6±15.3** 10.0±5.3**26.7 24.9±11.0** 9.7±4.0**與未植入對照組比較##P＜0.01。
與植入對照組比較**P＜0.01。
上述表明未植入對照組前列腺腺泡腔直徑較小，腺上皮細(xì)胞未見增高；植入對照組則增加明顯，個(gè)體數(shù)值差別也較大；陽性對照組和海狗油各劑量組在腺泡腔直徑和腺上皮細(xì)胞高度均不有同程度地縮小，高劑量組的數(shù)值已接近未植入對照組；與植入對照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有非常顯著性差異(P＜0.01)。
通過以上實(shí)驗(yàn)可以看出，海狗油在13.3-26.7ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃給藥5周，對小鼠尿生殖竇植入所致的前列腺增生，可使增高的血清酸性磷酸酶數(shù)值降至正常；前列腺各葉濕重系數(shù)和前列腺各葉干燥重量有明顯的降低；前列腺病理組織學(xué)觀察及測定認(rèn)為抗前列腺增生作用明顯。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，利用海狗油可以在較大劑量下，有明顯的對抗尿生殖竇植入所致小鼠前列腺增生的作用。
權(quán)利要求
1.一種主要成份為二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)的海狗油作為制備治療前列腺增生的藥的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用優(yōu)選6.7-26.7ml/kg的劑量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用更優(yōu)選13.3-26.7的劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治前列腺增生的藥的應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)，在海狗油為6.7－26.7ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃給藥，對尿生殖竇植入法小鼠前列腺增生，本發(fā)明所述的海狗油能夠明顯地降低升高的血清酸性磷酸酶，減輕增生的前列腺各葉濕重系數(shù)和干燥后的重量，縮小前列腺組織細(xì)胞中腺泡腔直徑和腺上皮高度；另外還增加睪丸系數(shù)值，減少精囊系數(shù)值；表明本發(fā)明所述的海狗油具有明顯的對抗前列腺增生的作用。
文檔編號A61P13/08GK1410076SQ01135520
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者徐康森, 李湛軍, 樂嘉靜, 忻余, 林蘭, 何謂鑒 申請人:中國藥品生物制品檢定所