專利名稱：細(xì)胞死亡抑制蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過與caspase-12或其前體結(jié)合來抑制caspase-12活化的蛋白，以及含有該蛋白的細(xì)胞死亡抑制劑。
caspase是一族在多細(xì)胞生物體的編程性細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵性作用的蛋白酶。至今已從人和鼠中鑒定了Caspase族的十四個(gè)成員(Thornberry,N.A.和Lazebnik,Y.,“caspase，內(nèi)部危害物”，科學(xué)281,1312-1316(1998))。通過利用其特異蛋白水解活性裂解一組特異的蛋白來實(shí)現(xiàn)Caspase的功能。存在多種caspase的原因之一被認(rèn)為是因?yàn)椴煌腸aspase功能對(duì)應(yīng)于不同的編程性細(xì)胞死亡刺激物。
現(xiàn)在正在闡明，當(dāng)caspase與正常功能如發(fā)育過程中的形態(tài)形成，成人中(體內(nèi))穩(wěn)態(tài)的維持，和對(duì)身體有害細(xì)胞的清除有關(guān)時(shí)，如果它們被非正常活化則可能引起嚴(yán)重的疾病如神經(jīng)變性的疾病(Yuan,J.和Yankner,B.A.,Nat.Cell Biol.1,E44-45(1999))。
Caspase被生物合成為非活性前體的形式并通過分子內(nèi)的特異性裂解(過程)而被活化。因此，如果這一過程被抑制，則有可能抑制由caspase引起的編程性細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的目的是提供一種抑制caspase-12活化的蛋白和一種含有該蛋白的細(xì)胞死亡抑制劑。
為了解決上述問題，本發(fā)明發(fā)明人通過廣泛和深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種癌特異蛋白MAGE-3或其被截短的形式與caspase-12或其前體(以下常被稱作“caspase-12前體”)特異結(jié)合。因而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
本發(fā)明涉及一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白，或編碼該重組蛋白的基因(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，上述基因是一種由選自下列(C)和(d)的DNA組成的基因(c)一種由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列組成的DNA，(d)一種在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列雜交的DNA并且該DNA編碼一種抑制caspase-12活化的蛋白。
本發(fā)明還涉及一種含有上述基因的重組載體。
本發(fā)明還涉及一種含有上述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明還涉及一種制備抑制caspase-12活化的蛋白的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體并從得到的培養(yǎng)物中回收該蛋白。
本發(fā)明還涉及一種通過將MAGE-3蛋白和/或其截短形式與caspase-12或其前體結(jié)合所形成的復(fù)合物。
本發(fā)明還涉及一種含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式的細(xì)胞死亡抑制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，MAGE-3蛋白是一種選自下列(e)和(f)的重組蛋白(e)一種由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白，(f)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，MAGE-3蛋白的截短形式是一種選自上述(a)和(b)的重組蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，細(xì)胞死亡是至少一種選自編程性細(xì)胞死亡、壞死、預(yù)定(scheduled)細(xì)胞死亡、程序細(xì)胞死亡和細(xì)胞損傷的細(xì)胞死亡。
本發(fā)明還涉及一種用于治療細(xì)胞死亡相關(guān)疾病的治療劑，該治療劑含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病是至少一種選自阿爾茨海默疾病、神經(jīng)變性疾病、自體免疫疾病、肌萎縮和器官紊亂的疾病。
本發(fā)明還涉及一種抑制caspase-12的活化的方法，包括將MAGE-3蛋白或其截短形式與caspase-12或其前體結(jié)合。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗編程性細(xì)胞死亡活性的方法，包括采用特異識(shí)別MAGE-3蛋白或其截短形式的抗體來處理所述組織或細(xì)胞，并檢測(cè)所述MAGE-3蛋白或所述截短形式在所述組織或細(xì)胞中的表達(dá)，其中檢測(cè)到所述MAGE-3蛋白或其所述截短形式的高度表達(dá)表明所述細(xì)胞組織具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)抗編程性細(xì)胞死亡活性的方法，包括檢測(cè)編碼MAGE-3蛋白或其截短形式的mRNA在組織或細(xì)胞中的表達(dá)。


圖1表示純化源自大腸桿菌的MAGE-3蛋白的SDS-聚丙酰胺凝膠電泳圖譜。
圖2表示測(cè)定哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中MAGE-3與caspase-12結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果。
圖3表示測(cè)定哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中MAGE-3與caspase-12的p10區(qū)域結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果。
圖4表示MAGE-3的氨基酸序列。
圖5表示MAGE-3與兩種形式的caspase-12(即成熟酶和酶原)之間的結(jié)合親合力的比較結(jié)果。
圖6表示caspase-12前體的示意圖。
圖7表示測(cè)定MAGE-3抑制caspase-12活化的結(jié)果。
圖8表示通過MAGE-3的高表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞抵抗編程性細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本說明書包括本申請(qǐng)要求了優(yōu)先權(quán)的在先日本專利申請(qǐng)NO.2000-41927的說明書和/或附圖的內(nèi)容。
本發(fā)明涉及一種被命名為“黑素瘤相關(guān)抗原3”的癌-特異蛋白及其截短形式和它們的用途?；谏鲜龅鞍拙哂幸种芻aspase-12的加工過程的功能這一發(fā)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
caspase-12前體定位在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上，并通過ER-特異應(yīng)力引發(fā)的自我加工過程而成為有活性的caspase-12(Nakagawa,T．等，自然403,98-103(2000))。已提出ER應(yīng)力是一種阿爾茨海默疾病、人類神經(jīng)變性疾病的誘因。因此，通過利用MAGE-3抑制從caspase-12前體到成熟caspase-12的活化或成熟caspase-12本身的活化，與ER應(yīng)力有關(guān)的疾病如阿爾茨海默疾病能得到預(yù)防或治療。而且，由于MAGE-3蛋白對(duì)caspase活化的抑制與caspase-12具有特異性，因此利用MAGE-3的抑制劑是高度特異的，因此預(yù)料不會(huì)對(duì)其它c(diǎn)aspase的正常功能產(chǎn)生副作用。
本文使用的表達(dá)方式“抑制caspase-12的活化”的意思是通過與caspase-12前體的特異結(jié)合來抑制從caspase-12前體到成熟caspase-12的加工過程，或通過與成熟caspase-12的特異結(jié)合來抑制從caspase-12前體到成熟(活化)caspase-12的功能。這種抑制的結(jié)果使得由成熟caspase-12引起的細(xì)胞死亡得到抑制成為可能。然而，本發(fā)明中，優(yōu)選地是讓MAGE-3或其截短形式與caspase-12前體結(jié)合。
本發(fā)明中，通過MAGE-3(Caugler,B．等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))蛋白或其截短形式抑制caspase-12的活化是可能的。本發(fā)明中，MAGE-3蛋白被表示為“MAGE-3”，編碼MAGE-3的基因被表示為“MAGE-3”。MAGE-3及其截短形式對(duì)caspase-12特異并且不具有結(jié)合其它c(diǎn)aspase的活性。
本發(fā)明中，通過傳統(tǒng)基因工程技術(shù)分離MAGE-3。將得到的基因引入載體來制備重組載體，在將重組載體引入合適的宿主來制備轉(zhuǎn)化體。如果將重組載體構(gòu)建成能在宿主中具有功能的表達(dá)載體，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體可以獲得MAGE-3。
1．編碼MAGE-3及其截短形式的基因的克隆首先，為了獲得本發(fā)明的MAGE-3而進(jìn)行MAGE-3的克隆。盡管MAGE-3的核苷酸序列是己知的(Caugler,B．等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))，但它也可通過以下描述的基因工程技術(shù)來制備。
(1)MAGE-3的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選可通過傳統(tǒng)技術(shù)來制備MAGE-3的mRNA。例如，用胍試劑或酚試劑處理睪丸或腫瘤的組織或細(xì)胞來獲得全長(zhǎng)RNA。然后，通過采用以寡脫氧胸苷酸(dT)纖維素或采用Sepharose2B的聚尿苷酸-Sepharose(瓊脂糖凝膠)為載體的親和柱方法或通過分批方法獲得聚腺苷?；腞NA(mRNA)。以得到的mRNA為模板，采用寡脫氧胸苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA。然后，從單鏈cDNA合成雙鏈cDNA。將如此得到的雙鏈cDNA整合到合適的克隆載體中來制備重組載體。用該重組載體轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌的宿主。以四環(huán)素抗性和氨芐青霉素抗性為標(biāo)記篩選所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體從而獲得cDNA文庫(kù)。
或者，本發(fā)明可以使用商品cDNA文庫(kù)(例如，人睪丸cDNA文庫(kù)；Clontech)。
作為從選擇的轉(zhuǎn)化體中篩選具有目的DNA的那些克隆的篩選方法，例如可以采用使用抗體的免疫篩選技術(shù)或以已知DNA序列為基礎(chǔ)合成引物然后使用該引物進(jìn)行PCR的方法。
(2)截短的MAGE-3的制備本發(fā)明中，設(shè)計(jì)并合成編碼截短形式的MAGE-3的基因(下文稱作“截短的MAGE-3”)。截短形式的MAGE-3指的是在MAGE-3的全長(zhǎng)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的N-端或C-端或兩端具有氨基酸缺失的蛋白，最多缺失氨基酸的總數(shù)是312。更特別地，截短形式的MAGE-3指的是缺失后至少保留了2個(gè)，優(yōu)選地10個(gè)或更多的SEQ IDNO:2的氨基酸的多肽或蛋白。本發(fā)明的截短形式的MAGE-3的特定實(shí)例包括缺失了從SEQ ID NO:2的位點(diǎn)1至位點(diǎn)81(絲氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白；缺失了從SEQ IDNO:2的位點(diǎn)1至位點(diǎn)88(絲氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白；缺失了從SEQ ID NO:2的位點(diǎn)1至位點(diǎn)90(谷氨酰胺)的氨基酸的MAGE-3蛋白；和缺失了從SEQ ID NO:2的位點(diǎn)1至位點(diǎn)93(谷氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白。
本發(fā)明的截短形式的MAGE-3(下文稱作“截短的MAGE-3”)中，缺失了從SEQ ID NO:2的位點(diǎn)1至位點(diǎn)93的氨基酸的MAGE-3蛋白以SEQ ID NO:4表示。與SEQ ID NO:2的部分氨基酸序列對(duì)應(yīng)的這一氨基酸序列跨越位點(diǎn)94至位點(diǎn)314。
通過以MAGE-3(SEQ ID NO:1；Caugler,B．等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))為模板和采用以定位于目的截短蛋白編碼區(qū)以外的SEQ ID NO:1的任何區(qū)域的部分序列為基礎(chǔ)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR能夠獲得這些截短的蛋白。必須指出為了合成截短的MAGE-3將含有翻譯起始密碼的核苷酸序列插入到編碼區(qū)的5’端是有利的。
(3)MAGE-3的突變體和截短MAGE-3的突變體的構(gòu)建本發(fā)明中，將突變引入MAGE-3或截短MAGE-3的部分氨基酸序列是可能的。因此，本發(fā)明的MAGE-3或截短MAGE-3的還包括這些突變蛋白。為了將突變引進(jìn)氨基酸，采用一種將突變引進(jìn)編碼目的氨基酸的基因的核苷酸序列的技術(shù)。
通過已知技術(shù)如Kunkel的方法或缺口雙鏈體方法，或通過基于這些方法的技術(shù)可以將突變引進(jìn)基因。例如，通過以引進(jìn)突變的寡核苷酸為引物(Yoshikawa,F．等，生物化學(xué)雜志271:18277-18284(1996))的點(diǎn)-特異誘變可以引進(jìn)突變。這可以采用商品誘變?cè)噭┖腥鏜utan-K(Takara)或Mutan-G(Takara)或體外誘變系列試劑盒(Takara)中的LA PCR來進(jìn)行。
例如，合成了由在MAGE-3或截短的MAGE-3的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的突變核苷酸及其側(cè)翼區(qū)(每側(cè)大約10個(gè)核苷酸)組成的引物。然后，以MAGE-3為模板并使用上述引物進(jìn)行PCR。純化PCR產(chǎn)物并采用合適的限制酶進(jìn)行處理，因而獲得想要的MAGE-3或截短的AMAGE-3。
(4)核苷酸序列的測(cè)定測(cè)定如此獲得的基因的核苷酸序列。通過Maxam-Gilbert的化學(xué)修飾法或利用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法進(jìn)行測(cè)序。然而，通常采用自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(例如，377A DNA序列儀；Perkin-Elmer)。
SEQ ID NO:1表示MAGE-3的核苷酸序列，SEQ ID NO:2表示MAGE-3的氨基酸序列。SEQ ID NO:3表示截短的MAGE-3的核苷酸序列，SEQ ID NO:4表示截短的MAGE-3的氨基酸序列。只要由這些氨基酸序列組成的多肽具有特異結(jié)合caspase-12或caspase-12前體的活性(即，只要它們能夠抑制caspase-12的活化)，那么這些氨基酸序列就可能發(fā)生了突變?nèi)缛笔?、替換或添加了一個(gè)或多個(gè)(例如，一個(gè)或幾個(gè)，優(yōu)選地大約一個(gè)至十個(gè)，更優(yōu)選地一個(gè)至五個(gè))氨基酸。
除了編碼含在本發(fā)明的截短MAGE-3(SEQ ID NO:4)中的氨基酸的基因(SEQ ID NO:3)外，本發(fā)明的基因還包括只是簡(jiǎn)并密碼不同的編碼相同多肽的簡(jiǎn)并異構(gòu)體。而且，本發(fā)明的基因還包括在嚴(yán)格條件下與截短的MAGE-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)雜交并編碼抑制caspase-12活化的蛋白的DNA。本文使用的“嚴(yán)格條件”指的是這樣的條件，即其中發(fā)生了所謂的特異性雜交，但沒有發(fā)生非特異性雜交。例如，可以給出的那些條件，即其中兩個(gè)高度同源的核苷酸(即，彼此具有60％或更高，優(yōu)選地80％或更高同源性的DNA)相互雜交，但兩個(gè)同源性較低的核苷酸之間不發(fā)生雜交。更特別地是，采用15-900mM，優(yōu)選地15-150mM的鈉濃度，和37-70℃，優(yōu)選地68℃的溫度。
一旦測(cè)出了本發(fā)明的截短的MAGE-3的核苷酸序列，就可以通過化學(xué)合成或通過采用基于所測(cè)核苷酸序列合成的引物而進(jìn)行的PCR來獲得本發(fā)明的基因。
3．含有本發(fā)明的基因的重組載體和轉(zhuǎn)化體的制備(1)重組載體的制備通過將本發(fā)明的基因連接(插入)到合適的載體中來獲得本發(fā)明的重組載體。只要能夠在宿主中復(fù)制，插入了本發(fā)明基因的載體沒有特別的限制。例如，可以使用質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等等。
質(zhì)粒DNA的特定實(shí)例包括商品質(zhì)粒如pBluescript SK+(Stratagene)。本發(fā)明使用的其它質(zhì)粒的實(shí)例包括來源于大腸桿菌的質(zhì)粒(例如，pBR322,pBR325,pUC118和pUC119)，來源于枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒(例如，pUB110和pTP5)和來源于酵母的質(zhì)粒(例如，YEp13,YEp24和YCp50)。噬菌體DNA的特定實(shí)例包括λ噬菌體(例如，Charon4A Charon21A,EMBL3,EMBL4,λgt10,λgt11和λZAP)。并且，還可以使用動(dòng)物載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或痘苗病毒；或昆蟲病毒載體如桿狀病毒。并且，可以使用其中連接了基因表達(dá)活化蛋白(如B41)的融合質(zhì)粒(例如，pJG4-5)。本發(fā)明可以使用的融合質(zhì)粒并不限于上述的pJG4-5。本發(fā)明還可以使用其中連接著GST、GFP、His-tag、Myc-tag等的融合質(zhì)粒。
為了將本發(fā)明的基因插入載體中，可以采用的方法是用合適的限制酶消化純化的DNA，然后插入到合適的載體DNA的限制酶切位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)中來與載體連接。
本發(fā)明的基因必須與載體進(jìn)行可操縱性的連接。為了這個(gè)目的，除了啟動(dòng)子和本發(fā)明的基因外，如果需要，本發(fā)明的載體可含有順式元件如一個(gè)加強(qiáng)子、一個(gè)剪切信號(hào)、一個(gè)聚腺苷酸插入信號(hào)、篩選標(biāo)記、一個(gè)核糖體結(jié)合序列(SD序列)等。作為篩選標(biāo)記，可以列舉出氯霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因等。
(2)轉(zhuǎn)化體的制備將本發(fā)明的重組載體引入宿主可以獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，因而進(jìn)行目的基因的表達(dá)。只要能夠表達(dá)本發(fā)明的基因，所述宿主沒有特別的限制。本發(fā)明可以使用的宿主的特定實(shí)例包括埃希氏桿菌如大腸桿菌；芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌；假單胞桿菌如惡臭假單胞菌；酵母菌如釀酒酵母、粟酒裂殖酵糖母；動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。
如果采用細(xì)菌如大腸桿菌作為宿主，那么本發(fā)明的重組載體優(yōu)選地不但能夠在宿主中自我復(fù)制而且還由一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明的基因和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列組成。
本發(fā)明可以使用的大腸桿菌的特定實(shí)例包括BL21(DE3)、JM109和HB101。本發(fā)明可以使用的枯草芽孢桿菌的特定實(shí)例包括WB700和LKS87。
只要能夠指導(dǎo)本發(fā)明的基因在宿主如大腸桿菌中表達(dá)，任何啟動(dòng)子都可以用來作為本發(fā)明的啟動(dòng)子。例如，可以使用一種來源于大腸桿菌或噬菌體的啟動(dòng)子如trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng)子；或一種來源于大腸桿菌-感染噬菌體的啟動(dòng)子如T7啟動(dòng)子。也可以使用人工修飾的啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。
如果以酵母作為宿主，可以使用例如釀酒酵母、粟酒裂殖糖酵母或Pichia pastoris。這種情況下可使用的啟動(dòng)子沒有受到特別的限制。只要能夠指導(dǎo)本發(fā)明的基因在酵母菌中表達(dá)，任何啟動(dòng)子都可以使用?？梢粤信e，例如，GAL1啟動(dòng)子、GAL10啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子，MFα1啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、AOX1啟動(dòng)子等。作為將重組載體引入酵母的方法，可以使用任何DNA轉(zhuǎn)移方法?？梢粤信e，例如，電穿孔方法(Beker,D.M.，酶學(xué)方法，194:182-187(1990))，原生質(zhì)球法(Hinnen,A．等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，75:1929-1933(1978))，醋酸鋰方法(Itoh,H.,J.Bacteriol.,153:163-168(1983))等。
如果以動(dòng)物細(xì)胞作為宿主，可以使用猿COS-7或非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)；小鼠L細(xì)胞；大鼠GH3,PC12或NG108-15細(xì)胞；人FL、HEK293、Hela或Jurkat細(xì)胞等。SRα啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、LRT啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等可用作啟動(dòng)子。還可使用人巨細(xì)胞病毒的早期基因啟動(dòng)子。例如，可以采用電穿孔、磷酸鈣方法或脂轉(zhuǎn)染作為將重組載體引入動(dòng)物細(xì)胞的方法。
如果以昆蟲細(xì)胞為宿主，可以使用Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞等。例如，可以采用磷酸鈣方法、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔作為將重組載體引入昆蟲細(xì)胞的方法。
4．截短的MAGE-3的制備通過培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體和從得到的培養(yǎng)物中回收所述蛋白來獲得本發(fā)明的截短的MAGE-3。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物”指的是下列任何物質(zhì)培養(yǎng)物上清液、培養(yǎng)細(xì)胞或微生物，或從培養(yǎng)細(xì)胞或微生物得到的裂解產(chǎn)物。按照普遍用于培養(yǎng)宿主的傳統(tǒng)方法進(jìn)行本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)。
只要含有可被微生物同化的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽并能有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，無(wú)論是天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基都可用作培養(yǎng)由微生物宿主如大腸桿菌或酵母菌獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基。
碳?xì)浠衔锶缙咸烟?、果糖、蔗糖、淀粉；有機(jī)酸如乙酸、丙酸；和醇如乙醇和丙醇可以用作碳源。氨，無(wú)機(jī)或有機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨；其它含氮化合物；胨；肉抽提物；玉米漿等可用作氮源。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵(Ⅱ)，硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等可用作無(wú)機(jī)物。
通常，在有氧條件(如振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng))和37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)過程中，PH保持在6.5至7.5。用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等進(jìn)行PH調(diào)節(jié)。培養(yǎng)過程中，如果需要，可以向培養(yǎng)基中添加抗生素如氨芐青霉素或四環(huán)素。
當(dāng)對(duì)用含有誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，如果需要，可以往培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物。例如，當(dāng)對(duì)用含有由異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以往培養(yǎng)基中添加IPTG。當(dāng)對(duì)用含有由吲哚乙酸(IAA)誘導(dǎo)的trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以往培養(yǎng)基中添加IAA。
可以采用通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，或一種補(bǔ)充了胎牛血清的這些培養(yǎng)基等作為培養(yǎng)從動(dòng)物宿主細(xì)胞中獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基。通常，在5％CO2的條件下和37℃下培養(yǎng)1至30天。培養(yǎng)過程中，如果需要，可以向培養(yǎng)基中添加抗生素如卡那霉素或青霉素。
培養(yǎng)后，如果蛋白產(chǎn)生于微生物或細(xì)胞內(nèi)，則通過諸如超聲處理、反復(fù)凍融、或勻漿器處理的方法裂解微生物或細(xì)胞來獲得本發(fā)明截短的MAGE-3。如果本發(fā)明截短的MAGE-3產(chǎn)于微生物或細(xì)胞外，則直接采用培養(yǎng)液或進(jìn)行離心去除微生物或細(xì)胞。然后，采用傳統(tǒng)分離/純化蛋白的生化技術(shù)處理得到的上清液。這些技術(shù)包括硫酸銨沉淀、凝膠層析、離子交換層析和親合層析，并且這些技術(shù)可以單獨(dú)使用，也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕M合來使用。因此，從上述培養(yǎng)物中可以分離和純化到本發(fā)明的蛋白。
5．細(xì)胞死亡抑制劑MAGE-3或其截短的MAGE-3與caspase-12或其前體發(fā)生特異反應(yīng)，因而抑制了從前體到成熟酶的轉(zhuǎn)變過程。因此，MAGE-3或其截短的MAGE-3可用作細(xì)胞死亡抑制劑。MAGE-3或其截短的MAGE-3還可用于治療或預(yù)防與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病(細(xì)胞死亡相關(guān)疾病)。而且，MAGE-3或其截短的MAGE-3被用作基因治療的治療劑。另外，通過測(cè)定細(xì)胞中的MAGE-3含量，能夠檢測(cè)細(xì)胞或組織抵抗編程性細(xì)胞死亡的能力。
細(xì)胞死亡相關(guān)疾病的特定實(shí)例包括阿爾茨海默疾病、神經(jīng)變性疾病、自體免疫疾病、肌萎縮和器官紊亂的疾病。不論這些疾病是單獨(dú)發(fā)生還是以并發(fā)癥的形式發(fā)生，都可以采用本發(fā)明的治療劑進(jìn)行治療。所述并發(fā)癥也包括上述疾病與其它疾病的結(jié)合。
本發(fā)明的治療劑或用于基因治療的治療劑可以經(jīng)口服或非腸道和系統(tǒng)或局部給藥。
如果本發(fā)明的所述蛋白或基因被用作細(xì)胞死亡相關(guān)疾病的預(yù)防劑或治療劑(包括基因治療劑)，則沒有特別限制靶位。例如，本發(fā)明的治療劑可用于治療或預(yù)防發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)(如大腦、脊髓)、血管系統(tǒng)(如動(dòng)脈、靜脈、心臟)、呼吸系統(tǒng)(如氣管、肺)、消化系統(tǒng)(如唾液腺、胃、腸、肝、胰腺)、淋巴系統(tǒng)(如淋巴節(jié)、脾、胸腺)、泌尿系統(tǒng)(如腎)，或生殖系統(tǒng)(如睪丸、卵巢、子宮)的組織中的細(xì)胞死亡相關(guān)疾病的特定目的。這種疾病可能是一種獨(dú)立的疾病，也可能與其它細(xì)胞死亡相關(guān)疾病并發(fā)，或者甚至與細(xì)胞死亡相關(guān)疾病之外的疾病并發(fā)。
如果本發(fā)明的治療劑是口服用藥，則可將該治療劑制成任何劑型如片劑、膠囊、粒劑、粉劑、丸劑、錠劑、內(nèi)服液劑、懸浮液、乳化液或糖漿?；蛘?，所述治療劑可以制成使用前才再次溶解的干燥產(chǎn)品。如果本發(fā)明的治療劑是非腸道給藥，則可將該治療劑配制成靜脈注射液(包括點(diǎn)滴液)、肌內(nèi)注射液、腹膜注射液、皮下注射液、栓劑等。注射液可以單位劑量安瓿或多劑量容器的形式提供。
通過傳統(tǒng)方法采用醫(yī)藥制劑中通常使用的合適賦形劑、填充劑、結(jié)合劑、增濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑、分散劑、緩沖液、保藏劑、溶解輔佐劑、抗菌劑、調(diào)味劑/香料、止痛劑、穩(wěn)定劑、等滲劑等來制備這些配方藥。
上述每一種配方藥可含有藥學(xué)上可接受的載體或添加劑。這種載體或添加劑的特定實(shí)例包括水、藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯乙醇、聚乙烯吡咯酮、羧基乙烯聚合物、藻酸鈉、水溶葡聚糖、羧甲(基)淀粉鈉、果膠、黃原膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙烯甘醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨醇和乳糖。根據(jù)制劑的劑型可以選擇一種或多種這些添加劑或適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行結(jié)合。
本發(fā)明治療劑的劑量大小取決于如對(duì)象的年齡、給藥途徑和給藥次數(shù)這樣因素，并且變化幅度很大。當(dāng)本發(fā)明的有效量的所述蛋白與合適的稀釋劑和藥學(xué)上可接受的載體一起給藥時(shí)，每次給藥時(shí)的蛋白有效量范圍為0.0001至1000mg/體重。治療劑可以一天給藥一次或每天幾個(gè)劑量。
當(dāng)本發(fā)明的基因被用作基因治療的藥劑時(shí)，則本發(fā)明的基因可以通過注射直接給藥?；蛘?，以結(jié)合了本發(fā)明基因的載體的形式給藥。用于這一目的的合適載體的特定實(shí)例包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過采用這一病毒載體，本發(fā)明的基因可以有效的給藥。或者，本發(fā)明的基因可以包裹在磷脂泡囊如脂質(zhì)體中，并且得到的脂質(zhì)體能夠?qū)?duì)象進(jìn)行給藥。由于脂質(zhì)體是含有生物降解物質(zhì)的封閉泡囊，所以將本發(fā)明的基因和脂質(zhì)體混合以便基因保留在脂質(zhì)體的內(nèi)液層和雙層脂膜中(形成了脂質(zhì)體-基因復(fù)合物)。接著，當(dāng)這一復(fù)合物與細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，復(fù)合物中的基因就被細(xì)胞吸收(脂轉(zhuǎn)染)。然后，得到的細(xì)胞通過下述方法進(jìn)行給藥。
作為本發(fā)明的基因治療劑的給藥方法，除了傳統(tǒng)系統(tǒng)給藥如靜脈或動(dòng)脈內(nèi)給藥外，還可以對(duì)神經(jīng)中樞系統(tǒng)(如大腦、脊髓)、血管系統(tǒng)(如動(dòng)脈、靜脈、心臟)、呼吸系統(tǒng)(如氣管、肺)、消化系統(tǒng)(如唾液腺、胃、腸、肝、胰)、淋巴系統(tǒng)(如淋巴結(jié)、脾、胸腺)、泌尿系統(tǒng)(如腎)、生殖系統(tǒng)(如睪丸、卵巢、子宮)等進(jìn)行局部給藥。而且，還可以采用結(jié)合導(dǎo)管技術(shù)和外科手術(shù)的方法。
本發(fā)明基因治療劑的使用劑量根據(jù)諸如對(duì)象的年齡、性別和條件、給藥的途徑、給藥的次數(shù)和配方的類型這些因素而變化。通常，本發(fā)明基因的合適使用劑量是每天0.1-100mg/成人。
6．抗編程性細(xì)胞死亡活性的檢測(cè)測(cè)定本發(fā)明適用于細(xì)胞或組織內(nèi)抗編程性細(xì)胞死亡活性的檢測(cè)。主要是，那些作為MAGE-3的檢測(cè)結(jié)果顯示出高效表達(dá)MAGE-3(包括其截短的形式)的細(xì)胞或組織被判斷為具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。MAGE-3或其截短形式的檢測(cè)和定量可以通過將其與特異識(shí)別MAGE-3或其截短形式的抗體(多克隆或單克隆)進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行。將從細(xì)胞或組織制備的提取物點(diǎn)在一張膜如硝酸纖維素膜上以便制備斑點(diǎn)印跡，或?qū)⑻崛∥镞M(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到一張膜如硝酸纖維素膜上以便制備蛋白印跡。然后，抗MAGE-3的抗體和第二抗體與印跡進(jìn)行反應(yīng)以便檢測(cè)MAGE-3?；蛘撸捎萌鏓LISA(酶聯(lián)免疫親合測(cè)定)這種技術(shù)對(duì)提取物直接進(jìn)行MAGE-3定量檢測(cè)。也可以用抗MAGE-3的抗體直接對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行免疫染色來檢測(cè)那些具有獲得性抗編程性細(xì)胞死亡活性的細(xì)胞或組織。
而且，還可以通過檢測(cè)組織或細(xì)胞中編碼MAGE-3或其截短形式的mRNA來檢測(cè)組織或細(xì)胞的抗編程性細(xì)胞死亡活性?？梢酝ㄟ^對(duì)組織采用原位雜交或位點(diǎn)PT-PCR(反轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng))來檢測(cè)mRNA或通過對(duì)從組織或細(xì)胞中得到的提取物采用RNA印跡法或PT-PCR來進(jìn)行mRNA的檢測(cè)。
以下將參照實(shí)施例更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于這些實(shí)施例。這些實(shí)施例中使用的核苷酸相關(guān)試劑和酶是從Takara生物化學(xué)公司(Takara Biochemicals(日本))和新英格蘭生物試驗(yàn)室(New England Biolabs(美國(guó)))購(gòu)買的。培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基物質(zhì)是從Difco(美國(guó))購(gòu)買的。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基物質(zhì)是從Gibco-BRL(美國(guó))購(gòu)買的。除非另有說明，其它試劑是由Sigma-Aldrich(美國(guó))生產(chǎn)的。
實(shí)施例1MAGE-3的克隆以人睪丸cDNA文庫(kù)(Clontech，美國(guó))為模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))來獲得用于大規(guī)模表達(dá)實(shí)驗(yàn)的MAGE-3蛋白的編碼區(qū)。整個(gè)操作過程如下所述。不僅是本實(shí)施例中，后面的實(shí)施例中DNA和RNA的整個(gè)處理過程都按照Sambrook等描述的方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F,和Maniatis,T.，等編寫的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，美國(guó)，紐約，冷泉港(1989))進(jìn)行。
盡管在包括黑素瘤的許多癌細(xì)胞中觀察到了MAGE-3的高表達(dá)，但是，MAGE-3在正常細(xì)胞中的表達(dá)只限于睪丸(Van Pel,A，等，免疫周報(bào)(Immunol.Rev.)145,229-250(1995))。PCR中使用的引物(例如，NTOP77,NBOT68,NTOP79和NBOT65)具有下述序列。為了便于以下克隆，5’引物(NTOP79)含有可被EcoRV酶切割的GATATC序列，3’引物(NBOT65)含有可被XhoI酶切割的CTCGAG序列。
NTOP77:GCCCAGCTCCTGCCCACACT(SEQ ID NO:5)NBOT68:GGATGCGGCCCCGGAAGGT(SEQ ID NO:6)NTOP79:CTCGATATCGCACCATGCCTCTTGAGCAGAGG(SEQID NO:7)NBOT65:CTCCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCT(SEQ ID NO:8)用于PCR的一套DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液(擴(kuò)展的高保真PCR系統(tǒng))是從Boehringer Mannheim(德國(guó))購(gòu)買的。PCR的反應(yīng)條件如下所述。主要是，以1ng的睪丸cDNA為模板和采用引物NTOP77進(jìn)行第一次PCR。這第一次反應(yīng)循環(huán)40次，一個(gè)循環(huán)過程由變性(94℃保持1分鐘)，引物退火(56℃保持1分鐘)和DNA延伸(72℃保持1分鐘)組成。一千分之一的PCR產(chǎn)物用于第二次PCR。采用引物NTOP79和NBOT65，第二次PCR循環(huán)35次，一個(gè)循環(huán)過程由變性(94℃保持1分鐘)，引物退火(50℃保持1分鐘)和DNA延伸(72℃保持1分鐘)組成。
PCR反應(yīng)結(jié)果，大約900bp的DNA片斷被特異擴(kuò)增。采用EcoRV和XhoI酶(兩者購(gòu)自于Takara Biochemicals)切割該片斷的兩端后，經(jīng)瓊脂凝膠電泳，再提取DNA(采用美國(guó)的Bio101生產(chǎn)的Geneclean試劑盒)來純化所述片斷。將純化的DNA片斷插入到普通載體pBluescriptSK(-)的EcoRV和XhoI位點(diǎn)來得到質(zhì)粒pBN178。
實(shí)施例2MAGE-3的大規(guī)模生產(chǎn)采用大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)MAGE-3首先，通過PCR擴(kuò)增克隆在pBN178中的MAGE-3。將可被限制性酶NheI切割的序列加到5’引物，將可被限制性酶XhoI切割的序列加到3’引物。反應(yīng)循環(huán)25次，一個(gè)循環(huán)過程由變性(94℃保持1分鐘)，引物退火(51℃保持1分鐘)和DNA延伸(72℃保持1分鐘)組成。
以實(shí)施例1中所述的相同方式純化擴(kuò)增DNA片斷，然后，插入到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體pRSET-A(Invitrogen，美國(guó))的EcoRV和XhoI位點(diǎn)來得到質(zhì)粒pBN202。使用pRSET-A載體在克隆基因的5’端加上含有His-His-His-His-His-His(Met-Arg-Gly-His-His-His-His-His-His-Gly-Met-Ala-Ser:SEQ ID NO:9)的標(biāo)記序列。這樣能夠利用帶有鎳離子的親合樹脂(例如，Probond；Invitorogen)進(jìn)行表達(dá)蛋白的親合純化。
用pNB202轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS株。采用含有氨芐青霉素(100ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體(Sambrook,J.,Fritsch,E.F，和Maniatis,T.，等編寫的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，美國(guó)，紐約，冷泉港(1989))。通過向含有處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中加入0.2mM的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)MAGE-3的表達(dá)。按照Novagen的說明書(美國(guó))采用Probond親合樹脂(Invitrogen)純化通過強(qiáng)制性表達(dá)產(chǎn)生的MAGE-3蛋白。
結(jié)果，從1升培養(yǎng)液中獲得了大約100ug的純MAGE-3。通過SDS-聚丙酰胺凝膠電泳證實(shí)了該純MAGE-3的純度很高(圖1)。
實(shí)施例3MAGE-3和Caspase-12前體之間的結(jié)合實(shí)驗(yàn)在COS-1細(xì)胞中超表達(dá)Caspase-12前體和MAGE-3蛋白。然后，通過免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)源自于COS-1細(xì)胞的提取物中它們的結(jié)合。
通過免疫兔子來制備用于免疫沉淀檢測(cè)的抗MAGE-3的抗體。主要是，將代表MAGE-3的C-末端序列的多肽(CHISYPPLHEWVLREGEE；SEQ ID NO:10；Tana Laboratories，美國(guó))連接到載體蛋白(活化的血藍(lán)蛋白；Pierce，美國(guó))上，然后與佐劑一起給兔子注射。在上述多肽的氨基末端人工加上“C”以便多肽與載體蛋白和所使用的親合樹脂結(jié)合。另一方面，將與上述序列相同的多肽偶聯(lián)到活化的FMP-Cellulofine樹脂上(Seikagaku公司，日本)來制備多肽柱，該多肽柱用于以下的親合純化。將從免疫兔中得到的抗血清上樣到多肽柱以使特異抗體與多肽結(jié)合。用甘氨酸溶液(PH2.6)從所述柱上洗脫特異抗體。通過加入1M的Tris將洗脫液的PH值提高到中性。這樣獲得的特異抗體被用于下面的實(shí)驗(yàn)。
編碼caspase-12前體的cDNA和編碼MAGE-3的cDNA分別被克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)(Invitrogen，美國(guó))中，然后通過瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染被轉(zhuǎn)移到COS-1細(xì)胞中?；蚬こ袒虮挥糜贑aspase-12前體，其中將FLAG序列(Hopp,T.P．等，生物/技術(shù)6,1204-1210(1988))插入表達(dá)產(chǎn)物的氨基末端。為了將這些基因轉(zhuǎn)移到COS-1細(xì)胞中，使用了優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒(Superfect Transfection Kit)(Qiagen,德國(guó))。
轉(zhuǎn)染兩天后，回收COS-1細(xì)胞來制備細(xì)胞提取物。通過采用抗FLAG親合凝膠(Sigma-Aldrich，美國(guó))，將插入了FLAG的Caspase-12有選擇地從細(xì)胞提取物中免疫沉淀出來。采用ELC-plus試劑盒(Amersham-Phamacia)通過蛋白印跡檢測(cè)蛋白(Harlow,E.和Lane,D.,抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，美國(guó)，紐約，冷泉港(1989))。
結(jié)果如圖2所示。圖2中，泳道1表示MAGE-3共存于免疫沉淀中。這一結(jié)果的發(fā)生是由于MAGE-3通過抗FLAG親合凝膠與Caspase-12前體進(jìn)行了結(jié)合。如果以在COS-1細(xì)胞中只有MAGE-3超表達(dá)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就不能通過抗FLAG親合凝膠來免疫沉淀MAGE-3(泳道2)。
因而表明在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAGE-3蛋白和Caspase-12前體形成了一種穩(wěn)定的復(fù)合物。
實(shí)施例4Caspase-12中的MAGE-3結(jié)合區(qū)域和其特異性的檢測(cè)按照美國(guó)的R.Brent等建立的酵母兩次雜交方法(Gyuris,J．等，細(xì)胞75,791-803(1993))檢測(cè)Caspase-12中的MAGE-3結(jié)合區(qū)域。按照這一方法，當(dāng)含有這兩種蛋白基因的酵母菌株顯示β-半乳糖苷酶活性時(shí)，則可檢測(cè)到兩種蛋白的結(jié)合。
主要是，將編碼MAGE-3的cDNA克隆到載體pJG4-5中以便構(gòu)建一種由MAGE-3和編碼基因表達(dá)-活化蛋白B42的基因組成的融合基因。含有這種融合基因的質(zhì)粒被命名為pNB321。
將對(duì)應(yīng)于含在成熟Caspase-12中的p10亞基(Thornberry,N.A．和Lazebnik,Y.，科學(xué)281,1312-1316(1998))的cDNA片斷克隆到載體Peg202中以便構(gòu)建一種由p10和LexA的DNA-結(jié)合區(qū)域組成的融合基因。含有這種融合基因的質(zhì)粒被命名為pNB316。
將質(zhì)粒pNB321和pNB316以及含有一個(gè)β-半乳糖苷酶報(bào)道基因的pSH18-34引入一株用于分析目的的芽殖酵母菌株EGY48來構(gòu)建NMY307菌株。用合成培養(yǎng)基(0.67％的酵母氮源(Difco，美國(guó))；組氨酸-，色氨酸-和不含尿嘧啶的氨基酸/核苷酸混合物(Bio-101，美國(guó))，2％的半乳糖)培養(yǎng)NMY307。然后，按照Gyuris等的方法(Gyuris等，細(xì)胞75,791-803(1993))檢測(cè)NMY307中的β-半乳糖苷酶活性。
另外，以所述同樣的方法檢測(cè)這樣一些酵母菌株中的β-半乳糖苷酶活性，該酵母菌株中含有編碼其它Caspase(即，Caspase-1,、-2、-3和-8)的p10區(qū)域(單獨(dú)克隆到pEG202中)和MAGE-3(克隆到pJG4-5)的基因片斷。
結(jié)果如圖3所示。圖3中，“1”,“2”,“3”,“8”和“12”分別代表含有編碼Caspase-1、-2、-3-8和-12的p10區(qū)域和MAGE-3的基因片斷的酵母菌株。“P”代表通過將編碼活化轉(zhuǎn)錄因子的基因(克隆到pSH17-4)和β-半乳糖苷酶報(bào)道基因(克隆到pSH18-34)引進(jìn)EGY48所制備的陽(yáng)性對(duì)照菌株?！癗”代表通過將編碼Caspase-12的p10區(qū)域的基因片斷和β-半乳糖苷酶報(bào)道基因(克隆到pSH18-34)引進(jìn)EGY48所制備的陰性對(duì)照菌株。
結(jié)果表明，其中具有β-半乳糖苷酶活性的酵母細(xì)胞產(chǎn)生了一種來源于物質(zhì)X-Gal的有色物質(zhì)(5-溴-4-氯-3-吲哆-β-D-硫代半乳糖苷)(下面板圖中的“12”)。這意味著成熟Caspase-12的p10區(qū)域結(jié)合了MAGE-3蛋白。這一β-半乳糖苷酶活性幾乎與在陽(yáng)性對(duì)照菌株(下面板圖中的“P”)中觀察到的活性在強(qiáng)度上相同。然而，在陰性對(duì)照菌株(下面板圖中的“N”)中沒有觀察到顏色的產(chǎn)生。并且，在任何其它進(jìn)行試驗(yàn)的Caspase(即，Caspase-1、-2、-3和-8)中象陰性對(duì)照菌株“N”一樣沒有產(chǎn)生顏色(圖3，下面的板圖)。因此，沒有檢測(cè)到這些Caspase與MAGE-3的結(jié)合。
因此表明定位于Caspase-12的C-末端側(cè)鏈上的p10區(qū)域(在成熟Caspase-12中其變?yōu)榇蠹s10kDa的亞基)對(duì)于Caspase-12與MAGE-3的結(jié)合是必需的，并且還表明MAGE-3與Caspase-12的結(jié)合是特異的。
實(shí)施例5Caspase-12和截短形式的MAGE-3之間的結(jié)合實(shí)驗(yàn)采用HeLa細(xì)胞cDNA文庫(kù)對(duì)能與Caspase-12前體的p10區(qū)域結(jié)合的因子進(jìn)行研究。
將編碼Caspase-12前體的p10區(qū)域的基因片斷克隆到pEG202中并采用由R.Brent等建立的相互作用捕獲技術(shù)(Gyuris,J．等，細(xì)胞75，791-803(1993))進(jìn)行處理。得到的全部結(jié)合蛋白都是截短形式的MAGE-3。這些截短形式如下所述。最短的截短形式(截短形式1)由跨越全長(zhǎng)MAGE-3蛋白的位點(diǎn)94的Gly殘基到C-末端的Glu殘基的氨基酸序列組成(以SEQ ID NO:2表示)。
截短形式1由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-93位點(diǎn)的氨基酸截短形式2由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-90位點(diǎn)的氨基酸截短形式3由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-88位點(diǎn)的氨基酸截短形式4由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-81位點(diǎn)的氨基酸按照上述Gyuris等的方法檢測(cè)每一種截短形式與Caspase-12的結(jié)合。主要是，將一種編碼Caspase-12前體的p10區(qū)域的基因片斷和一種編碼截短的MAGE-3的基因片斷和一種lacZ報(bào)道基因轉(zhuǎn)化到芽殖酵母菌株EGY48中。在半乳糖合成培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體。將平板上形成的克隆轉(zhuǎn)移到一張尼龍膜上(Hybond-N+；Amersham-Pharmacia)，然后浸入液氮中來裂解酵母細(xì)胞。將上面載有裂解細(xì)胞的尼龍膜浸入一種含有X-Gal的磷酸緩沖液中(Gyuris,J．等，細(xì)胞75,791-803(1993))并在30℃下保持4-6小時(shí)。結(jié)果，證實(shí)了通過Caspase-12前體的p10區(qū)域與截短的MAGE-3的結(jié)合導(dǎo)致了lacZ基因在酵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)產(chǎn)生了半乳糖苷酶的酶活性，膜表面則發(fā)生了產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)。
所有截短的形式呈現(xiàn)出很強(qiáng)的顏色反應(yīng)。因此表明即使是跨越Gly94到Glu314的MAGE-3的部分長(zhǎng)度的多肽(C-末端)[圖4中的所示區(qū)域跨越“”標(biāo)記(位點(diǎn)94)到C-末端(位點(diǎn)314)]也具有結(jié)合Caspase-12的能力。
實(shí)施例6MAGE-3蛋白和Caspase-12之間的結(jié)合實(shí)驗(yàn)(成熟Caspase-12的結(jié)合)在這個(gè)實(shí)施例中，通過GST-融合蛋白結(jié)合試驗(yàn)分別測(cè)定Caspase-12的前體和活化形式與MAGE-3蛋白的結(jié)合程度。
用于這些試驗(yàn)的成熟Caspase-12(下文常稱作“p30”)是通過從Caspase-12前體中去除不含在成熟(活化)Caspase-12中的N-末端結(jié)構(gòu)域序列前體，然后將His-His-His-His-His-His-序列插入到N-末端來制備的。將一種編碼這個(gè)p30蛋白的eDNA片段克隆到大腸桿菌質(zhì)粒載體pRSET-A中(Invitrogen)。當(dāng)p30在大腸桿菌中大規(guī)模表達(dá)時(shí)，通過自我加工，該蛋白被轉(zhuǎn)化為成熟的形式。
另外，用在這些試驗(yàn)中的未成熟Caspase-12如下制備。主要是，為了穩(wěn)定未成熟Caspase-12(即，防止自我加工)，采用Ser殘基替換定位在Caspase-12的活化位點(diǎn)的Cys殘基以便構(gòu)建一個(gè)突變體p30(命名為“p30C/S”)。單獨(dú)在大腸桿菌中大規(guī)模地表達(dá)這一突變體。根據(jù)Invitrogen的說明書進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)和p30蛋白的誘導(dǎo)合成。利用N-末端6x(His)序列、通過鎳柱親合色譜(Probond親合樹脂；Invitrogen)來純化p30和p30C/S。
為了容易地回收Caspase-12-回收產(chǎn)物，制備了編碼由MAGE-3和融合到其末端的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)組成的融合蛋白的cDNA(pNB341)。主要是，將編碼MAGE-3的cDNA克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體pGEX-4T-3(Amersham-Pharmacia；瑞典)中以便前者的讀框與后者的讀框重合，因而構(gòu)建一個(gè)融合基因。將pNB341引進(jìn)大腸桿菌XL-2Blue MRF’，按照Amersham-Pharmacia的說明書進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和GST-MAGE-3融合蛋白的誘導(dǎo)合成。使用谷胱甘肽樹脂(谷胱甘肽Sepharose4B；Amersham-Pharmacia)從大腸桿菌細(xì)胞的提取物中純化GST-MAGE-3融合蛋白。按照Amersham-Pharmacia的說明書進(jìn)行純化。
將純化的GST-MAGE-3蛋白與p30(成熟Caspase-12)或p30C/S(未成熟Caspase-12)混合，然后利用谷胱甘肽樹脂從溶液中進(jìn)行回收。通過蛋白印跡分析與GST-MAGE-3蛋白共沉淀的蛋白。
結(jié)果見圖5。本圖中的每條泳道如下說明泳道1其中成熟Caspase-12與GST進(jìn)行了混合的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不含MAGE-3)泳道2與GST-MAGE-3一起以沉淀的形式回收的成熟Caspase-12泳道3其中Caspase-12前體與GST進(jìn)行了混合的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不含MAGE-3)泳道4與GST-MAGE-3一起以沉淀的形式回收的未成熟Caspase-12從圖5所見，盡管認(rèn)為p30(成熟Caspase-12)和p30C/S(未成熟Caspase-12)是共沉淀的，但認(rèn)為p30C/S比p30的沉淀要早得多。因此，盡管兩者都能進(jìn)行結(jié)合，但發(fā)現(xiàn)未成熟Caspase-12比成熟Caspase-12更能有效地與GST-MAGE-3蛋白結(jié)合。
實(shí)施例7MAGE-3抑制Caspase的活化本實(shí)施例中，體外合成的Caspase-12前體(48kDa)被裂解為成熟的Caspase-12，從而在體外再現(xiàn)體內(nèi)活性。
Caspase-12的前體裂解為成熟Caspase-12的位點(diǎn)是特異的。這個(gè)裂解位點(diǎn)是一個(gè)特定Asp殘基，該Asp殘基定位在成熟Caspase-12中的大約20kDa到10kDa亞基(分別稱作p20和p10)之間的邊緣上(圖6；泳道2，圖7)。這一特異裂解可能會(huì)通過向裂解反應(yīng)中加入MAGE-3蛋白而被抑制。實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行。
主要是，采用編碼Caspase-12前體的cDNA和體外蛋白合成試劑盒(TNT體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯試劑盒；Promega，美國(guó))合成Caspase-12前體。合成反應(yīng)中加入35S-標(biāo)記的甲硫氨酸(Amersham-Pharmacia)以使產(chǎn)生的酶原被放射性標(biāo)記。
在含有20mM Tris-HCl(PH7.0)和10mM二硫蘇糖醇的緩沖液中將放射性標(biāo)記的Caspase-12前體、成熟Caspase-12和MAGE-3蛋白進(jìn)行混合。然后，在37℃下進(jìn)行45分鐘的裂解反應(yīng)。通過加入等體積的2X電泳樣品緩沖液[100mM Tris-HCl(PH6.8),2％月桂基硫酸鈉，10％巰基乙醇，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油]并在100℃下將溶液加熱4分鐘來終止反應(yīng)。
將該反應(yīng)溶液制成SDS-聚丙酰胺凝膠(14％)。所得到的凝膠采用致敏物(Ampify；Amersham-Pharmacia)進(jìn)行處理、干燥并進(jìn)行放射自顯影。采用BAS2500檢測(cè)系統(tǒng)(Fuji膜，日本)檢測(cè)干膠含有的放射性蛋白。
結(jié)果見表7。每一泳道說明如下。
(1)板圖A泳道1在有放射性甲硫氨酸存在的條件下體外合成的Caspase-12前體泳道2-7由Caspase-12前體裂解為的成熟Caspase-12(0.28μg)。裂解反應(yīng)是在MAGE-3蛋白存在的條件下進(jìn)行的，MAGE-3蛋白的用量如下所示泳道2(0μg)，泳道3(0.3μg)，泳道4(1.5μg)，泳道5(3μg)，泳道6(6μg)，泳道7(12μg)。
泳道8由Caspase-12前體裂解為的成熟Caspase-12(1.1μg)。裂解反應(yīng)是在有12μgMAGE-3蛋白存在的條件下進(jìn)行的。
泳道9由Caspase-12前體裂解成的成熟Caspase-12(1.1μg)。對(duì)照樣品。裂解反應(yīng)是在以12μg牛血清清蛋白替換MAGE-3蛋白的條件下進(jìn)行的。
(2)板圖B泳道1類似于板圖A中泳道7的樣品的樣品(即，反應(yīng)混合物中加入兩倍量的底物(Caspase-12前體))泳道2類似于板圖A中泳道7的樣品的樣品(即，裂解反應(yīng)在有24μgMAGE-3存在的條件下進(jìn)行的)泳道3與板圖A中的泳道9的樣品相同的樣品圖7A中的泳道2至7顯示了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)中逐漸增大存在于反應(yīng)中的MAGE-3蛋白的量(0到12μg)。加入12μg的MAGE-3幾乎能夠完全抑制生成Caspase-12的裂解反應(yīng)。當(dāng)以加入12μg的牛血清清蛋白替換MAGE-3作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒有觀察到抑制作用(泳道9，圖7A)。抑制作用主要是由MAGE-3與Caspase-12結(jié)合導(dǎo)致的結(jié)果。
而且，在12μg的MAGE-3就能幾乎完全抑制裂解反應(yīng)的條件下加入過量的成熟Caspase-12(即，1.1μg；4倍于用于泳道2-7的量，圖7A)并不能恢復(fù)裂解反應(yīng)(泳道8，圖7A)。然而，在相同的條件下，加入過量(即，0.4μl的體外翻譯蛋白溶液；兩倍于用于泳道1，板圖B和泳道1至9，板圖A的量)的底物(Caspase-12前體)，則又可檢測(cè)到特異性的裂解(泳道2，圖7B)。
這些結(jié)果表明Caspase是通過特異性分子內(nèi)的裂解被活化的。還表明MAGE-3與Caspase-12前體的有力結(jié)合抑制了Caspase-12的活化。
實(shí)施例8培養(yǎng)細(xì)胞中MAGE-3的抗編程性細(xì)胞死亡效應(yīng)這個(gè)實(shí)施例證實(shí)了MAGE-3在細(xì)胞中的高表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)力-依賴編程性細(xì)胞死亡的抗性。
為了檢測(cè)在細(xì)胞水平上MAGE-3對(duì)Caspase-12活化的抑制，構(gòu)建了能高表達(dá)MAGE-3的細(xì)胞克隆。然后，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)于編程性細(xì)胞死亡刺激物的反應(yīng)。在除睪丸以外的組織中測(cè)定MAGE-3的表達(dá)水平(Van,Pel,A.等，免疫周報(bào)(Immunol.Rev.145,229-250(1995))。
主要是，采用優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒(Superfect Transfection Kit)，將含有編碼MAGE-3的cDNA的質(zhì)粒pNB179引入鼠成肌細(xì)胞株C2C12中。由于pNB179含有抗藥基因neo，所以含有這個(gè)組合到染色體中的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇性地生長(zhǎng)在含有抗菌素Geneticin(Gibco-BRL)的培養(yǎng)基中。經(jīng)過兩個(gè)星期的選擇培養(yǎng)，挑出培養(yǎng)平板上形成的抗性細(xì)胞的菌落，分別進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行克隆。通過蛋白印跡檢測(cè)每個(gè)克隆中表達(dá)量(采用抗MAGE-3蛋白的抗體)。
Caspase-12被細(xì)胞中的ER-依賴、編程性細(xì)胞死亡-誘導(dǎo)刺激物所活化(Nakagawa,T.，等，自然403,98-103(2000))。然后本發(fā)明發(fā)明人以0.4μM的濃度向上述高表達(dá)克隆的培養(yǎng)基中加入了毒胡蘿卜素(24小時(shí))，所述毒胡蘿卜素是ER-特異性鈣ATP酶的抑制劑，(Calbiochem，美國(guó)；Thastrup,O．等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,2466-2470(1990))。
結(jié)果，胞內(nèi)鈣平衡被打破，促進(jìn)了Caspase-12的活化。因此，誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的編程性細(xì)胞死亡。更特別地是，當(dāng)用0.4μM濃度的毒胡蘿卜素對(duì)C12C12細(xì)胞進(jìn)行(親本株)24小時(shí)處理時(shí)，50％或更多的細(xì)胞死亡，并顯示出編程性細(xì)胞死亡的形態(tài)(圖8中的右上板圖)。
另外，當(dāng)以相同方式、采用毒胡蘿卜素處理C2/MA13和C2MA21克隆時(shí)，細(xì)胞顯示出抗性。據(jù)顯微鏡觀察，這些克隆的90％或更多的細(xì)胞保持正常形態(tài)(圖8中的右中板圖和右下板圖)。左側(cè)板圖顯示了對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中細(xì)胞是用0.1％的二甲基磺酸處理的。
因此，為了定量分析對(duì)毒胡蘿卜素處理的抗性，計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞克隆的存活率。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司，日本)測(cè)定的結(jié)果表明在用毒胡蘿卜素處理24小時(shí)后，C12C12的存活率降低到50％，而C2/MA13和C2MA21的存活率仍保持在很高水平(75％)。因而表明在MAGE-3高表達(dá)的情況下，細(xì)胞對(duì)ER-特異性應(yīng)力具有抗性。這意味著MAGE-3抑制編程性細(xì)胞死亡的發(fā)生和發(fā)展。
本說明書中的所有出版物、專利和申請(qǐng)都是以全文的形式在本說明書中引用參考。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種蛋白和含有該蛋白的細(xì)胞死亡抑制因子，該蛋白通過與Caspase-12特異結(jié)合來抑制Caspase-12的活化。該蛋白被用作抑制細(xì)胞死亡如編程性細(xì)胞死亡的藥物。
正文中沒有提到的序列表SEQ ID NO:5合成DNASEQ ID NO:6合成DNASEQ ID NO:7合成DNASEQ ID NO:8合成DNASEQ ID NO:9合成多肽SEQ ID NO:10合成多肽序列表<110>RIKEN<120>細(xì)胞死亡抑制蛋白質(zhì)<130>PH-1154<140><141><150>JP2000-41927<151>18-FEB-2000<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4204<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(2465)..(3409)<400>1acgcaggcag tgatgtcacc cagaccacac cccttccccc aatgccactt cagggggtac 60tcagagtcag agacttggtc tgaggggagc agaagcaatc tgcagaggat ggcggtccag 120gctcagccag gcatcaactt caggaccctg agggatgacc gaaggccccg cccacccacc 180cccaactccc ccgaccccac caggatctac agcctcagga cccccgtccc aatccttacc 240ccttgcccca tcaccatctt catgcttacc tccaccccca tccgatcccc atccaggcag 300aatccagttc cacccctgcc cggaacccag ggtagtaccg ttgccaggat gtgacgccac 360tgacttgcgc attggaggtc agaagaccgc gagattctcg ccctgagcaa cgagcgacgg 420cctgacgtcg gcggagggaa gccggcccag gctcggtgag gaggcaaggt aagacgctga 480gggaggactg aggcgggcct cacctcagac agagggcctc aaataatcca gtgctgcctc 540tgctgccggg cctgggccac cccgcagggg aagacttcca ggctgggtcg ccactacctc 600accccgccga cccccgccgc tttagccacg gggaactctg gggacagagc ttaatgtggc 660cagggcaggg ctggttagaa gaggtcaggg cccacgctgt ggcaggaatc aaggtcagga 720ccccgagagg gaactgaggg cagcctaacc accaccctca ccaccattcc cgtcccccaa 780cacccaaccc cacccccatc ccccattccc atccccaccc ccacccctat cctggcagaa 840tccgggcttt gcccctggta tcaagtcacg gaagctccgg gaatggcggc caggcacgtg 900agtcctgagg ttcacatcta cggctaaggg agggaagggg ttcggtatcg cgagtatggc 960cgttgggagg cagcgaaagg gcccaggcct cctggaagac agtggagtcc tgaggggacc 1020cagcatgcca ggacaggggg cccactgtac ccctgtctca aaccgaggca ccttttcatt 1080cggctacggg aatcctaggg atgcagaccc acttcagcag ggggttgggg cccagccctg 1140cgaggagtca tggggaggaa gaagagggag gactgagggg accttggagt ccagatcagt 1200ggcaaccttg ggctggggga tgctgggcac agtggccaaa tgtgctctgt gctcattgcg 1260ccttcagggt gaccagagag ttgagggctg tggtctgaag agtgggactt caggtcagca 1320gagggaggaa tcccaggatc tgcagggccc aaggtgtacc cccaaggggc ccctatgtgg 1380tggacagatg cagtggtcct aggatctgcc aagcatccag gtgaagagac tgagggagga 1440ttgagggtac ccctgggaca gaatgcggac tgggggcccc ataaaaatct gccctgctcc 1500tgctgttacc tcagagagcc tgggcagggc tgtcagctga ggtccctcca ttatcctagg 1560atcactgatg tcagggaagg ggaagccttg gtctgagggg gctgcactca gggcagtaga 1620gggaggctct cagaccctac taggagtgga ggtgaggacc aagcagtctc ctcacccagg 1680gtacatggac ttcaataaat ttggacatct ctcgttgtcc tttccgggag gacctgggaa 1740tgtatggcca gatgtgggtc ccctcatgtt tttctgtacc atatcaggta tgtgagttct 1800tgacatgaga gattctcagg ccagcagaag ggagggatta ggccctataa ggagaaaggt 1860gagggccctg agtgagcaca gaggggatcc tccaccccag tagagtgggg acctcacaga 1920gtctggccaa ccctcctgac agttctggga atccgtggct gcgtttgctg tctgcacatt 1980gggggcccgt ggattcctct cccaggaatc aggagctcca ggaacaaggc agtgaggact 2040tggtctgagg cagtgtcctc aggtcacaga gtagaggggg ctcagatagt gccaacggtg 2100aaggtttgcc ttggattcaa accaagggcc ccacctgccc cagaacacat ggactccaga 2160gcgcctggcc tcaccctcaa tactttcagt cctgcagcct cagcatgcgc tggccggatg 2220taccctgagg tgccctctca cttcctcctt caggttctga ggggacaggc tgacctggag 2280gaccagaggc ccccggagga gcactgaagg agaagatctg taagtaagcc tttgttagag 2340cctccaaggt tccattcagt actcagctga ggtctctcac atgctccctc tctccccagg 2400ccagtgggtc tccattgccc agctcctgcc cacactcccg cctgttgccc tgaccagagt 2460catc atg cct ctt gag cag agg agt cag cac tgc aag cct gaa gaa ggc 2509Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly1 5 10 15ctt gag gcc cga gga gag gcc ctg ggc ctg gtg ggt gcg cag gct cct 2557Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro
20 25 30gct act gag gag cag gag gct gcc tcc tcc tct tct act cta gtt gaa 2605Ala Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu35 40 45gtc acc ctg ggg gag gtg cct gct gcc gag tca cca gat cct ccc cag 2653Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln50 55 60agt cct cag gga gcc tcc agc ctc ccc act acc atg aac tac cct ctc 2701Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu65 70 75tgg agc caa tcc tat gag gac tcc agc aac caa gaa gag gag ggg cca 2749Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro80 85 90 95agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc agt agg 2797Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg100 105 110aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga gcc agg 2845Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg115 120 125gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga aat tgg 2893Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp130 135 140cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc ttg cag 2941Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Sar Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln145 150 155ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc cac ttg 2989Leu Val Phe Gly Ile Glu Lau Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu160 165 170 175tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg ctg ggt 3037Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly180 185 190gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc ctg gcc 3085Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala195 200 205ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc tgg gag 3133Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu210 215 220gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt atc ttg 3181Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu225 230 235ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa aac tac 3229Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr240 245 250 255ctg gag tac cgg cag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat gaa ttc 3277Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe260 265 270ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa gtc ctg 3325Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu275 280 285cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac cca ccc 3373His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro290 295 300ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga gtctgagcac3419Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310 315gagttgcagc cagggccagt gggagggggt ctgggccagt gcaccttccg gggccgcatc 3479ccttagtttc cactgcctcc tgtgacgtga ggcccattct tcactctttg aagcgagcag 3539tcagcattct tagtagtggg tttctgttct gttggatgac tttgagatta ttctttgttt 3599cctgttggag ttgttcaaat gttcctttta acggatggtt gaatgagcgt cagcatccag 3659gtttatgaat gacagtagtc acacatagtg ctgtttatat agtttaggag taagagtctt 3719gttttttact caaattggga aatccattcc attttgtgaa ttgtgacata ataatagcag 3779tggtaaaagt atttgcttaa aattgtgagc gaattagcaa taacatacat gagataactc 3839aagaaatcaa aagatagttg attcttgcct tgtacctcaa tctattctgt aaaattaaac 3899aaatatgcaa accaggattt ccttgacttc tttgagaatg caagcgaaat taaatctgaa 3959taaataattc ttcctcttca ctggctcgtt tcttttccgt tcactcagca tctgctctgt 4019gggaggccct gggttagtag tggggatgct aaggtaagcc agactcacgc ctacccatag 4079ggctgtagag cctaggacct gcagtcatat aattaaggtg gtgagaagtc ctgtaagatg 4139tagaggaaat gtaagagagg ggtgagggtg tggcgctccg ggtgagagta gtggagtgtc 4199agtgc 4204<210>2<211>314<212>PRT<213>人類<400> 2Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu1 5 10 15Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala20 25 30Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
35 40 45Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser50 55 60Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp65 70 75 80Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser85 90 95Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys100 105 110Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu115 120 125Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln130 135 140Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu145 150 155 160Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr165 170 175Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp180 185 190Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile195 200 205Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu210 215 220Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly225 230 235 240Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu245 250 255Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu260 265 270Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His275 280 285His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu290 295 300His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310<210>3<211>666<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(1)..(666)<400>3ggg cca agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc 48Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu1 5 10 15agt agg aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga 96Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg20 25 30gcc agg gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga 144Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly35 40 45aat tgg cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc 192Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser50 55 60ttg cag ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc 240Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly65 70 75 80cac ttg tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg 288His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu85 90 95ctg ggt gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc 336Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val100 105 110ctg gcc ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc 384Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile115 120 125tgg gag gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt 432Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser130 135 140atc ttg ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa 480Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu145 150 155 160aac tac ctg gag tac cgg Gag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat 528Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr165 170 175gaa ttc ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa 576Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys180 185 190gtc ctg cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac 624Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr195 200 205cca ccc ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga 666Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu210 215 220<210>4<211>221<212>PRT<213>人類<400>4Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu1 5 10 15Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg20 25 30Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly35 40 45Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser50 55 60Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly65 70 75 80His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu85 90 95Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val100 105 110Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile115 120 125Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser130 135 140Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu145 150 155 160Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr165 170 175Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys180 185 190Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr195 200 205Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu210 215 220<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述分成DNA<400>5gcccagctcc tgcccacact20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>6ggatgcggcc ccggaaggt19<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>7ctcgatatcg caccatgcct cttgagcaga gg32<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400> 8ctcctcgagt cactcttccc cctctct 27<210>9<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400> 9Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser1 5 10<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>10Cys His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly1 5 10 15Glu Glu
權(quán)利要求
1．一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
2．一種編碼選自下列(a)和(b)的重組蛋白的基因(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
3．一種由選自下列(c)和(d)的DNA組成的基因(c)一種由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列組成的DNA，(d)一種在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列雜交并編碼抑制caspase-12活化的蛋白的DNA。
4．一種含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5．一種含有權(quán)利要求4所述的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
6．一種生產(chǎn)抑制caspase-12活化的蛋白的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)化體并從所得到的培養(yǎng)物中回收所述蛋白。
7．一種由MAGE-3蛋白和/或其截短形式結(jié)合caspase-12或其前體所形成的復(fù)合物。
8．一種含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式的細(xì)胞死亡抑制劑。
9．一種如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞死亡抑制劑，其中MAGE-3蛋白是一種選自下列(e)和(f)的重組蛋白(e)一種由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白，(f)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白。
10．一種如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞死亡抑制劑，其中MAGE-3蛋白的截短形式是一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
11．一種如權(quán)利要求8至10中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)胞死亡抑制劑，其中細(xì)胞死亡至少是一種選自編程性細(xì)胞死亡、壞死、預(yù)定細(xì)胞死亡、程序細(xì)胞死亡和細(xì)胞損傷的細(xì)胞死亡。
12．一種用于細(xì)胞死亡相關(guān)疾病的治療劑，含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式。
13．如權(quán)利要求12所述的治療劑，其中MAGE-3蛋白是一種選自下列(e)和(f)的重組蛋白(e)一種由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白，(f)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白。
14．如權(quán)利要求12所述的治療劑，其中截短形式的MAGE-3蛋白是一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
15．如權(quán)利要求12至14中的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的治療劑，其中與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病是至少一種選自阿爾茨海默疾病、神經(jīng)變性疾病、自體免疫疾病、肌萎縮和器官紊亂的疾病。
16．一種抑制caspase-12活化的方法，包括將MAGE-3蛋白和/或其截短形式結(jié)合到caspase-12或其前體上。
17．一種檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗編程性細(xì)胞死亡活性的方法，包括采用特異識(shí)別MAGE-3蛋白或其截短形式的抗體來處理所述組織或細(xì)胞，并檢測(cè)所述MAGE-3蛋白或所述截短形式在所述組織或細(xì)胞中的表達(dá)，其中檢測(cè)到所述MAGE-3蛋白或其截短形式的高度表達(dá)表明所述細(xì)胞組織具有抗編程性細(xì)胞死亡的活性。
18．一種檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗編程性細(xì)胞死亡活性的方法，包括檢測(cè)編碼MAGE-3蛋白或其截短形式的mRNA在組織或細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制caspase－12活化的蛋白以及該蛋白的用途。本發(fā)明涉及一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且抑制caspase－12活化的SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列組成的蛋白。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1316432SQ0111651
公開日2001年10月10日 申請(qǐng)日期2001年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月18日
發(fā)明者森島信裕, 柴田武彥 申請(qǐng)人:理化學(xué)研究所