專利名稱：抗血栓劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與人凝固因子或輔因子相結(jié)合的單克隆抗體(mAbs)和其作為血栓形成抑制劑的用途。
背景技術(shù)：
在正常情況下，血管內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞的損傷，無論損傷大小，將通過通常稱為凝血″級聯(lián)反應(yīng)(cascade)″的一系列事件而觸發(fā)止血反應(yīng)。該級聯(lián)反應(yīng)以使可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白而達到極點，不溶性纖維蛋白與血小板一起形成局部血凝塊或者血栓，血凝塊或血栓阻止血液組分外滲。然后，隨著血凝塊溶解和血管完整性修復(fù)以及血流恢復(fù)而出現(xiàn)傷口愈合。
在受傷和血凝塊形成之間發(fā)生的事件，受到一系列反應(yīng)的精細調(diào)節(jié)和聯(lián)接。簡言之，大量以無活性酶原形式的血漿凝血蛋白和輔因子在血液中循環(huán)著。活性酶復(fù)合物在受損傷位點裝配起來，繼而激活絲氨酸蛋白酶，伴隨有各個連續(xù)的絲氨酸蛋白酶催化后續(xù)酶原成為活化蛋白酶。此酶級聯(lián)反應(yīng)導致每一步驟均放大后繼步驟的效應(yīng)。關(guān)于凝血級聯(lián)反應(yīng)的概述，參見″Thombosis and Hemorrhage″，J.Loscalzo和A.Schafer，編著，BlackwellScientific Publications，Oxford，England(1994)一書的第一章。
雖然有效的血凝限制了損傷部位的血液損失，但血栓在靜脈或動脈的不適當形成是殘障和死亡的常見原因。異常凝血活性可以導致和/或源自病理或治療，諸如心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、房性纖顫、中風、腎臟損害、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)、播散性血管內(nèi)凝血、敗血癥、肺栓塞和深靜脈血栓形成。血凝塊在人造器官、分流器和假體如人工心臟瓣膜外表面的形成也是成問題的。
中風，是導致死亡的主要原因，是造成永久性殘廢的常見原因。導致中風神經(jīng)缺陷的急性灶性腦缺血，最頻見于由血栓栓塞引起。血栓可由心源性病變和動脈粥樣斑產(chǎn)生。原位血栓形成可發(fā)生于大的、腦外的腦供血血管。研究提示，腦動脈閉塞后存在一個有限時間間期，超過該間期，則發(fā)生明顯的不可逆的神經(jīng)元損傷和持久的神經(jīng)缺陷。參見Stroke TherapyBasic，Preclinical，and Clinical Directions，ed.L.P.Miller，Wiley-Liss，Inc.(1999)一書的第14章第355-381頁。
目前，批準用于這些病理和其它血栓形成性及栓子性病癥治療的抗凝劑，包括硫酸化雜多糖肝素和低分子量(LMW)肝素。這些藥物經(jīng)胃腸外給藥，通過激活凝血酶抑制劑、抗凝血酶III并使全部凝血因子失活而引起快速、完全的凝血抑制反應(yīng)。
然而，由于潛伏期的存在，肝素和LMW肝素有其缺點。作為單純壓迫動作和伴隨的與物理物體接觸結(jié)果的失控性出血或者在手術(shù)部位的失控性出血，是主要的并發(fā)癥，并在1～7％接受連續(xù)輸液患者和8～14％接受間斷快速濃注的患者中觀察到了并發(fā)癥。為了使這些風險降至最小，不斷地采集血液樣本以便能夠持續(xù)監(jiān)測體外凝血時間，這在實質(zhì)上增加了治療成本并且給患者帶來不便。
另外，達到所需有效水平而不置患者于冒出血風險境地的治療目標范圍是狹窄的。該治療范圍是大約1至小于3(g肝素/ml血漿，它導致激活的部分凝血激酶時間(aPTT)測定時間約35至約100秒。將肝素濃度提高至超過目標范圍3(g/ml和濃度大于4(g/ml，則測不到凝血活性。因此，必須給予密切關(guān)注以保證患者的血漿濃度在治療范圍之內(nèi)。
另一獲得批準的具有緩慢和長效作用的抗凝劑是華法令(warfarin)，是一種香豆素衍生物。華法令通過與凝血酶原維生素K依賴性翻譯后修飾和其它維生素K-依賴性凝血因子競爭而發(fā)揮作用。
在抗凝作用的一般情形下，對于華法令、肝素及LMW肝素來說，在稍高于治療范圍的濃度時，可以見到血液表現(xiàn)為不凝結(jié)。
在急性心肌梗塞(MI)時，溶栓治療的主要目標包括梗塞血管的早期和持久再灌注。急性MI的現(xiàn)行療法，既包括纖溶酶原激活物如組織纖溶酶原激活物(tPA)或鏈激酶，也包括抗凝劑如未分級肝素、低分子量肝素或直接凝血酶抑制劑或者抗血小板劑如阿司匹林或血小板糖蛋白IIb/IIIa阻斷劑。參見Topol，Am Heart J，136，S66-S68(1998)。這些治療的聯(lián)合，是基于這樣的觀察凝塊形成和溶解是動態(tài)過程，而凝血酶活性和生成在閉塞性血栓形成之后以及在凝塊溶解期間和之后仍在繼續(xù)。見Granger等，J Am CollCardiol，31，497-505(1998)。
治療急性MI的最適策略依然難以捉摸，可利用的制劑和治療方案則顯示出正負兩方面的特性。舉例來說，纖維蛋白-結(jié)合的凝血酶對于肝素所致的抑制作用不敏感(Becker等，″Chemistry and Biology of Serpins″，PlenumPress，New York(1997)一書的第6章)，而停止肝素治療后凝血酶活性則表現(xiàn)出反彈性增加，于是觀察到中止肝素后24小時內(nèi)再梗塞增加。見Watkins等，Catheterization and Cardiovascular Diagnosis，44，257-264(1998)andGranger，Circulation，91，1929-1935(1995)。而且，抗血小板劑可能伴發(fā)出血或血小板減少癥。
再有，大量臨床試驗業(yè)已證實，高劑量溶栓劑導致血漿止血標志(hemostatic marker)顯著改變。見Rao等，J Clin Invest，101，10-14(1988)；Bovill等，Ann Int Med，115，256-265(1991)；Neuhaus等，J Am Coll Cardiol，19，885-891(1992)。盡管提高tPA濃度造成血凝塊溶解增加，但是這些止血標志的改變反映出溶栓治療不利之處的增大，特別是嚴重出血的發(fā)生。
在血栓栓塞性中風的情況下，在出現(xiàn)中風癥狀的早期(3小時內(nèi))實施溶栓治療以預(yù)防不可逆損害。目前許可用于局部缺血和/或梗塞組織再灌注的溶栓劑，包括纖溶酶原激活物tPA、尿激酶和鏈激酶。然而，溶栓治療與嚴重的出血傾向有關(guān)，在血栓栓塞性中風的溶栓治療中，主要擔心的是治療將通過誘發(fā)出血而使局部缺血性損傷惡化。
很顯然，存在著對在控制栓塞性病癥中有效、同時又保持止血功能的抗血栓劑的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面，是治療動物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗體或抗體片段。
本發(fā)明另一方面，是治療動物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段和纖溶酶原激活物。
本發(fā)明的再一方面，是在動物血栓栓塞后誘發(fā)局部缺血的治療中降低所需溶栓劑劑量的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段和溶栓劑。
本發(fā)明還一方面，是預(yù)防動物血栓栓塞性中風的方法，包括對具有發(fā)生血栓栓塞性中風風險的動物施用抗-因子IX抗體或抗體片段。
附圖簡述

圖1是描述含有鼠抗-因子IX mAbs BC1和BC2的正常人血漿滴定實驗結(jié)果的圖。
圖2是描述含鼠抗-因子IX mAbs 9E4(2)F4和11G4(1)B9的正常人血漿滴定的實驗結(jié)果的圖。
圖3是描述含鼠抗-因子X mAbs HFXHC和HFXLC以及鼠抗-因子XImAb HFXI的正常人血漿滴定的實驗結(jié)果的圖。
圖4是描述在大鼠頸動脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IX mabs于60分鐘時對激活的部分凝血激酶時間(aPTT)影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖5是描述在大鼠頸動脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IX mabs于60分鐘時對凝血酶原時間影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖6是描述大鼠頸動脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IXmabs對頸動脈血流的閉塞影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖7是描述在大鼠頸動脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IX mabs對血栓重量影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖8是描述在大鼠頸動脈血栓形成模型中肝素、鼠因子IX mab BC2、嵌合因子IX mab和人源化因子IX mAbs于60分鐘時對aPTT影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖9是描述在大鼠頸動脈血栓形成模型中肝素、鼠因子IX mab BC2、嵌合因子IX mab和人源化因子IX mAbs對血栓重量影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖10是描述抗-因子IX mab和肝素對tPA-介導的再灌注影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖11描述抗-因子IX mab和肝素對頸動脈脈管開放作用(patency)影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖12是描述抗-因子IX mab和肝素對恢復(fù)血流時間影響的實驗結(jié)果的直方圖。
圖13描述tPA對止血參數(shù)、纖維蛋白原、纖溶酶原和抗纖溶酶的影響。
圖14描述tPA、肝素和抗-因子IX mab對aPTT的影響。
圖15描述在血栓栓塞性中風中tPA、SB 249417、tPA與SB 249417聯(lián)合對合計的(aggregate)平均梗塞體積的影響。
發(fā)明詳述在本說明書中引證的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請，均如前面那樣引入本文作為參考。
本發(fā)明提供針對凝血因子的多種抗體、改變的抗體及其片段，它們以自限性中和活性(self-limiting neutralizing activity)為特征。優(yōu)選地，凝血因子來自固有的或普通的凝血途徑。更優(yōu)選，抗-凝血因子抗體是抗-因子IX、抗-因子IXa、抗-因子X、抗-因子Xa、抗-因子XI、抗-因子XIa、抗-因子VIII、抗-因子VIIIa、抗-因子V、抗-因子Va、抗-因子VII、抗-因子VIIa、抗凝血酶或抗-凝血酶原。尤其優(yōu)選的是抗-因子IX抗體。例舉的抗-凝血因子抗體，是針對人因子IX的人源化單克隆抗體SB 249413、SB 249415、SB249416、SB 249417、SB 257731和SB 257732，針對人因子IX的嵌合單克隆抗體chαFIX、針對人因子IX和/或因子IXa的鼠單克隆抗體BC1、BC2、9E4(2)F4，和11G4(1)B9，或者分別針對人因子X和XI的小鼠單克隆抗體HFXLC和HFXI。尤其優(yōu)選的是抗-人因子IX單克隆抗體SB 249417。
通過慣常的雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示組合文庫、免疫球蛋白鏈改組和人源化技術(shù)以產(chǎn)生新的自限性中和抗體，可以制備本發(fā)明抗體。還包括在內(nèi)的是具有自限性中和活性的全長人mAbs。這些產(chǎn)物對于與下述有關(guān)的血栓性和栓子性病癥的治療和藥物組合物非常有用心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、房性纖顫、中風、腎臟損害、肺栓塞、深靜脈血栓形成、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀血管成形術(shù)、播散性血管內(nèi)凝血、敗血癥、人造器官、分流器或假體。
本文所用術(shù)語″自限性中和活性″，是指能與人凝血因子、優(yōu)選是來自固有和普通途徑的凝血因子相結(jié)合并以使得產(chǎn)生凝血的有限調(diào)變(limitedmodulation)之方式抑制血栓形成的抗體的活性，所述凝血因子包括因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa和V/Va、VII/VIIa和凝血酶/凝血酶原?！迥挠邢拚{(diào)變″定義為凝血時間增加(通過激活的部分凝血激酶時間(activated partial thromboplastin time，aPTT)延長測得)，盡管單克隆抗體濃度增加血漿卻保持aPTT達到其最大值的可凝性。凝血的此種有限調(diào)變，與增加肝素濃度時血漿呈現(xiàn)不凝性并顯示無限aPTT的情形形成對照。優(yōu)選地，本發(fā)明方法的最大aPTT值落入肝素治療范圍之內(nèi)。最優(yōu)選地，最大aPTT在約35秒至約100秒范圍內(nèi)，此相當于正常對照aPTT值的約1.5～約3.5倍。在本發(fā)明一個實施方案中，aPTT延長而沒有顯著的凝血酶原時間(PT)延長。
術(shù)語″聯(lián)合″，是指單個療程中一種治療劑在施用另一種治療劑之前、之后或者與之一同施用。
″改變的抗體″，是指由改變了的免疫球蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白，它可以通過在一個選擇的宿主細胞中進行表達而獲得。此類改變的抗體是基因工程抗體(例如，嵌合的或人源化抗體)或者缺少全部或部分免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體片段，例如Fv、Fab、Fab′或F(ab′)2等。
″改變的免疫球蛋白編碼區(qū)″，是指編碼本發(fā)明改變的抗體的核苷酸序列。當改變的抗體是CDR-移植的或人源化抗體時，將編碼非-人免疫球蛋白免疫球蛋白互補決定區(qū)(CDRs)的序列插入到含有人可變框架區(qū)序列的第一個免疫球蛋白配偶體(partner)中。任選地，第一個免疫球蛋白配偶體可操作地與第二個免疫球蛋白配偶體相連接。
″第一個免疫球蛋白配偶體″，是指編碼人框架區(qū)或者人免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列，在所述區(qū)中，天然(或天然發(fā)生的)CDR-編碼區(qū)被供體抗體的CDR-編碼區(qū)所替換。人可變區(qū)可以是免疫球蛋白重鏈、輕鏈(或者重、輕二鏈)、其類似物或功能片段。此類位于抗體(免疫球蛋白)可變區(qū)內(nèi)的CDR區(qū)，可以用本領(lǐng)域已知的方法予以測定。譬如，Kabat等在″Sequences ofProtein of Immunological Interest″，4th Ed.，U.S.Department of Health and人Services，National Institutes of Health(1987)中，公開了尋找CDRs的原則。另外，已知計算機程序?qū)τ诖_定CDR區(qū)/結(jié)構(gòu)非常有用。
″第二個免疫球蛋白配偶體″，是指編碼蛋白或肽的另一核苷酸序列，第一個免疫球蛋白配偶體就是與該第二個免疫球蛋白配偶體在框架融合或者通過任選的傳統(tǒng)的接頭序列相融合(即，可操作地聯(lián)接)。優(yōu)選地，它是免疫球蛋白基因。第二個免疫球蛋白配偶體可包括編碼相同(即同源的，第一和第二改變的抗體來源相同)或另一(即異源的)目的(interest)抗體整個恒定區(qū)的核苷酸序列。它可以是免疫球蛋白重鏈或輕鏈(或者作為單個多肽一部分的重、輕二鏈)。第二個免疫球蛋白配偶體并不局限于具體免疫球蛋白種類或者同種型。而且，第二個免疫球蛋白配偶體可包括免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分，諸如在Fab，或F(ab)2(即，適當人恒定區(qū)或框架區(qū)的不連續(xù)部分)中發(fā)現(xiàn)的那些。此免疫球蛋白配偶體也可包括編碼暴露在宿主細胞外表面的膜內(nèi)在蛋白的序列(例如作為噬菌體展示文庫的一部分)，或編碼分析或診斷檢測所用蛋白的序列(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶)等。
術(shù)語Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′或F(ab′)2使用其標準含義，參見Harlow等，in ″AntibodyA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory，(1988)。
如本文所用的那樣，″基因工程抗體”描述一類改變的抗體，即全長合成抗體(例如與抗體片段相對的嵌合或人源化抗體)，其中所選受體抗體的輕鏈和/或重鏈可變域的一部分被來自一個或多個供體抗體的類似部分替換，所述供體抗體對所選抗原表位具有特異性。舉例來說，此類分子可包括以人源化重鏈與未修飾輕鏈(或嵌合輕鏈)結(jié)合(或反之亦然)為特征的抗體?；蚬こ炭贵w也可以改變編碼受體抗體輕鏈和/或重鏈可變域框架區(qū)的核苷酸序列以便保持供體的抗體結(jié)合特異性為特征。這些抗體可包括用來自本文所述供體抗體的CDRs替換來自受體抗體的一個或多個或CDRs(優(yōu)選所有CDRs)。
″嵌合抗體″，是指一類含有與源自受體抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)相結(jié)合的源自供體抗體的天然存在可變區(qū)(輕鏈和重鏈)的基因工程抗體。
″人源化抗體″，是指一類具有源自非-人供體免疫球蛋白CDRs、分子的其余免疫球蛋白衍生部分來自一種或多種人免疫球蛋白的基因工程抗體。另外，框架支持殘基可以改變以保存結(jié)合親合性。參見例如Queen等，ProcNatl Acad Sci USA，86，10029-10032(1989)，Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991)。
術(shù)語″供體抗體″，是指為第一免疫球蛋白配偶體貢獻其可變區(qū)、CDRs或其功能片段或其類似物的核苷酸序列，以便提供改變的免疫球蛋白編碼區(qū)并導致表達具有供體抗體的抗原特異性和中和活性的改變抗體的單克隆或重組抗體。適用于本發(fā)明的一個供體抗體是命名為BC2的鼠自限性中和單克隆抗體。其它適宜供體抗體包括命名為BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI的鼠自限性中和單克隆抗體。
術(shù)語″受體抗體″，是指與供體抗體異源的的單克隆或重組抗體，它為第一免疫球蛋白配偶體提供編碼其重鏈和/或輕鏈框架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。優(yōu)選地，人抗體是受體抗體。
″CDRs″定義為抗體互補決定區(qū)氨基酸序列，它們是免疫球蛋白重鏈和輕鏈的超變區(qū)。參見例如Kabat等，″Sequences of Protein of ImmunologicalInterest″，4th Ed.，U.S.Department of Health and human Services，NationalInstitutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可變部分，有3個重鏈和3個輕鏈CDRs或CDR區(qū)。因此，本文中″CDRs″是指所有3個重鏈CDRs，或所有3個輕鏈CDRs或者所有的重鏈和輕鏈CDRs，如果合適的話。
CDRs為抗體與抗原或者抗原表位結(jié)合提供大多數(shù)接觸殘基。本發(fā)明目標CDRs來自于供體抗體可變重鏈和輕鏈序列，并包括天然存在CDRs的類似物，所述類似物也具有或者保持所衍自的供體抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
″具有抗原結(jié)合特異性或者中和能力″，是指例如，盡管mAb BC2以一定水平的自限性中和活性為特征，但是由適宜結(jié)構(gòu)環(huán)境中BC2核苷酸序列編碼的CDR可以具有低的或者高的活性。預(yù)計BC2的CDRs在該環(huán)境中仍然與BC2一樣識別相同的表位(一個或多個表位)。
″功能片段″是保持與所來自的抗體相同抗原結(jié)合特異性和/中和活性的部分重鏈或輕鏈可變序列(例如，免疫球蛋白可變區(qū)氨基或羧基末端小的缺失)。
″類似物″是由至少一個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述修飾可以是化學修飾或者是少數(shù)氨基酸(即不超過10個氨基酸)取代或重排，所述修飾允許氨基酸序列保持未修飾序列的生物學特性，例如抗原特異性和高親合性。例舉的類似物包括通過取代建構(gòu)，從而在CDR-編碼區(qū)內(nèi)或編碼區(qū)附近產(chǎn)生一定的核酸內(nèi)切酶限制性酶切位點的沉默突變。
類似物也可以等位變異(allelic variations)的方式出現(xiàn)?！宓任蛔儺惢蛐揎棥迨蔷幋a本發(fā)明氨基酸或肽序列的核苷酸序列的改變。此變異或修飾可以緣于遺傳密碼的簡并或者是特意進行工程改造的，以提供所需的特性。這些變異或修飾可以致使或者不致使任何編碼的氨基酸序列發(fā)生改變。
術(shù)語″效應(yīng)劑″，是指非-蛋白載體分子，所述改變的抗體、和/或天然或合成的供體抗體輕鏈或重鏈或供體抗體的其它片段通過常規(guī)手段與之結(jié)合。此類非-蛋白載體可包括診斷領(lǐng)域中使用的常規(guī)載體，例如聚苯乙烯或其它塑料珠，多糖，例如BIAcore(Pharmacia)系統(tǒng)中所用的，或者在醫(yī)療領(lǐng)域中有用的和對人與動物施用安全的其它非-蛋白物質(zhì)。其它效應(yīng)劑可包括螫合重金屬原子或放射性同位素的大環(huán)化合物(macrocycle)。此類效應(yīng)劑對增加改變的抗體的半衰期是有用的，例如聚乙二醇。
為用于構(gòu)建本發(fā)明抗體、改變抗體及片段，可使用非-人種屬如牛、羊、猴、雞、嚙齒類(例如鼠和大鼠)以產(chǎn)生通過人凝血因子，優(yōu)選因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原或來自它們的肽表位進行呈遞所需的免疫球蛋白。使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)以提供將非-人mAb分泌為各自的凝血因子的雜交瘤細胞株。然后，如實施例部分所描述的那樣，使用包被96-孔板的因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原，或者使用與抗生蛋白鏈菌素包被的板相結(jié)合的生物素?；蜃覫X/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原，進行此類雜交瘤的結(jié)合篩選。或者，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或本發(fā)明所用的技術(shù)產(chǎn)生全長人mAbs。
本發(fā)明一示范性、自限性中和mAb是mAb BC2，它是一種可用于發(fā)展嵌合或人源化分子的鼠抗體。BC2 mAb以對凝血時間的自限性抑制活性為特征。如aPTT試驗測定的那樣，BC2 mAb對凝血時間的作用顯示出約100秒的最大值。BC2 mAb也結(jié)合因子IXa，抑制因子IX向IXa轉(zhuǎn)變并抑制因子IXa活性。二價金屬輔因子是活性所需的，mAb對于Ca2+顯示出較Mn2+更大的偏愛。在aPTT試驗中，觀察到的IC50為約50nM。BC2 mAb顯示出與大鼠的種屬-交叉反應(yīng)性而且是IgG2a同位型。
其它所需供體抗體是鼠mAbs，BC1、9E4(2)F4和11 G4(1)B9。這些mAbs以對凝血時間的自限性抑制活性為特征。如aPTT試驗中測得的那樣，這些mAbs對凝血時間作用顯示出的最大值為對9E4(2)F4約90～100秒，對11G4(1)B9約80秒。BC1 mAb也結(jié)合因子IXa，抑制因子IXa活性但是不抑制因子IX向IXa的轉(zhuǎn)變。其活性不需要金屬輔因子。在aPTT試驗中觀察到BC1的IC50為約35nM。BC1 mAb是IgG1同位型。
另一種以對凝血時間自限性抑制活性為特征的所需的供體抗體是鼠mAb HFXLC。如aPTT試驗測得的那樣，HFXLC mAb對凝血時間的作用顯示出約50～60秒的最大值。HFXLC mAb結(jié)合因子X輕鏈，并抑制因子X/Xa活性。aPTT試驗中觀察到的IC50是約20nM。
另一種以對凝血時間自限性抑制活性為特征的所需的供體抗體是小鼠mAb，HFXI。如aPTT試驗測得的那樣，HFXImAb對凝血時間的作用顯示出約100秒的最大值。HFXLC mAb結(jié)合因子XI并抑制因子XI/XIa活性。在aPTT試驗中觀察到的IC50是約30nM。
盡管不意欲受到有關(guān)作用機理的任何具體理論的限制，但是這些mAbs看起來通過非競爭性或者變構(gòu)機理來調(diào)節(jié)凝血，因而僅達到了部分抑制作用。
本發(fā)明不限于使用BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI或它們的超變(即CDR)序列。因而，任何其它以自限性中和活性為特征的適合的高親和力抗體和相應(yīng)的CDRs可被替換。在下面描述中，將BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI通稱為供體抗體，這樣做只是為了使說明和描述簡明。
本發(fā)明也包括使用衍生自針對適合的人凝血因子或輔因子的mAbs的Fab片段或F(ab′)2片段。這些片段作為抗凝血因子，優(yōu)選抗因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原的具有自限性中和活性的試劑是非常有用的。Fab片段包含整個輕鏈和重鏈的氨基末端部分。F(ab′)2片段由通過二硫鍵結(jié)合在一起的2個Fab片段所形成。mAbsBC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI以及其它類似的高親和力抗體，提供可用常規(guī)方法得到的Fab片段和F(ab′)2片段，所述常規(guī)方法例如用適當?shù)牡鞍姿饷?，木瓜蛋白酶?或胃蛋白酶裂解mAb，或采用重組方法。這些Fab和F(ab′)2片段本身作為治療劑、預(yù)防劑或診斷劑非常有用，并且作為包括對于形成本文所述重組或人源化抗體有用的可變區(qū)和CDR序列的序列供體是非常有用的。
通過組合噬菌體文庫(參見例如Winter等，Ann Rev Immunol，12，433-455(1994))或通過免疫球蛋白鏈改組(參見例如Marks等，Bio/Technology，10，779-783(1992)(涉及到的這兩篇文獻以其全部在此引入作為參考)，可以構(gòu)建Fab和F(ab′)2片段，其中使來自選擇抗體(例如BC2)的Fd或vH免疫球蛋白與輕鏈免疫球蛋白的所有組成成分vL(或vK)相結(jié)合，以形成新的Fabs。相反，使來自選擇抗體的輕鏈免疫球蛋白與重鏈免疫球蛋白的所有組成成分vH(或Fd)結(jié)合，以形成新的Fabs。通過使mAbBC2的Fd與輕鏈免疫球蛋白的所有組成成分結(jié)合，可以得到自限性中和因子IX Fabs。因此，人們能夠從鏈改組技術(shù)中回收(recover)具有獨特序列(核苷酸和氨基酸)的中和Fabs。
上述mAb BC2或其它抗體可以捐獻序列，如可變重鏈和/或輕鏈肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段和它們的類似物，以及編碼它們的在設(shè)計和得到以供體抗體抗原結(jié)合特異性為特征的各種改變抗體中有用的核苷酸序列。
本發(fā)明編碼可變輕鏈和重鏈肽序列的核苷酸序列或其或片段，對于在編碼CDRs或框架區(qū)的核苷酸序列內(nèi)特異性變化的誘變引入，和對于使產(chǎn)生的修飾或融合的核苷酸序列整合入表達質(zhì)粒中是非常有用的。例如，框架和CDR-編碼區(qū)核苷酸序列的沉默取代，可用于產(chǎn)生便利于插入誘變的CDR和/或框架區(qū)的限制性酶切位點。這些CDR-編碼區(qū)可用于構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體。
BC2重鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO5和7。來自此區(qū)的CDR序列列于SEQ ID NO8、9和10。
BC2輕鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NOs6和11。來自該區(qū)的CDR序列列于SEQ ID NOs12、13和14。
把遺傳密碼的簡并考慮進來，可以構(gòu)建編碼本發(fā)明可變重鏈和輕鏈氨基酸序列和CDR序列以及它們的功能片段和具有相同的供體抗體抗原結(jié)合特異性的類似物的各種編碼序列。編碼可變鏈肽序列或CDRs的本發(fā)明分離的核苷酸序列或其片段，可用于產(chǎn)生改變的抗體，例如本發(fā)明嵌合或人源化抗體或當與第二個免疫球蛋白配偶體可操作地結(jié)合時的其它基因工程抗體。
應(yīng)當指出的是，除了編碼本文所述改變抗體和抗體部分的核苷酸序列外，其它這樣的核苷酸序列也在本發(fā)明考慮之中，諸如那些與天然CDR-編碼序列互補的或與CDR-編碼區(qū)附近修飾的人框架區(qū)互補的核苷酸序列。有用的DNA序列包括那些在嚴謹條件下與該DNA序列雜交的序列，見T.Maniatis等，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory(1982)，pp.387-389。此種嚴謹雜交條件的一個實例是，65℃4XSSC，接著于65℃用0.1XSSC洗滌1小時?；蛘?，示范性的嚴謹雜交條件是，50％甲酰胺，42℃ 4XSSC。優(yōu)選地，這些雜交DNA序列長度上至少約18個核苷酸，即大約CDR的大小。
改變的免疫球蛋白分子可編碼改變的抗體，后者包括基因工程抗體如嵌合抗體和人源化抗體。一種所期望的改變的免疫球蛋白編碼區(qū)，包含編碼具有因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原抗體，優(yōu)選如本發(fā)明提供的高親和力抗體的抗原特異性的肽的CDR-編碼區(qū)，所述編碼區(qū)插入到第一免疫球蛋白配偶體諸如人框架或人免疫球蛋白可變區(qū)。
優(yōu)選地，第一免疫球蛋白配偶體可操作地與第二免疫球蛋白配偶體連接。第二個免疫球蛋白配偶體定義同上，并可包括編碼有關(guān)第二抗體區(qū)的序列，例如Fc區(qū)。第二免疫球蛋白配偶體也可包括編碼另一免疫球蛋白的序列，輕鏈或重鏈恒定區(qū)在讀框內(nèi)或者通過聯(lián)結(jié)子序列而與所述另一免疫球蛋白序列融合。針對凝血因子的功能片段或類似物的基因工程抗體，也可被設(shè)計引出與相同抗體的結(jié)合性增強。
第二個免疫球蛋白配偶體也可與上述定義的包括非-蛋白載體的效應(yīng)劑結(jié)合，第二個免疫球蛋白配偶體可以通過常規(guī)方式可操作地與效應(yīng)劑相連接。
第二個免疫球蛋白配偶體(例如抗體序列)和效應(yīng)劑之間的融合或連接可通過任何適宜方法來完成，例如通過常規(guī)的共價或離子鍵、蛋白質(zhì)融合或異-雙功能交聯(lián)劑如碳二亞胺、戊二醛等。此類技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知并描述在常用化學和生物化學課文中。
另外，只是為第二個免疫球蛋白配偶體和效應(yīng)劑之間提供所需空間量的常規(guī)接頭序列也可構(gòu)建在改變的免疫球蛋白編碼區(qū)中。此類聯(lián)結(jié)子的設(shè)計也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
此外，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)修飾本發(fā)明分子的信號序列以增強表達。
優(yōu)選的改變的抗體包含具有mAb BC2的抗原結(jié)合特異性的可變重鏈和/或輕鏈肽或蛋白序列，例如VH和VL鏈。本發(fā)明還期望的另一改變的抗體，是以含有鼠抗體分子BC2重鏈和/或輕鏈可變區(qū)至少一個，優(yōu)選全部CDRs的氨基酸序列為特征的抗體，所述鼠抗體分子BC2的其余序列來自人來源或是其功能片段或類似物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明改變的抗體已經(jīng)附著上其它試劑。譬如，重組DNA技術(shù)用于產(chǎn)生本發(fā)明的改變的抗體，其中完全抗體分子的Fc片段或CH2 CH3結(jié)構(gòu)域已被酶或其它可檢測分子替換(即多肽效應(yīng)子或者報導分子(reporter molecular))。
第二個免疫球蛋白配偶體也可以可操作地與異源于含CDR序列的非-免疫球蛋白肽、蛋白或其片段相連接，所述含CDR序列對凝血因子，優(yōu)選因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原具有抗原特異性。產(chǎn)生的蛋白顯示出非-免疫球蛋白抗原特異性和表達特征(characteristic)。融合配偶體特征可以是例如功能性特征，如另一結(jié)合或受體結(jié)構(gòu)域，或治療特征，如果融合配偶體本身是治療性蛋白的話，或另外的抗原特征。
本發(fā)明另一期望的蛋白可包括完整抗體分子、具有全長重鏈和輕鏈或者它們的任何不連續(xù)片段如Fab或F(ab′)2片段、重鏈二聚體或它們的任何小的重組片段如FV、或者單鏈抗體(SCA)或者任何與所選供體mAb(例如mAb BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI)具有相同特異性的其它分子。此類蛋白可以改變的抗體形式使用或者以其未融合形式使用。
每當?shù)诙庖咔虻鞍着渑俭w來自不同于供體抗體的抗體時，例如免疫球蛋白框架或恒定區(qū)的任何同位型或種類(class)，就產(chǎn)生基因工程抗體。基因工程抗體可包括來自一個來源(例如受體抗體)的免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)和可變框架區(qū)，來自供體抗體的一個或多個(優(yōu)選所有的)CDRs，例如本文所述的抗-因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原抗體。另外，可以進行對受體mAb輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)在核酸或氨基酸水平或者供體CDR區(qū)的改變，例如缺失、取代或添加，以保持供體抗體抗原結(jié)合特異性。
此類基因工程抗體設(shè)計使用凝血因子mAb(任選地如前所述進行修飾)可變重鏈和/或輕鏈的一個(或者二者均用)或者一個或多個重鏈或輕鏈CDRs。本發(fā)明基因工程抗體顯示出自限性中和活性。
此基因工程抗體可包括人源化抗體或嵌合抗體，所述人源化抗體包含選擇的人免疫球蛋白或亞型的框架區(qū)，所述嵌合抗體含有與凝血因子抗體功能片段融合的人重鏈和輕鏈恒定區(qū)。適合的人(或其它動物)受體抗體可以通過與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列同源性而選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫例如KABAT數(shù)據(jù)庫、Los Alamos數(shù)據(jù)庫和Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫。以與供體抗體框架區(qū)同源性(基于氨基酸)為特征的人抗體，可能適宜于為插入供體CDRs提供重鏈可變框架區(qū)?？砂凑疹愃品绞竭x擇能夠貢獻輕鏈可變框架區(qū)的適宜受體抗體。應(yīng)當指出，受體抗體重鏈和輕鏈并非必需來自相同的受體抗體。
優(yōu)選地，異源框架和恒定區(qū)選自人免疫球蛋白類(class)和同位型，如IgG(亞型1至4)、IgM、IgA和IgE。然而，受體抗體不必要僅包含人免疫球蛋白蛋白序列。舉例來說，可以購建這樣一個基因，其中編碼人免疫球蛋白鏈一部分的DNA序列與編碼非-免疫球蛋白氨基酸序列如多肽效應(yīng)子或報導分子的DNA融合。
特別優(yōu)選的人源化抗體包含插入到選擇的人抗體序列框架區(qū)上的BC2s的CDRs。為中和人源化抗體，來自因子IX抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的一個、兩個或優(yōu)選三個CDRs被插入到選擇的人抗體序列的框架區(qū)中，取代后者抗體的天然CDRs。
優(yōu)選地，在人源化抗體中，人重鏈和輕鏈的可變域均已經(jīng)通過一個或多個CDR替換而被基因工程改造。使用全部6個CDRs或小于6個CDRs的各種組合是可能的。優(yōu)選6個CDRs被全部替換。使用來自人受體抗體未修飾的輕鏈作為輕鏈，僅僅在人重鏈替換CDRs是可能的。而且，依靠常用抗體數(shù)據(jù)庫，相容性輕鏈還可以選自另一個人的抗體。基因工程抗體的其余部分可來自任何適宜的受體人免疫球蛋白。
因此，基因工程人源化抗體優(yōu)選具有天然人抗體結(jié)構(gòu)或其片段，并且具有對于有效治療應(yīng)用而言所需的結(jié)合特性，所述治療例如治療人血栓性和栓子性疾病。
最優(yōu)選地，人源化抗體具有SEQ ID NO31、52、或89所列出的重鏈氨基酸序列。也最優(yōu)選的是，人源化抗體具有SEQ ID NO44、57、62、74、78或99所示輕鏈氨基酸序列。特別優(yōu)選人源化抗體SB 249413，其重鏈具有SEQ ID NO31所示的氨基酸序列而其輕鏈具有SEQ ID NO44所示氨基酸序列。也特別優(yōu)選人源化抗體SB 249415，其重鏈具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列而其輕鏈SEQ ID NO57所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB 249416，其重鏈具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列而輕鏈具有SEQ ID NO62所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB 249417，其重鏈具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列和輕鏈具有SEQ ID NO74所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB 257731，其重鏈具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列和輕鏈具有SEQ ID NO78所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB 257732，其重鏈具SEQ ID NO89所示氨基酸序列和輕鏈具有SEQ ID NO99所示氨基酸序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當懂得，不必影響供體抗體(即類似物(analog))特異性和高親和力，通過改變可變域氨基酸，可將基因工程抗體進一步修飾?？梢灶A(yù)見，重鏈和輕鏈氨基酸可被可變域框架或CDRs或者框架和CDRs的其它氨基酸取代。這些取代可由來自特定亞組的供體抗體或共有序列提供。
另外，可改變恒定區(qū)以增強或降低本發(fā)明分子的選擇特性。譬如，二聚化，與Fc受體結(jié)合，或結(jié)合并激活補體的能力(參見例如，Angal等，MolImmunol，30，105-108(1993)，Xu等，J Biol Chem，269，3469-3474(1994)，Winter等，EP 307434-B)。
改變的抗體是嵌合抗體的話，它有別于前述人源化抗體，因為它提供全部的非-人供體抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，包括框架區(qū)，與重鏈和輕鏈的人免疫球蛋白恒定區(qū)相結(jié)合?？梢灶A(yù)見到，相對于本發(fā)明人源化抗體而言保留了另外的非-人序列的嵌合抗體將會在人體引發(fā)顯著的免疫應(yīng)答。
此類抗體在預(yù)防和治療下面討論的血栓和栓子性病癥中特別有用。
優(yōu)選地，通過下述過程，可變輕鏈和/或重鏈序列和mAb BC2或其它適宜供體mAbs(如BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI)的CDRs以及它們的編碼核苷酸序列，用于構(gòu)建本發(fā)明的改變的抗體，優(yōu)選人源化抗體。也使用相同或類似的技術(shù)以產(chǎn)生本發(fā)明的其它實施方案。
按照常規(guī)克隆產(chǎn)生選擇供體mAb(例如小鼠抗體BC2)的雜交瘤，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA，例如Sambrook等在″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory(1989)中描述的技術(shù)。使用多聚核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶，得到含有至少CDR-編碼區(qū)的BC2的可變重鏈和輕鏈區(qū)和為保持供體mAb結(jié)合特異性以及保持來自人免疫球蛋白抗體鏈的免疫球蛋白-來自部分所需的受體mAb輕鏈和/或重鏈可變域框架區(qū)。使用已知數(shù)據(jù)庫通過與其它抗體比較來鑒定CDR-編碼區(qū)。
接著，制備小鼠/人嵌合抗體并分析結(jié)合能力。此嵌合抗體包含與人Ig兩條鏈恒定區(qū)結(jié)合的全部非-人供體抗體VH和VL區(qū)。
使用計算機數(shù)據(jù)庫(例如KABAT)鑒定來自人抗體重鏈可變區(qū)的同源性框架區(qū)，并選擇與BC2具有同源性的人抗體作為受體抗體。采用在框架區(qū)中任選核苷酸取代以整合入限制性酶切位點的手段，設(shè)計人抗體框架內(nèi)含有BC2 CDR-編碼區(qū)的合成的重鏈可變區(qū)序列。然后，使用長的合成寡聚體來合成設(shè)計的序列。或者，設(shè)計的序列通過重疊寡核苷酸來合成、通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行擴增并且矯正錯誤?？砂搭愃品绞皆O(shè)計適宜的輕鏈可變框架區(qū)。
人源化抗體可來自嵌合抗體，或優(yōu)選地，通過將來自重鏈和輕鏈的供體mAb CDR-編碼區(qū)適當?shù)夭迦脒x擇的重鏈和輕鏈框架內(nèi)而合成得到。或者，使用標準誘變技術(shù)來制備本發(fā)明人源化抗體。因此，產(chǎn)生的人源化抗體含有人框架區(qū)和供體mAb CDR-編碼區(qū)。接著可進行框架殘基的操作。產(chǎn)生的人源化抗體可在重組宿主細胞例如COS、CHO或骨髓瘤細胞中表達。對其它適宜的因子IX-特異性或其它凝血因子-特異性、自限性、中和、高親和力、非-人抗體使用該項技術(shù)，可以制得其它人源化抗體。
通過把改變抗體的編碼序列與常規(guī)調(diào)節(jié)控制序列可操作地結(jié)合，產(chǎn)生常規(guī)的表達載體或重組質(zhì)粒，所述常規(guī)調(diào)節(jié)控制序列能夠控制在宿主細胞中復(fù)制和表達，和/或由宿主細胞的分泌。調(diào)節(jié)序列包括啟動子序列(例如CMV啟動子)和信號序列(可以來自其它已知抗體)。類似地，可以產(chǎn)生具有編碼互補性抗體輕鏈或重鏈的DNA序列的第二個表達載體。優(yōu)選地，為盡可能確保每一個多肽鏈被功能性表達，除有關(guān)的編碼序列和選擇標志之外，此第二個表達載體與第一個表達載體完全相同?；蛘撸淖兊目贵w的重鏈和輕鏈編碼序列存在于單個載體中。
使用常規(guī)技術(shù)，將選擇的宿主細胞與第一和第二載體共轉(zhuǎn)染(或僅用一個載體轉(zhuǎn)染)以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)染宿主細胞，其同時包含重組或合成的輕鏈和重鏈。然后，用常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞來產(chǎn)生本發(fā)明的基因工程抗體。通過適當?shù)膶嶒?，例如ELISA或RIA，把包括重組重鏈和/或輕鏈相結(jié)合的人源化抗體從培養(yǎng)物中篩選出來。類似的常規(guī)技術(shù)可用于構(gòu)建其它本發(fā)明的改變抗體和分子。
本發(fā)明方法和組分構(gòu)建物中使用的適于克隆和亞克隆步驟的載體，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員加以選擇。譬如，可使用pUC克隆載體系列，如pUC19，可自供應(yīng)商商購得到，所述供應(yīng)商如Amersham或Pharmacia。另外，能夠迅速復(fù)制、具有豐富克隆位點和選擇性基因(例如抗生素抗性)并容易操縱的任何載體，均可用于克隆。因此，在本發(fā)明中，克隆載體的選擇并不是限制因素。
類似地，用于表達本發(fā)明基因工程抗體的載體，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員從任何常規(guī)載體中予以選擇。載體也含有指導異源DNA序列在選擇的宿主細胞中復(fù)制和表達的選擇的調(diào)節(jié)序列(如CMV啟動子)。這些載體含有上述DNA序列，其編碼基因工程抗體或改變的免疫球蛋白編碼區(qū)。另外，載體可以整合選擇的為便于操作通過插入所需限制性酶切位點而修飾的免疫球蛋白序列。
表達載體也以適于擴增表達異源DNA序列的基因為特征(例如哺乳動物二氫葉酸還原酶基因(DHFR))。其它優(yōu)選的載體序列包括聚腺苷酸信號序列，如來自牛生長激素(BGH)和β球蛋白啟動子序列(betaglopro)。可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成對于本發(fā)明有用的表達載體。
通過已知的引導重組DNA產(chǎn)物在選擇宿主中表達和/或分泌所用的方法，可以從商業(yè)或天然來源或合成得到此類載體的組分，例如復(fù)制子、選擇基因、增強子、啟動子，信號序列等。為了此目的，也可選擇其它無數(shù)類型的為本領(lǐng)域所知的用于哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母和真菌表達的適宜表達載體。
本發(fā)明也包括用含有基因工程抗體或其改變的免疫球蛋白分子編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了的細胞系。對于此類克隆載體克隆和其它操作有用的宿主細胞，也是常規(guī)的。然而，最期望來自各種大腸桿菌株的細胞用于本發(fā)明構(gòu)建改變的抗體中的克隆載體的復(fù)制和其它步驟。
表達本發(fā)明基因工程抗體或改變的抗體的適宜的宿主細胞或細胞系，優(yōu)選哺乳動物細胞如CHO、COS(纖維母細胞(例如3T3))和髓樣細胞，更加優(yōu)選CHO或髓樣細胞?？梢允褂萌思毎@樣使得分子被用人糖基化模式予以修飾。或者，可以使用其它真核細胞系。適宜哺乳動物宿主細胞的選擇，以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴增、篩選、產(chǎn)物生產(chǎn)和純化的方法，均為本領(lǐng)域所已知。參見例如Sambrook等，出處同上。
證明細菌細胞作為適宜表達本發(fā)明重組Fabs的宿主細胞是非常有用的(參見例如，Plückthun，A.，Immunol Rev，130，151-188(1992))。然而，由于在細菌細胞中表達的蛋白呈未折疊或不適當?shù)恼郫B形式或呈非-糖基化形式的傾向，因此在細菌細胞中產(chǎn)生的任何重組Fab將不得不進行保留抗原結(jié)合能力的篩選。如果由細菌細胞表達的分子以正確折疊的形式呈現(xiàn)，那么該細菌細胞則是所需的宿主。譬如，表達所用各種E.coli株作為宿主細胞是生物工程領(lǐng)域眾所周知的。也可使用各種枯草芽孢桿菌株、鏈霉菌屬、其它細菌等。
如果需要，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酵母株以及昆蟲細胞(例如果蠅屬(Drosophila)和鱗翅類(Lepidoptera))和病毒性表達系統(tǒng)也可用作宿主細胞。參見例如Miller等，Genetic Engineering，8，277-298，Plenum Press(1986)并在此引入作為參考。
構(gòu)建本發(fā)明載體的一般方法、產(chǎn)生本發(fā)明宿主細胞所需的轉(zhuǎn)染方法和從該宿主細胞產(chǎn)生本發(fā)明改變的抗體所需的培養(yǎng)方法，均是常規(guī)技術(shù)。同樣，本發(fā)明改變的抗體一旦產(chǎn)生，則可以按照本領(lǐng)域的標準技術(shù)而從細胞培養(yǎng)物中純化出來，所述技術(shù)包括硫酸銨沉降、親和柱、柱層析、凝膠電泳等。這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握范圍之內(nèi)并且不限制本發(fā)明。
另一表達人源化抗體的方法，可利用轉(zhuǎn)基因動物中的表達，例如美國專利4,873,316所描述的方法。該方法涉及使用動物酪蛋白啟動子的表達系統(tǒng)，所述酪蛋白啟動子轉(zhuǎn)基因性地整合進哺乳動物中，使雌性動物在其乳汁中產(chǎn)生所需的重組蛋白。
基因工程抗體一旦由所需方法產(chǎn)生，接著就要使用適當?shù)脑囼灆z測抗體的體外活性。目前，傳統(tǒng)的ELISA試驗?zāi)Ｊ接糜诙ㄐ院投吭u定基因工程抗體與因子IX或與其它適合凝血因子的結(jié)合。另外，其它體外試驗也用于證實中和效力，繼之后，進行人臨床研究評價基因工程抗體在體內(nèi)的持久性(不管通常的清除機制)。
按照所述的由BC2制備人源化抗體的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可由本文所述其它供體抗體、可變區(qū)序列和CDR肽構(gòu)建人源化抗體。可以產(chǎn)生具有潛在可能性地被基因工程抗體受體識別為″自身″可變區(qū)框架的基因工程抗體。對可變區(qū)框架小的修飾，可以引起抗原結(jié)合的大的增加，而對受體沒有可估量的增加的免疫原性。此類基因工程抗體可優(yōu)選治療人凝血因子-介導的病癥。此類抗體對于診斷這些病癥也是非常有用的。
本發(fā)明也涉及抑制動物特別是人血栓形成的方法，方法包括聯(lián)合施用有效劑量的具有自限性中和活性的抗-凝血因子單克隆抗體與纖溶酶原激活物。聯(lián)合治療增加亞-最適濃度纖溶酶原激活物時的血栓溶解，減少恢復(fù)血流的時間和增加血管再灌注的頻率和總持續(xù)時間。與肝素相反，聯(lián)合治療不顯著擾亂正常的止血功能和節(jié)約(spare)纖維蛋白原、纖溶酶原和α-2-抗纖溶酶水平。因此，本發(fā)明也涉及減少在治療動物血栓形成中所需溶栓劑劑量的方法，包括與溶栓劑聯(lián)合施用特異靶向于固有凝血途徑的組分的抗凝劑。
優(yōu)選地，凝血因子來自固有的或普通的凝血途徑。最優(yōu)選地，抗-凝血因子單克隆抗體是抗-因子IX、抗-因子IXa、抗-因子X、抗-因子Xa、抗-因子XI、抗-因子XIa、抗-因子VIII、抗-因子VIIIa、抗-因子V、抗-因子Va、抗-因子VII、抗-因子VIIa、抗凝血酶或抗-凝血酶原。MAb可包括一種或多種本文所述基因工程抗體或改變的抗體或者它們的片段。
優(yōu)選地，纖溶酶原激活物是tPA、鏈激酶、尿激酶。特別優(yōu)選的是tPA。也優(yōu)選在例如Tachias and Madison，J Biol Chem，272，14580-14585(1997)；Fujise等，Circulation，95，715-722(1997)；Coombs等，J Biol Chem，273，4323-4328(1998)；Van de Werf等，Am Heart J，137，786-791(1999)描述的tPA變體，和鏈激酶與尿激酶變體，如單鏈尿激酶纖溶酶原激活物、?；睦w溶酶原鏈激酶激活劑復(fù)合物、葡萄球菌激酶和吸血蝠來源的纖溶酶原激活物。
或者，乙酰水楊酸與抗-凝血因子單克隆抗體聯(lián)合施用。某些情況下，聯(lián)合治療降低抗-凝血因子單克隆抗體的治療有效量。
通過與各自凝血因子結(jié)合并且繼之自限性抑制凝血級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生使用本發(fā)明分子而誘發(fā)的治療反應(yīng)。因此，以適于治療用的制劑和配制品形式存在的本發(fā)明分子，是易于患有或者體驗過與下述疾病(但不限于此)有關(guān)的異常凝血活性的人群所高度期望的心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、房性纖顫、中風、腎臟損害、肺栓塞、深靜脈血栓形成和人工器官以及假體性植入物。特別優(yōu)選在心肌梗塞中使用。
另一優(yōu)選的用途是在治療血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血中使用。因此，本發(fā)明也涉及治療動物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗體或抗體片段。該抗體或片段可在栓子后施用，即在無論起源于脈管系統(tǒng)何處的血凝塊已經(jīng)進入腦脈管系統(tǒng)并滯留、阻斷和/或減少血流且引起局部缺血之后再施用。抗體或片段也可在中風后施用，即在個體或觀察者識別到由栓子形成造成了神經(jīng)功能損害后施用。而且，本發(fā)明涉及治療動物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段與纖溶酶原激活物。抗體或片段和纖溶酶原激活物在栓子后或中風后施用。這些治療方法導致側(cè)枝血管的持續(xù)灌注。本發(fā)明的損傷后治療方法緩解延長局部缺血的后果，所述局部缺血如局部缺血床(bed)中持續(xù)性病理性血栓形成，后者可以造成梗塞組織擴大和神經(jīng)缺損增大。
另外，本發(fā)明涉及在動物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血治療中減少所需溶栓劑劑量的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體與溶栓劑。
另一優(yōu)選的用途是向易于患血栓栓塞性中風的動物預(yù)防性給藥。因此，本發(fā)明也涉及預(yù)防動物血栓栓塞性中風的方法，包括向具有血栓栓塞中風風險的動物施用抗-因子IX抗體。具有血栓栓塞中風風險的個體包括但不限于易患心房顫動或者接受外科手術(shù)或其它pro-促凝劑侵襲性技術(shù)的患者。
本發(fā)明改變的抗體、抗體及其片段也用于與其它抗體聯(lián)接，特別是與負責本發(fā)明基因工程抗體所針對的病癥標志物(表位)發(fā)生反應(yīng)的其它人mAbs。
據(jù)信，本發(fā)明治療劑治療異常凝血病癥需要約1天至約3周，或者根據(jù)需要而定。這較目前使用的抗凝劑肝素和華法令顯示出相當大的優(yōu)越性。劑量和治療期間涉及本發(fā)明分子在人循環(huán)中的相對持續(xù)時間，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)受治病癥和患者的一般健康狀況而加以調(diào)整。
本發(fā)明治療劑的給藥模式可以是將治療劑投放給宿主的任何適宜途徑。本發(fā)明的改變的抗體、抗體、基因工程抗體及其片段、纖溶酶原激活物、藥物組合物，特別適于非胃腸給藥，即皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或者鼻內(nèi)給藥。
本發(fā)明治療劑可配制成在可藥用載體中含有有效量本發(fā)明基因工程(例如人源化)抗體和纖溶酶原激活物作為活性成分的藥物組合物。或者，本發(fā)明藥物組合物也可含有乙酰水楊酸。在本發(fā)明的預(yù)防藥中，優(yōu)選的是含有基因工程抗體、呈備用(ready for)注射形式的含水懸浮液或者溶液，懸浮液或溶液優(yōu)選在生理pH緩沖。非胃腸給藥的組合物一般含有本發(fā)明基因工程抗體溶液或者基因工程抗體溶解在可藥用載體優(yōu)選含水載體中的混合物?？墒褂枚喾N載體，例如0.4％鹽液，0.3％甘氨酸等。這些溶液無菌并且一般不含微粒物。這些溶液可用常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)(例如過濾)進行滅菌。組合物可含有為接近生理條件所需的可藥用輔劑，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。藥物制劑中本發(fā)明抗體濃度可以差異很大，即從小于約0.5％，通常為或至少約1％至高達15或20％重量，而且將依所選具體給藥模式主要根據(jù)液體體積、粘度等加以選擇。
因此，本發(fā)明肌內(nèi)注射用的藥物組合物可制成含有1mL無菌緩沖水和約1ng至約100mg(例如約50ng至約30mg或更多)、優(yōu)選地約5mg至約25mg本發(fā)明基因工程抗體。類似地，本發(fā)明靜脈輸注用藥物組合物可制成含有約250ml無菌Ringer′s溶液和約1mg至約30mg、優(yōu)選5mg至約25mg本發(fā)明基因工程抗體。配制非胃腸給藥組合物的實際方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知或者對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯然的，并且表述在″Remington′s Pharmaceutical Science″，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania中。
優(yōu)選本發(fā)明治療劑在作為藥品制劑時是呈單位劑量形式。合適的治療有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很方便地決定。為有效治療人或動物的血栓或栓子性病癥，應(yīng)當非胃腸道施用單劑量大約0.1mg至約20mg/kg體重的本發(fā)明蛋白或抗體，優(yōu)選靜脈輸注或者肌內(nèi)注射。如果需要，在血栓響應(yīng)期間可按照臨床醫(yī)師選擇的適當?shù)拈g歇重復(fù)施用此劑量。
為了貯存并于使用前在適宜載體中重懸，可以將本文描述的抗體、改變的抗體或其片段冷凍干燥。該項技術(shù)已被證實對于常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，可以使用本領(lǐng)域熟知的冷凍干燥和重懸技術(shù)。
現(xiàn)在，參照下列具體但非限制性實施例來描述本發(fā)明。
實施例1制備和篩選抗-因子IX單克隆抗體給雌性Balb/C小鼠注射按照Jenny，R.等，Prep Biochem，16，227-245(1986)所述方法純化的人因子IX。通常，每只小鼠接受的初始注射劑量為溶解在0.15mL磷酸緩沖鹽液(PBS)中并與0.15mL完全Freund′s佐劑相混合的100(g蛋白。在2-3月的期間，每兩周一次注射溶于0.15mL PBS和0.15mL不完全Freund′s佐劑中的50(g蛋白，以加強免疫。最后一次加強注射后，在脾/骨髓瘤細胞融合前3天小鼠接受溶于PBS的50(g因子IX。從免疫的小鼠中分離出脾細胞，并按照Oi，V.T.等在″Selected Methods inCellular Immunology，″Mishell，B.B.and Shigii，S.M.，eds.，F(xiàn)reeman Press，SanFrancisco一書中描述的方法，使用聚乙二醇使脾細胞與NS-1骨髓瘤細胞融合(Kohler，G.等，Eur J Immunol，6，292-295(1976))。融合后，細胞重懸于含有10％胎牛血清的RPMI 1640介質(zhì)中，將等量份的介質(zhì)加到含有0.5mL腹腔灌洗細胞-條件培養(yǎng)介質(zhì)的4塊24-孔板的每一個孔中。第二天，每孔接受1.0mL溶于含10％胎牛血清RPMI 1640介質(zhì)中的2×10-4M次黃嘌呤、8×10-7M氨蝶呤和3.2×10-5M胸苷。每3-4天去除一半的介質(zhì)并代之以含有1×10-4M次黃嘌呤和1.6×10-5M胸苷的新鮮介質(zhì)，由此營養(yǎng)細胞。
大約2周后，從每個孔中取出1.0mL雜交瘤介質(zhì)，使用Jenny，R.J.等在Meth Enzymol，222，400-416(1993)中所述的ELISA試驗檢測抗-因子IX抗體。簡要講，將因子IX固定到96-孔微滴定板的塑料孔上，接著，在孔中孵育雜交瘤上清液或純化抗體的稀釋液。洗滌孔，并用與辣根過氧化物酶和生色物質(zhì)o-聯(lián)茴香胺(dianisidine)相偶合的山羊抗-鼠免疫球蛋白第二抗體來檢測抗體-抗原復(fù)合物的存在。
通過有限稀釋將含有抗-因子IX抗體的孔亞克隆，并在96-孔板中生長。通過上述ELISA測定從克隆的雜交瘤細胞培養(yǎng)物的上清液中篩選因子IX的抗體，將來自陽性雜交瘤的細胞擴展(expand)、冷凍、貯于液氮中，然后在小鼠中作為腹水腫瘤生長。
實施例2抗-凝血因子抗體在凝血中的自限性作用在使用Baxter參考程序LIB0293-J，3/93版(Baxter Scientific，Edison，New Jersey)的fibrometer(Becton-Dickinson Microbiology Systems，Cockeysville，Maryland)中，測定增加抗-凝血因子抗體濃度對于人血漿激活的部分凝血激酶時間(aPTT)的影響。
開始本試驗之前，盛有2～3mL 0.02M CaCl2的5mL試管放入fibrometer的加熱室中。人血漿樣本，要么來自新鮮采集血液并冰浴保存，要么按照制造商的介紹而由Hemostasis Reference Plasma(AmericanDiagnostics，Greenwich，Connecticut)重配。
來自豬腸粘膜的未分級的肝素(Sigma Chemical，St.Louis，Missouri)、來自腸粘膜的低分子量肝素(Lovenox，enoxaparin sodium，Rhone-PoulencRorer Pharmaceuticals，Collegeville，Pennsylvania)或mAb抗凝劑，均配制成大約50μM的儲備溶液，并系列稀釋直接成為檢測血漿。含有血漿而不含抗凝劑的空白管作為對照。
兩個fibro Tube fibrometer杯分別充滿含有抗凝劑的100(1檢測血漿和含有125μl肌動蛋白激活的cephaloplastin reagent(肌動蛋白試劑，來自鞣花酸中的兔腦腦磷脂，購自Baxter Scientific)的100μl檢測血漿，將兩個杯子放入到37℃的fibrometer井中。
1分鐘后，將100μl肌動蛋白試劑轉(zhuǎn)移到含有血漿的杯中，用吸量管混合內(nèi)容物數(shù)次。孵育3分鐘后，使用AutomaticPipette/Timer-trigger(Becton-Dickinson)將預(yù)熱到37℃的100μl CaCl2加入到血漿-肌動蛋白試劑混合物中。記錄凝血時間，結(jié)果以凝血時間作為在300μl總試驗體積中抗凝劑終濃度的函數(shù)而呈示于圖1。試驗中因子IX表觀濃度(nominal concentration)是30-40nM。
圖1所示結(jié)果描述增加鼠抗-因子IX mAbs BC1和BC2濃度對aPTT凝血時間的影響。兩種mAbs均通過延長aPTT而抑制凝血，并且兩種mAbs均達到對aPTT的終極飽和效應(yīng)。BC1和BC2分別為～35nM和～50nM時，IC50值類似，但是兩種抗體在最大響應(yīng)方面的差異是顯著的。飽和濃度的BC1增加aPTT約50％，達到～40秒。另一方面，BC2增加aPTT 3.5倍，達到約90秒。在使用肝素的抗凝治療中所用的治療靶范圍是突出的。結(jié)果表明這兩種mAbs落入肝素治療的aPTT范圍。
mAbs BC1和BC2的特性總結(jié)于表I。每一個BC mAbs識別酶原、因子IX以及活性蛋白酶、因子IXa，但只有BC2能夠阻斷酶原激活和蛋白酶活性。發(fā)現(xiàn)BC1和BC2與Cynomologous猴因子IX有交叉反應(yīng)。另外，BC2與大鼠因子IX也有交叉反應(yīng)。
表I.抗-因子IX mAbs體外特性總結(jié)BC1 BC2結(jié)合因子IX 是 是結(jié)合因子IXa是 是抑制IX轉(zhuǎn)變?yōu)镮Xa不 是抑制在Xase復(fù)合物中IXa的活性是 是需要輔因子 不需要 二價金屬Ca2+＞Mn2+aPTTmax×100％150 350aPTT正常IC50，nM ～35～50種屬交叉反應(yīng) 猴 大鼠，猴同位型 IgG1IgG2a圖2所示結(jié)果描述增加抗-因子IX mAbs 9E4(2)F4和11G4(1)B9濃度對aPTT凝血時間的影響。將試驗用血漿稀釋到正常濃度的一半，得到起始aPTT為45秒。兩種mAbs均通過延長aPTT而抑制凝血，兩種mAbs均達到對aPTT的終極飽和效應(yīng)。9E4(2)F4和11G4(1)B9的飽和濃度增加aPTT，對于9E4(2)F4 aPTT增加到～90至100秒，而11G4(1)B9增加至～80秒。結(jié)果表明兩種mAbs均處于肝素治療aPTT范圍的上末端。
圖3所示結(jié)果描述增加抗-因子X mAbs HFXLC(相對輕鏈表位)，HFXHC(相對重鏈表位)和抗-因子XI mab HFXI的濃度對aPTT凝血時間的影響。這些mAbs得自Enzyme Research Laboratories(South Bend，IN)。mAbsHFXLC和HFXI通過延長aPTT而抑制凝血，兩種mAbs均達到對aPTT的終極飽和效應(yīng)。HFXLC的IC50值是～40nM；飽和濃度增加aPTT至～60秒。HFXI的IC50值是～20nM；飽和濃度增加aPTT至～100秒。結(jié)果表明，HFXLC落入肝素治療aPTT范圍，而HFXI落入肝素治療范圍的上末端。mAb HFXHC對于aPTT凝血時間無影響。
用因子VIII的抗體、因子IXa的輔因子，也觀察到aPTT的自限性延長。例如，購自Affinity Biologicals，Inc.的抗-人因子VIII抗體、SAF8C-IG，增加aPTT至最大約65秒。用約100nM抗體，達到aPTT最大延長的一半。
實施例3鼠因子IX mAbs在大鼠血栓模型的效力為了評價抗-因子IX抗體在預(yù)防動脈血栓形成中的效力，采用了Schumacher等在J Cardio Pharm，22，526-533(1993)中報道的大鼠頸動脈血栓形成模型。該模型是如下構(gòu)成的將FeCl3溶液產(chǎn)生的氧自由基(oxygenradicals)施用在頸動脈表面上，從而對頸動脈內(nèi)皮造成局部(segmental)損傷。
簡而言之，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頸靜脈插套管以便進行靜脈內(nèi)注射，左股動脈插套管以便監(jiān)測血壓和心率。通過頸部手術(shù)切口無菌操作分離頸動脈，并裝備上磁性流動探頭以便測量血流。穩(wěn)定一段時間后，建立下列各項變量的基線參數(shù)頸動脈血流、動脈壓、心率、激活的部分凝血激酶時間(aPTT)和凝血酶原時間(PT)。此后，把用50％FeCl3溶液濕透的預(yù)測(premeasured)Whatman濾紙放到頸動脈上15分鐘，以徹底損傷下面的內(nèi)皮細胞。移走FeCl3浸濕的濾紙后，經(jīng)過60分鐘完成實驗。實驗?zāi)?，從頸動脈中取出頸動脈血栓并稱重。
所有試藥均在開始頸動脈損傷前15分鐘施用。檢驗下列治療，并與因子IX mAb BC2進行比較。
1.肝素15、30、60或120U/kg快速濃注，接著在60分鐘內(nèi)分別輸注0.5、1、2或4U/kg/min。
2.乙酰水楊酸(ASA，阿司匹林)5mg/kg快速濃注。
3.抗-因子IX mAb BC21、3或6mg/kg快速濃注，隨后60分鐘時間內(nèi)分別輸注0.3、1或2μg/kg/min。
4.肝素30U/kg快速濃注+1U/kg/min+5mg/kg的ASA。
5.抗-因子IX mAb BC21mg/kg+0.3μg/kg/min+5mg/kg的ASA。
圖4和5通過顯示肝素、ASA和因子IX mAb BC2對aPTT(圖4)和PT(圖5)的影響而描述抗-凝血劑/血栓形成樣本的比較藥理學。
出血素質(zhì)關(guān)鍵指數(shù)-aPTT，用作評價本研究所用抗-凝血劑/血栓形成劑對出血傾向效力的主要標準。圖4的結(jié)果證實，肝素使aPTT劑量依賴性延長，在兩個較高劑量時凝血時間最大延長，超出檢測限。單獨的ASA不顯著增加aPTT，但與肝素聯(lián)合時，觀察到明顯的協(xié)同效應(yīng)。因子IX mAbs對于aPTT具有中度作用，即使是最高劑量，凝血時間的增加也不超過臨床實踐所用標準抗-凝血劑的3倍界限。最顯著的是，低劑量因子IX mAb BC2與ASA聯(lián)合并不改變aPTT。
圖5中，數(shù)據(jù)表明肝素在兩個高劑量時和ASA+肝素聯(lián)合時也使PT顯著延長，但任何劑量的因子IX mAb單獨時或者與ASA聯(lián)合時均不使PT延長。
肝素、ASA和因子IX mAb對頸動脈閉塞的作用示于圖6。結(jié)果表明，所有載體-治療動物的頸動脈因?qū)p傷發(fā)生響應(yīng)而閉塞。肝素劑量依賴性地抑制頸動脈的閉塞。在最高劑量時，肝素完全預(yù)防頸動脈閉塞；然而，該劑量時不能引發(fā)凝血。單獨ASA對于頸動脈閉塞僅有微小的作用。ASA與肝素聯(lián)合也不能完全預(yù)防頸動脈閉塞。因子IX mAb在兩個高劑量時完全中止頸動脈閉塞，而這兩個劑量并不使凝血延長超過臨床所需的目標。單獨使用很多情況下不能保證開放的低劑量因子IX mAb，當與ASA聯(lián)合給藥時，完全抑制頸動脈閉塞。
肝素、ASA和因子IX mAb對血栓重量的影響示于圖7。肝素劑量依賴性減小頸動脈血栓塊。然而，盡管完全阻斷凝血，但是仍在頸動脈中發(fā)現(xiàn)了一些殘余的血栓。ASA單獨使用或者與肝素(30 U/kg給藥方案)聯(lián)合給藥僅部分影響血栓重量。因子IX mAb劑量依賴性減小血栓塊，高劑量確實完全預(yù)防血栓形成。而且，低劑量抗-因子IX mAb和ASA聯(lián)合，一個完全預(yù)防頸動脈閉塞而對凝固指標無不利影響的給藥方案，完全預(yù)防血栓形成。
在大鼠頸動脈血栓形成模型進行的該項研究清楚地證明，因子IX mAb在高度形成血栓的動脈損傷模型中預(yù)防血栓形成的效力。最為突出的是，證實了因子IX mAb的效力落在aPTT限定的所期望的治療抗凝目標內(nèi)。而且，肝素-現(xiàn)行的標準抗凝劑，僅在嚴重影響凝固達到產(chǎn)生不可凝固血液程度的劑量時才能獲得與因子IX mAb堪比的效力。有趣的是，觀察到的ASA與肝素聯(lián)合治療所達到的提高效力的作用和協(xié)同作用，在ASA與抗-因子IX mAb聯(lián)合給藥時也得到了證實。然而，與肝素和ASA聯(lián)合導致抗-血栓形成和抗-凝血劑作用均增強不同，因子IX mAb和ASA聯(lián)合導致抗-血栓形成效力提高而與對體外血液凝固參數(shù)沒有持續(xù)作用。一起考慮，數(shù)據(jù)顯示，因子IX mAb卓越的抗血栓形成能力比得上肝素、ASA或肝素與ASA的聯(lián)合。
實施例4大鼠血栓形成模型的掃描電鏡應(yīng)用氯化鐵后15分鐘，從假性對照(sham)、單用氯化鐵、氯化鐵+6mg/kg因子IX抗體的模型中采集大鼠頸動脈(3/組)片段。通過甲醛灌注并且結(jié)扎損傷區(qū)域的上下兩端而固定動脈。將固定動脈脫水，六甲基二硅氮烷中溫育并在干燥器中干燥。將干燥的動脈縱向切開，放置在掃描電鏡(SEM)的支柱上并用金濺射涂膜。
假性對照動脈的SEM顯示基本正常的內(nèi)皮，伴有零星分散的血小板。內(nèi)皮中有少數(shù)破裂處，可能是手術(shù)期間機械損傷的結(jié)果，下面的基底膜覆蓋有一層血小板。在模型大鼠中未觀察到血栓形成的證據(jù)。
用氯化鐵處理的動脈SEM顯示占據(jù)管腔大部分的大的壁血栓。血栓由聚集的血小板、紅細胞和無定形及纖維性蛋白性材料。蛋白性材料由纖維蛋白組成。動脈內(nèi)皮大部分被大的血栓遮蓋?？梢钥吹?，用氯化鐵處理過的區(qū)域下的內(nèi)皮被無數(shù)附著的血小板和無定形蛋白性物質(zhì)所覆蓋。
取自大鼠的用氯化鐵處理、也用因子IX抗體處理過的動脈的SEM，顯示大部分管腔沒有血栓。用氯化鐵處理過區(qū)域下的內(nèi)皮顯示出廣泛損傷，且一些區(qū)域被附著的血小板所覆蓋和血小板聚集，但是沒有或者很少有蛋白性物質(zhì)。
實施例5抗-因子IX mAb BC2重鏈和輕鏈cDNA序列分析使用TriReagent(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH)按照制造商的指導純化總RNA。用異丙醇沉淀RNA并溶于0.5％SDS以及以0.5MNaCl調(diào)整。按照制造商的指導，使用Dynabeads Oligo(dT)25(Dynal A.S.，LakeSuccess，NY)分離聚腺苷酸化RNA。從珠粒中洗脫聚腺苷酸化RNA并將后者重懸于TE緩沖液。根據(jù)制造商的說明書(Boehringer Mannheim Cat.No.1483-188)，以dT寡聚物起始采用RT-PCR試劑盒將12等量份的100ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄。對于重鏈，使用鼠IgG2a鉸鏈引物(SEQ ID NO1)和重鏈信號序列引物(SEQ ID NO2)，將6 RNA/DNA雜化物進行25輪PCR擴增。類似地，對于輕鏈，使用小鼠κ引物(SEQ ID NO3)和簡并輕鏈信號序列引物(SEQ ID NO4)，將6 RNA/DNA雜化物進行25輪PCR擴增。將12份擴增物中的每一份PCR產(chǎn)物聯(lián)接PCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)。隨機挑選重組克隆的集落，使用Birnboim和Doly在Nucl.Acids Res.7，1513(1979)中所述的堿性提取方法，小量制備質(zhì)粒DNA。用EcoRI消化分離的質(zhì)粒DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上進行分析。通過改進的Sanger法，對雙鏈cDNA的適宜大小的插入片段(即對于重鏈是～700bp而對于輕鏈是～700bp)測序。比較所有12份產(chǎn)物的重鏈和輕鏈的序列，得到共有的BC2重鏈可變區(qū)序列(SEQ ID NO5)和共有的BC2輕鏈可變區(qū)序列(SEQ ID NO6)。
BC2重鏈可變區(qū)cDNA的序列分析揭示了編碼121氨基酸序列的363核苷酸開放閱讀框架(SEQ ID NO7)。重鏈CDR1、2和3序列分別列于SEQID NOs8、9和10。
BC2輕鏈可變區(qū)cDNA的序列分析揭示了編碼107氨基酸序列的321核苷酸開放讀框(SEQ ID NO11)。輕鏈CDR1、2和3序列分別列于SEQ IDNO12、13和14。
實施例6人源化抗體將稱為SB 249413、SB 249415、SB 249416、SB249417、SB 257731和SB 257732的6個人源化抗體設(shè)計為在人抗體框架中含有上述鼠CDRs。
SB 249413SB 249413含有重鏈F9HZHC 1-0和輕鏈F9HZLC 1-0。使用得自免疫球蛋白RF-TS3′CL的重鏈的前3個框架區(qū)(Capra，J.D.等，J.Clin.Invest.86，1320-1328(1990)在Kabat數(shù)據(jù)庫中標識為KabproHhc10w)和前述BC2重鏈CDRs，設(shè)計合成的可變區(qū)人源化重鏈F9HZHC 1-0。不進行影響CDR呈遞的框架氨基酸取代。產(chǎn)生四個重疊的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs15、16、17和18)，后者在退火和延伸時，編碼代表重鏈可變區(qū)并包括CDR3(SEQ IDNOs19和20)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs21和22)擴增該合成的基因，將該基因聯(lián)接于pCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并從SpeI、KpnI限制性消化中分離。使用2個引物(SEQID NOs26和27)經(jīng)PCR擴增編碼人源化抗-呼吸道合病毒重鏈(SEQ ID NO25)的構(gòu)建物的適當區(qū)域，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SpeI進行消化，得到編碼包括可變區(qū)(SEQ ID NOs23和24)前5個氨基酸的campath信號序列的第二個DNA片段。產(chǎn)生的2個片段聯(lián)接進EcoR1、KpnI消化的含有人共有框架4和IgG1恒定區(qū)的pFHZHC2-6pCD哺乳動物細胞表達載體。含有單個氨基酸突變載體的pFHZHC2-3pCD載體描述在公布的國際專利申請WO94/05690中。用XbaI和EcoR5消化pFHZHC2-3pCD并插入得自2個合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs28和29)的聯(lián)接子，使框架2最后的殘基(殘基49)由絲氨酸突變?yōu)楸彼帷9HZHC 1-0插入物的序列示于SEQ ID NOs30和31。
使用得自免疫球蛋白LS8′CL(Carnack等，J.Exp.Med.169，1631-1643(1989)在Kabat數(shù)據(jù)庫中標識為KabproHk1318)的人輕鏈的框架區(qū)和前述BC2輕鏈CDRs，設(shè)計合成的可變區(qū)人源化輕鏈F9HZLC 1-0。不進行可能影響CDR呈遞的框架氨基酸取代。產(chǎn)生了兩個重疊的合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs32和33)，當后者退火和延伸時，編碼代表輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NOs34和35)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs36和37)擴增該合成的基因，將該基因聯(lián)接進pCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并從ScaI、SacII限制性消化中分離。使用2個引物(SEQ ID NOs26和40)經(jīng)PCR擴增編碼人源化抗-呼吸道合病毒重鏈(SEQ ID NO25)的構(gòu)建物的適當區(qū)域，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和ScaI進行消化，得到編碼包括可變區(qū)(SEQ ID NOs38和39)頭2個氨基酸的campath信號序列的第二個DNA片段。將產(chǎn)生的2個片段聯(lián)接進EcoR1、SacII消化的含有人框架4和κ恒定區(qū)的pFHzLC1-2pCN哺乳動物細胞表達載體中。含有單個氨基酸突變的載體的pFHZLC1-1pCN載體描述在公布的國際專利申請WO94/05690中。通過用SmaI和Kpn1消化pFHZLC1-pCN并插入得自2個合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs41和42)的聯(lián)接子，使框架2的一個殘基由絲氨酸突變?yōu)楦彼帷9HZLC 1-0插入物的序列示于SEQ IDNOs43和44。
SB 249415SB 249415含有重鏈F9HZHC 1-1和輕鏈F9HZLC 1-1。這些重鏈和輕鏈構(gòu)建物分別基于F9HZHC 1-0和F9HZLC 1-0，然而，它們具有影響CDR呈遞的框架氨基酸取代。
F9HZHC 1-1具有可能影響CDR呈遞的3個框架氨基酸取代。產(chǎn)生兩個重疊的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs45和46)，當后者退火和延伸時，編碼代表重鏈可變區(qū)的可變部分的氨基酸發(fā)生改變(SEQ ID NOs47和48)。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs49和50)擴增合成的基因，將基因聯(lián)接進pCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并從EcoNI、KpnI限制性消化中分離。將該片段聯(lián)接進EcoNI、KpnI消化的F9HZHC1-0(SEQ ID NO30)載體中。F9HZHC 1-1插入物的序列示于SEQ IDNOs51和52。
F9HZLC 1-1具有影響CDR呈遞的4個框架氨基酸取代。產(chǎn)生兩個合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs53和54)，當后者退火時，具有KpnI和BamHI粘性末端，并編碼代表輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO55)改變部分的氨基酸。用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI消化F9HZLC 1-0(SEQ ID NO43)并與合成的DNA聯(lián)接。F9HZLC 1-1插入物的序列示于SEQ ID NOs56和57。
SB 249416SB 249416含有重鏈F9HZHC 1-1(上述)(SEQ ID NO52)和輕鏈F9HZLC 1-2。輕鏈構(gòu)建物基于F9HZLC 1-1，然而，它具有影響CDR呈遞的另外一個框架氨基酸取代。
產(chǎn)生了兩個合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs58和59)，當退火時，具有BamHI和XbaI粘性末端并編碼代表輕鏈可變區(qū)可變部分的氨基酸(SEQ IDNO60)。用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI消化F9HZLC 1-1(SEQ ID NO56)載體并與合成的DNA相聯(lián)接。F9HZLC 1-2插入物序列示于SEQ ID NOs61和62。
SB 249417SB 249417含有重鏈F9HZHC 1-1(上述)(SEQ ID NO52和輕鏈F9HZLC 2-0。使用得自免疫球蛋白REI(Palm and Hilschmann，Z.Phvsiol.Chem.354，1651-1654(1973)在Kabat數(shù)據(jù)庫中標識為KabproHKL111)的人輕鏈框架區(qū)和前述BC2輕鏈CDRs，設(shè)計F9HZLC 2-0合成的可變區(qū)人源化輕鏈。引入5個氨基酸共有人取代基。進行影響CDR呈遞的6個框架氨基酸鼠取代。產(chǎn)生兩個重疊的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs63和64)當后者退火并延伸時，編碼代表輕鏈可變區(qū)的氨基酸(SEQ ID NOs65和66)。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs67和68)擴增該合成的基因，將該基因聯(lián)接進pCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并從ScaI、SacII限制性消化中分離。使用2個引物(SEQ ID NOs26和69)經(jīng)PCR擴增編碼人源化抗-呼吸道合病毒重鏈(SEQ ID NO25)的構(gòu)建物的適當片段，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和ScaI消化，得到編碼包括可變區(qū)(SEQ ID NO38)頭2個氨基酸的campath信號序列的第二個DNA片段。通過退火2個合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs71和72)，產(chǎn)生編碼人框架4(SEQ ID NO70)并具有SacII和NarI粘性末端的第三個DNA片段。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NarI消化F9HZLC 1-0(SEQ ID NO43)，并聯(lián)接到3個DNA片段。F9HZLC 2-0插入物的序列示于SEQ ID NOs73和74。
SB 257731SB 257731含有重鏈F9HZHC 1-1(SEQ ID NO52)和輕鏈F9HZLC 1-3，F(xiàn)9HZLC 1-2(SEQ ID NO62)的單個氨基酸突變。用2個引物(SEQ ID NOs26和69)經(jīng)PCR擴增F9HZLC 1-2，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和ScaI進行消化。分離出94bp片段(SEQ ID NOs75和76)。將該片段聯(lián)接進EcoRI、ScaI消化的F9HZLC 1-2載體中產(chǎn)生輕鏈構(gòu)建體F9HZLC 1-3。F9HZLC 1-3插入物的序列示于SEQ ID NOs77和78。
SB 257732SB 257732含有合成的可變區(qū)人源化重鏈F9HZHC 3-和輕鏈F9HZLC3-0。產(chǎn)生4個重疊的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs79、80、81和82)，當后者退火并延伸時，編碼代表被改變的重鏈可變區(qū)的氨基酸(SEQ ID NOs83和84)。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs85和86)擴增該合成的基因，將基因聯(lián)接進pCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)中，并從StuI、KpnI限制性消化中分離。將分離的片段聯(lián)接進StuI、KpnI消化的F9HZHC1-1(SEQ ID NO52)載體。然后，用EcoRI、SpeI消化該載體以除去信號序列。使用2個引物(SEQ ID NOs26和87)經(jīng)PCR擴增F9HZHC1-0并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SpeI消化，得到編碼含有可變區(qū)頭5個氨基酸的信號序列(SEQ ID NO23)的DNA片段。將產(chǎn)生的片段聯(lián)接進載體中。F9HZHC3-0插入物的序列示于SEQ ID NOs88和89。
產(chǎn)生了4個重疊的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs90、91、92和93)，當它們退火并延伸時，編碼代表輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NOs94和95)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs96和97)擴增該合成的基因，將基因聯(lián)接進pCR2000載體(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并從ScaI、NarI限制性消化物中分離。將分離的片段聯(lián)接進ScaI、NarI消化的F9HZLC1-3(SEQ ID NO77)載體中。F9HZLC3-0插物的序列示于SEQ IDNOs98和99。
人源化抗-子IX mAbs在CHO細胞表達。將適合在不含血清的介質(zhì)中懸浮生長的DG-44細胞系接種到盛在250ml一次性無菌埃倫邁爾燒瓶(Corning)中的不含蛋白但含有1X核苷酸和0.05％F68的100ml介質(zhì)中，所述埃倫邁爾燒瓶放在37℃5％C02、95％空氣潮濕培養(yǎng)箱的Innova 2100型150rpm平臺振動器(New Brunswick Scientific)上。這些細胞以4×105細胞/ml每周兩次進行傳代。通過用Not1消化，每15μg的pCN-Lc-輕鏈和pCD-Hc-重鏈載體線性化，無菌條件下共沉淀并重懸于50ul 1X TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)中。使用Hensley等在J.Biol.Chem.269，23949-23958(1994)中所述技術(shù)，利用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-RadLaboratories)將DNA電傳孔進Acc-098細胞中。1.2×107細胞在12.5ml冰浴PBS蔗糖溶液(PBS，272mM蔗糖，7mM pH7.4磷酸鈉，1mM MgCl2)中洗滌一次，重懸于0.8ml PBS，加入50ul DNA溶液并在冰上培養(yǎng)15min。于380V和25微法脈沖(pulse)細胞，然后在冰上培養(yǎng)10min。篩選前24hr，將細胞以在維持介質(zhì)中5×105細胞/板的密度鋪板到96孔培養(yǎng)板中。在維持介質(zhì)中，通過對400μg/ml G418(Geneticin，Life Technologies，Inc.)的抗性來篩選細胞。測定前24hr，用150μl維持介質(zhì)營養(yǎng)細胞。
使用電化學發(fā)光(ECL)檢測法在Origen分析器(IGEN，Inc.)上測定來自各個集落的條件培養(yǎng)基，參見Yang等，Biotechnology，12，193-194(1994)。
進行測定(測定緩沖劑)和操作分析器(細胞清潔劑)所需的所有溶液均來自IGEN。使用TAG-NHS-酯(IGEN，Inc.)按照TAG∶蛋白為7∶1的摩爾比標記抗體(抗-人IgG(g-鏈特異性)，Sigma化學品和人IgG(H+L)的F(ab′)2片段，Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)，同時用生物素-LC-Sulfo-NHS-酯(IGEN，Inc.)以生物素∶蛋白為20∶1的摩爾比對蛋白A(Sigma)加以標記，兩種標記均按照IGEN′的推薦進行?？股鞍祖溇?涂層的磁珠(M-280)購自Dynal。
使用下述步驟進行免疫測定每份樣本，50μl抗生蛋白鏈菌素-涂層的磁珠(用吐溫1.25％稀釋成在pH7.8 PBS中的終濃度為600(g/ml)與50μl生物素-蛋白A(用1.25％吐溫在pH7.8 PBS中稀釋為終濃度1μg/ml)混合，并于室溫攪拌狀態(tài)下孵育15分鐘，加入50μl TAG抗體(終濃度1.25(g/ml人IgG(H+L)的F(ab′)2片段與用1.25％吐溫在pH7.8 PBS中稀釋的0.25(g/ml抗-人IgG(g-鏈特異性)的混合物)，然后，將溶液加入到50μl條件培養(yǎng)介質(zhì)中，于室溫攪拌狀態(tài)下孵育1hr。200μl測定緩沖液加入到反應(yīng)混合物中，在Origen I型分析器上分析樣本以測定ECL。結(jié)果表明，約20-37％的被測定集落分泌超過15ng/ml的抗體，平均表達約150ng/ml。
使用Procep A捕獲步驟(step)接著進行離子交換色譜以減少DNA負擔，從條件培養(yǎng)介質(zhì)中純化人源化抗-因子IX mAbs。Procep A吸著劑材料(Bioprocessing Ltd.，Durham，England)用于制備直徑與高度比為1∶1的柱。把澄清的條件培養(yǎng)介質(zhì)以150cm/hr的速度裝載到柱上。用磷酸緩沖鹽液(PBS)、含有1M NaCl的PBS、最后用PBS順次洗柱。結(jié)合的物質(zhì)用0.1M乙酸洗脫液收獲。將洗脫液調(diào)整至pH5.5并用水稀釋(1∶4)。以80cm/hr的速度將稀釋液裝載到預(yù)先用pH5.5 20mM乙酸鈉平衡過的S-瓊脂糖凝膠柱(2.5×13cm)上。用乙酸緩沖液洗柱直至得到穩(wěn)定的基線，并用pH7.4的20mM磷酸鈉以25cm/hr速度洗脫結(jié)合的蛋白。洗脫下來的物質(zhì)用0.4微米的膜過濾并貯于4℃。
實施例7小鼠-人嵌合抗體按照制造商(Boehringer Mannheim Cat.No.1483-188)的指示，使用dT寡聚物引發(fā)，用RT-PCR試劑盒對100ng BC2 RNA進行反轉(zhuǎn)錄，用合成的ScaI(SEQ ID NO100)和NarI(SEQ ID NO101)引物擴增PCR，以產(chǎn)生帶有Sca1、Nar1末端(SEQ ID NOs102和103)的BC2輕鏈可變區(qū)。該DNA聯(lián)接進ScaI、NarI消化的F9HZHC1-3(SEQ ID 77)中，并用ScaI、NarI進行消化以產(chǎn)生小鼠-人嵌合輕鏈F9CHLC(SEQ ID NOs104和105)。
按照制造商(Boehringer Mannheim Cat.No.1483-188)的指示，使用dT寡聚物作為引物，用RT-PCR試劑盒對100ng BC2 RNA進行反轉(zhuǎn)錄，用合成的SpeI(SEQ ID NO106)和NheI(SEQ ID NO107)引物擴增PCR，以產(chǎn)生帶有Spe1、Nhe1末端(SEQ ID NOs108和109)的BC2重鏈可變區(qū)。用EcoRI(SEQ ID 26)和SpeI(SEQ ID 87)引物從RSVHZ19重鏈(SEQ ID NO25)中PCR擴增campath信號序列。把這兩個DNA片段聯(lián)接進EcoRI、NheI消化的公布的國際專利申請WO95/07301所述的IL4CHHCpcd載體中，用BC2因子IX小鼠可變區(qū)代替IL4可變區(qū)，從而產(chǎn)生小鼠-人嵌合的重鏈F9CHHC(SEQ ID Nos110和111)。
按照上述人源化構(gòu)建物的共轉(zhuǎn)染和純化方法，完成小鼠-人嵌合抗體chαFIX的共轉(zhuǎn)染和純化。
實施例8
人源化因子IX mAbs在大鼠血栓模型的效力為了評價人源化抗-因子IX抗體預(yù)防動脈血栓形成的效力，使用了實施例3所述的大鼠頸動脈血栓形成模型。建立頸動脈血流、動脈壓、心率、血管開放和激活的部分凝血激酶時間(aPTT)的基線參數(shù)。此后15分鐘，損傷頸動脈10分鐘。發(fā)生頸動脈損傷后60分鐘，測定這些參數(shù)。也從頸動脈中取出頸動脈血栓并稱重。
所有試藥均在發(fā)生頸動脈損傷前15分鐘經(jīng)靜脈施用。檢驗下述治療并與抗-因子IX mAb BC2進行比較。
1.載體2.chαFIX3mg/kg快速濃注3.SB 2494133mg/kg快速濃注4.SB 2494153mg/kg快速濃注5.SB 2494163mg/kg快速濃注6.SB 2494173mg/kg快速濃注7.SB 2577313mg/kg快速濃注8.肝素60units/kg快速濃注+2單位/kg/min輸注aPTT用作評價本研究所用抗-凝血劑/血栓劑效力對出血傾向的主要標準。圖8的結(jié)果證實，人源化因子IX mAbs SB 249413、SB 249415、SB249416、SB 249417和SB 257731在3.0mg/kg時對aPTT具有中度的作用，所用劑量在臨床可接受范圍之內(nèi)。
因子IX mAbs對血栓塊的作用示于圖9。結(jié)果表明，所有人源化mAbs在減小血栓塊方面同等有效。
該項在大鼠頸動脈血栓形成模型進行的研究清楚地證明，人源化因子IX mAbs在高度形成血栓的動脈損傷模型中預(yù)防血栓形成的效力。最突出的是，所有人源化因子IX mAbs的效力落入所期望的由aPTT限定的治療抗凝目標范圍之內(nèi)。
實施例9抗體的生物化學和生物物理學特性用MALD-MS測定SB 249417的分子質(zhì)量為148,000Da。SB 249417的分析性超速離心得到完全相同的值。在因子IX和Ca2+存在時，得自BC 2沉淀的抗體具有248,000Da的質(zhì)量，相當于mAb和兩個因子IX合起來的質(zhì)量。存在或不存在因子IX時，未觀測到更高數(shù)量級聚集物的證據(jù)。
用與固定的蛋白A表面相結(jié)合的抗體，使用BIAcore分析法評定了因子IX與SB 249417結(jié)合的動力學。使用49nM重組人因子IX(rhFIX，GeneticsInstitute)并在5mM Ca2+存在條件下進行測定。相互作用以快速結(jié)合和相對緩慢的解離速度為特征，結(jié)合kass＝2.0×105M-1s-1，而解離kdiss＝4.1×10-4s-1。計算出因子IX結(jié)合的Kd為1.9nM。
表1總結(jié)SB 249417的生物物理學特性。
表1SB 249417的生物物理學特性總結(jié)同位型 IgG1，kappa由SDS-PAGE的純度＞95％(還原條件下)分子量質(zhì)譜測量法 148,000Da分析性超速離心法148,000Da因子IX結(jié)合的化學計量學等溫滴定測熱法 1.5摩爾因子IX∶1摩爾mAb因子IX結(jié)合親合性等溫滴定測熱法 Kd＝4nM，25℃生物傳感器 Kd＝2nM因子IX結(jié)合動力學生物傳感器 kass＝2.0×105M-1s-1kdiss＝4×10-4s-1表2總結(jié)本發(fā)明mAbs的因子IX結(jié)合特性。計算的解離常數(shù)基本上相同，在試驗誤差之內(nèi)。
表2因子IX與抗-因子IX mAbs結(jié)合的動力學mAbkass(M-1s-1)kdiss(s-1) calc.KD(nM)SB 2494172.0×1054.1×10-41.9BC2 4.8×1059.1×10-41.9Chf9 2.4×1053.0×10-41.3SB 2494136.5×1052.8×10-33.7-5.1SB 2494157.5×1051.8×10-41.1-2.3SB 2494165.2×1054.1×10-40.8SB 2577319.2×1059.9×10-41.1SB 2577321.1×1061.2×10-31.5用滴定微量量熱法描述rhFIX和SB 249417，BC2和其它人源化構(gòu)建物之間相互作用的特征，微量量熱法測量溶液中來自結(jié)合固有熱的結(jié)合相互作用。將106(M FIX 9次注射入含有2μM mAb SB 249417的熱量計中。以發(fā)出的熱量檢測頭4次注射的結(jié)合。最后5次注射時，用FIX飽和mAb結(jié)合位點，僅僅觀測到混合的基礎(chǔ)(background)熱量。結(jié)果表明，如預(yù)期的那樣，等位點發(fā)生在FIX/mAb的摩爾結(jié)合比接近2。非線性最小平方分析這些數(shù)據(jù)得到結(jié)合親合力。
在34-44℃溫度范圍內(nèi)，在pH 7.4的10mM HEPES、10mM CaCl2、150mM NaCl中，測定mAbs的rhFIX親和力。這些數(shù)據(jù)使得直接測定37℃的親和力，從van′t Hoff方程中計算25℃時的親和力。表3中的數(shù)據(jù)表明，SB 249417、BC2和它的其它人源化構(gòu)建物的親和力相同，在誤差之內(nèi)(因子2)。
表3抗-FIX mAbs滴定測熱法的結(jié)果mAb Kd，nM(25℃)Kd，nM(37℃)摩爾結(jié)合比FIX/mAbBC2 10 20 1.4SB 2494136 12 1.9SB 2494153 7 1.7SB 2494174 12 1.5SB 2577324 9 1.8通過差式掃描測熱法測定，mAbs SB 249413、SB 249415、SB 249417和SB 257732均顯示出極類似的熱穩(wěn)定性。它們的未折疊(unfolding)Tms范圍為70-75℃，表明對抗熱誘導變性的高穩(wěn)定性。
實施例10抗體-介導的抑制因子IX的機制構(gòu)建由因子IX序列剪接進同源蛋白因子VII框架而構(gòu)成的嵌合構(gòu)建物文庫，并用于繪制因子IX BC2 mAb的表位。見Cheung等，Thromb.Res.80，419-427(1995)。使用BiaCore 2000表面胞質(zhì)團共振裝置，測定結(jié)合。BC2抗體利用NHS/EDC反應(yīng)直接與芯片(chip)偶合。在pH7.4，25mM MOPS、0.15M NaCl、5mM CaCl2中，以20μL/min的量與200nM每種給定構(gòu)建物進行接觸，接觸兩分鐘測定結(jié)合。使用相同但不含蛋白質(zhì)的緩沖液，監(jiān)測3分鐘的解離情況。在存在50mM EDTA的條件下，未檢測到野生型構(gòu)建物。數(shù)據(jù)示于表4。
表4因子IX構(gòu)建物與BC2抗體結(jié)合的總結(jié)
這些數(shù)據(jù)表明，下列構(gòu)建物表現(xiàn)出與BC2結(jié)合含有因子IX輕鏈和因子VII重鏈(IX LC/VII HC)的構(gòu)建物；含有因子IX gla和芳族堆疊結(jié)構(gòu)域(IX-A/VII)的構(gòu)建物；含有在因子VII gla結(jié)構(gòu)域(VII gla(IX 3-11)/IX)之內(nèi)的因子IX gla結(jié)構(gòu)域的殘基3-11的構(gòu)建物；和含有在殘基5(IX K5A)處具有賴氨酸取代為丙氨酸的因子IX的構(gòu)建物。VII gla(IX 3-11)/IX構(gòu)建物顯示出等同于野生型因子IX(血漿IXa and r-IX)的BC2結(jié)合性。因此，BC2抗體與含在因子IX gla結(jié)構(gòu)域殘基3-11之內(nèi)的表位相結(jié)合。
實施例11用抗-因子IX抗體和組織纖溶酶原激活物治療動脈血栓形成在頸動脈完全閉塞后開始施用tPA，伴有或不伴有輔助治療。持續(xù)監(jiān)測動脈的血流。
用戊巴比妥鈉(55mg/kg，i.p.)麻醉體重300-490gm的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River，Raleigh，NC)。把大鼠仰位置于加熱的(37℃)手術(shù)板上，在頸部制造切口；分離氣管，用PE-240 Intramedic tube進行氣管插管。然后分離左頸動脈和頸靜脈。將Parafilm M墊(4mm2，AmericanNational Can)放置在頸動脈下，在動脈上放置電磁血流探針(Carolina Medical)以測量血流。為了給藥，將插管(Tygon，0.02″×0.04″，Norton PerformancePlastics)插入頸靜脈中。接下來，分離左股動脈并進行插管以測量血壓和采集血液樣本。
按照實施例3的方法，把用FeCl3溶液(50％)飽和過的直徑6.5mm的玻璃微濾紙環(huán)狀片放置在頸動脈流速探針下游10分鐘，引發(fā)頸動脈中的血栓形成。在該特性得到清楚描述的模型中，血栓通常在15分鐘內(nèi)完全形成。
抗-因子IX抗體、SB 249415以快速濃注方式施用而與tPA(Genentech，South San Francisco，CA)聯(lián)合給藥，而以快速濃注方式施用肝素(Elkins-SinnInc.，Cherry Hill，NJ)，然后輸注。所有藥物輸注持續(xù)到實驗期間末-自血管閉塞時間起60分鐘。于0、30和60min(實驗?zāi)?時自股動脈采集血液樣本1mL，加入3.8％檸檬酸溶液并離心，用于aPTT和PT測定。用帶有標準程序的fibrometer(BB1L，Baxter Dade或MLA Electra 800自動凝固計時器)監(jiān)測aPTT和凝血酶原時間(PT)。實驗?zāi)r，從頸動脈取出血栓并稱重。
所有數(shù)據(jù)用平均組值(SEM表示以表明各組大鼠的只數(shù)。組間分析使用多項比較目的的ANOVA和Bonferoni檢驗，p＜0.05則認為有顯著性。
通過將FeCl3處理過的片敷貼到大鼠頸動脈而造成動脈開始損傷后約15min，發(fā)生閉塞血栓形成。如圖10所示，單用tPA，在60min實驗方案期間，僅在施用劑量為9mg/kg tPA后67％受治療血管顯示出重新得到血流時才觀察到閉塞血管再灌注。該劑量的tPA，包括60U/kg肝素或3mg/kg抗-因子IX抗體，SB 249415，會導致再灌注發(fā)生率的進一步增加，提示在FeCl3損傷模型中大約30％血栓對于溶解而言是難治療的。
圖10的結(jié)果表明，低劑量tPA，再灌注發(fā)生率顯著依賴于與溶栓劑一同給藥的抗凝劑。當施用60U/kg肝素時，顯示再灌注的血管百分比急劇下降，用3和6mg/kg tPA時，分別僅觀察到12.5％和40％再灌注。然而，當3mg/kg SB 249415與tPA一同給藥時，3mg/kg tPA達到大于60％再灌注，6mg/kg tPA時，大于79％再灌注。因此，抗-因子IX抗體顯著位移溶栓劑量響應(yīng)曲線，使得低劑量溶栓劑即可再灌注。
血栓溶解和血凝塊形成是動態(tài)過程，有時觀察到再閉塞后的開放期間。既然在60min實驗方案期間持續(xù)監(jiān)測頸動脈血流，那么也就可能定量頸動脈開放(patency)的總時間。如圖11所示，血管開放的總期間大體上因3mg/kg抗-因子IX抗體和tPA的聯(lián)合施用而增加。這在最低劑量和中等劑量tPA即分別為3和6mg/kg時尤為明顯。聯(lián)合施用劑量為3mg/kg SB 249415和3mg/kg tPA時，總開放時間為30.6±9.2min，與之相對，聯(lián)合施用60U/kg肝素和3mg/kg tPA時，總開放時間為7.1±7.1min。單用3mg/kg tPA，開放時間為0。劑量為6mg/kg的tPA與肝素聯(lián)合施用，僅使開放時間輕微增加至12.9±6.0min。而與tPA-SB 249415聯(lián)合，則達到最大開放時間38.7±8.4min。僅在最高劑量tPA(9mg/kg)時，與肝素的聯(lián)合才接近與SB 249415聯(lián)合時達到的開放時間，分別為31.9±4.8min和38.0±8.4min。
動脈梗塞后血流的快速恢復(fù)對于使局部缺血組織的損害降至最小而言是決定性的。圖12的結(jié)果表明，抗-因子IX抗體與tPA聯(lián)合相對于單用tPA或者肝素加用tPA來說，使再灌注時間減少，使用低劑量tPA即可達到這一效果。當3mg/kg SB 249415與3mg/kg tPA聯(lián)合施用來造成血栓溶解時，血栓溶解時間是29.4±9.2min。單用3mg/kg tPA，未觀察到再灌注。用60U/kg肝素與3mg/kg tPA聯(lián)合，血栓溶解時間是52.8±7.1min。更高劑量的tPA，6和9mg/kg，抗體與tPA聯(lián)合治療方案取得分別在19.4±6.3和20.8±8.7min開始血栓溶解的效果。在不加抗凝劑的情況下，6和9mg/kg tPA的血栓溶解時間分別是60min(即實驗方案的界限)和27.5±6.4min。加入60U/kg肝素，相應(yīng)的血栓溶解時間是44.0±7.1和27.0±4.9min。因此，使用SB 249415總是能夠較肝素或者單用tPA更早取得再灌注。
實施例12抗-因子IX抗體對止血功能的影響在用單獨tPA、tPA與肝素聯(lián)合以及tPA與SB 249415聯(lián)合對大鼠治療的治療期末，通過監(jiān)測纖維蛋白原、纖溶酶原和α-2-抗纖溶酶的水平測定了抗-因子IX或作為輔助劑的肝素對維持止血功能的影響，并與使用載體治療動物的結(jié)果進行比較。如圖13所示，增加tPA的劑量導致每一種所測止血標志物的水平下降。隨著tPA劑量增加至9mg/kg，α-2-抗纖溶酶水平從未用tPA治療動物的約90％降至約20％。在9mg/kg治療組，纖溶酶原水平從未用tPA治療的約100％平均值降至約40％。類似地，在高劑量tPA組，纖維蛋白原水平從約150mg/dL降至約90mg/dL。有趣的是，輔劑的選擇并不顯著影響其中的任何一種標志物。在施用載體、30或60U/kg肝素或者1或3mg/kg SB 249415的動物中，每一劑量的TPA均觀察到相似水平的α-2-抗纖溶酶、纖溶酶原和纖維蛋白原；觀察到的止血標志物的降低只是溶栓劑劑量，tPA的函數(shù)，而且這些降低特別是纖維蛋白原的降低，似乎在tPA劑量大于6mg/kg，即在最高劑量組9mg/kg時尤其明顯。
也監(jiān)測了不同治療方案對標準aPTT凝固試驗aPTT的影響(圖14)。隨著tPA劑量增加，aPTT分別由對使用載體和9mg/kg tPA的19.3s±0.6s增至30.0s±1.6s。施用3mg/kg SB 249415，對照動物aPTT的有限增加，增至49.6s±6.4s。當SB 249415與tPA聯(lián)合給藥時，觀察到aPTT稍有增加，并取決于tPA劑量。SB 249415與3mg/kg tPA聯(lián)合時，aPTT為58.3s±5.2s，而SB 249415與9mg/kg tPA聯(lián)合，則使aPTT增至77.3s±19.7s。施用30U/kg或60 U/kg劑量的肝素，導致aPTT大幅度增加。沒有tPA時，30和60U/kg劑量的肝素，其aPTT分別為約300s到600s。tPA治療的動物，aPTT為約800s。
肝素提高aPTT，特別是與干擾止血參數(shù)的藥劑配伍時，由于需要高劑量tPA以達到有效再灌注，因而很容易造成出血傾向。相反，SB 249415并不引起aPTT明顯提高并且能夠使用低劑量tPA，從而帶來在心肌梗塞和中風的溶栓治療中的顯著優(yōu)勢。
實施例13SB 249417提高中風時組織纖溶酶原激活物的溶解的潛力在這些研究中使用的大鼠血栓栓塞中風模型基本上如Busch等在BrainResearch，778，16-24(1997)中所描述的那樣。按照模型的三個主要步驟進行制備栓子，栓子形成后準備大鼠，進行藥理干預(yù)。
將取自供體大鼠的全血盛入檸檬酸化的空白管(vacutainer tube)中。將檸檬酸化(citrated)的血液(500ul)快速地加入含有1單位人凝血酶和5μl 1MCaCl2測試管中，CaCl2終濃度為10mM。5-10秒鐘內(nèi)，將小部分的混合物取出裝入～15cm長的PE50導管中，使之在室溫下凝結(jié)1小時。1小時結(jié)束時，從管中擠出凝塊放入盛有鹽水的佩氏培養(yǎng)皿中，切成1.5mm長的切片。將12塊切片(血凝塊)轉(zhuǎn)移到含有0.04mg/ml大鼠白蛋白的鹽溶液中，并以～60μl體積灌回PE50導管中。在導管中首尾相接的血凝塊用于大鼠的栓子形成。
對體重350-400g的雄性Sprague Dawley大鼠進行手術(shù)，以備接受皮下劑量的阿托品(0.5mg/kg)，然后用5％異氟烷麻醉，維持劑量使用2％異氟烷。體溫保持在37-38℃。在無菌條件下，在頸部制造saggital正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，右側(cè)內(nèi)端頸動脈(ICA)，右側(cè)外端的頸動脈(ECA)，以及翼腭動脈。給翼腭動脈打結(jié)(tied off)。分離出一段ECA后結(jié)扎并切斷。用血管鉗夾住CCA和ICA，將含有栓子的PE50導管插入ECA殘端并延伸到分叉處。去除ICA的血管鉗，在松開CCA血管鉗的同時將血栓緩慢注入ICA。在栓子形成后5分鐘，開始通過尾靜脈輸注載體(鹽液)、SB249417(2.0mg/kg)和/或t-PA(5.0mg/kg)。SB 249417以單一快速濃注劑量輸注，而t-PA的5mg/kg劑量則以10％快速濃注，接著在30分鐘時間內(nèi)將剩余的90％輸注。閉合手術(shù)切口，使大鼠蘇醒。
血栓形成后24小時，麻醉并處死大鼠。取出腦，并從前腦干開始切出每個2mm厚的7個橫斷面切片。在1％2，3，5-氯三苯四唑中溫育20分鐘，接著進行甲醛固定。對染色的腦切片攝像，使用圖象分析系統(tǒng)(Optimus Inc.，Bothell，Wash)進行分析。由不知實驗情況的操作者通過描計計算機屏幕上的梗塞來計算以mm2為單位的梗塞面積。每種處理情況下合起來的平均梗塞示于圖15(對照(n＝20)，tPA(n＝7)和SB 249417(n＝6))。栓塞后給大鼠施用tPA(5.0mg/kg)使平均梗塞體積減少～33％。單獨施用SB 249417使梗塞體積減少～70％。tPA(5.0mg/kg)和SB 249417(2.0mg/kg)聯(lián)合施用，提供進一步的保護作用，使平均梗塞體積減少～88％(P＝0.126)。該模型中，梗塞以類似頻率出現(xiàn)在紋狀體和新皮質(zhì)?；诠ＨM織的部位，閉塞最頻發(fā)生部位是大腦中腦動脈(MCA)。盡管頻率小，但是證據(jù)提示脈絡(luò)膜、大腦前動脈和大腦腦后動脈也偶爾發(fā)生閉塞。通過冠狀切面(未提供數(shù)據(jù))觀察時，在治療基礎(chǔ)上出現(xiàn)的梗塞體積減少大部分在中央MCA灌注區(qū)域。治療后，幾乎不改變梗塞組織分布。
結(jié)果表明，栓塞后施用抗-因子IX抗體如SB 249417作為單劑治療或者作為溶栓劑如tPA的輔劑時，可以減少梗塞腦組織的形成。期望抗-因子IX抗體如SB 249417作為單劑藥物或者作為溶栓劑的輔劑在治療血栓栓塞中風中具有臨床實用性。聯(lián)合治療使得溶栓劑劑量減小并由此而減少了促發(fā)出血性中風的風險。
本發(fā)明可以其它并不背離本發(fā)明精神或者基本特性的具體形式實施，因此，表明本發(fā)明保護范圍應(yīng)當參照本發(fā)明權(quán)利要求書而不是前述的說明書。
序列表序列表(1)一般信息(i)申請人邁克爾，布萊克本(Blackburn，Michael)喬拉，福伊爾斯坦(Feuerstein，Giora)弗蘭克.C.巴龍(Barone，F(xiàn)rank C.)約翰.R.圖米(Toomey，John R.)(ii)發(fā)明名稱抗血栓劑(iii)序列數(shù)量111(iv)相關(guān)地址(A)地址史密絲克萊恩比徹姆公司(SmithKline Beecham Corporation)(B)街道709 Swedeland Road(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)國家美國(F)ZIP19406(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計算機IBM相容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ Version 1.5(vi)現(xiàn)申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)栁粗?B)申請日期herewith(C)分類(vii)優(yōu)先權(quán)項(A)申請?zhí)?9/571,434(B)申請日期15-MAY-2000(viii)代理人/代理信息(A)姓名EBaumeister，Kirk(B)登記號33,833(C)參考/文檔號碼P50438-2(ix)聯(lián)系信息(A)電話610-270-5096(B)傳真610-270-5090(C)TELEX(2)序列信息SEQ ID NO1(i)序列特征
(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO1CATCCTAGAG TCACCGAGGA 20(2)序列信息SEQ ID NO2(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO2AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C21(2)序列信息SEQ ID NO3(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO3CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG36
(2)序列信息SEQ ID NO4(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO4GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21(2)序列信息SEQ ID NO5(i)序列特征(A)長度363個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO5CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT120CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT180GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT240TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG300AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT360GCA 363(2)序列信息SEQ ID NO6(i)序列特征(A)長度321個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO6CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA120TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC180TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA240GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC300ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321(2)序列信息SEQ ID NO7(i)序列特征(A)長度121氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO7Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120(2)序列信息SEQ ID NO8(i)序列特征(A)長度5氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO8Asn Tyr Gly Met Asn15(2)序列信息SEQ ID NO9(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO9Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys1 5 10 15Gly(2)序列信息SEQ ID NO10(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO10
Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr1 5 10(2)序列信息SEQ ID NO11(i)序列特征(A)長度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO11Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO12(i)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO12
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His1 5 10(2)序列信息SEQ ID NO13(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5(2)序列信息SEQ ID NO14(i)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO14Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr1 5(2)序列信息SEQ ID NO15(i)序列特征(A)長度104個堿基對(B)類型 核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無
(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO15CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC 60AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT 104(2)序列信息SEQ ID NO16(i)序列特征(A)長度108個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO16TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG 60AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG 108(2)序列信息SEQ ID NO17(i)序列特征(A)長度107個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO17GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT 60CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG 107
(2)序列信息SEQ ID NO18(i)序列特征(A)長度91個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO18GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA60GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G 91(2)序列信息SEQ ID NO19(i)序列特征(A)長度337個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置2...337(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO19A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG49Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys1 5 10 15GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC 97Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn20 25 30TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA145Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
35 40 45AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGG CGG193Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg50 55 60TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC241Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile65 70 75 80AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAA289Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu85 90 95GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC337Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO20(i)序列特征(A)長度112氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO20Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys1 5 10 15Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn20 25 30Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile35 40 45Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg50 55 60Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile65 70 75 80Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu85 90 95Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO21
(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO21GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC 33(2)序列信息SEQ ID NO22(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO22TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG 30(2)序列信息SEQ ID NO23(i)序列特征(A)長度97個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列
(B)位置27...95(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO23GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTA GT 97Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu10 15 20(2)序列信息SEQ ID NO24(i)序列特征(A)長度23氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu20(2)序列信息SEQ ID NO25(i)序列特征(A)長度110個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源
(xi)序列描述SEQ ID NO25GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC 60TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG 110(2)序列信息SEQ ID NO26(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO26GGAGACGCCA TCGAATTCTG A 21(2)序列信息SEQ ID NO27(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO27GATTGCACTA GTTGGACCTG GGAGTGGACA 30(2)序列信息SEQ ID NO28(i)序列特征(A)長度77個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無
(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO28CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG60ACGGGCCGGT TCACGAT 77(2)序列信息SEQ ID NO29(i)序列特征(A)長度73個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO29ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC60TCTGCGACCC ACT 73(2)序列信息SEQ ID NO30(i)序列特征(A)長度363個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...363(D)其它信息F9HZHC 1-0(xi)序列描述SEQ ID NO30CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT240Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT288Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95GCG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100105 110CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA363Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO31(i)序列特征(A)長度121氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO31Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO32(i)序列特征(A)長度165個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO32AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC 60CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC120TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT165(2)序列信息SEQ ID NO33(i)序列特征(A)長度146個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO33CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT 60GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC120
AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CATAGA 146(2)序列信息SEQ ID NO34(i)序列特征(A)長度280個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置2...280(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO34A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg1 5 10 15GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACT145Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT241Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe65 70 75 80GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG280Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO35(i)序列特征
(A)長度93氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO35Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO36(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO36TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27(2)序列信息SEQ ID NO37(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO37GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA27(2)序列信息SEQ ID NO38(i)序列特征(A)長度94個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置27...92(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO38GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT 94Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val10 15 20(2)序列信息SEQ ID NO39(i)序列特征(A)長度22氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無
(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO39Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly15 10 15Val His Ser Glu Ile Val20(2)序列信息SEQ ID NO40(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO40GACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA30(2)序列信息SEQ ID NO41(i)序列特征(A)長度55個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO41GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC55(2)序列信息SEQ ID NO42(i)序列特征(A)長度51個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO42CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C51(2)序列信息SEQ ID NO43(i)序列特征(A)長度321個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC1-0(xi)序列描述SEQ ID NO43GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT144His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45
GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA240Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA321Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO44(i)序列特征(A)長度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO44Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO45(i)序列特征(A)長度134個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO45CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATAT120CTACAGATCA GCAG 134(2)序列信息SEQ ID NO46(i)序列特征(A)長度134個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO46GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC120AGAGGAGTCT AGAG 134(2)序列信息SEQ ID NO47(i)序列特征(A)長度225個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點
(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...225(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO47CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA 48Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly1 5 10 15AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA 96Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu20 25 30GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT144Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala35 40 45GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT192Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly50 55 60TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC225Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75(2)序列信息SEQ ID NO48(i)序列特征(A)長度75氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO48Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly1 5 10 15Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu20 25 30Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala35 40 45Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly50 55 60
Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75(2)序列信息SEQ ID NO49(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO49TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG 27(2)序列信息SEQ ID NO50(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO50TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT 24(2)序列信息SEQ ID NO51(i)序列特征(A)長度363個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型
(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...363(D)其它信息F9HZHC 1-1(xi)序列描述SEQ ID NO51CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met35 40 45GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT240Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT288Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA363Gln Glv Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO52(i)序列特征(A)長度121氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO52Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO53(i)序列特征(A)長度82個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO53CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC60GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82(2)序列信息SEQ ID NO54(i)序列特征(A)長度90個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO54GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC60TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC 90(2)序列信息SEQ ID NO55(i)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO55Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser1 5 10 15Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser20 25(2)序列信息SEQ ID NO56(i)序列特征(A)長度321個堿基對(B)類型 核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC 1-1
(xi)序列描述SEQ ID NO56GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT144His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA240Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA321Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO57(i)序列特征(A)長度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO57Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100(2)序列信息SEQ ID NO58(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO58GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T 41(2)序列信息SEQ ID NO59(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO59CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G 41(2)序列信息SEQ ID NO60(i)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser1 5 10(2)序列信息SEQ ID NO61(i)序列特征(A)長度321個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC 1-2(xi)序列描述SEQ ID NO61GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT144His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA240Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA321Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO62(i)序列特征(A)長度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO62Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO63(i)序列特征(A)長度165個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO63AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC 60CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC120TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT165(2)序列信息SEQ ID NO64(i)序列特征(A)長度161個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO64CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT 60GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC120AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G161(2)序列信息SEQ ID NO65(i)序列特征(A)長度280個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置2...280(D)其它信息
(xi)序列描述SEQ ID NO65A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC GCC ACT145Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC GGT AGC193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAT ATC241Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile65 70 75 80GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG280Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO66(i)序列特征(A)長度93氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO66Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
50 55 60Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO67(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO67TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG 27(2)序列信息SEQ ID NO68(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO68TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG 27(2)序列信息SEQ ID NO69(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO69CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT 33(2)序列信息SEQ ID NO70(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO70Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala1 5 10 15Ala(2)序列信息SEQ ID NO71(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO71GGACGTTCGG CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 48(2)序列信息SEQ ID NO72(i)序列特征(A)長度52個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO72CGCCGCCACA GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC 52(2)序列信息SEQ ID NO73(i)序列特征(A)長度321個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC 2-0(xi)序列描述SEQ ID NO73CAG ATA GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT 48Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC144His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
GGT AGC GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG240Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80GAT ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG321Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO74(i)序列特征(A)長度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO74Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO75(i)序列特征(A)長度94個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置27...94(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO75GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CT 94Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu10 15 20(2)序列信息SEQ ID NO76(i)序列特征(A)長度23氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO76Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Val Leu20(2)序列信息SEQ ID NO77(i)序列特征(A)長度401個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置27...401(D)其它信息F9HZLC 1-3(xi)序列描述SEQ ID NO77GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln10 15 20 25TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC149Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser30 35 40TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AGA197Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg45 50 55CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT245Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala60 65 70AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC293Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr75 80 85ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCG GTT TAT TAC341Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr90 95 100 105TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG389Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys110 115 120GTG GAG ATC AAA401Val Glu Ile Lys125
(2)序列信息SEQ ID NO78(i)序列特征(A)長度125氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO78Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu20 25 30Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val35 40 45Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro50 55 60Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu85 90 95Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn100 105 110Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125(2)序列信息SEQ ID NO79(i)序列特征(A)長度81個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO79AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC60
AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81(2)序列信息SEQ ID NO80(i)序列特征(A)長度99個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO80TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC60TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99(2)序列信息SEQ ID NO81(i)序列特征(A)長度87個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO81GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA60AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT87(2)序列信息SEQ ID NO82(i)序列特征(A)長度86個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無
(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO82GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT86(2)序列信息SEQ ID NO83(i)序列特征(A)長度278個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置3...278(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO83AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 47Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg1 5 10 15CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA95Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg20 25 30AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 143Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe35 40 45TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 191Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu50 55 60AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 239Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met65 70 75GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 278
Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr80 85 90(2)序列信息SEQ ID NO84(i)序列特征(A)長度92氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO84Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln1 5 10 15Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn20 25 30Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser35 40 45Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys50 55 60Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp65 70 75 80Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr85 90(2)序列信息SEQ ID NO85(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO85AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG 30(2)序列信息SEQ ID NO86
(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO86GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG26(2)序列信息SEQ ID NO87(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO87CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG37(2)序列信息SEQ ID NO88(i)序列特征(A)長度446個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列
(B)位置27...446(D)其它信息F9HZHC 3-0(xi)序列描述SEQ ID NO88GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATC CAA CTA GTG CAA101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln10 15 20 25TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC149Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys30 35 40AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA197Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg45 50 55CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA245Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg60 65 70AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC293Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe75 80 85TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA341Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu90 95 100 105AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG389Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met110 115 120GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC CTG GTC ACC437Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125 130 135GTC TCC TCT446Val Ser Ser140(2)序列信息SEQ ID NO89(i)序列特征(A)長度140氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO89Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val65 70 75 80Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)序列信息SEQ ID NO90(i)序列特征(A)長度90個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO90AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC60TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT 90(2)序列信息SEQ ID NO91
(i)序列特征(A)長度108個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO91CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG 60CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC 108(2)序列信息SEQ ID NO92(i)序列特征(A)長度108個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO92TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC 60TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG 108(2)序列信息SEQ ID NO93(i)序列特征(A)長度102個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO93
GGCGCCGCCA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA 60ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT 102(2)序列信息SEQ ID NO94(i)序列特征(A)長度330個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置2...328(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO94A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30TAC CAA CAG AAA CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG 145Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT 241Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80GCG ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC 289Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly85 90 95GGA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCG GCG CC 330
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105(2)序列信息SEQ ID NO95(i)序列特征(A)長度109氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO95Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105(2)序列信息SEQ ID NO96(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO96
CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC 26(2)序列信息SEQ ID NO97(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO97AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC 26(2)序列信息SEQ ID NO98(i)序列特征(A)長度412個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置27...412(D)其它信息F9HZLC 3-0(xi)序列描述SEQ ID NO98GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln10 15 20 25TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTTGGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT 149
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr30 35 40TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA197Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys45 50 55CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT245Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala60 65 70AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC293Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr75 80 85ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC341Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr90 95 100 105TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG389Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys110 115 120CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GC 412Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Val125(2)序列信息SEQ ID NO99(i)序列特征(A)長度129氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO99Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala20 25 30Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val35 40 45Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro50 55 60
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu85 90 95Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn100 105 110Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val115 120 125Val(2)序列信息SEQ ID NO100(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO100CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC26(2)序列信息SEQ ID NO101(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO101GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41(2)序列信息SEQ ID NO102(i)序列特征(A)長度335個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...335(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO102CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 48Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT144His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA240Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG288Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT GTT GCG GCG CC 335Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO103(i)序列特征(A)長度112氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO103Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO104(i)序列特征(A)長度318個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...318(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO104CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG48Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT144His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA240Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG288Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA318Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)序列信息SEQ ID NO105(i)序列特征(A)長度106氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO105Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr
85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)序列信息SEQ ID NO106(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO106CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 30(2)序列信息SEQ ID NO107(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO107TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32(2)序列信息SEQ ID NO108(i)序列特征(A)長度369個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無
(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1...369(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO108CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 48Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT240Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT288Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCT AGC369Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO109(i)序列特征(A)長度123氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO109Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO110(i)序列特征(A)長度363個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(ix)特點(A)NAME/KEY編碼序列(B)位置1…363(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO110CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG48Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15
ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT240Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT288Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA363Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120(2)序列信息SEQ ID NO111(i)序列特征(A)長度121氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQ ID NO11lGln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe
50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120
權(quán)利要求
1.治療動物血栓栓塞后引發(fā)的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗體或抗體片段。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段在栓塞后施用。
3.權(quán)利要求1所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段是在中風后施用。
4.權(quán)利要求1所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鑒定特征。
5.權(quán)利要求4所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249417的鑒定特征。
6.治療動物血栓栓塞后引發(fā)的局部缺血的方法，包括施用SB 249417。
7.治療動物血栓栓塞后引發(fā)的局部缺血的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段和纖溶酶原激活物。
8.權(quán)利要求7所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段和纖溶酶原激活物是在栓塞后施用。
9.權(quán)利要求7所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段和纖溶酶原激活物是在中風后施用。
10.權(quán)利要求7所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鑒定特征。
11.權(quán)利要求10所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249417的鑒定特征。
12.權(quán)利要求7所述方法，其中溶栓劑是tPA、尿激酶、鏈激酶或它們的變體。
13.權(quán)利要求12所述方法，其中溶栓劑是tPA。
14.治療動物血栓栓塞后引發(fā)的局部缺血的方法，包括聯(lián)合施用SB249417和tPA。
15.在治療動物血栓栓塞后引發(fā)的局部缺血中減少所需溶栓劑劑量的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段與溶栓劑。
16.權(quán)利要求15所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鑒定特征。
17.權(quán)利要求16所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249417的鑒定特征。
18.權(quán)利要求15所述方法，其中溶栓劑是tPA、尿激酶、鏈激酶或它們的變體。
19.權(quán)利要求18所述方法，其中溶栓劑是tPA。
20.預(yù)防動物血栓栓塞性中風的方法，包括向具有發(fā)生血栓栓塞中風風險的動物施用抗-因子IX抗體或抗體片段。
21.權(quán)利要求20所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鑒定特征。
22.權(quán)利要求20所述方法，其中抗-因子IX抗體或抗體片段具有SB249417的鑒定特征。
23.預(yù)防動物血栓栓塞中風的方法，包括向具有發(fā)生血栓栓塞中風風險的動物施用SB 249417。
全文摘要
公開了針對凝固因子IX的單克隆抗體以及它們在抑制血栓形成中的用途。
文檔編號A61P7/02GK1501812SQ00819723
公開日2004年6月2日 申請日期2000年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月15日
發(fā)明者弗蘭克·C·巴龍, 弗蘭克 C 巴龍, N 布萊克本, 邁克爾·N·布萊克本, Z 福伊爾斯坦, 喬拉·Z·福伊爾斯坦, R 圖米, 約翰·R·圖米 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司