專利名稱：奈瑟球菌的抗原性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自細菌-腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的抗原性肽序列。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)是不能動的、對人有致病性的革蘭氏陰性雙球菌。
根據(jù)該菌的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定出12種腦膜炎奈瑟球菌的血清型。A型是南撒哈拉-非洲地區(qū)流行病中最常見的病原體。B型和C型血清型菌是導致美國以及大多數(shù)發(fā)達國家內(nèi)大多數(shù)病例的原因。W135和Y型血清型菌是導致美國和發(fā)達國家的其余病例的原因。
目前使用的腦膜炎球菌疫苗是由血清型A、C、Y和W135組成的四價多糖疫苗，然而腦膜炎球菌B(menB)仍是一個問題。不能采用多糖方法，因為menB莢膜多糖是一種α(2-8)-相連的N-乙酰神經(jīng)氨酸的聚合物，它也存在于哺乳動物組織中。一種menB疫苗方法是采用外膜蛋白(OMP)的混合物。為了克服抗原性變異，已經(jīng)構(gòu)建了含有高達9種不同膜孔蛋白的多價疫苗(例如，Poolman JT(1992)“腦膜炎球菌疫苗的發(fā)展”Infect.Agents Dis.413-28)。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白，但是這些方法均不能克服抗原性變異(例如Ala′Aldeen和Borriello(1996)″腦膜炎球菌運鐵蛋白結(jié)合蛋白1和2均是外露的，并能產(chǎn)生殺傷同源和異源菌株的殺菌性抗體″Vaccine14(1)49-53)。
本發(fā)明本發(fā)明提供了在國際專利申請WO 99/24578中所公開的蛋白質(zhì)的片段，其中所述片段含有至少一個抗原決定簇。
因此，如果在WO 99/24578中公開的任一特定蛋白質(zhì)序列的長度為x個氨基酸(見表II)，那么本發(fā)明提供了該蛋白質(zhì)的至多含x-1個氨基酸的片段。該片段可以比其更短(例如x-2，x-3，x-4，...)，并且宜為100個氨基酸或更少(例如90個氨基酸或更少，80個氨基酸等)。該片段可以短至3個氨基酸，但宜為更長(如高達6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、75、或100個氨基酸)。
優(yōu)選的片段含有表I中所公開的奈瑟球菌肽序列，或其亞序列。片段可以比表I中所給出的片段更長，例如當表I中的片段是從蛋白質(zhì)的氨基酸殘基p至殘基q，那么本發(fā)明還涉及從殘基(p-1)、(p-2)或(p-3)至殘基(q+1)、(q+2)或(q+3)的片段。
本發(fā)明還提供了與這些片段同源(即有序列相同性)的多肽。根據(jù)具體的序列，序列相同性的程度宜大于50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。這些同源的多肽包括片段的突變體和等位基因變體。兩個序列之間的相同性宜用Smith-Waterman同源性搜尋算法確定，如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中，采用參數(shù)“缺口罰分(gap penalty)”為12，“缺口延伸罰分(gap extension penalty)”為1進行缺口仿射搜索。
本發(fā)明還提供了含有一種或多種上述片段的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的附加條件是在其范圍內(nèi)不包括含有WO99/24578中所公開的446個蛋白質(zhì)序列中任一個蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)(即WO99/24578中偶數(shù)SEQ ID 2，4，6，8，10，...，888，890，892)。
當然，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用多種方法制備(例如，重組表達、從細胞培養(yǎng)物中純化、化學合成等)，并可采用各種形式(例如天然的、C末端和/或N末端融合形式等)。它們宜制成基本上純凈的形式(即基本上不含其它奈瑟球菌或宿主細胞蛋白)。短的蛋白質(zhì)優(yōu)選用化學肽合成法生產(chǎn)。
另一方面，本發(fā)明提供了識別本發(fā)明片段的抗體，附加條件是本發(fā)明在其范圍內(nèi)不包括識別WO99/24578中446個完整蛋白質(zhì)序列之一的抗體?？贵w可以是多克隆的，或更佳地是單克隆的，并且可以用任何合適方式產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了含有被這些抗體識別的肽序列。當然，這些肽序列包括WO99/24578中奈瑟球菌蛋白質(zhì)的片段，但還包括結(jié)合于免疫球蛋白時模擬奈瑟球菌肽抗原性結(jié)構(gòu)的肽。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明所述片段和蛋白質(zhì)的核酸，附加條件是本發(fā)明在其范圍內(nèi)不包括編碼WO99/24578中446個中任一個蛋白質(zhì)序列的核酸。
此外，本發(fā)明提供了一類核酸，所述核酸含有與這些序列同源(即有序列相同性)的序列。此外，本發(fā)明還提供了可雜交于這些序列(較佳地在“高度嚴緊”條件下雜交(如65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液中))的核酸。
還應理解，本發(fā)明提供了一類核酸，所述核酸含有與上述序列互補的序列(例如用于反義或探測目的)。
當然，本發(fā)明的核酸可以用多種方法制備(例如，化學合成、從基因組或cDNA文庫、或從生物體本身制得等)，并可采用各種形式(例如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。此外，術(shù)語“核酸”包括DNA和RNA，以及它們的類似物，如含有修飾骨架的那些類似物，還包括肽核酸(PNA)等。
另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的核苷酸序列的載體(如表達載體)以及用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明蛋白質(zhì)、抗體和/或核酸的組合物。這些組合物適合作為例如疫苗、診斷試劑或免疫原性組合物。
本發(fā)明還提供了用作藥劑(例如作為疫苗或免疫原性組合物)，或作為診斷試劑的本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)或抗體。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)或抗體在生產(chǎn)下列物質(zhì)中的應用(i)用于治療或預防奈瑟球菌屬細菌感染的藥劑；(ii)用于檢測奈瑟球菌屬細菌或檢測抗奈瑟球菌屬細菌抗體是否存在的診斷試劑；和/或(iii)用于產(chǎn)生抗奈瑟球菌屬細菌的抗體的試劑。所述的奈瑟球菌屬細菌可以是任何物種或菌株(例如淋病奈瑟球菌)，但優(yōu)選腦膜炎奈瑟球菌，尤其是菌株A或菌株B。
本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)和/或抗體。
另一方面，本發(fā)明提供了各種方法。
提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法，該方法包括步驟在誘導蛋白表達的條件下，培育本發(fā)明的宿主細胞。
提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)或核酸的方法，其中用化學法部分或全部地合成所述蛋白或核苷酸。
提供了一種檢測本發(fā)明的多核苷酸的方法，該方法包括下列步驟(a)在雜交條件下使本發(fā)明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；和(b)檢測所述雙鏈體。
提供了一種檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟(a)在適合形成抗體-抗原復合物的條件下使本發(fā)明的抗體和生物樣品接觸；和(b)檢測所述復合物。
下面是可用于實施本發(fā)明(例如為了免疫或診斷目的而使用所公開的序列)的標準技術(shù)和程序的綜述。該綜述不是對本發(fā)明的限制，相反它只是給出了一些可以使用但并非必需的例子。
綜述除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻中有全面的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗手冊》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編.1984)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(B.D.Hames和S.J.Higgins編，1984)；《動物細胞培養(yǎng)》(R.I.Freshney編，1986)；《固定化細胞和酶》(IRL出版社，1986)；B.Perbal，《分子克隆實用指南》(1984)；《酶學方法》系列叢書(Academic Press，Inc.)，尤其是154和155卷；《哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(J.H.Miller和M.P.Calos編，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Mayer和Walker編(1987)，《細胞和分子生物學的免疫化學方法》(Academic Press，London)；Scopes，(1987)《蛋白質(zhì)純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實驗免疫學手冊》I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編1986)。
在本說明書中采用了核苷酸和氨基酸的標準縮寫。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請均全部納入本文作參考。
定義當組合物中總X+Y重量的至少85％是X時，則稱含有X的組合物“基本上沒有Y”。較佳的，X占組合物中X+Y總重量的至少約90％，更佳至少約95％或者甚至99％(重量)。
術(shù)語“包含”指“含有”和“由......構(gòu)成”，例如“包含”X的組合物可以完全由X構(gòu)成，或者可以含有X之外的物質(zhì)，例如X+Y。
術(shù)語“抗原決定簇”包括B細胞表位和T細胞表位。
術(shù)語“異源”指在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起的兩種生物學組分。此組分可以是宿主細胞、基因、或調(diào)控區(qū)如啟動子。盡管異源組分在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起，但是它們能一起起作用，例如當與某基因異源的一種啟動子與該基因操作性相連時。另一個例子是奈瑟球菌序列與小鼠宿主細胞異源。另一例子是來自相同或不同蛋白質(zhì)的兩個表位，已經(jīng)以自然界沒有的排列方式組裝在一個蛋白質(zhì)中。
“復制起點”是啟動和調(diào)節(jié)多核苷酸(例如表達載體)復制的一種多核苷酸序列。復制起點可作為細胞內(nèi)多核苷酸復制的自主性單位，能在其自身的控制下進行復制。復制起點是載體在特定宿主細胞中復制所需要的。有了某一復制起點，表達載體就能在細胞中合適蛋白的存在下高拷貝數(shù)的復制。復制起點的例子是在酵母中有效的自主復制序列；以及在COS-7細胞中有效的病毒性T-抗原。
表達系統(tǒng)奈瑟球菌屬細菌的核苷酸序列可在各種不同的表達系統(tǒng)中表達；例如與哺乳動物細胞、桿狀病毒、植物、細菌和酵母一起使用的那些系統(tǒng)。
i.哺乳動物系統(tǒng)哺乳動物表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的。哺乳動物啟動子是能結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常鄰近編碼序列的5′端，還具有一個TATA盒，其通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25-30個堿基對(bp)處。認為TATA盒指導RNA聚合酶II在正確位點開始RNA合成。哺乳動物啟動子還含有一個上游啟動子元件，其通常位于TATA盒上游100至200bp內(nèi)。該上游啟動子元件決定了轉(zhuǎn)錄啟動的速度，并可在兩個方向之一上起作用[Sambrook等人(1989)“克隆基因在哺乳動物細胞中的表達”《分子克隆實驗手冊》，第2版]。
哺乳動物病毒基因通常是高表達的，具有廣泛的宿主范圍；因此，編碼哺乳動物病毒基因的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括SV40早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)以及單純皰疹病毒啟動子。另外，從非病毒基因(如鼠金屬硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的啟動子序列。表達可以是組成型的或受調(diào)控的(誘導型)，取決于啟動子能否在激素反應性細胞中用促糖皮質(zhì)激素誘導。
增強元件(增強子)的存在，聯(lián)合上述啟動子元件通常會提高表達水平。增強子是這樣一種調(diào)控性DNA序列，當其與同源或異源啟動子相連，合成在正常的RNA起始位點開始時，它能刺激轉(zhuǎn)錄提高1000倍。當增強子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游，處于正?；蚍D(zhuǎn)方向，或距離啟動子1000個核苷酸以上的距離時，它均具有活性[Maniatis等人(1987)Science 2361237；Alberts等人(1989)《細胞分子生物學》，第2版]。從病毒衍生獲得的增強子元件可能是特別有用的，因為它們通常具有較寬的宿主范圍。例子包括SV40早期基因增強子[Dijkema等人(1985)EMBO J.4761]以及衍生自Rous肉瘤病毒的長末端重復序列(LTR)的增強子/啟動子[Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.796777]以及來自人巨細胞病毒的增強子/啟動子[Boshart等人(1985)Cell 41521]。另外，一些增強子僅僅在誘導物(例如激素或金屬離子)的存在下是可調(diào)節(jié)的并具有活性[Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2215；Maniatis等人(1987)Science 2361237]。
DNA分子可在哺乳動物細胞中胞內(nèi)表達。啟動子序列可以和DNA分子直接相連，在這種情況下，重組蛋白的N端第一個氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育來從蛋白上切下此N端。
另外，外來蛋白也可從細胞中分泌到生長培養(yǎng)基中，方法是產(chǎn)生嵌合的DNA分子，該DNA分子編碼的融合蛋白包括一前導序列片段，該片段在哺乳動物細胞中提供了外源蛋白的分泌。較佳的，在前導序列片段和外源基因之間可以有能在體內(nèi)或體外斷裂的加工位點。前導序列片段通常編碼一種信號肽，該信號肽由引導蛋白分泌出細胞的疏水性氨基酸組成。腺病毒三聯(lián)前導序列是哺乳動物細胞中分泌外來蛋白的一個前導序列的例子。
通常，哺乳動物細胞識別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3′的調(diào)控區(qū)域，因此它和啟動子元件一起連接在編碼序列的側(cè)面。成熟mRNA的3′端由定點的轉(zhuǎn)錄后斷裂和聚腺苷酸化形成[Birnstiel等人(1985)Cell 41349；Proudfoot和Whitelaw(1988)″真核RNA的終端和3′端加工″《轉(zhuǎn)錄和剪接》(B.D.Hames和D.M.Glover編)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14105]。這些序列指導mRNA的轉(zhuǎn)錄，mRNA能被翻譯成該DNA編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括從SV40衍生的那些[Sambrook等人(1989)“克隆基因在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中的表達”《分子克隆實驗指南》]。
通常，上述組件，包括啟動子、聚腺苷酸化信號以及轉(zhuǎn)錄終止序列被一起放在表達構(gòu)建物中。如果需要，表達構(gòu)建物中還包括增強子、具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子以及前導序列。表達構(gòu)建物通常以復制子形式維持，例如是能在宿主(如哺乳動物細胞或細菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。哺乳動物復制系統(tǒng)包括從動物病毒衍生的那些系統(tǒng)，其需要反式作用因子來進行復制。例如，含有乳多空病毒復制系統(tǒng)的質(zhì)粒，如SV40[Gluzman(1981)Cell 23175]或多瘤病毒，在合適的病毒T抗原存在下復制出極高的拷貝數(shù)。哺乳動物復制子的其它例子包括衍生自牛乳頭瘤病毒和EB病毒的復制子。另外，復制子可以有兩個復制系統(tǒng)，從而使其能維持在例如哺乳動物細胞中進行表達并能在原核宿主中克隆和擴增。這些哺乳動物細菌穿梭載體的例子包括pMT2[Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9946]和pHEBO[Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.61074]。
所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中。
可作為宿主進行表達的哺乳動物細胞系是本領(lǐng)域中已知的，其包括許多從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖細胞系，包括但不局限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、乳倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(如Hep G2)和其它許多細胞系。
ii.桿狀病毒系統(tǒng)也可將編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸插入合適的昆蟲表達載體中，并與該載體中的控制元件操作性相連。載體構(gòu)建采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)。總地來說，表達系統(tǒng)的組分包括一種轉(zhuǎn)移載體，通常是細菌質(zhì)粒，其含有桿狀病毒基因組片段以及便于插入待表達異源基因的限制性位點；野生型桿狀病毒，其序列與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源(這使得異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中)；以及合適的昆蟲宿主細胞和生長培養(yǎng)基。
將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入轉(zhuǎn)移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細胞中，使載體和病毒基因組重組。表達包裝的重組病毒，鑒定并純化重組噬斑。桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)材料及其方法，除別的以外，可以試劑盒形式購自Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″試劑盒)。這些技術(shù)通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，在Summers和Smith的Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)(后稱“Summer和Smith的文章”)中有充分描述。
在將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入桿狀病毒基因組之前，通常將上述組件，包括啟動子、前導序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列裝配在中間置換型構(gòu)建物(轉(zhuǎn)移載體)中。該構(gòu)建物可含有單個基因以及操作性相連的調(diào)控元件；多個基因，每個基因有其自己的一套操作性相連調(diào)控元件；或是由同一組調(diào)控元件調(diào)控的多個基因。中間置換型構(gòu)建物通常保持在一個復制子中，例如能在宿主(如細菌)內(nèi)穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復制子將具有一個復制系統(tǒng)，從而使其能保持在合適的宿主中進行克隆和擴增。
目前，用來將外源基因?qū)階cNPV的最常用的轉(zhuǎn)移載體是pAc373。還可設計本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它許多載體。這些載體例如包括，pVL985(其將多角體蛋白的起始密碼子從ATG變?yōu)锳TT，在ATT下游32個堿基對處引入一個BamHI克隆位點；見Luckow和Summers，Virology(1989)1731)。
質(zhì)粒通常還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Miller等人(1988)Ann.Rev.Microbiol.，42177)以及用來在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨芐青霉素抗性(amp)基因和復制起點。
桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并啟動下游(5′到3′)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，該區(qū)通常鄰近編碼序列的5′端。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括一個RNA聚合酶結(jié)合位點以及一個轉(zhuǎn)錄起始位點。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體還可能具有稱為增強子的第二區(qū)，如果該區(qū)域存在，它通常遠離結(jié)構(gòu)基因。表達可以是調(diào)控型或組成型的。
在病毒感染周期晚期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供了特別有用的啟動子序列。例子包括從編碼病毒多角體蛋白的基因衍生獲得的序列，F(xiàn)riesen等人(1986)“桿狀病毒基因表達的調(diào)控”《桿狀病毒分子生物學》(Walter Doerfler編輯)；EPO公開號127839和155476；以及編碼p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.69765。
編碼合適的信號序列的DNA可以衍生自分泌的昆蟲或桿狀病毒蛋白的基因(如桿狀病毒多角體蛋白基因)(Carbonell等人，(1988)Gene，73409)。另外，由于哺乳動物細胞翻譯后修飾的信號(如信號肽斷裂、蛋白水解斷裂和磷酸化)看來可被昆蟲細胞識別，且分泌和胞核積累所需的信號看來在無脊椎動物細胞和脊椎動物細胞之間是保守的，因此也可用非昆蟲來源的前導序列來提供昆蟲中的分泌，這些前導序列例如是從編碼人α-干擾素(Maeda等人(1985)，Nature 315592)、人胃泌素釋放的肽(Lebacq-Verheyden等人(1988)，Molec.Cell.Biol.83129)、人IL-2(Smith等人(1985)PNAS，828404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene 58273)和人葡糖腦苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，799)的基因衍生獲得的。
重組多肽或聚蛋白可以在胞內(nèi)表達，或如果它用合適的調(diào)控序列表達，它可被分泌。非融合的外源蛋白的良好胞內(nèi)表達理想的通常需要具有短前導序列的異源基因在ATG起始信號前有合適的翻譯起始信號。如果需要，可通過和溴化氰體外培育來從成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。
另外，可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子將非天然分泌的重組聚蛋白或蛋白從昆蟲細胞中分泌出來，該嵌合的DNA分子所編碼的融合蛋白包含一前導序列片段，該片段提供了昆蟲中分泌外源蛋白的作用。該前導序列片段通常編碼一種信號肽，該信號肽包含的疏水性氨基酸引導蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
在插入了編碼該蛋白表達產(chǎn)物前體的DNA序列和/或基因后，用轉(zhuǎn)移載體的異源DNA和野生型桿狀病毒的基因組DNA共同轉(zhuǎn)化(通常是共轉(zhuǎn)染)昆蟲細胞宿主。此構(gòu)建物的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列通常包含2-5kb的桿狀病毒基因組片段。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點內(nèi)的方法是本領(lǐng)域所知的。(見Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)32156；和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通過同源雙交換重組來插入一個基因如多角體蛋白基因中；插入還可以是插入工程改造入所需桿狀病毒基因內(nèi)的限制性酶切位點中。Miller等人(1989)，Bioessays 491。當DNA序列被克隆在表達載體多角體蛋白基因位置中時，其5′和3′均側(cè)接了多角體蛋白特異性序列，并位于多角體蛋白啟動子的下游。
隨后將新形成的桿狀病毒表達載體包裝到感染性重組桿狀病毒中。發(fā)生同源重組的頻率很低(在約1％和5％之間)；因此，共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的大多數(shù)病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一種方法來鑒別重組病毒。該表達系統(tǒng)的一個優(yōu)點是肉眼篩選能區(qū)分重組病毒。在病毒感染后期，天然病毒產(chǎn)生的多角體蛋白在受其感染細胞的胞核中產(chǎn)生的水平非常高。累積的多角體蛋白形成的包涵體還含有包埋顆粒。這些包涵體的大小為15微米，它們具有高度的折光性，從而使它們呈現(xiàn)明亮的發(fā)光外觀，在光學顯微鏡下很容易觀察。感染了重組病毒的細胞缺少包涵體。為了區(qū)分重組病毒和野生型病毒，用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將轉(zhuǎn)染上清接種到單層昆蟲細胞上形成噬斑。即，在光學顯微鏡下篩選存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重組病毒)包涵體的噬斑?！爱敶⑸飳W方法”第2卷(Ausubel等人編輯)，16.8(增補10，1990)；Summers和Smith，同上；Miller等人(1989)。
已經(jīng)開發(fā)出感染進入幾種昆蟲細胞的重組桿狀病毒表達載體。例如，已經(jīng)開發(fā)出用于感染以下昆蟲細胞的重組桿狀病毒埃及伊蚊、苜蓿丫紋夜蛾、家蠶、黑尾果蠅、草地夜蛾和粉紋夜蛾(WO 89/046699；Carbonell等人(1985)J.Virol.56153；Wright(1986)Nature 321718；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.32156；綜述見Fraser等人(1989)InVitro Cell.Dev.Biol.25225)。
可以購得細胞和細胞培養(yǎng)基用于在桿狀病毒/表達系統(tǒng)中直接表達和融合表達異源多肽；細胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的。例如見Summers和Smith，同上。
然后，經(jīng)修飾的昆蟲細胞可以生長在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基能穩(wěn)定地保持該質(zhì)粒于修飾的昆蟲宿主中。當表達產(chǎn)物的基因處于可誘導的控制下時，可以使宿主生長至高密度，并誘導表達。另外，當表達是組成型表達時，產(chǎn)物將被連續(xù)表達到培養(yǎng)基中，營養(yǎng)性培養(yǎng)基必需不斷循環(huán)，取出感興趣的產(chǎn)物同時補充消耗的營養(yǎng)物。產(chǎn)物可用以下這些技術(shù)來純化例如層析，如HPLC、親和層析、離子交換層析等；電泳；密度梯度離心；溶劑抽提等。產(chǎn)物可按需作進一步純化，以基本上除去所有也分泌到培養(yǎng)基中或由昆蟲細胞裂解而產(chǎn)生的昆蟲蛋白，以提供一種至少基本上不含宿主碎片如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的產(chǎn)物。
為了進行蛋白質(zhì)表達，將從轉(zhuǎn)化子衍生獲得的重組宿主細胞培育在允許重組蛋白的編碼序列表達的條件下。這些條件將隨所選定的宿主細胞而變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易根據(jù)本領(lǐng)域已知的知識來確定該條件。
iii.植物細胞表達系統(tǒng)本領(lǐng)域已知有許多植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和全植物遺傳表達系統(tǒng)。典型的植物細胞基因表達系統(tǒng)包括在以下專利中描述的那些，例如US 5,693,506；US 5,659,122；和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry 303861-3863(1991)中描述了在植物細胞培養(yǎng)物中遺傳表達的其它例子。除上述參考文獻外，關(guān)于植物蛋白信號肽的描述還可在下列文獻中找到Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.20933-40(1987)；Chandler等人，PlantMolecular Biology 3407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.2603731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene 55353-356(1987)；Whittier等人，Nucleic Acids Research152515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology 33-14(1989)；Yu等人，Gene122247-253(1992)。關(guān)于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸誘導分泌的酶調(diào)節(jié)植物基因表達的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，《植物生理學進展》，MalcolmB.Wilkins編輯，1984 Pitman Publishing Limited，London，21-52頁中找到。描述其它調(diào)節(jié)代謝的基因的參考文獻參見Sheen，Plant Cell，21027-1038(1990)；Maas等人，歐洲分子生物學協(xié)會雜志(EMBO J.)93447-3452(1990)；Benkel和Hickey，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.).841337-1339(1987)。
通常，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將所需的多核苷酸序列插入一表達盒中，該表達盒含有為在植物中操作而設計的基因調(diào)控元件。將該表達盒插入所需的表達載體中，表達盒的上游和下游有適合在植物宿主中表達的伴隨序列。這些伴隨序列可來自質(zhì)?；虿《?，并為載體提供所需的性能，以允許載體將DNA從起初的克隆宿主(如細菌)中移動到所需植物宿主中?；A(chǔ)的細菌/植物載體構(gòu)建物最好能提供寬的宿主范圍原核復制起點；原核可選擇標記；以及，對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而言，宜提供T DNA序列用于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)移至植物染色體。當異源基因不易檢測時，該構(gòu)建物最好還具有一個適用于確定植物細胞是否已經(jīng)轉(zhuǎn)化的可選擇標記基因。關(guān)于合適標記(例如對于禾草類家族成員)的綜述可在Wilmink和Dons，1993，Plant Mol.Biol.Reptr，11(2)165-185中找到。
還建議采用適合將異源序列整合到植物基因組中的序列。這些序列可能包括用于同源重組的轉(zhuǎn)座子序列以及允許將異源表達盒隨機插入植物基因組中的Ti序列。合適的原核可選擇標記包括抗生素(如氨芐青霉素或四環(huán)素)抗性標記。編碼其它功能的其它DNA序列也可存在于載體中，這是本領(lǐng)域所知的。
本發(fā)明的核酸分子可包括在一個表達盒中來表達感興趣的蛋白質(zhì)。通常只要一個表達盒，但是兩個或多個表達盒也是可行的。除了編碼異源蛋白的序列外，重組表達盒還含有下列元件啟動子區(qū)域、植物5′非翻譯序列、起始密碼子(根據(jù)結(jié)構(gòu)基因原來是否具有而定)、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。表達盒5′和3′端的獨特限制性酶位點能使表達盒方便地插入預先存在的載體中。
異源編碼序列可以用于任何與本發(fā)明有關(guān)的蛋白。編碼感興趣的蛋白的序列將編碼出一個信號肽，該信號肽能適當?shù)丶庸ず娃D(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，并且通常缺少可能會導致本發(fā)明的所需蛋白與膜結(jié)合的序列。由于對于大部分來說，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)將針對發(fā)芽期間表達和轉(zhuǎn)運的基因，采用提供轉(zhuǎn)運的信號肽，也可提供轉(zhuǎn)運感興趣的蛋白質(zhì)。通過這種方式，感興趣的蛋白將從表達該蛋白的細胞中轉(zhuǎn)運出來，并能被有效地收獲。通常，種子中的分泌是通過糊粉或小盾體上皮層進入種子的胚乳。盡管不需要使蛋白從產(chǎn)生該蛋白的細胞中分泌出來，但是這種分泌有利于重組蛋白的分離和純化。
由于所需基因產(chǎn)物的最終表達將在真核細胞中進行，因此需要確定克隆的基因部分是否含有作為內(nèi)含子被宿主剪接體機制加工的序列。如果是這樣，需要對“內(nèi)含子”區(qū)進行定點誘變，以防止一部分遺傳信息作為錯誤的內(nèi)含子密碼而喪失，Reed和Maniatis，Cell 4195-105，1985。
可用微量移液管以機械方式轉(zhuǎn)移重組DNA，將載體直接顯微注射到植物細胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet，202179-185。還可用聚乙二醇將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物細胞中，Krens等人，Nature，296，72-74，1982。導入核酸片段的另一種方法是用小顆粒進行高速彈道貫穿，在這些小珠或顆粒的基質(zhì)中或表面上帶有核酸，Klein等人，Nature，327，70-73，1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185330-336提出用顆粒轟擊大麥胚乳以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大麥。還有一種導入方法是使原生質(zhì)體和其它實體(微細胞(minicell)、細胞、溶酶體或其它可融合的脂質(zhì)表面體)融合，F(xiàn)raley等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。
載體也可通過電穿孔導入植物細胞中。(Fromm等人，PNAS 825824，1958)。在該技術(shù)中，在含有基因構(gòu)建物的質(zhì)粒存在下電穿孔植物原生質(zhì)體。高電場強度的電脈沖使生物膜可逆地被通透，從而允許導入質(zhì)粒。電穿孔的植物原生質(zhì)體重新形成細胞壁，分裂并形成植物愈傷組織。
能分離出原生質(zhì)體并能培育成全再生植物的所有植物，都能用本發(fā)明進行轉(zhuǎn)化，從而回收得到含有轉(zhuǎn)基因的全植物。已經(jīng)知道實際上可以從培育的細胞或組織再生所有的植物，其包括但不局限于，甘蔗、甜菜、棉花、果實和其它樹、豆科植物和蔬菜的所有主要種類。一些合適的植物包括，例如，草莓屬、蓮花屬、苜蓿屬、驢食豆屬、三葉草屬、胡盧巴屬、豇豆屬、柑橘屬、亞麻屬、老鸛草屬、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、鼠耳芥屬、蕓苔屬、蘿卜屬、白芥屬、顛茄屬、辣椒屬、曼陀羅屬、天仙子屬、番茄屬、煙草屬、茄屬、碧冬茄屬、毛地黃屬、Majorana、菊苣屬、向日葵屬、萵苣屬、雀麥屬、天門冬屬、金魚草屬、龍骨角屬、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬、稷屬、狼尾草屬、毛茛屬、千里光屬、蛾蝶花屬(Salpiglossis)、香瓜屬、Browaalia、大豆屬、黑麥草屬、玉蜀黍?qū)?、小麥屬、蜀黍?qū)俸吐恿_屬各種類。
再生方式隨各種植物而有所不同，但是通常是首先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸液。形成愈傷組織，從愈傷組織中誘生出枝條，隨后是根。另外，從原生質(zhì)體懸液可以誘生形成胚胎。這些胚胎象天然的胚胎那樣發(fā)芽形成植物。培養(yǎng)基通常含有各種氨基酸和激素，如植物生長素和細胞分裂素。尤其是對于玉米和苜蓿屬來說，在培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝條和根通常同時發(fā)育。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型以及培養(yǎng)史。如果控制了這三個變量，那么再生能完全再現(xiàn)和重復。
在一些植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，本發(fā)明所需的蛋白可能被排泄出來，或者蛋白可從全植物中提取出來。當本發(fā)明所需的蛋白被分泌到培養(yǎng)基中后，就可進行收集。或者，可以用機械方式破碎胚以及無胚-半種子或其它植物組織，以釋放出分泌到細胞和組織之間的蛋白。將該混合物懸于緩沖液中，以收回可溶性蛋白。然后用常規(guī)的蛋白分離和純化方法純化重組蛋白。用常規(guī)方法調(diào)節(jié)時間、溫度、pH、氧和體積等參數(shù)，以優(yōu)化異源蛋白的表達和回收。
iv.細菌系統(tǒng)細菌表達技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。細菌啟動子是能結(jié)合細菌RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常位于編碼序列的5′端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點以及一個轉(zhuǎn)錄起始位點。細菌啟動子可能還有第二個功能區(qū)域稱為操縱子，它可能與毗鄰的RNA合成開始的RNA聚合酶結(jié)合位點重疊。該操縱子允許(可誘導)對轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié)，因為基因阻遏蛋白可能結(jié)合操縱子并因而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在負調(diào)節(jié)元件(如操縱子)不存在時，可能發(fā)生組成型表達。另外，正調(diào)節(jié)可通過基因激活蛋白結(jié)合序列來實現(xiàn)，如果有的話，該結(jié)合序列通常鄰近RNA聚合酶結(jié)合序列的(5′)?；蚣せ畹鞍椎睦邮欠纸獯x物激活劑蛋白(CAP)，它幫助啟動大腸桿菌(E.coli)中的lac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18173]。因此，表達的調(diào)控可能是正作用或負作用，從而增強或減弱轉(zhuǎn)錄。
編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人(1977)Nature 1981056]和麥芽糖)代謝酶的啟動子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))[Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.84057；Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9731；美國專利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]的啟動子序列。β-內(nèi)酰胺酶(bla)啟動子系統(tǒng)[Weissmann(1981)″干擾素的克隆和其它錯誤″《干擾素3》(I.Gresser編輯)]，λ嗜菌體PL[Shimatake等人(1981)Nature 292128]和T5[美國專利4,689,406]啟動子系統(tǒng)也提供了有用的啟動子序列。
另外，非天然存在的合成的啟動子也可象細菌啟動子一樣起作用。例如，一種細菌或嗜菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄激活序列可以和另一種細菌或嗜菌體啟動子的操縱子序列連接在一起，形成合成的雜交啟動子[美國專利4,551,433]。例如，tac啟動子是雜合的trp-lac啟動子，它由trp啟動子以及受lac阻遏蛋白調(diào)節(jié)的lac操縱子序列組成[Amann等人(1983)Gene 25167；de Boer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021]。另外，細菌啟動子可包括非細菌來源但能結(jié)合細菌RNA聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動子。天然存在的非細菌來源的啟動子還能和相容的RNA聚合酶偶聯(lián)在一起，從而在原核細胞中高水平地表達某些基因。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)就是一種偶聯(lián)的啟動子系統(tǒng)[Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074]。另外，雜合的啟動子還可由嗜菌體啟動子以及大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(EP-A-0267851)。
除了有功能的啟動子序列外，有效的核糖體結(jié)合位點對于外來基因在原核細胞中的表達也是有用的。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點稱為Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密碼子(ATG)以及在起始密碼子上游3-11個核苷酸處的長度為3-9個核苷酸的序列[Shine等人(1975)Nature 25434]。認為SD序列是通過SD序列和大腸桿菌16SrRNA的3′端之間堿基配對來促進mRNA與核糖體結(jié)合的[Steitz等人(1979)″信使RNA中的遺傳信號和核苷酸序列″生物學調(diào)節(jié)和發(fā)育基因表達″(編者R.F.Goldberger)]。為了表達具有弱的核糖體結(jié)合位點的原核基因和真核基因[Sambrook等人(1989)″克隆基因在大腸桿菌中的表達″《分子克隆實驗手冊》]。
DNA分子可以在胞內(nèi)表達。啟動子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，N端的第一個氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育或通過和細菌甲硫氨酸N-端肽酶體內(nèi)或體外培育，將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下(EP-A-0219237)。
融合蛋白為直接表達提供了另一種方法。通常，將編碼內(nèi)源細菌蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5′端融合。在表達時，該構(gòu)建物將提供這兩個氨基酸序列的融合物。例如，λ噬菌體細胞基因可以和外源基因的5′端相連并在細菌中表達。所得融合蛋白宜保留一個酶(因子Xa)加工位點，以便將噬菌體蛋白與外源基因切開[Nagai等人(1984)Nature 309810]。融合蛋白也可用lacZ[Jia等人(1987)Gene 60197]，trpE[Allen等人(1987)J.Biotechnol.593；Makoff等人(1989)，J.Gen.Microbiol.13511]以及Chey[EP-A-0324647]基因的序列組成。兩個氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一可切割的位點。另一個例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成，該區(qū)域宜保留一個酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。通過這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白[Miller等人(1989)Bio/Technology 7698]。
另外，還可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子來將外源蛋白分泌出細胞，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個信號肽序列片段，該序列片段能使細菌中的外源蛋白分泌出來[美國專利4,336,336]。信號序列片段通常編碼一個信號肽，該信號肽含有疏水性氨基酸，能指引蛋白分泌出細胞。蛋白質(zhì)被分泌到生長培養(yǎng)基(革蘭陽性菌)中或細胞內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)間隙內(nèi)(革蘭陰性菌)。在編碼的信號肽片段和外源基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點。
編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性細菌蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如是大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等人(1983)，《基因表達的實驗操作》；Ghrayeb等人(1984)EMBO J.32437]以及大腸桿菌堿性磷酸酶信號序列(pboA)[Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212]。另一個例子是，可采用各種芽孢桿菌菌株的α淀粉酶基因的信號序列將異源蛋白分泌出枯草芽孢桿菌[Palva等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0244 042]。
通常，細菌所識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3′的調(diào)控區(qū)，它和啟動子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列通常包括約50個核苷酸的DNA序列，該序列能形成幫助終止轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例子包括衍生自具有強啟動子的基因(如大腸桿菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的轉(zhuǎn)錄終止序列。
上述組件，包括啟動子、信號序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列通常一起被放在表達構(gòu)建物中。表達構(gòu)建物通常以復制子的形式維持，例如能在宿主(如細菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復制子具有一個復制系統(tǒng)，從而允許其維持在原核宿主中或進行表達或進行克隆和擴增。另外，復制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個質(zhì)粒，更佳的含有至少約20個質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對宿主的影響，可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。
另外，表達構(gòu)建物可以和一個整合載體一起整合入細菌基因組中。整合載體通常含有至少一個序列與細菌染色體同源，從而允許該載體整合。整合看來是載體和細菌染色體中的同源DNA之間重組的結(jié)果。例如，用不同芽孢桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體整合到芽孢桿菌染色體中(EP-A-0127328)。整合載體還可包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列。
通常，染色體外構(gòu)建物以及整合的表達構(gòu)建物可含有可選擇的標記，以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株?？蛇x擇標記可在細菌宿主中表達，其包括賦予細菌對藥物(如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素)抗性的基因[Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469]。可選擇標記還可包括生物合成性基因，如在組氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途徑中的那些基因。
另外，上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個可選擇標記，如上所述，該載體以復制子形式維持或發(fā)展成一個整合載體。
已經(jīng)開發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化到許多細菌中的表達和轉(zhuǎn)化載體(無論是染色體外復制子還是整合載體)。例如，已經(jīng)開發(fā)出了用于下列細菌的表達載體枯草芽孢桿菌[Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0036259和063 953；WO84/04541]，大腸桿菌[Shimatake等人，(1981)Nature 292128；Amann等人，(1985)Gene40183；Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189113；EP-A-0036 776、136 829和136 907]，酪鏈球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655]；淺青紫鏈球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655]，淺青紫鏈霉菌[美國專利4,745,056]。
將外源DNA導入細菌宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用氯化鈣或其它試劑(如二價陽離子和二甲亞砜)處理對細菌進行轉(zhuǎn)化。DNA還可通過電穿孔方法導入細菌細胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的細菌種類而不同。[參見，例如使用桿菌Masson等人，(1989)FEMS Microbiol.Lett.60273；Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA795582；EP-A-0036 259和063 953；WO 84/04541；使用彎曲桿菌Miller等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；和Wang等人，(1990)J.Bacteriol.172949；使用埃希氏大腸桿菌Cohen等人，(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower等人，(1988)NucleicAcids Res.166127；Kushner(1978)″用ColE1-衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進方法″Genetic EngineeringProceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia編輯)；Mandel等人，(1970)J. Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949318；使用乳酸桿菌Chassy等人，(1987)FEMS Microbiol.Lett.44173；使用假單胞菌Fiedler等人，(1988)Anal.Biochem 17038；使用葡萄球菌Augustin等人，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203；使用鏈球菌Barany等人，(1980) J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)″用電穿孔轉(zhuǎn)化鏈球菌產(chǎn)乳酸微生物″Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III編輯)；Perry等人，(1981)Infect.Immun.321295；Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti等人，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1412]。
v.酵母表達酵母表達系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。酵母啟動子是能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，它通常位于編碼序列的5′端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(″TATA″盒)以及一個轉(zhuǎn)錄起始位點。酵母啟動子可能還有第二個功能區(qū)域稱為上游激活序列(UAS)，如果存在的話，它通常遠離結(jié)構(gòu)基因。UAS能調(diào)節(jié)表達(可誘導)。在UAS不存在時，發(fā)生組成型表達。表達的調(diào)控可能是正作用或負作用的，從而增強或減弱轉(zhuǎn)錄。
酵母是一種發(fā)酵生物體，具有活潑的代謝途徑，因此編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP-A-0284 044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的啟動子序列[Myanohara等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801]。
另外，非天然存在的合成的啟動子也可象酵母啟動子一樣起作用。例如，一種酵母啟動子的UAS序列可以和另一種酵母啟動子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)連接在一起，形成合成的雜合啟動子。這種雜合啟動子的例子包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)相連的ADH調(diào)控序列(美國專利No.4,876,197和4,880,734)。雜合啟動子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的調(diào)控序列組成的啟動子與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的組合(EP-A-0164 556)。另外，酵母啟動子可包括非酵母來源但能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動子。這些啟動子的例子包括，尤其是，[Cohen等人，(1980) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078；Henikoff等人，(1981)Nature 283835；Hollenberg等人，(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96119；Hollenberg等人，(1979)″細菌抗生素抗性基因在釀酒酵母中的表達″Plasmids of Medical，Environmentaland Commercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler編輯)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)Gene 11163；Panthier等人，(1980)Curr.Genet.2109]。
DNA分子可以在酵母菌胞內(nèi)表達。啟動子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，重組蛋白N端的第一個氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下。
象在哺乳動物、桿狀病毒以及細菌表達系統(tǒng)中一樣，融合蛋白為酵母表達系統(tǒng)提供了另一種方法。通常，將編碼內(nèi)源酵母蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5′端融合。在表達時，該構(gòu)建物將提供這兩個氨基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5′端相連并在酵母中表達。兩個氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼可切割的位點。例如參見EP-A-0196056。另一個例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成，該區(qū)域宜保留一個酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。因此，通過這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。
另外，還可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子來將外源蛋白從細胞分泌到生長培養(yǎng)基中，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個前導序列片段，該前導序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出來。較佳的，在編碼的前導片段和外來基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點。該前導序列片段通常編碼了含有疏水性氨基酸的信號肽，其引導蛋白從細胞分泌出來。
編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性酵母蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如有酵母轉(zhuǎn)化酶基因(EP-A-0012 873；JPO 62096,086)以及A-因子基因(美國專利4,588,684)。另外，非酵母來源的前導序列(如干擾素前導序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060 057)。
較佳的一類分泌前導序列采用了酵母α-因子基因的片段，其含有″pre″信號序列和″pro″區(qū)。可采用的α因子片段的類型包括全長pre-pro α因子前導序列(約83個氨基酸殘基)以及截短的α-因子前導序列(通常約25至50個氨基酸殘基)(美國專利4,546,083和4,870,008；EP-A-0324274)。采用α-因子前導片段提供分泌作用的其它前導序列包括雜合的α-因子前導序列，其由第一個酵母的pre序列以及第二個酵母α因子的pro區(qū)域組成(例如見WO 89/02463)。
通常，酵母識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3′的調(diào)控區(qū)，其和啟動子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列和其它酵母識別的終止序列的例子是編碼糖酵解酶的那些轉(zhuǎn)錄終止序列。
上述組件，包括啟動子、前導序列(如果需要時)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列，通常被一起放在表達構(gòu)建物中。表達構(gòu)建物通常以復制子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或細菌)中穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復制子可能具有兩個復制系統(tǒng)，從而允許其能維持在例如酵母中進行表達，并能維持在原核宿主進行克隆和擴增。這些酵母-細菌穿梭載體的例子包括YEp24[Botstein等人(1979)Gene 817-24]，pCL/1[Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646]和YRp17[Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158157]。另外，復制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個質(zhì)粒，更佳的含有至少約20個質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對宿主的影響，可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。例如參見Brake等人，同上。
另外，表達構(gòu)建物可以和一個整合載體一起整合入酵母基因組中。整合載體通常含有至少一個序列與酵母染色體同源，從而允許該載體整合，最好含有兩個同源序列側(cè)接該表達構(gòu)建物。整合看來是載體和酵母染色體中同源DNA之間重組的結(jié)果[Orr-Weaver等人(1983)Methods in Enzymol.101228-245]。通過選擇合適的同源序列插入載體中，可將整合載體導入酵母中某一特定的基因座。見Orr-Weaver等人，同上。可以整合入一個或多個表達構(gòu)建物，這可能會影響重組蛋白產(chǎn)生的水平[Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806750]。載體中的染色體序列可以載體中的單個片段形式存在(從而導致整個載體的整合)，或是與染色體中的相鄰片段同源的兩個片段，這兩個片段在載體中側(cè)接在表達構(gòu)建物兩側(cè)，從而可導致僅表達構(gòu)建物的穩(wěn)定性整合。
通常，染色體外構(gòu)建物以及整合的表達可建物均含有可選擇的標記，以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株?？蛇x擇標記可包括能在酵母宿主中表達的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，這些基因分別賦予酵母細胞對衣霉素以及G418的抗性。另外，合適的可選擇標記還可能為酵母在毒性化合物(如金屬)存在下提供生長能力。例如，CUP1的存在使酵母能在銅離子存在下生長[Butt等人，(1987)Microbiol，Rev.51351]。
另外，上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個可選擇標記，如上所述，該載體以復制子形式維持或發(fā)展成一個整合載體。
已經(jīng)開發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化入許多酵母中的表達和轉(zhuǎn)化載體(無論是染色體外復制子還是整合載體)。例如，已經(jīng)開發(fā)出用于下列酵母菌的表達載體和將外源DNA導入酵母宿主的方法白色念珠菌[Kurtz，等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6142]，麥芽糖念珠菌[Kunze，等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141]，多形漢遜酵母[Gleeson，等人，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202302]，脆壁克魯維酵母[Das，等人，(1984)J.Bacteriol.1581165]，乳酸克魯維酵母[De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154737；Van den Berg等人，(1990)Bio/Technology 8135]，季也蒙畢赤酵母[Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141]，巴斯德畢赤酵母[Cregg，等人，(1985)Mol.Cell.Biol.53376；美國專利No.4,837,148和4,929,555]，釀酒酵母[Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153163]，栗酒裂植酵母[Beach和Nurse(1981)Nature 300706]，以及Yarrowia lipolytica[Davidow，等人，(1985)Curr.Genet.10380471 Gaillardin，等人，(1985)Curr.Genet.1049]。
將外源DNA導入酵母宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用堿陽離子處理轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球或完整酵母細胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的酵母種類而不同。例如參見，[Kurtz等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6142；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141；念珠菌]；[Gleeson等人，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202302；漢遜酵母]；[Das等人，(1984)J.Bacteriol.1581165；De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.1541165；Van den Berg等人，(1990)Bio/Technology 8135；克魯維酵母]；[Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.53376；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141；美國專利No.4,837,148和4,929,555；畢赤酵母]；[Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153163釀酒酵母]；[Beach和Nurse(1981)Nature 300706；裂殖酵母]；[Davidow等人，(1985)Curr.Genet.1039；Gaillardin等人，(1985)Curr.Genet.1049；Yarrowia]。
抗體本文所用的術(shù)語“抗體”指由至少一個抗體結(jié)合位點組成的一個或一組多肽?！翱贵w結(jié)合位點”是一個三維結(jié)合空間，其內(nèi)表面形狀和電荷分布與抗原表位的特征互補，從而使抗體與抗原結(jié)合。“抗體”例如包括，脊椎動物抗體、雜合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、經(jīng)修飾的抗體、單價抗體、Fab蛋白以及單結(jié)構(gòu)域抗體。
針對本發(fā)明蛋白的抗體可用于親和層析、免疫試驗以及區(qū)別/鑒定奈瑟球菌蛋白。
針對本發(fā)明蛋白的多克隆和單克隆抗體可用常規(guī)方法制得。通常，首先用蛋白來免疫合適的動物，較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可獲得的血清體積多，能獲得標記的抗家兔和抗山羊抗體，因此對于制備多克隆抗血清來說，家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如Freund氏完全佐劑)混合或乳化，然后腸胃外(通常是皮下或肌內(nèi))注射該混合物或乳劑。每次注射50-200微克的劑量就足夠了。2-6周后用鹽水(較佳的是用Freund氏不完全佐劑)配的蛋白質(zhì)注射一次或多次以強化免疫。另外可以用本領(lǐng)域已知的方法進行體外免疫來產(chǎn)生抗體，從本發(fā)明的目的來看，認為其與體內(nèi)免疫等效。將免疫后的動物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育該血液1小時，然后4℃培育2-18小時，獲得多克隆抗血清。離心(例如1000g 10分鐘)回收血清。家兔每次取血可獲得約20-50毫升。
用Kohler和Milstein的標準方法[Nature(1975)256495-96]或其改進方法制得單克隆抗體。通常，如上所述對小鼠或大鼠免疫。然而，并非是對動物取血然后抽提血清，而是取出脾臟(以及任選地取出幾個大的淋巴結(jié))，將其分離成單細胞。如果需要，可將細胞懸液(在除去非特異性粘附的細胞后)加入包被了蛋白質(zhì)抗原的板或孔中，對脾細胞進行篩選。表達抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細胞結(jié)合到板上，不象懸液其它物質(zhì)那樣被洗去。然后對所得B細胞或所有解離的脾細胞進行誘導，使其與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤，培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基(如次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養(yǎng)基，“HAT”)中。通過有限稀釋接種所得雜交瘤，并測定特異性結(jié)合免疫抗原(且不結(jié)合無關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生。然后，體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應器中)或體內(nèi)(如小鼠腹水中)培養(yǎng)所選的分泌單克隆抗體的雜交瘤。
如果需要，抗體(無論是多克隆還是單克隆抗體)可用常規(guī)技術(shù)來標記。合適的標記包括熒光團、發(fā)色團、放射活性原子(尤其是和)、密電子試劑、酶、以及具有特異性結(jié)合配偶的配體。酶通常靠其活性來檢測。例如，辣根過氧化物酶通常是檢測其將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍色的能力，可用分光光度計定量測定。“特異性結(jié)合配偶”指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原以及對其有特異性的單克隆抗體。其它特異性結(jié)合配偶包括生物素和親和素或鏈親和素，IgG和蛋白A，以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。應理解，上述內(nèi)容并非要將各種標記分成不同的類，因為同一標記可在幾種不同的模型中起作用。例如，可作為放射活性標記，或作為密電子試劑。HRP可作為酶或單抗的抗原。另外，一種物質(zhì)可以和各種標記組合以獲得所需的效果。例如，在實施本發(fā)明中，單抗和親和素也需要標記，因此，可以用生物素標記單抗，并用標記了的親和素檢測其存在，或用標記HRP的抗生物素單抗檢測其存在。其它替換和可能性對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的，所以應認作等價物屬于本發(fā)明的范圍。
藥物組合物藥物組合物可包含本發(fā)明的多肽、抗體或核酸。該藥物組合物將包含治療有效量的本發(fā)明的多肽、抗體或多核苷酸。
本文所用的術(shù)語“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果的量。該效果例如可通過化學標記或抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性癥狀的減少，例如導致體溫降低。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。
為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構(gòu)建物。
藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術(shù)語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑(例如抗體、多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可能是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
本文可用的藥學上可接受的鹽例如有無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。
治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學上可接受的載體的定義中。
輸藥方法一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待治療的對象可以是動物；尤其可以治療人對象。
直接輸送該組合物通?？赏ㄟ^皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸送至組織間隙來實現(xiàn)。組合物也可輸送至病灶區(qū)。其它給藥方式包括口服和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮膚施用(參見例如WO98/20734)、用針、基因槍或手持噴霧器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
疫苗本發(fā)明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。
這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸，通常與“藥學上可接受的載體”組合，這些載體包括本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素(如白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。
增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，例如，(a)MF59TM(WO 90/14837；第10章疫苗設計亞基和佐劑方法，Powell和Newman編，Plenum Press，1995)，其含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span 85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亞微米級顆粒；(b)SAF，其含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(見下文)，微量流化成亞微米級乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑，和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鯊烯、0.2％吐溫80以及取自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐劑，例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或從其產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性復合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA)；(5)細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；以及(6)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質(zhì)。Alum和MF59TM是較佳的。
如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨?；?L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
免疫原性組合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，藥學上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運載體中。
通常，可將免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。
用作疫苗的免疫原性組合物，包含免疫學有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的組分?！懊庖邔W有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實驗來確定。
常規(guī)方法是從腸胃外途徑通過注射給予免疫原性組合物，例如皮下、肌內(nèi)或透皮給藥(例如WO98/20734)。適合其它給藥方式的其它配方包括口服和肺制劑、栓劑和透皮應用。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。
作為以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗的一種替代方案是，可以采用DNA疫苗接種[例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9271-283；Donnelly等人(1997)AnnuRev.Immunol 15617-648；見下文]。
基因輸送載體用于輸送構(gòu)建物的基因治療載體可以局部或全身性給予，其中所述構(gòu)建物包括本發(fā)明治療劑的編碼序列，將其輸送至哺乳動物以便在哺乳動物體內(nèi)表達。這些構(gòu)建物可利用體內(nèi)或活體外方式中的病毒或非病毒載體方法。這些編碼序列的表達可用內(nèi)源哺乳動物啟動子或異源啟動子誘導。編碼序列的體內(nèi)表達可以是組成型的或受調(diào)控的。
本發(fā)明包括能表達所涉及的核酸序列的基因輸送運載體?；蜉斔瓦\載體宜為病毒載體，更佳的是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒或甲病毒載體。病毒載體還可以是星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒或披膜病毒的病毒載體。通常參見Jolly(1994)Cancer GeneTherapy 151-64；Kimura(1994)Human Gene Therapy 5845-852；Connelly(1995)HumanGene Therapy 6185-193；以及Kaplitt(1994)Nature Genetics 6148-153。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是本領(lǐng)域中熟知的并且我們認為任何逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體都可用于本發(fā)明，它們包括B、C和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1(見O′Neill(1985)J.Virol.53160)廣嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒如MCF和MCF-MLV(見Kelly(1983)J.Virol 45291)、泡沫病毒和慢病毒。見《RNA腫瘤病毒》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985。
逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的諸部分可從不同逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生獲得。例如，逆轉(zhuǎn)錄載體LTR可以從小鼠肉瘤病毒衍生獲得，tRNA結(jié)合位點可以從Rous肉瘤病毒衍生獲得，包裝信號從小鼠白血病病毒獲得，第二鏈的合成起點從禽類白血病病毒獲得。
可將這些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入合適的包裝細胞系，用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)導感受態(tài)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒(見美國專利5,591,624)。通過將嵌合性整合酶摻入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以便將其定點整合到宿主細胞DNA中(見WO96/37626)。較佳的重組病毒載體是復制缺陷型重組病毒。
適合與上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一起使用的包裝細胞系是本領(lǐng)域熟知的，很容易制得(見WO95/30763和WO92/05266)，并能用來產(chǎn)生能生產(chǎn)重組載體顆粒的生產(chǎn)型細胞系(也稱為載體細胞系或“VCL”)。包裝細胞系宜從人親代細胞(如HT1080細胞)或貂親代細胞系制取，以便消除人血清的滅活作用。
用來構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的較佳的逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括禽類白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂細胞灶誘導病毒、鼠肉瘤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒和Rous肉瘤病毒。特別佳的鼠白血病病毒包括4070A和1504A(Hartley和Rowe(1976)J Virol 1919-25)，Abelson(ATCC No.VR-999)，F(xiàn)riend(ATCC No.VR-245)，Graffi，Gross(ATCC Nol VR-590)，Kirsten，Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)以及莫洛尼鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒可以從保藏機構(gòu)或保藏中心如Rockville，Maryland的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，或用常用的技術(shù)從已知來源分離獲得。
可用于本發(fā)明的典型的已知逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體包括在以下專利申請中描述的那些載體GB2200651，EP0415731，EP0345242，EP0334301，WO89/02468；WO89/05349，WO89/09271，WO90/02806，WO90/07936，WO94/03622，WO93/25698，WO93/25234，WO93/11230，WO93/10218，WO91/02805，WO91/02825，WO95/07994，US 5,219,740，US 4,405,712，US 4,861,719，US 4,980,289，US 4,777,127，US 5,591,624.另見Vile(1993)Cancer Res 533860-3864；Vile(1993)Cancer Res 53962-967；Ram(1993)Cancer Res 53(1993)83-88；Takamiya(1992)J Neurosci Res 33493-503；Baba(1993)J Neurosurg 79729-735；Mann(1983)Cell 33153；Cane(1984)Proc Natl Acad Sci816349；以及Miller(1990)Human Gene Therapy 1。
人腺病毒基因治療載體也是本領(lǐng)域中已知的，并可用于本發(fā)明。例如參見Berkner(1988) Biotechniques 6616和Rosenfeld(1991)Science 252431，以及WO93/07283，WO93/06223和WO93/07282。用于本發(fā)明的典型的已知的腺病毒基因治療載體包括在上述文獻以及下述專利中描述的那些例子WO94/12649，WO93/03769，WO93/19191，WO94/28938，WO95/11984，WO95/00655，WO95/27071，WO95/29993，WO95/34671，WO96/05320，WO94/08026，WO94/11506，WO93/06223，WO94/24299，WO95/14102，WO95/24297，WO95/02697，WO94/28152，WO94/24299，WO95/09241，WO95/25807，WO95/05835，WO94/18922和WO95/09654。另外，可以采用Curiel(1992)Hum.GeneTher.3147-154中描述的給予和已殺死腺病毒相連的DNA的方法。本發(fā)明的基因輸遞載體還包括腺病毒伴隨病毒(AAV)載體。用于本發(fā)明的這種載體的主要且較佳的例子是Srivastava，WO93/09239中公開的AAV-2為基礎(chǔ)的載體。最佳的AAV載體包含兩個AAV反向末端重復序列，其中通過替換核苷酸對天然D-序列進行修飾，使至少5-18個天然的核苷酸(較佳的至少10-18個天然核苷酸，最佳的10個天然核苷酸)被保留下來，而D-序列其余的核苷酸缺失或用非天然核苷酸取代。AAV反向末端重復序列的天然D-序列是每個AAV反向末端重復序列中不參與HP形成的20個串聯(lián)核苷酸的序列(即每一端有一個序列)。非天然的替換核苷酸可以是天然D-序列該位置中所見核苷酸以外的任何核苷酸。其它可采用的典型AAV載體是pWP-19、pWN-1，兩者均公開在Nahreini(1993)Gene 124257-262中。這樣的AAV載體的另一個例子是psub201(見Samulski(1987)J.Virol.613096)。另一個典型的AAV載體是Double-D ITR載體。Double-D ITR載體的構(gòu)建方案公開在美國專利5,478,745中。還有其它的載體是公開在Carter的美國專利4,797,368和Muzyczka的美國專利5,139,941、Chartejee的美國專利5,474,935和Kotin的WO94/288157中的載體。可用于本發(fā)明的另一個AAV載體例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增強子和白蛋白啟動子，并且主要指導肝內(nèi)表達。其結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方案公開在Su(1996)Human Gene Therapy 7463-470中。其它的AAV基因治療載體在美國專利5,354,678，5,173,414，5,139,941，5,252,479中有所描述。
本發(fā)明的基因治療載體還包括皰疹載體。主要且較佳的例子是含有編碼胸苷激酶多肽的序列的單純皰疹病毒載體，如公開在US5,288,641和EP0176170(Roizman)中的那些。其它典型的單純皰疹病毒載體包括WO95/04139中公開的HFEM/ICP6-LacZ(Wistar Institute)、Geller(1988)Science 2411667-1669以及WO90/09441和WO92/07945中公開的pHSVlac、Fink(1992)Human Gene Therapy 311-19中描述的HSVUs3∷pgC-lacZ、EP 0453242(Breakefield)中描述的HSV 7134、2 RH 105和GAL4以及保藏于ATCC、保藏號為ATCC VR-977和ATCC VR-260的那些病毒。
還考慮到甲病毒基因基因治療載體也可用于本發(fā)明。較佳的甲病毒載體是新培斯病毒載體。披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)、以及在美國專利5,091,309，5,217,879以及WO92/10578中描述的那些。更具體地說，可以采用1995年3月15日提交的美國申請08/405,627、WO94/21792、WO92/10578、WO95/07994、US 5,091,309和US 5,217,879中描述的那些甲病毒載體。這些甲病毒可以從保藏機構(gòu)或保藏中心如Rockville，Maryland的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，或用常用的技術(shù)從已知來源分離獲得。較佳的是，采用細胞毒性降低的甲病毒載體(見USSN 08/679640)。
DNA載體系統(tǒng)，如真核分層的(layered)表達系統(tǒng)也可用于表達本發(fā)明的核酸。關(guān)于真核分層的表達系統(tǒng)詳見WO95/07994。較佳的，本發(fā)明的真核分層表達系統(tǒng)宜從甲病毒載體衍生獲得，更佳的從新培斯病毒載體衍生獲得。
適用于本發(fā)明的其它病毒載體包括從脊髓灰質(zhì)炎病毒衍生的載體，例如ATCCVR-58以及在Evans，Nature 339(1989)385和Sabin(1973)J.Biol.Standardization 1115中描述的那些；鼻病毒，例如ATCC VR-1110以及在Arnold(1990)J Cell Biochem L401中描述的那些；痘病毒，如金黃色痘病毒或牛痘病毒，例如ATCC VR-111和ATCCVR-2010，以及在Fisher-Hoch(1989)Proc Natl Acad Sci 86317；Flexner(1989)Ann NYAcad Sci 56986，F(xiàn)lexner(1990)Vaccine 817；US 4,603,112，US 4,769,330以及WO89/01973中描述的那些；SV40病毒，例如ATCC VR-305以及在Mulligan(1979)Nature 277108和Madzak(1992)J Gen Virol 731533中描述的那些；流感病毒，例如ATCC VR-797以及用例如US 5,166,057和Enami(1990)Proc Natl Acad Sci873802-3805；Enami和Palese(1991)J Virol 652711-2713；Luytjes(1989)Cell 59110中所述的反基因技術(shù)制得的重組流感病毒(另見McMichael(1983)NEJ Med 30913，Yap(1978)Nature 273238以及Nature(1979)277108)；EP-0386882和Buchschacher(1992)J.Virol.662731中描述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，例如ATCC VR-67和VR-1247，以及EP-0440219中描述的那些；奧拉病毒，例如ATCC VR-368；Bebaru病毒，例如ATCC VR-600和ATCC VR-1240；Cabassou病毒，例如ATCC VR-922；屈曲病毒，例如ATCC VR-64和ATCC VR-1241；Fort Morgan病毒，例如ATCC VR-924；Getah病毒，例如ATCC VR-369和ATCC VR-1243；Kyzylagach病毒，例如ATCC VR-927；Mayaro病毒，例如ATCC VR-66；Mucambo病毒，例如ATCC VR-580和ATCCVR-1244；Ndumu病毒，例如ATCC VR-371；Pixuna病毒，例如ATCC VR-372和ATCCVR-1245；Tonate病毒，例如ATCC VR-925；Triniti病毒，例如ATCC VR-469；Una病毒，例如ATCC VR-374；Whataroa病毒，例如ATCC VR-926；Y-62-33病毒，例如ATCC VR-375；O′Nyong病毒，東部腦炎病毒，例如ATCC VR-65和ATCC VR-1242；西部腦炎病毒，例如ATCC VR-70，ATCC VR-1251，ATCC VR-622和ATCC VR-1252；和冠狀病毒，例如ATCC VR-740和在Hamre(1966)Proc Soc Exp Biol Med 121190中描述的那些。
將本發(fā)明的組合物輸送至細胞內(nèi)并不局限于上述病毒載體。還可采用其它輸送方法和介質(zhì)，例如核酸表達載體、與已被殺死的腺病毒相連或不相連的單獨的聚陽離子凝縮的DNA(例如參見1994年12月30日美國申請No.08/366,787和Curiel(1992)HumGene Ther 3147-154)、配體連接的DNA(例如參見Wu(1989)J.Biol.Chem.26416985-16987)、真核細胞輸送載體細胞(例如參見1994年5月9日提交的美國申請No.08/240,030以及美國申請No.08/404,796)、光聚合水凝膠材料的沉淀、手提式基因轉(zhuǎn)移顆粒槍(如美國專利5,149,655所述)、電離輻射(如US5,206,152和WO92/11033所述)、核電荷中和/或與細胞膜融合。其它方法在Philip(1994)Mol Cell Biol 142411-2418以及Woffendin(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.911581-1585中有所描述。
可以采用顆粒介導的基因轉(zhuǎn)移，例如參見美國申請No.60/023,867。簡言之，可將序列插入含有控制高水平表達的常規(guī)序列的常規(guī)載體中，然后和合成性基因轉(zhuǎn)移分子一起培育，這些基因轉(zhuǎn)移分子例如是聚合性DNA-結(jié)合陽離子(如聚賴氨酸、魚精蛋白和白蛋白)，其與細胞尋靶配體(如脫唾液酸血清類粘蛋白(如Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.2624429-4432所述)、胰島素(如Hucked(1990)Biochem Pharmacol 40253-263所述)、半乳糖(如Plank(1992)Bioconjugate Chem 3533-539所述)、乳糖或運鐵蛋白)相連。
裸DNA也可用于轉(zhuǎn)化宿主細胞。典型的裸DNA導入方法在WO 90/11902和US5,580,859中有所描述。用可生物降解的乳膠珠可以改善攝取效果。在對珠粒的胞吞作用開始后，DNA包被的乳膠珠粒被有效地運輸?shù)郊毎?。通過處理珠粒以提高其疏水性可進一步改進該方法，從而促進核內(nèi)體的破壞和將DNA釋放到細胞質(zhì)中。
可作為基因輸送運載體的脂質(zhì)體在US 5,422,120，WO95/13796，WO94/23697，WO91/14445和EP-524,968中有所描述。如USSN 60/023,867中所描述的，在非病毒輸送時，可將編碼多肽的核酸序列插入含有控制高水平表達的常規(guī)序列的常規(guī)載體中，然后和合成性基因轉(zhuǎn)移分子一起培育，這些基因轉(zhuǎn)移分子例如是聚合性DNA-結(jié)合陽離子(如聚賴氨酸、魚精蛋白和白蛋白)，其與細胞尋靶配體(如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或運鐵蛋白)相連。其它輸送系統(tǒng)包括采用脂質(zhì)體來包裹DNA，該DNA所含基因在各種組織特異性或活性普遍存在的啟動子控制下。適用的其它非病毒輸送系統(tǒng)包括機械輸送系統(tǒng)，如Woffendin等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(24)11581-11585中描述的方法。另外，這類編碼序列和表達產(chǎn)物可以通過光聚合的水凝膠材料的沉淀來輸送?？捎脕磔斔途幋a序列的其它基因輸送常規(guī)方法例如包括，用手提式基因轉(zhuǎn)移顆粒槍(如美國專利5,149,655所述)；用電離輻射來激活轉(zhuǎn)移的基因(如US 5,206,152和WO92/11033所述)。
典型的脂質(zhì)體和聚陽離子基因輸送載體在下列文獻中有所描述US 5,422,120和4,762,915；WO 95/13796；WO94/23697；WO91/14445；EP-0524968；Stryer，Biochemistry，236-240頁(1975)W.H.Freeman，San Francisco；Szoka(1980)BiochemBiophys Acta 6001；Bayer(1979)Biochem Biophys Acta 550464；Rivnay(1987)MethEnzymol 149119；Wang(1987)Proc Natl Acad Sci 847851；Plant(1989)Anal Biochem176420。
多核苷酸組合物可包含治療有效量的基因治療運載體，其定義如上所述。出于本發(fā)明的目的，有效的劑量是給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構(gòu)建物。
輸送方法一旦配制后，本發(fā)明的多核苷酸組合物可以以下三種方式給予(1)直接給予對象；(2)活體外輸送給對象衍生的細胞；或(3)體外表達重組蛋白。待處理的對象可以是哺乳動物或鳥類。另外，也可對人進行治療。
直接輸送該組合物通?？赏ㄟ^皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸送至組織間隙來實現(xiàn)。該組合物也可輸送至病損部位。其它給藥方式包括口服和肺部給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮膚應用(例如見WO98/20734)、用針、基因槍或手持噴霧器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
活體外輸送以及將轉(zhuǎn)化的細胞重新植入對象體內(nèi)的方法是本領(lǐng)域所熟知的，在例如WO93/14778中有所描述。用于活體外應用的細胞例子包括例如干細胞、尤其是造血細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞或腫瘤細胞。
通常，對于活體外和體外應用，核酸的輸送可通過以下步驟來實現(xiàn)，例如葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中，所有這些均是本領(lǐng)域所熟知的。
多核苷酸和多肽藥物組合物除了上述的藥學上可接受的載體和鹽外，多核苷酸和多肽組合物中還可采用下列附加試劑。
A.多肽一個例子是多肽，其包括但不局限于脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)；運鐵蛋白；脫唾液酸糖蛋白；抗體；抗體片段；鐵蛋白；白介素；干擾素；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、干細胞因子和促紅細胞生成素。還可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用來自其它侵襲性生物的蛋白，例如瘧原蟲惡性瘧疾的環(huán)孢子蛋白的17個氨基酸的肽(稱為RII)。
B.激素，維生素等其它可包括的種類例如是激素、類固醇、雄激素、雌激素、甲狀腺激素或維生素、葉酸。
C.聚亞烷基、多糖等另外，聚(亞烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽組合在一起。在一個較佳的實施方案中，聚(亞烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入單糖、二糖或多糖。在此方面的一個較佳實施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脫乙酰殼多糖和聚交酯-聚乙醇酸內(nèi)酯共聚物。
D.脂質(zhì)和脂質(zhì)體所需的多核苷酸或多肽還可在輸送給對象或?qū)ο笱苌募毎鞍谥|(zhì)中或包裹在脂質(zhì)體中。
脂質(zhì)包裹通常用能穩(wěn)定結(jié)合或捕獲并保留核酸的脂質(zhì)體來實現(xiàn)。濃縮的多核苷酸與脂質(zhì)制劑之比可以不同，但是通常在約11(毫克DNA微摩爾脂質(zhì))之間，或脂質(zhì)更多。關(guān)于脂質(zhì)體作為輸送核酸的載體的綜述參見Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.10971-17；Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101512-527。
用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽離子(帶正電荷)、陰離子(帶負電荷)和中性制劑。陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)顯示出能以有功能的形式介導質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)輸送(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7416)；mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866077-6081)；和純化的轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)輸送(Debs(1990)J.Biol.Chem.26510189-10192)。
陽離子脂質(zhì)體很容易購得。例如，N[1-2，3-二油烯基氧)丙基]-N，N，N-三乙銨(DOTMA)脂質(zhì)體可以以Lipofectin的商標從GIBCO BRL，Grand Island，NY購得。(另見Felgner，同上)。其它商品脂質(zhì)體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域熟知的方法從易購得的材料制得。例如參見，Szoka(1978)PNAS USA 754194-4198；WO90/11092關(guān)于DOTAP(1，2-二(油?；?-3-(三甲基銨溶)丙烷)脂質(zhì)體合成的描述。
同樣，陰離子和中性脂質(zhì)體也是容易獲得的，例如購自Avanti PolarLipids(birmingham，AL)，或容易用易購得的材料制得。這種材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)。這些材料還能以合適比例與DOTMA和DOTAP原料混合。用這些材料制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域熟知的。
脂質(zhì)體可包含多層脂質(zhì)體(MLV)，小的單層脂質(zhì)體(SUV)、或大的單層脂質(zhì)體(LUV)。各種脂質(zhì)體-核酸復合物可用本領(lǐng)域已知的方法制得。例如參見Straubinger(1983)Meth.Immunol.101512-527；Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA754194-4198；Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394483；Wilson(1979)Cell 1777)；Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443629；Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76836；Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA763348)；Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76145；Fraley(1980)J.Biol.Chem.(1980)25510431；Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75145；以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215166。
E.脂蛋白另外，脂蛋白也可加入待輸送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。還可采用這些蛋白的突變體、片段或融合蛋白。另外，可采用天然存在的脂蛋白的修飾物，例如乙?；腖DL。這些脂蛋白能使多核苷酸的輸送指向表達脂蛋白受體的細胞。較佳的，如果待輸送的多核苷酸中加入了脂蛋白，則組合物中不加入其它尋靶的配體。
天然存在的脂蛋白包含脂質(zhì)和蛋白部分。蛋白部分稱為脫輔基蛋白。目前，已經(jīng)分離并鑒定出了脫輔基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有兩個含有幾種蛋白，用羅馬數(shù)字AI、AII、AIV；CI、CII、CIII命名。
脂蛋白可包含多個脫輔基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，隨著時間的推移，這些脂蛋白失去A，得到C和E脫輔基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脫輔基蛋白，LDL包含脫輔基蛋白B；HDL包含脫輔基蛋白A、C和E。
這些脫輔基蛋白的氨基酸是已知的，并且在下列文獻中有所描述Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54699；Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151162；Chen(1986)J BiolChem 26112918；Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA 772465；and Utermann(1984)Hum Genet 65232。
脂蛋白含有各種脂質(zhì)，包括甘油三酯、膽固醇(游離的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂質(zhì)的組成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。關(guān)于天然存在的脂蛋白的脂質(zhì)含量更詳細的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。選擇脂質(zhì)的組成，以使脫輔基蛋白的構(gòu)型有利于受體結(jié)合活性。還可選擇脂質(zhì)的組成，以促進與多核苷酸結(jié)合分子中的疏水性相互作用和結(jié)合。
天然存在的脂蛋白可以用諸如超離心方法從血清中分離出來。這些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.BioChem.2555454-5460以及Mahey(1979)J Clin.Invest64743-750中有所描述。脂蛋白還可在體外產(chǎn)生，或通過在所需宿主細胞中表達脫輔基蛋白基因的重組方法產(chǎn)生。例如參見Atkinson(1986)Annu Rev Biophys Chem 15403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30443。脂蛋白也可購自商業(yè)供應商，如Biomedical Techniologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA。關(guān)于脂蛋白的進一步描述可在Zuckermann等人的WO98/06437中找到。
F.聚陽離子試劑聚陽離子試劑可以與或不與脂蛋白一起包括在含所需待輸送多核苷酸/多肽的組合物中。
聚陽離子試劑通常在生理性相關(guān)的pH下表現(xiàn)出凈的正電荷，并能中和核酸的電荷，而有助于輸送至所需位置。這些試劑具有體外、活體外和體內(nèi)的用途。聚陽離子試劑可用來將核酸通過肌內(nèi)或皮下等輸送至活的對象。
下面是用作聚陽離子試劑的多肽例子聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸和魚精蛋白。其它例子包括組蛋白、魚精蛋白、人血清白蛋白、DNA結(jié)合蛋白、非組蛋白染色體蛋白、DNA病毒的外殼蛋白，如(X174，轉(zhuǎn)錄因子還含有結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域，因此可用作核酸凝聚劑。簡言之，轉(zhuǎn)錄因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有結(jié)合DNA序列的基本結(jié)構(gòu)域。
聚陽離子有機試劑包括精胺、亞精胺和腐胺。
從上面的清單可以推出聚陽離子試劑的尺寸和物理性能，以構(gòu)建其它多肽聚陽離子試劑或產(chǎn)生合成的聚陽離子試劑。
有用的合成聚陽離子試劑例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。LipofectinTM和lipofectAMINETM是與多核苷酸/多肽組合時形成聚陽離子復合物的單體。
免疫診斷試驗本發(fā)明的奈瑟球菌抗原可用于免疫試驗來檢測抗體水平(或相反，可用抗奈瑟球菌抗體來檢測抗原水平)。根據(jù)明確的免疫試驗，可以開發(fā)重組抗原，以代替侵入性診斷方法?？蓹z測生物學樣品(例如包括血液或血清樣品)中的抗奈瑟球菌蛋白的抗體。免疫試驗的設計可作很大變化，其各種方案均是本領(lǐng)域中已知的。免疫試驗的方案可采取例如競爭性、或直接反應或夾心型試驗。方案例如還可采用固體支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多數(shù)試驗涉及采用有標記的抗體或多肽；該標記例如可以是熒光標記、化學發(fā)光標記、放射活性標記或染料分子。擴增探針信號的試驗也是已知的；其例子是采用生物素和親和素的試驗，酶標記的和介導的免疫試驗，如ELISA試驗。
將合適的材料(包括本發(fā)明的組合物)以及進行試驗所需的其它試劑和材料(例如合適的緩沖液、鹽溶液等)和合適的試驗說明書包裝到合適的容器中，構(gòu)成適用于免疫診斷且含有適當標記的試劑的試劑盒。
核酸雜交“雜交”指兩個核酸序列相互之間通過氫鍵而結(jié)合。通常，一個序列固定于固體載體，另一個將游離于溶液內(nèi)。然后，在有利于形成氫鍵的條件下使兩個序列相互接觸。影響這種結(jié)合的因素包括溶劑的類型和體積；反應溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相序列與固體載體非特異性結(jié)合的試劑(Denhardt′s試劑或BLOTTO)；各序列的濃度；是否使用化合物來增加序列結(jié)合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及雜交后洗滌條件的嚴謹程度。見Sambrook等人[同上]第2卷，第9章，9.47至9.57頁。
“嚴謹性”指有利于非常相似的序列結(jié)合而不利于不同序列結(jié)合的雜交反應條件。例如，應選擇溫度和鹽濃度的組合，使溫度比所研究的雜交的Tm計算值低大約120至200℃。溫度和鹽濃度常可通過初步實驗中憑經(jīng)驗來確定，在初步實驗中，固定在濾膜上的基因組DNA樣品與感興趣的序列雜交，然后在不同的嚴謹度條件下洗滌。見Sambrook等人第9.50頁。
在進行例如Southern印跡時，要考慮的參數(shù)是(1)待印跡的DNA的復雜性以及(2)探針與受檢測序列之間的同源性。對于高度復雜的真核基因組中的單拷貝基因，待研究片段的總量可以在10的一個數(shù)量級范圍內(nèi)變化，質(zhì)粒為0.1至1微克，或?qū)⑹删w消化至10-9至10-8克。對于復雜性較低的多核苷酸，可以采用實際上更短的印跡、雜交以及接觸時間，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探針。例如，從1微克酵母DNA開始，用僅僅1小時的接觸時間，印跡2小時，然后和108cpm/μg的探針雜交4-8小時，就可以檢測單拷貝酵母基因。對于單拷貝哺乳動物基因而言，一種保守的方法是從10微克DNA開始，印跡過夜，在10％硫酸葡聚糖存在下用108cpm/μg以上的探針雜交過夜，導致接觸時間約為24小時。
有幾個因素可能會影響探針與感興趣片段之間的DNA-DNA雜交物的解鏈溫度(Tm)，因而影響雜交和洗滌的合適條件。在許多情況下，探針并非與待測片段100％同源。其它常常遇到的變量包括雜交序列的長度和G+C總含量，以及雜交緩沖液的離子強度和甲酰胺含量。所有這些因素的作用可近似表示成一個方程式Tm＝81+16.6(log10Ci)+0.4[％(G+C)]-0.6(％甲酰胺)-600/n-1.5(％錯配)其中Ci是鹽濃度(單價離子)，n是雜交物堿基對的長度(對Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284的方法稍作了修改)。
在設計雜交實驗時，影響核酸雜交的一些因素可以方便地予以改變。雜交和洗滌時的溫度以及洗滌時的鹽濃度的調(diào)節(jié)最為簡單。隨著雜交溫度(即嚴謹度)的升高，不同源的鏈之間發(fā)生雜交的可能性變得更少，結(jié)果背景值降低。如果放射性標記的探針并非與固定的片段完全同源(這在基因家族和種間雜交實驗中是常見的)，則必須降低雜交溫度，而背景值將會增加。洗滌溫度以類似的方式影響雜交帶的強度和背景值的程度。洗滌的嚴謹性也隨鹽濃度的降低而升高。
通常，在50％甲酰胺存在下的方便的雜交溫度是對于靶片段同源性達95％至100％的探針而言，是42℃；對于同源性為90％至95％的探針，為37℃；對于同源性為85％和90％的探針，為32℃。對于較低的同源性，應用上述方程式應相應地降低甲酰胺含量和調(diào)節(jié)溫度。如果探針和靶片段之間的同源性是未知的，則最簡單的方法是從非嚴謹?shù)碾s交和洗滌條件開始。如果在放射自顯影后發(fā)現(xiàn)了非特異性的條帶或高背景值，則可在高嚴謹性下洗滌濾膜，并重新曝光。如果曝光所需時間使得該方法不切實際，則應平行測試幾種雜交和/或洗滌嚴謹性。
核酸探針試驗采用本發(fā)明的核酸探針的方法(如PCR、分支DNA探針試驗或印跡技術(shù))能確定cDNA或mRNA的存在。如果探針和本發(fā)明的序列能形成穩(wěn)定地足以被檢測到的雙鏈體或雙鏈復合物，則稱探針與本發(fā)明的序列“雜交”。
核酸探針將與本發(fā)明的奈瑟球菌核苷酸序列(包括有義和反義鏈)雜交。盡管有許多不同的核苷酸序列編碼該氨基酸序列，但是天然的奈瑟球菌序列是較佳的，因為它是實際存在于細胞中的序列。mRNA代表一種編碼序列，因此探針應與該編碼序列互補；單鏈cDNA與mRNA互補，因此eDNA探針應與非編碼序列互補。
探針序列無需和奈瑟球菌序列(或其互補體)相同，序列以及長度的一些差異能增加試驗的靈敏度，如果核酸探針能和靶核苷酸形成能被檢測的雙鏈體的話。另外，核酸探針可包括其它核苷酸，以使形成的雙鏈體穩(wěn)定。其它奈瑟球菌序列也是有幫助的，可作為檢測形成的雙鏈體的標記。例如，非互補的核苷酸序列可以和探針的5′端相連，探針序列的其余部分與奈瑟球菌序列互補?；蛘?，可將非互補的堿基或較長的序列散布到探針中，只要探針序列與奈瑟球菌序列有足夠的互補性以便與其雜交從而形成能被檢測的雙鏈體。
探針的確切長度和序列將取決于雜交條件，如溫度、鹽濃度等。例如，對于診斷應用，根據(jù)分析物序列的復雜程度，核酸探針通常含有至少10-20個核苷酸，較佳的15-25個，更佳的至少30個核苷酸，但是也可短于該長度。短的引物通常需要較低溫度，以便和模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。
探針可用合成方法產(chǎn)生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)1033185]的方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)807461]的方法，或用市售的自動寡核苷酸合成儀合成。
可以根據(jù)偏好選擇探針的化學特征。對于某些應用，DNA或RNA是合適的。對于其它的應用，可以加入修飾，例如骨架修飾，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用來增加體內(nèi)半衰期，改變RNA親和力，增加核酸酶抗性等[例如參見Agrawal和Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 612-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14376-387]；還可采用類似物如肽核酸[例如參見Corey(1997)TIBTECH 15224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH11384-386]。
另外，聚合酶鏈反應(PCR)是另一個熟知的檢測少量靶核酸的手段。該試驗在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155335-350]；美國專利4,683,195和4,683,202中有所描述。用兩個“引物”核苷酸與靶核酸雜交，并用來引導反應。引物可包含不與擴增靶序列(或其互補序列)雜交的序列，以幫助雙鏈體的穩(wěn)定性，或例如可插入一個簡便的限制性位點。這些序列通常側(cè)接所需的奈瑟球菌序列。
利用最初的靶核酸作為模板，熱穩(wěn)定的聚合酶能從引物產(chǎn)生靶核酸的拷貝。在聚合酶產(chǎn)生臨界量的靶核酸后，它們可用較傳統(tǒng)的方法(如Southern印跡)來檢測。當采用Southern印跡方法時，標記的探針將與奈瑟球菌序列(如其互補序列)雜交。
另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人[同上]描述的傳統(tǒng)印跡技術(shù)來檢測。用凝膠電泳可純化并分離利用聚合酶從mRNA產(chǎn)生的mRNA或cDNA。然后，將凝膠上的核酸印跡到固體載體如硝酸纖維素上。使固體載體與標記的探針接觸，然后洗滌除去所有未雜交的探針。然后，檢測含有標記探針的雙鏈體。該探針通常用放射活性物質(zhì)作標記。
優(yōu)選片段的例子對WO99/24578中所公開的蛋白質(zhì)序列進行計算機分析，預測在全長蛋白質(zhì)中的抗原性肽片段。在該分析中使用了3種算法●  AMPHI，該程序用于預測T細胞表位[Gao等人(1989)J.Immunol.1433007；roberts等人(1996)AIDS Res Hum Retrovir 12593；Quakyi等人(1992)Scand J Immunol suppl.119]，并且可從DNASTAR，Inc(1228 South Park Street，Madison，Wisconsin 53715，USA)的Protean軟件包中獲得。
●  抗原指數(shù)(ANTIGENIC INDEX)，由Jameson & Wolf(1988)“抗原指數(shù)一種新的預測抗原決定簇的算法”，CABIOS，4181186所公開。
●  親水性(HYDROPHILICITY)，由Hopp & Woods(1981)“根據(jù)氨基酸序列預測蛋白質(zhì)的抗原決定簇”，PNAS，783824-3828。
表I預測了WO99/24578中所公開的蛋白質(zhì)的優(yōu)選片段。這3種算法常鑒別出相同的片段(例如，ORF100-從殘基98-109的片段，和從殘基111-121的片段)。這類多重鑒別出的片段是特別優(yōu)選的。這些算法還常常鑒別出重迭的片段(例如對于ORF100，AMPHI鑒別出殘基143-152，而抗原指數(shù)鑒別出殘基148-157)。本發(fā)明明明白白地包括這些重迭片段組合所形成的片段(例如，對于ORF100，從殘基143-157的片段)。還鑒別出被一個氨基酸所隔開的片段(例如ORF48-1中，親水性鑒別出334-342和344-349)。本發(fā)明還包括橫跨了這種“相鄰”片段的兩個極值的片段(如ORF48-1的334-349)。
表I-在WO99/24578中所公開的蛋白質(zhì)的14151種片段關(guān)鍵詞本申請的片段#1是WO99/24578中公開的ORF1-1的氨基酸9-18。本申請的片段#2是WO99/24578中公開的ORF1-1的氨基酸39-41，依此類推。
應理解，本發(fā)明是僅通過實施例方式進行描述的，而且可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行改動。
表II本發(fā)明在其范圍內(nèi)不包括包含WO99/24578中所公開的446種蛋白質(zhì)序列中任一序列的蛋白質(zhì)。如上所述，如果在WO99/24578中所包括的任一特定蛋白質(zhì)序列的長度是x個氨基酸，那么本發(fā)明的抗原性片段具有該蛋白質(zhì)的至多x-1個氨基酸。對于WO99/24578中給出的446種蛋白質(zhì)的每一種蛋白，在下表中給出了x的值
權(quán)利要求
1.一種片段，其特征在于，它是WO99/24578中所公開的蛋白質(zhì)的片段，所述片段含有至少一個抗原決定簇。
2.如權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于，片段長度為100個氨基酸或更短。
3.如權(quán)利要求1或2所述的片段，其特征在于，片段長度為3個氨基酸或更長。
4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的片段，其特征在于，它是表1中14151種片段之一。
5.一種多肽，其特征在于，它與權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的片段有50％或更高的序列相同性。
6.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，它包含權(quán)利要求1、2或3所述的一種或多種片段，附加條件是該蛋白質(zhì)不是WO99/24578中所公開的446種完整蛋白質(zhì)序列之一。
7.一種抗體，其特征在于，它識別權(quán)利要求1-4中任一項所述的片段。
8.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，它包含一肽序列，所述肽序列被權(quán)利要求7所述的抗體識別。
9.一種核酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1、2、或3所述的片段，權(quán)利要求5所述的多肽，或權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)。
10.一種組合物，其特征在于，它包含權(quán)利要求1、2、或3所述的片段，權(quán)利要求5所述的多肽，權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，權(quán)利要求7所述的抗體，和或權(quán)利要求9所述的核酸，其中該組合物是疫苗、診斷試劑或免疫原性組合物。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物的用途，其特征在于，用作藥物。
12.如權(quán)利要求1、2、或3所述的片段，權(quán)利要求5所述的多肽，權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，權(quán)利要求7所述的抗體，和/或權(quán)利要求9所述的核酸的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)下列物質(zhì)(i)用于治療或預防奈瑟球菌屬細菌感染的藥劑；(ii)用于檢測奈瑟球菌屬細菌或檢測抗奈瑟球菌屬細菌抗體是否存在的診斷試劑；和/或(iii)用于產(chǎn)生抗奈瑟球菌屬細菌的抗體的試劑。
13.一種治療患者的方法，其特征在于，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求10所述的組合物。
全文摘要
WO99/24578公開了大量的來自腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及這些蛋白質(zhì)的含有至少一個抗原決定簇的片段。還公開了同源序列和含有這些片段的蛋白質(zhì)。
文檔編號A61P31/04GK1671844SQ00810602
公開日2005年9月21日 申請日期2000年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月19日
發(fā)明者V·馬斯格阿尼, V·斯卡拉托, M·斯卡塞利, C·加萊奧蒂, M·R·莫拉 申請人:啟龍股份公司