一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法及其產物和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種α -葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法及其 產物和應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，糖尿病在全世界廣泛流行，目前已成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大類 嚴重危害人類健康的慢性疾病。隨著我國經濟、社會的迅速發(fā)展，膳食結構和生活方式的改 變，人口老齡化速度的加快，糖尿病的患病率也呈現(xiàn)快速增加的趨勢。在糖尿病患病率快速 上升的同時，我國糖尿病的知曉率、治療率及控制率明顯偏低。糖尿病已成為一個嚴重危害 我國人群健康的公共衛(wèi)生問題，對經濟社會發(fā)展產生越來越嚴重的影響。
[0003] 根據發(fā)病機制不同，糖尿病分為I型糖尿?。ㄒ葝u素依賴型）和II型糖尿?。ǚ?胰島素依賴型），后者約占糖尿病總數(shù)的85%以上。迄今為止，治療II型糖尿病的藥物根 據治療機制不同主要分為：（1)促胰島素分泌劑：如磺酰脲類；（2)胰島素增敏劑：如屈吉 他宗（troglitazone)等噻唑烷衍生物；（3) α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-GI):如阿卡波糖 等。由于a-GI具有作用溫和持久、毒副作用小甚至無毒的優(yōu)點，因此得到越來越多國內外 研宄者的青睞。
[0004] 研宄表明，α -葡萄糖苷酶抑制劑（a -GI)可有效地降低糖尿病人的餐后高血糖， 作為口服降糖藥的一種，其發(fā)生作用的場所位于小腸，作用方式是抑制小腸體內的α-葡 萄糖苷酶活性，從而達到降低餐后高血糖的目的。如果使用者飲食中碳水化合物占50%以 上，則降糖效果更為明顯，因此其適用于以碳水化合物為主食的人群，尤其是中老年糖尿病 患者。目前所發(fā)現(xiàn)的a-GI雖能克服傳統(tǒng)降糖藥的一些缺點，但種類相對較少，人們仍不 斷致力于開發(fā)新型α-GI，尤其是天然產物的研宄。近年來，從天然產物中分離和提取的 a -GI主要來自草本植物和放線菌屬，只有少數(shù)關于乳酸菌產物降血糖的報道。
[0005] H.FujitaaNutri. 131:1211-1213,2001)報道了從中國傳統(tǒng)的調味品豆豉 (Touchi)采用熱水抽提的方式，得到具有抑制α-葡萄糖苷酶（大鼠蔗糖水解酶）活性的 抽提物，該抽提物在大鼠和高血糖人群中具有降血糖作用；美國專利US7354606B2公開了 一種采用豆鼓抽提物與來自于白蕓豆（kidney bean)的α-淀粉酶抑制劑phaseolamin 混用，用于治療高血糖的方法。A. Momose (J.J. Soc. Food Tech. Sci, Feb, 2011)報道了從 meso (-種日本傳統(tǒng)的采用天然發(fā)酵方法生產的作為調味料使用的發(fā)酵豆制品）分離到的 α-葡萄糖苷酶抑制劑具有調節(jié)餐后血糖波動的作用。這些研宄均停留在大豆發(fā)酵物的粗 提物層面，鮮有關于其中抑制劑有效成分的分離與定性的報道，因此，匱乏的理論依據極大 地阻礙了大豆制品中α-葡萄糖苷酶抑制劑的大規(guī)模制備與應用。

【發(fā)明內容】

[0006] 因此，本發(fā)明要解決的技術問題就是針對現(xiàn)有大豆發(fā)酵物具有α -葡萄糖苷酶抑 制效果的研宄僅僅停留在粗提物層面，鮮有關于其中具體有效成分的分離方法與定性分析 報道的現(xiàn)狀，提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法及其產物和應用。
[0007] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ST-III (CGMCC No. 0847)發(fā)酵所得豆?jié){發(fā)酵液的上清經 萃取、硅膠柱等工藝分離純化后，可獲得具有強烈的α -葡萄糖苷酶抑制活性組分，從而完 成了本發(fā)明。
[0008] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案之一為：一種α -葡萄糖苷酶抑制 劑的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：
[0009] (1)將植物乳桿菌ST-III接種于無菌豆?jié){中發(fā)酵獲得發(fā)酵豆?jié){；
[0010] ⑵將步驟⑴所得的發(fā)酵豆?jié){加熱，冷卻后離心取上清，所得上清使用2?5倍 體積的乙酸乙酯進行萃取，將所得乙酸乙酯相經過減壓蒸干后加入乙酸乙酯配制成粗提 液；
[0011] ⑶取步驟⑵所得粗提液過硅膠柱，用乙酸乙酯和正己烷混合液對硅膠柱進行 梯度洗脫，分部收集α -葡萄糖苷酶抑制率多10%的洗脫液；
[0012] (4)將步驟（3)所得的α -葡萄糖苷酶抑制率彡10%的洗脫液去除有機溶劑后干 燥，即得α-葡萄糖苷酶抑制劑。
[0013] 其中步驟⑴為將植物乳桿菌ST-III接種于無菌豆?jié){中發(fā)酵獲得發(fā)酵豆?jié){。其中 所述發(fā)酵的溫度較佳地為25?40°C，所述發(fā)酵的時間較佳地為24?120小時。其中所述 的豆?jié){是由作為主要糧食品種的豆類制備的，如選自大豆、赤豆、綠豆、蠶豆、大白蕓豆和小 白蕓豆，最優(yōu)選大豆。所述的豆?jié){的制備方法是常規(guī)，如在豆?jié){機中制備成豆?jié){。豆?jié){經過 滅菌后即得無菌豆?jié){，滅菌方法常規(guī)，如高溫蒸煮滅菌，118°C 15分鐘。所述的滅菌豆?jié){優(yōu) 選固形物含量3% -9% (w/w)，最優(yōu)選豆衆(zhòng)濃度為5-6% (w/w)。植物乳桿菌ST-III在無菌 豆?jié){中的接種量優(yōu)選0.5 %-5 % (v/v)，最優(yōu)選2 % (v/v)。發(fā)酵溫度優(yōu)選35-37 °C，最佳的 是37°C。發(fā)酵時間更優(yōu)選24-30小時。植物乳桿菌ST- III接種于無菌豆?jié){中發(fā)酵，可以作 為唯一的發(fā)酵菌種，也可以和其他菌類同時發(fā)酵，本發(fā)明優(yōu)選植物乳桿菌ST-III作為唯一 的發(fā)酵菌種。
[0014] 其中步驟（2)為將步驟（1)所得的發(fā)酵豆?jié){加熱，冷卻后離心取上清，所得上清使 用2?5倍體積的乙酸乙酯進行萃取，將所得乙酸乙酯相經過減壓蒸干后加入乙酸乙酯配 制成粗提液。其中所述的減壓蒸干為本領域常規(guī)的蒸發(fā)干燥技術，較佳地為旋轉蒸發(fā)干燥、 平行蒸發(fā)干燥等。其中所述發(fā)酵豆?jié){加熱的溫度較佳地為95?KKTC，更佳地為98°C，所 述加熱的時間較佳地為10?30分鐘，更佳地為20分鐘，所得上清較佳地使用3?4倍體 積的乙酸乙酯進行萃取。
[0015] 其中步驟（3)為取步驟（2)所得粗提液過硅膠柱，用乙酸乙酯和正己烷混合液對 硅膠柱進行梯度洗脫，分部收集α-葡萄糖苷酶抑制率多10%的洗脫液。其中所述硅膠柱 的初始條件較佳地為乙酸乙酯與正己烷的體積比為2:3,所述乙酸乙酯和正己烷混合液中 乙酸乙酯與正己烷的體積比較佳地為2:3?4:1，更佳地為乙酸乙酯與正己烷的體積比為 2:3、乙酸乙酯和正己烷的體積比為3:2和/或乙酸乙酯和正己烷的體積比為4:1，所述梯度 洗脫的流速較佳地為〇. 5?I. 5mL/min。
[0016] 其中，分部收集α -葡萄糖苷酶抑制率多10%的洗脫液可以按本領域常規(guī)進行操 作，較佳地是在使用乙酸乙酯和正己烷混合液進行梯度洗脫的時候，分管收集洗脫液，對各 管洗脫液的α -葡萄糖苷酶抑制率進行測試，選擇其中α -葡萄糖苷酶抑制率多10%的各 管洗脫液按組分峰分部進行合并收集，如在本發(fā)明中，會產生兩個洗脫峰，則分管收集兩個 洗脫峰中α-葡萄糖苷酶抑制率多10%的洗脫液，將所得洗脫液合并。其中所述洗脫液的 收集速度為本領域常規(guī)技術，所述洗脫液的收集速度較佳地為每3?Smin/管。在洗脫過 程中，如果洗脫液中不同溶劑的體積比例在本發(fā)明所限定的范圍之外時，會因為不恰當?shù)?洗脫條件導致兩種組分洗脫分離的效果變得很差，其結果極有可能是兩個組分同時被洗脫 下來，而不是順序洗脫。為了排除了實驗操作誤差所導致的假陽性結果對本實驗的影響， α-葡萄糖苷酶抑制率更佳地為多15%。
[0017] 其中步驟⑷為將步驟⑶所得的α -葡萄糖苷酶抑制率多10%的洗脫液去除有 機溶劑后干燥，即得α-葡萄糖苷酶抑制劑。其中所述干燥技術較佳地為冷凍干燥技術，所 述冷凍干燥技術為本領域常規(guī)的冷凍干燥技術，只要能將溶劑去除，獲得所述α -葡萄糖 苷酶抑制劑即可。
[0018] 本發(fā)明的一較佳實例如下：
[0019] (1)將植物乳桿菌ST- III接種于無菌豆?jié){中，25?40°C發(fā)酵24?120小時，獲得 發(fā)酵豆?jié){；
[0020] (2)將步驟⑴所得的發(fā)酵豆?jié){95?100°C加熱10?30分鐘，冷卻至15?25°C 后離心取上清，所得上清使用2?5倍體積的乙酸乙酯進行萃取，將所得的乙酸乙酯相旋轉 蒸發(fā)干后，加入乙酸乙酯配制成α-葡萄糖苷酶抑制劑的粗提液；
[0021] (3)取步驟⑵所得粗提液上樣于初始條件為乙酸乙酯：正己烷的體積比為2 :3 的硅膠柱上，按乙酸乙酯：正己烷的體積比為2 :3、乙酸乙酯：正己烷的體積比為3 :2、乙酸 乙酯：正己烷的體積比為4 :1，以0. 5?I. 5mL/min的流速對硅膠柱進行梯度洗脫，其中每 個梯度洗脫一個柱體積，洗脫液按每3?Smin/管的速度收集洗脫液，所述比例為體積比；
[0022] (4)將步驟（3)所得的各管洗脫液去除有機溶劑后加水溶解，測試所得