專利名稱：重組成熟溶葡萄球菌素的表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種在重組細菌宿主體內表達不含前溶葡萄球菌素原(preprolyostaphin)和溶葡萄球菌素原(prolysostaphin)的成熟溶葡萄球菌素的方法、與誘導型啟動子操作性連接的編碼表達成熟溶葡萄球菌素的載體、以及表達成熟溶葡萄球菌素的遺傳工程細菌宿主。
先有技術的描述葡萄球菌感染通過葡萄球菌食物中毒、燒傷和創(chuàng)傷感染以及泌乳反芻動物的乳腺感染給人類造成巨大的痛苦和經濟損失。這些感染通常對常規(guī)抗生素具有抵抗力或者一旦停用抗生素，就具有復發(fā)的趨勢。模仿葡萄球菌的生物變種溶血葡萄球菌(Staphylococcussimulans biovar staphylolyticus)生成一種細胞外鋅金屬蛋白酶即甘氨酰甘氨酸內肽酶，一般稱為“溶葡萄球菌素”，該酶可以水解細胞壁肽聚糖上的五甘氨酸聯接。因此，溶葡萄球菌素對破壞葡萄球菌物種是有活性的，但對其他所有的屬卻無活性。溶葡萄球菌素這種對存活葡萄球菌細胞的獨特性質提供了一種抗菌機制，該機制顯著不同于現在使用的抗葡萄球菌抗生素的作用機制。同樣的，溶葡萄球菌素提供了治療和預防葡萄球菌性疾病的新穎方法的可能性。然而，由于天然來源的低水平表達以及強效毒素的共同分泌，使得從模仿葡萄球菌的生物變種溶血葡萄球菌中純化溶葡萄球菌素而將其用于詳細的物理和生化研究，以及評價其用于治療和預防葡萄球菌感染的潛能都很困難。
野生型溶葡萄球菌素基因編碼前酶原(preproenzyme)，該前酶原由三個不同結構域組成，在其N末端是一個由38個氨基酸殘基組成的典型的分泌性信號肽，然后是七個前后排列的重復的13個氨基酸序列構成的親水性并且高度有序的結構域，接著是含有246個氨基酸的疏水性成熟溶葡萄球菌素自身。成熟的酶是一個大約27kDa的單體并且不含有二硫鍵。在溶血葡萄球菌培養(yǎng)基中，從溶葡萄球菌素原到成熟溶葡萄球菌素的轉化在細胞外發(fā)生并且去除了酶原的親水性前后排列的重復部分。
溶葡萄球菌素內肽酶的野生型基因(end)位于模仿葡萄球菌的生物變種溶血葡萄球菌的大分子β-內酰氨酶陽性質粒上。(Heath，L.S.，H.E.Heath and G.L.Sloan(1987)“Cloning of thelysostaphin gene of S.simulans biovar staphylolyticus.″Abstr.Ann.Meet，Am.Soc.Microb.H58p149；Heath，L.S.，H.E.Heath和G.L.Sloan，(1987)″Plasmid encoded lysostaphinendopeptidase gene of S.simulans biovar staphylolyticus.”FEMS Microb.Lell.44129-133.)。完整的操縱子已經被克隆(見Recsei P.A.，A.D.Gruss和R.P.Novick(1987)″Cloning，sequence，and expression of the lysostaphin gene fromStaphylococcus simulans.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA841127-1131；Heinrich P.，R.Rosenstein，M.Bohmer，P.Sonner和F.Gotz(1987)″The molecular organization of thelysostaphin gene and its sequences repeated in tandem.″Mol.Gen.Genet.209563-569，以及1990年6月5日授權于Recsei的美國專利4,931,390)并且完整的序列和啟動子元件都已經被測序。這些參考文獻報道了前溶葡萄球菌素原在大腸桿菌中的表達，該前溶葡萄球菌素原然后在細胞外轉化為溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素。這項工作用野生型溶葡萄球菌素內肽酶啟動子來完成。溶葡萄球菌素原也可以在巨細胞病毒(CMV)啟動子轉錄調控下，在真核系統(tǒng)內被表達。(Williamson C.M.，A.J.Bramley和A.J.Lax(1994)“Expression f the lysostaphin gene of Staphylococcus simulansin a eukaryotic system.”Appl Environ Microbiol；60(3)771-776.)早期生產溶葡萄球菌素內肽酶的方法或者是直接從模仿葡萄球菌中純化該酶(Schindler C.A.和V.T.Schuardt(1965)Schuardi(1965)“Purification and properties of lysostaphinalyticagent for the Staphylococcus aureus.″Biochem.Biophys.Acta.97242-250；Iverson O.J.和A.Grov(1973)″Studies onlysostaphin.separation and characterization of threeenzymes.″Eur.J.Biochem.38293-300；Valisena S.，F.E.Varaldo和G.Satta(1982)″Purification and Characterizationof three separate bacteriolytic enzymes excreted by S.aureus，S.simulans and S.saprophyficus.″J Bact.151636-647；SugaiM.，T.Akiyama，Y.Miyake，E.Ishida和H.Suginaka(1990)″Rapid purification of lysostaphin for analysis of cell-wallproteins.″J Microb.Meth.12133-138和Marova land和V.Dadak(1993)″Modified simplified method for isolation oflysostaphin from the culture filtrate of Staphylococusstaphylolyticus.″Folia Microbiol 38245-252)，或者是表達溶葡萄球菌素原并利用模仿葡萄球菌提取物剪切前肽部分將其轉化為成熟溶葡萄球菌素(Marova和Dadak，supra；Williamson et al.，supra)。兩種傳統(tǒng)的途徑都有不同的缺點。當從天然來源分離時，成熟溶葡萄球菌素能被致熱原/致敏原和/或溶葡萄球菌素原或前溶葡萄球菌素原污染。當表達為酶原時，初始表達產生的溶葡萄球菌素原必須通過天然來源的提取物進行酶促轉化而產生成熟溶葡萄球菌素。這也造成了溶葡萄球菌素被致熱原或其他污染物污染的機會。
在現有技術中，還沒有關于不經過蛋白原形或前蛋白原形式的表達，而克隆和直接表達成熟形式的溶葡萄球菌素的報道。這里所描述的是一種直接生產溶葡萄球菌素的方法，該方法不需要中間產生前溶葡萄球菌素原或溶葡萄球菌素原。因此，使用本方法生產的溶葡萄球菌素不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原。
發(fā)明概述因為對溶葡萄球菌素的抗葡萄球菌潛能的進一步評價取決于容易獲得大量從安全的、非致病的來源高度純化的溶葡萄球菌素，本發(fā)明主要涉及一種重組質粒，該質粒驅動在經轉化而含有重組質粒的宿主細胞，優(yōu)選大腸桿菌細胞中過量表達產生成熟溶葡萄球菌素。
本發(fā)明還包括經轉化而含有并且表達該質粒的宿主細胞(優(yōu)選轉化的大腸桿菌細胞)，利用合適的被質粒轉化的宿主生產成熟溶葡萄球菌素的方法，以及利用轉化細胞生產的不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的溶葡萄球菌素。用包括下面所述的兩個層析步驟的程序將根據本發(fā)明生產的重組溶葡萄球菌素純化為均質。鑒定了重組產物的生化、酶以及生物物理特性，以便為重組產物建立適當的質量控制測定。
具體地，本發(fā)明的第一種實施方案是生產不含有前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素內肽酶的方法。本發(fā)明的特征在于提供了一種遺傳構建體，該構建體包括一段在前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的編碼元件不存在的條件下編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列，以及與編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列操作性連接的啟動子；轉化宿主細胞使其含有并表達遺傳構建體，從而在宿主胞漿內積聚不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素；然后從宿主細胞中分離成熟溶葡萄球菌素。
本發(fā)明的第二種實施方案定位于一種用于轉化宿主使其表達不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素內肽酶的表達構建體，該構建體包括在溶葡萄球菌素原編碼元件不存在的條件下編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的一段核苷酸序列；與編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列操作性連接的啟動子。
本發(fā)明的第三種實施方案是用這里描述的表達構建體轉化的遺傳工程宿主細胞，轉化細胞表達不受前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原污染的成熟溶葡萄球菌素。
本發(fā)明的第四種實施方案定位于含有無前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的純化溶葡萄球菌素的組合物，以及根據這里所述方法生產的組合物。
附圖
簡述圖.1是表示去除分泌信號和5’重復基序后擴增得到的溶葡萄球菌素基因的凝膠電泳圖。
圖.2表示本發(fā)明的質粒構建體，pEnd-11b的構建過程示意圖。
圖.3是在誘導前后經轉化而含有pEnd-11b質粒的大腸桿菌細胞裂解物中總蛋白的凝膠電泳圖。
圖.4是對12％SDS-PAGE凝膠的光密度掃描圖，顯示在經轉化而含有pEnd-11b質粒的大腸桿菌中重組成熟溶葡萄球菌素的表達水平。
發(fā)明詳述定義為了對說明書有一個清楚和一致的理解，在這里要用到以下定義。
構建體或表達構建體-DNA構建體包含至少一個編碼目的蛋白的亞序列，該亞序列操作性連接在一個或多個調節(jié)亞序列上，當構建體轉化到合適的宿主細胞中后，調節(jié)亞序列驅動被編碼蛋白的表達。這樣的構建體也可以包括編碼用于篩選轉化后含有構建體的宿主細胞的方法的亞序列，例如使轉化細胞具有抗生素抗性或者營養(yǎng)限制、多克隆位點等的亞序列。
操作性連接-當談到連接的DNA序列時，“操作性連接”是指序列在同一個閱讀框架內，并且上游調控序列將會執(zhí)行與下游結構序列相關的功能。操作性連接的DNA序列并不需要互相之間的直接物理性連接，而是可以被間插核苷酸分開，間插核苷酸序列不會干擾被連接序列的操作關系。
聚合酶鏈式反應(PCR)-一項使用變性循環(huán)、與引物對退火，以及利用DNA聚合酶延伸而產生所需多核苷酸序列的大量拷貝。反應的描述可見美國專利4,683,195和4,683,202。PCR技術廣泛應用于核酸的操作。
啟動子-RNA聚合酶與操縱子起始部位結合的DNA序列位點。一旦結合，RNA聚合酶就會沿著DNA由5’向3’方向移動并且合成相應的RNA序列。盡管啟動子的功能是作為RNA合成的啟動信號，但啟動子本身并不被轉錄。遺傳工程以下所述的DNA操作的許多步驟，包括利用限制性核酸內切酶消化，PCR擴增，雜交，連接，通過凝膠電泳區(qū)分和分離，利用異源DNA轉化細胞，篩選成功的轉化體等等，已為熟悉本領域的人所熟知并且被廣泛實施，因此這里就不再展開描述了。除非另外指出，這里應用的DNA操作方法都詳細描述于Sambrook，J.，E.F.Fritsch.和T.Maniatis(1989)，“分子克隆實驗室手冊，”冷泉港實驗室出版社紐約，NY。宿主細胞這里描述的重組DNA摻入宿主微生物中，從而驅動不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素的產生。宿主微生物可以是易于轉化的任意細菌或者真核宿主。優(yōu)選的宿主是大腸桿菌。僅僅為了簡潔和清晰的目的，以下公開的內容局限于大腸桿菌轉化體的描述。由于其在學術和工業(yè)方面的獨特性，它的快速生長率，為人熟知和易于操作的遺傳學背景，以及該生物體具有完整的基因組序列，大腸桿菌成為優(yōu)選的微生物。然而，本發(fā)明在其它原核微生物中，例如枯草桿菌等，以及酵母等真核生物中，也具有相同的功效。因此，以下的討論并不是將本發(fā)明局限在用大腸桿菌所舉例說明的實施方案中。質粒構建用于選擇性擴增成熟溶葡萄球菌素基因的PCR引物是根據已發(fā)表的溶葡萄球菌素內肽酶(end)序列(見Recsie等，supra)而設計的，并且利用模仿葡萄球菌的生物變種溶血葡萄球菌NRRL B-2628(農業(yè)研究機構保藏中心，以前稱作北部地區(qū)研究實驗室，國家農業(yè)研究中心，1815 North Univetsity St.，Peoria，Illinois 61604-3999，USA)的總DNA通過PCR方法對end基因進行選擇性擴增。然后，通過PCR介導的定位誘變在成熟溶葡萄球菌素(AATHE)起始部位之前用起始蛋氨酸密碼子(ATG)代替溶葡萄球菌素的信號肽和前肽(propeptide)編碼序列。將NdeI和BamHI限制性核酸內切酶位點分別摻入修飾基因的5’和3’末端以用于克隆目的。使用具有校對功能，并且熱穩(wěn)定的酶“VENT”DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，Massachusetts，USA)。通過檢測在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳上出現的一條765bp大小的條帶，PCR擴增產物證明編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的修飾基因被成功擴增出來(圖.1)。
然后將擴增得到的成熟溶葡萄球菌素操作性連接到啟動子序列上，優(yōu)選誘導型啟動子序列。如圖.2詳細描述所示，優(yōu)選的T710誘導型啟動子是被操作性連接到阻抑物基因lac I9上的噬菌體啟動子。
PCR產物用NdeI和BamHI限制性酶消化，將得到的開放閱讀框架插入到pET-11b表達載體(Stratagene，Lajolla，California，USA)的NdeI和BamHI位點之間，這樣，就將成熟溶葡萄球菌素內肽酶開放閱讀框架基因置于強效可調節(jié)性噬菌體T710啟動子的轉錄控制下(見圖.2)。
重組構建體在利用終止子染色化學的ABI Prism 337型自動DNA測序儀上，通過自動雙脫氧鏈終止DNA測序法來證實。獲得的核苷酸序列與已知的編碼成熟溶葡萄球菌素序列完全一致。成熟溶葡萄球菌素的表達成熟溶葡萄球菌素基因在ATCC47092的大腸桿菌BL21(DE3)(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA)的T710啟動子的轉錄控制下表達。命名為pEnd-11b的重組質粒通過常規(guī)方法(氯化鈣方法)轉化到優(yōu)選的宿主細胞，大腸桿菌BL21(DE3)中。加入異丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.4mM，誘導對應met-溶葡萄球菌素蛋白，分子量約為27kDa條帶處的蛋白過量表達。通過SDS-PAGE分析(見圖.3)誘導得到條帶的大小與以前報道的成熟溶葡萄球菌素的分子量完全一致。12％ SDS-PAGE的光密度儀掃描顯示，誘導的條帶約占誘導細胞提取物總蛋白的20.2％(見圖.4)。
由于金黃色葡萄球菌細胞裂解物摻入聚丙烯酰胺凝膠中，通過清除區(qū)域可以證實，對葡萄球菌的裂解活性位于同一個27kDa條帶上。根據上述方法形成的溶葡萄球菌素內肽酶，甚至在SDS和2-巰基乙醇中煮沸后，仍可重新獲得其活性，這與早期的報道是一致的(LeclercD.和A.Asselin(1989)“Detection of cell wall hydrolases afterdenaturing polyacrylamide electrophoresis.”Can.J.Microb.35749-753)。重組溶葡萄球菌素內肽酶的純化利用計算機程序DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，Wiseonsin，USA)分析由插入到質粒pEnd-11b中的核苷酸序列翻譯得到的met-溶葡萄球菌素內肽酶序列。得到的數據有助于設計有效的蛋白純化方案。在中性pH條件下，由滴定曲線估計met-溶葡萄球菌素內肽酶的凈電荷是+11.39，由此明確判斷met-溶葡萄球菌素是一個含有8.91％(以頻率計)/11.04％(以重量計)堿性殘基的堿性蛋白。在pH8.5條件下進行陰離子交換層析，大腸桿菌的大部分蛋白被吸附在Q-瓊脂糖樹脂上，而重組溶葡萄球菌素內肽酶則出現在100mM鹽濃度的洗脫液中。
然后合并得到的陽性部分并在pH5.5的緩沖液中進行透析，大量宿主(大腸桿菌)蛋白在該pH條件下變性并從溶液中沉淀出來，從而在溶液中留下非常純的溶葡萄球菌素制劑。在pH5.5條件下，成熟溶葡萄球菌素是強堿性蛋白，凈電荷為+18.6。大量的凈陽性電荷有助于利用陽離子交換層析將少量污染物從溶葡萄球菌素內肽酶制備液中分離出去。得到的含純化蛋白的部分在儲存緩沖液中透析并分裝儲存在-20℃下。
在現有技術途徑中，溶葡萄球菌素是利用硫酸胺沉淀法和DEAE-纖維素膜層析法進行純化，產率為4.3毫克/升培養(yǎng)液(Schindler和Schuardt，supra)。此外還報道了其它大量從模仿葡萄球菌的培養(yǎng)物濾液中純化溶葡萄球菌素的方法，包括使用離子交換層析(見Iversen和Grov，supra)或者使用等電聚焦和G-100凝膠過濾聯合(見Wadstrom T.和O.Vesterberg(1971)“Studies on endo-beta-acetyl-glucosaminidase，staphylolytic peptidase，and N-acetylmuramyl-L-alanineamidase in lysostaphin and fromS.aureus.”Acta Pathol.Microbiol.Scand.79248-264)。Valisena等，supra也報道了利用幾丁質-瓊脂糖CL4B親和純化方法進行溶葡萄球菌素的純化。Sugai等，supra，報道了涉及Cibacron藍3G-A(Tskgel Blue-5PW)上的染料配體親和高壓液相層析的方法。然而也有報道說Cibacron藍對溶葡萄球菌素活性有害(Marova和Dadak，supra).
Marova和Dadak也報道了一種用于從溶血葡萄球菌培養(yǎng)物過濾液中分離溶葡萄球菌素的純化方法，它利用一系列包括超濾，DEAE-纖維素膜層析法，以及在交聯葡聚糖G-50上進行凝膠過濾層析的技術，得到75.6％的產率。這種方法的不足之處在于它依賴于三種不同的層析步驟，其中包括的凝膠過濾層析是麻煩而又耗時的過程。
這里使用的生產過程在每升實驗室搖瓶培養(yǎng)液中能夠生產8.9毫克基本上為均質純度的純化成熟溶葡萄球菌素(見實施例中的表格)。獲得了具有良好溶葡萄球菌活性的溶葡萄球菌素內肽酶的11倍純化(比活性為11960U/mg，與Sigma，St.Louis，Missouri，USA提供的成熟溶葡萄球菌素相似)。根據本發(fā)明生產的溶葡萄球菌素回收率是70％。在考馬斯亮藍染色的12％SDS-PAGE凝膠上可以看出，制備物的純度近于均質。
本發(fā)明因此可用于在安全的，非致病宿主內生產重組的基本上為均質的溶葡萄球菌素內肽酶。這種方法可以按實驗室規(guī)模實施或擴大規(guī)模到工業(yè)水平生產。根據本發(fā)明生產的重組溶葡萄球菌素內肽酶的生化和酶特征在使用安福靈的聚丙烯酰胺凝膠電泳中的等電聚焦得到的實驗數據是9.8，結果與文獻中報道的天然成熟溶葡萄球菌素的數值一致。由遷移率(Rf)對標準分子量對數的曲線計算得出重組溶葡萄球菌素內肽酶亞單位分子量是26.9kDa。這一數值與理論估計的27.2kDa數值以及以上引用文獻中報道的數值極為接近。
本發(fā)明中用“Sephacryl S-200”(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)凝膠過濾層析法生產的溶葡萄球菌素的分子量約為27kDa，并且與從模仿葡萄球菌培養(yǎng)物過濾液中得到的成熟溶葡萄球菌素是完全一致的。根據本發(fā)明生產的蛋白，其溶葡萄球菌素活性率從一分鐘到十分鐘之間成線性，其比活性在Sigma指定條件下與商用溶葡萄球菌素(Sigma)的比活性具有可比性。重組成熟溶葡萄球菌素內肽酶在約47℃和pH值約7.0到8.0范圍內(峰值約為8.0)具有最大活性。盡管如此，根據本發(fā)明制備的蛋白在pH值約為10.0時仍保留約82％的活性。當在不同溫度溫育不同的時間間隔時，根據發(fā)明制備的蛋白在約50℃，溫育時間約10分鐘內保持穩(wěn)定，超過這些參數后，蛋白迅速失去其穩(wěn)定性(例如60℃熱處理十分鐘后，蛋白只能保留約40％活性)。在20℃和30℃下，重組溶葡萄球菌素保持穩(wěn)定至少達24小時。在40℃下，重組溶葡萄球菌素可維持十分穩(wěn)定的狀態(tài)達四小時，保持70％殘存活性。本發(fā)明獲得的重組溶葡萄球菌素的特性與以往Schindler和Schuardt，Recsei等，以及Iverson和Grov，supra的報道的不同之處在于以往報道的最適溫度和pH值分別為37℃和7.5。相反，根據本發(fā)明生產的溶葡萄球菌素在約47℃和pH約8.0的條件下有最佳活性。
實施例以下實施例只是用于幫助對此處所描述和要求保護的發(fā)明有更全面的了解。所舉實施例并不以任何形式限制所要求保護的發(fā)明的范圍。重組表達載體的構建現在參看圖.2，分泌信號肽和代表前肽的前后排列的重復序列被ATG起始密碼子代替，利用如下引物，通過PCR介導的定位誘變，在溶葡萄球菌素結構基因的5’末端建立EcoRI限制性位點，在終止密碼子后建立BamHI限制性位點5’-ACTGAATTCCATATGGCTGCAACACATGAACATTCAGCAC-3’(SEQ.ID.NO1)(劃線處是NdeI限制性位點)；和5’-CAGATCTGGATCCTCACTTTATAGTTCCCCAAAGAACAC-3’(SEQ.ID.NO2)(劃線處是BamHI限制性位點)。
利用“VENT”DNA聚合酶(New England Biolabs)，通過標準反應從質粒pRJ5(Recsei et al，supra，ATCC 67079)中選擇性PCR擴增修飾的基因，所選用的DNA聚合酶在Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀上具有3’到5’核酸外切酶的校準活性。擴增條件是94℃下1分鐘，65℃下1分鐘，72℃下40秒/循環(huán)，共計25個循環(huán)。擴增得到的片斷如圖.1所示，M表示分子量標記的泳道，泳道1和2表示兩個完全相同的765個堿基對擴增產物的條帶。
擴增得到的成熟溶葡萄球菌素基因去除了分泌信號和前后排列的重復序列，但操作性連接上ATG起始密碼子，然后將其連接在編碼lacI9阻抑物的序列和噬菌體T710啟動子上，生成一個構建體，其中具有5’ATG起始密碼子的成熟溶葡萄球菌素基因操作性連接在lacI9阻抑物和IPTG誘導型T710啟動子上。lacI9和啟動子序列可以從例如pET-11b這樣容易獲得的載體上得到。
通過NdeI和BamHI限制性核酸內切酶消化含有操作性連接到啟動子的成熟溶葡萄球菌素的構建體，然后插入到相應的消化了的pET-11b表達載體上，生成重組質粒pEnd-11b，其溶葡萄球菌素基因處在T710啟動子轉錄調控下。成熟溶葡萄球菌素的胞漿表達和葡萄球菌裂解活性的定位用pEnd-11b質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)。將200微升大腸桿菌BL21(DE3)(pEnd-11b)過夜培養(yǎng)物接種到含50μg/ml氨芐青霉素的Luria Bertani肉湯中。培養(yǎng)物在37℃條件下，劇烈震蕩生長到光密度為0.6(波長600nm)，然后加入0.4mM的IPTG誘導成熟溶葡萄球菌素在大腸桿菌胞漿中表達。誘導三小時后，細胞離心沉降，用2.5ml，50mM的Tris-HCl重懸，超聲裂解，然后離心去除顆粒部分?？偧毎崛∫汉涂扇苄圆糠职凑找阎椒?Laemmli U.K.(1970)“Cleavage of structural proteins during assembly of head ofbacteriophage T4.”Nature 227680-685)用考馬斯亮藍方法在12％SDS-PAGE凝膠上分析。通過使用FUJI GELSCAN光密度儀的凝膠光密度測量分析12％SDS-PAGE來確定重組蛋白表達水平。結果如圖.4所示，表大的成熟溶葡萄球菌素占胞漿蛋白的20.2％。葡萄球菌裂解活性的定位利用Sugai等(1990)，supra描述的方法并進行輕微的修改，在12％SDS-PAGE凝膠上定位葡萄球菌裂解活性條帶。電泳使用的緩沖系統(tǒng)與Laemmli(1970)，supra報道的相同。簡要地，制備含有1％(w/v濕細胞團塊)金葡菌237細胞的12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠。使用BIORADMiniprotean垂直板凝膠電泳裝置，在20mA恒定電流，4℃條件下進行電泳。電泳結束后，用冷的蒸餾水(3×100ml)徹底沖洗凝膠。最后，在37℃下將凝膠浸泡在含100mM氯化鈉的50mM，pH8.0的Tris-HCl中30分鐘。在暗背景下，利用間接光線觀察活性條帶。成熟溶葡萄球菌素的純化向兩升含有50mg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中接種10ml含大腸桿菌BL21(DE 3)(pEnd-11b)轉化菌的過夜培養(yǎng)物，在37℃，恒定轉速(200rpm)條件下培養(yǎng)到光密度值為0.6(波長600nm)，然后加入IPTG到終濃度為0.4mM誘導蛋白表達。誘導后的細胞可以在42℃下再生長3小時。然后將誘導的細胞用Sorvall GS-3轉頭在4℃下，8000rpm離心10分鐘，用100ml裂解緩沖液重懸(50mMTris-HCl，pH8.5，含有100mM氯化鈉和0.5mM苯基甲基磺?；?。
步驟I陰離子交換層析在玻璃柱中裝入70ml陰離子交換樹脂“Q-sepharose FF”(Pharmacia)，用100ml裂解緩沖液平衡。流速保持在2ml/min。將蛋白溶液加入到柱中，按每份體積10ml收集洗脫液。然后用100ml相同緩沖液清洗柱，并按上述收集組分。如上所述，利用SDS-PAGE分析峰值部分及葡萄球菌裂解活性。
步驟II酸化和陽離子交換層析收集含有溶葡萄球菌素的組分，在4℃下20倍體積的陽離子交換緩沖液中(40mM Tris-醋酸pH5.5，100mM氯化鈉)透析16小時。透析物在4℃，15000rpm條件下離心15分鐘，得到的上清液用于陽離子交換層析。用S-sepharose FF(Pharmacia)裝滿20ml容積的玻璃柱，用40ml陽離子交換緩沖液平衡。整個層析過程中，流速保持在2ml/min。
將上面得到的上清液加入平衡的柱中，用5倍柱體積(100ml)的相同緩沖液洗柱，然后再用5倍柱體積含有150mM氯化鈉的相同緩沖液清洗。結合在基質上的溶葡萄球菌素利用100ml150mM到500mM氯化鈉梯度的陽離子交換緩沖液洗脫。每組分按5ml體積收集并通過SDS-PAGE分析成熟溶葡萄球菌素內肽酶的存在和葡萄球菌裂解活性。合并含有純化的重組蛋白組分，將均質制劑放入到10倍體積的儲存緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM氯化鈉，50％(v/v)甘油)中透析，然后在-20℃儲存，產率是8.9mg/ml。關于每一步的產率和活性數據見下表
溶葡萄球菌素活性的分析利用改進的已報道的方法(Robinson，J.M.，J.K.Hardman andG.L.Sloan(1979)“Relationship between lysostaphinendopeptidase production and cell wall composition inStaphylococcus staphylolyticus.”J.Bact.1371158-1164)，通過監(jiān)測金葡菌237細胞的裂解而對溶葡萄球菌素內肽酶活性進行分析。簡要地，活躍生長的金葡菌237細胞經漂洗后懸浮于活性緩沖液中(50mM Tris-HCl，Ph7.5，100mM氯化鈉)，光密度值(波長600nM)調節(jié)到0.400。在Shimadzu2101分光光度儀上，使用1cm光程，在3.0ml石英比色杯內測量分析，Shimadzu2101分光光度儀具有一個溫度維持在37℃的“原位”控溫比色杯座。將等分的適當稀釋的重組溶葡萄球菌素溶液加入到懸浮液中，37℃溫育5分鐘后，記錄在波長600nm時細胞0D值的下降情況。溶葡萄球菌素的一個單位定義為，在37℃條件下，3ml反應體積內反應5分鐘，金葡菌237細胞懸浮液OD值(波長600nM)下降0.001所需的酶量。根據本發(fā)明制得的純化溶葡萄球菌素活性為11960U/mg.
序列表<110>G.S.哈特里R.沙馬印度生物技術國際有限公司<120>重組成熟溶葡萄球菌素的表達<130>溶葡萄球菌素<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物<400>1actgaattcc atatggctgc aacacatgaa cattcagcac 40<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物<400>2cagatctgga tcctcacttt atagttcccc aaagaacac39
權利要求
1.一種生產不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素內肽酶的方法，其特征在于(a)提供一種遺傳構建體，該構建體含有一段在編碼溶葡萄球菌素原的元件不存在的條件下編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列，和一個操作性連接在編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列上的啟動子；(b)轉化宿主細胞使其含有和表達步驟(a)的遺傳構建體，這樣不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素在宿主胞漿中積累；以及(c)從宿主細胞中分離出成熟溶葡萄球菌素。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(a)提供了含有一段在編碼溶葡萄球菌素原的元件不存在的條件下編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列的構建體，在其5’末端操作性連接一段起始序列，在該起始序列5’末端操作性連接誘導型啟動子。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中在步驟(a)提供含有IPTG誘導型啟動子的構建體。
4.前面任意一項權利要求的方法，其中在步驟(a)提供含有噬菌體T710啟動子的構建體。
5.前面任意一項權利要求的方法，其中在步驟(a)提供進一步含有與啟動子操作性連接的阻抑物的構建體。
6.權利要求5的方法，其中在步驟(a)提供進一步含有l(wèi)acI9阻抑物基因的構建體。
7.前面任意一項權利要求的方法，其中在步驟(b)進行大腸桿菌轉化。
8.前面任意一項權利要求的方法，其中在步驟(c)，通過以下方法分離成熟溶葡萄球菌素i)裂解宿主細胞產生裂解液；ii)使裂解液通過陰離子交換樹脂，收集并合并表現葡萄球菌裂解活性的組分；iii)酸化步驟ii)合并的組分，將酸化后的合并組分通過陽離子交換樹脂，以及收集并合并表現葡萄球菌裂解活性的組分。
9.一種用于轉化宿主使其表達不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素內肽酶的表達構建體，該構建體含有一段在編碼溶葡萄球菌素原的元件不存在的條件下編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列，和一個操作性連接在編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列上的啟動子。
10.權利要求9的構建體，其中在編碼溶葡萄球菌素原的元件不存在的條件下編碼成熟溶葡萄球菌素內肽酶的核苷酸序列在5’末端操作性連接一段起始序列，在該起始序列5’末端操作性連接誘導型啟動子。
11.權利要求9或權利要求10的構建體，其中啟動子是IPTG誘導型啟動子。
12.權利要求9，10或11的任意一項的構建體，其中啟動子是噬菌體T710啟動子。
13.權利要求9至12的任意一項的構建體，其中構建體進一步含有與啟動子操作性連接的阻抑物。
14.權利要求13的構建體，其中阻抑物是lacI9阻抑物基因。
15.一種遺傳工程宿主細胞，包含經轉化而含有權利要求9至14中的任意一項的構建體的宿主細胞，其中如此轉化的遺傳工程宿主細胞在其胞漿中表達不含前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素內肽酶。
16.權利要求15的遺傳工程宿主細胞，其中宿主細胞是大腸桿菌。
17.一種物質組合物，包含不合前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的成熟溶葡萄球菌素內肽酶，根據權利要求1至8的任意一項的方法生產的物質組合物。
全文摘要
克隆了模仿葡萄球菌(staphylococcus simulans)溶葡萄球菌素基因的一部分并且在前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原不存在的條件下在大腸桿菌胞漿中過度表達，從而產生成熟溶葡萄球菌素，其表達在IPTG誘導型啟動子和核糖體結合位點的轉錄控制下。被轉化宿主細胞的IPTG誘導在完全缺失前溶葡萄球菌素原和溶葡萄球菌素原的條件下產生細胞內的可溶成熟溶葡萄球菌素(27KDa)。如此形成的成熟溶葡萄球菌素不需要翻譯后修飾。如此形成的成熟溶葡萄球菌素可以用于治療和預防葡萄球菌感染。
文檔編號C12N1/21GK1406278SQ99817049
公開日2003年3月26日 申請日期1999年10月19日 優(yōu)先權日1999年10月19日
發(fā)明者G·S·哈特里, R·沙馬 申請人:印度生物技術國際有限公司, 科學及工業(yè)研究委員會