專利名稱：一種通過(guò)使用腈水解酶或含有腈水解酶的微生物來(lái)從腈類物質(zhì)中制備手性羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到編碼具腈水解酶活性的多肽的核酸序列，含有該核酸序列的核酸構(gòu)建物以及含有該核酸序列或該核酸構(gòu)建物的載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到被該核酸序列所編碼的氨基酸序列，以及含有該核酸序列、該核酸構(gòu)建物或含有該核酸序列或該核酸構(gòu)建物的載體的微生物。
本發(fā)明還涉及到從外消旋的腈類物質(zhì)中制備手性羧酸的方法。
手性羧酸是有機(jī)化學(xué)合成所需的化合物。它們是一大批藥學(xué)活性成分或用于農(nóng)作物保護(hù)的活性組分的起始材料。手性羧酸可被用于通過(guò)非對(duì)映體鹽類來(lái)進(jìn)行的經(jīng)典的外消選體拆分。這樣，R-(-)-或S-(-)-苯基乙醇酸被用于，例如，外消旋胺的外消旋拆分。R-(-)-苯基乙醇酸還被用作半合成抗生素和大量的農(nóng)用產(chǎn)品的合成的中間體。
在文獻(xiàn)中披露了手性羧酸的多種不同的合成路線。這樣，例如，通過(guò)發(fā)酵方法可工業(yè)化地獲得旋光活性的氨基酸。這些方法導(dǎo)致以下缺點(diǎn)，即對(duì)每一種氨基酸都需要開發(fā)一種特別的加工方法。這就是為什么要使用化學(xué)或酶學(xué)方法以制備最大范圍的不同的化合物?；瘜W(xué)方法的一個(gè)缺點(diǎn)是經(jīng)常必須在一個(gè)復(fù)雜的，多階段的，應(yīng)用不廣泛的合成中構(gòu)建立體中心。
手性羧酸的酶學(xué)合成可見于許多專利或?qū)＠姓?qǐng)中。WO92/05275描述α-羥基-α-烷基或α-烷基羧酸的對(duì)映構(gòu)建物在生物物質(zhì)存在下的合成。EP-B-0 348 901要求一種方法的權(quán)利，該方法用于通過(guò)使用產(chǎn)堿桿菌屬，假單胞菌，紅假單胞菌屬，棒狀桿菌菌株KO-2-4，不動(dòng)桿菌，芽孢桿菌，分支桿菌，紅球菌屬和假絲酵菌的微生物來(lái)制備旋光活性的α-取代有機(jī)酸。使用微生物對(duì)L-α-氨基酸的制備的權(quán)利要求見EP-B-0 332 379。
α-羥基羧酸的制備，具體來(lái)說(shuō)是使用各種微生物，例如金桿菌屬，假單胞菌，紅假單胞菌屬，棒狀桿菌，不動(dòng)桿菌，乳酪桿菌，芽孢桿菌，分支桿菌，紅球菌屬，短桿菌屬，土壤絲菌屬，貪噬菌屬，節(jié)核細(xì)菌屬和假絲酵菌的微生物，或使用酶來(lái)進(jìn)行的對(duì)乳酸或苯基乙醇酸的制備，其描述見于專利EP-A-0 348 901或其對(duì)應(yīng)的US5,283,193，EP-A-0 449 648，EP-B-0 473 328，EP-B-0 527 553或其對(duì)應(yīng)的US 5,296,373，EP-A-0 610 048，EP-A-0 610 049 EP-A-0666 320或WO97/32030。
這些方法的缺點(diǎn)為它們通常產(chǎn)生具較低的旋光純度的產(chǎn)物和/或進(jìn)行這些方法時(shí)空間-時(shí)間產(chǎn)量較低。這導(dǎo)致這些方法不具經(jīng)濟(jì)吸引力。甚至通過(guò)添加諸如亞硫酸鹽，二亞硫酸鹽，連二亞硫酸鹽，次亞磷鹽或亞磷酸鹽這樣的物質(zhì)(見EP-A-0 486 289)或通過(guò)使用具備提高的針對(duì)α-羥基腈的抗性的微生物(見WO97/32030)來(lái)提高生產(chǎn)能力的嘗試也導(dǎo)致生產(chǎn)能力增長(zhǎng)可忽略。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是開發(fā)一種簡(jiǎn)單，有成本效益的，應(yīng)用廣泛的方法以制備旋光活性的手性羧酸，該方法沒有上述的缺點(diǎn)。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這一目標(biāo)已經(jīng)通過(guò)一個(gè)方法實(shí)現(xiàn)，該方法根據(jù)于本發(fā)明，本發(fā)明用于在存在一種氨基酸序列或微生物的情況下制備通式I的手性羧酸 該制備包括轉(zhuǎn)化外消旋腈，其具有通式II 該氨基酸序列由選自以下群體的核酸序列編碼a)一個(gè)核酸序列，它具有在SEQ ID NO1中所描述的序列，b)一些核酸序列，它們衍生于在SEQ ID NO1中所描述的序列，是遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果，c)在SEQ ID NO1中所描述的序列的變體，它們編碼一些多肽，這些多肽具有SEQ ID NO2中所描述的序列并且在氨基酸水平上具有至少80％的同源性，該多肽的酶活性上無(wú)實(shí)質(zhì)性的降低，或者該微生物為一種生長(zhǎng)中的，休眠的或被破碎的微生物體，它含有來(lái)自上述的群體的一種核酸序列或一種核酸構(gòu)建物，該構(gòu)建物將來(lái)自所述的群體的核酸序列同一種或更多種調(diào)控信號(hào)相連接，該體系中至少每小時(shí)每毫克蛋白或每克干重將25mmol腈轉(zhuǎn)化為手性羧酸，其中，結(jié)構(gòu)式I和II中的取代基和變量具有以下意義*一個(gè)旋光活性中心R1，R2，R3各自獨(dú)立地為氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，雜芳基，OR4或NR4R5，其中基團(tuán)R1，R2，R3總是各不相同，R4氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，雜芳基或雜芳基羰基，R5氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，芳基或雜芳基。
結(jié)構(gòu)式I和II的化合物的R1，R2，R3各自獨(dú)立地為氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，雜芳基，OR4或NR4R5，其中基團(tuán)R1，R2，R3總是各不相同。
可能提及的烷基基團(tuán)為取代或未取代的，分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基鏈，例如，甲基，乙基，n-丙基，1-甲基乙基，n-丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，n-戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，n-己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，n-庚基，n-辛基，n-壬基，n-癸基。甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，i-丙基或i-丁基較為優(yōu)選。
可能提及的烯基基團(tuán)為取代或未取代的C2～C10-烯基鏈，例如，乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-甲基丙烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-1丁烯基，2-甲基-1-丁烯基，3-甲基-1丁烯基，1-甲基-2丁烯基，2-甲基-2丁烯基，3-甲基-2丁烯基，1-甲基-3丁烯基，2-甲基-3丁烯基，3-甲基-3丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-1-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-1-戊烯基，2-甲基-1-戊烯基，3-甲基-1-戊烯基，4-甲基-1-戊烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，2-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-1-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-1-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-1-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，3，3-二甲基-1-丁烯基，3，3-二甲基-2-丁烯基，1-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，2-乙基-3-丁烯基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-甲基-1-丙烯基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基，1-庚烯基，2-庚烯基，3-庚烯基，4-庚烯基，5-庚烯基，6-庚烯基，1-辛烯基，2-辛烯基，3-辛烯基，4-辛烯基，5-辛烯基，6-辛烯基，7-辛烯基，壬烯基或癸烯基。乙烯基，丙烯基，丁烯基或戊烯基較為優(yōu)選。
可能提及的芳基基團(tuán)為取代或未取代的芳基基團(tuán)，它們?cè)诃h(huán)或環(huán)系統(tǒng)中含有6-20個(gè)碳原子。環(huán)系統(tǒng)中可能含有稠合在一起的芳香環(huán)或通過(guò)烷基，烷基羰基，烯基或烯基羰基鏈，羰基，氧或氮連接的芳香環(huán)。在適當(dāng)情況下，芳基基團(tuán)還可經(jīng)C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-環(huán)烷基鏈連接于基礎(chǔ)框架。苯基或萘基較為優(yōu)選。
可能提及的雜芳基基團(tuán)為取代或未取代的，單一的或稠合的芳香環(huán)系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有一個(gè)或多個(gè)3-7員的芳香環(huán)，該環(huán)可能含有一個(gè)或多個(gè)雜原子，如N，O或S，并且在適當(dāng)情況下還可經(jīng)C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-環(huán)烷基鏈連接于基礎(chǔ)框架。這一類型的雜環(huán)芳基基團(tuán)的例子有吡唑，咪唑，噁唑，異噁唑，噻唑，三唑，吡啶，喹啉，異喹啉，吖啶，嘧啶，噠嗪，吡嗪，吩嗪，嘌呤或蝶啶。雜環(huán)芳基基團(tuán)可以經(jīng)過(guò)環(huán)或環(huán)系統(tǒng)中的雜原子或各種碳原子或經(jīng)過(guò)取代基團(tuán)連接于基礎(chǔ)框架。吡啶，咪唑，嘧啶，嘌呤，吡嗪或喹啉較為優(yōu)選。
對(duì)所述的R1，R2和R3較適合的取代基為諸如鹵素，如氟、氯或溴，硫代，硝基，氨基，羥基，烷基，烷氧基，烯基，烯基氧基，炔基或其它芳香類或其他飽和或不飽和的非芳香類環(huán)或環(huán)體系這樣的一種或多種取代基。較優(yōu)選的為諸如C1～C6-烷基這樣的烷基基團(tuán)，例如，甲基、乙基、丙基或丁基，還有芳基，例如苯基，以及諸如氟、氯或溴這樣的鹵素，羥基或氨基。
在OR4或NR4R5中的R4為氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，雜芳基或雜芳基羰基。
可能提及的烷基基團(tuán)為取代或未取代的，分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基鏈，例如，甲基，乙基，n-丙基，1-甲基乙基，n-丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，n-戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，n-己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，n-庚基，n-辛基，n-壬基，n-癸基。甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，i-丙基或i-丁基較為優(yōu)選。
可能提及的烯基基團(tuán)為分支或無(wú)分支的C2～C10-烯基鏈，例如，乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-甲基丙烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-1丁烯基，2-甲基-1丁烯基，3-甲基-1丁烯基，1-甲基-2丁烯基，2-甲基-2丁烯基，3-甲基-2丁烯基，1-甲基-3丁烯基，2-甲基-3丁烯基，3-甲基-3丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-1-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-1-戊烯基，2-甲基-1-戊烯基，3-甲基-1-戊烯基，4-甲基-1-戊烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，2-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-1-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-1-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-1-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，3，3-二甲基-1-丁烯基，3，3-二甲基-2-丁烯基，1-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，2-乙基-3-丁烯基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-甲基-1-丙烯基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基，1-庚烯基，2-庚烯基，3-庚烯基，4-庚烯基，5-庚烯基，6-庚烯基，1-辛烯基，2-辛烯基，3-辛烯基，4-辛烯基，5-辛烯基，6-辛烯基，7-辛烯基，壬烯基或癸烯基。乙烯基，丙烯基，丁烯基或戊烯基較為優(yōu)選。
可能提及的烷羰基基團(tuán)為取代或未取代的，分支或無(wú)分支的C1～C10-烷羰基基鏈，例如，甲基羰基，乙基羰基，n-丙基羰基，1-甲基乙基羰基，n-丁基羰基，1-甲基丙基羰基，2-甲基丙基羰基，1，1-二甲基乙基羰基，n-戊基羰基，1-甲基丁基羰基，2-甲基丁基羰基，3-甲基丁基羰基，2，2-二甲基丙基羰基，1-乙基丙基羰基，n-己基羰基，1，1-二甲基丙基羰基，1，2-二甲基丙基羰基，1-甲基戊基羰基，2-甲基戊基羰基，3-甲基戊基羰基，4-甲基戊基羰基，1，1-二甲基丁基羰基，1，2-二甲基丁基羰基，1，3-二甲基丁基羰基，2，2-二甲基丁基羰基，2，3-二甲基丁基羰基，3，3-二甲基丁基羰基，1-乙基丁基羰基，2-乙基丁基羰基，1，1，2-三甲基丙基羰基，1，2，2-三甲基丙基羰基，1-乙基-1-甲基丙基羰基，1-乙基-2-甲基丙基羰基，n-庚基羰基，n-辛基羰基，n-壬基羰基，n-癸基羰基。甲基羰基，乙基羰基，n-丙基羰基，n-丁基羰基，i-丙基羰基或i-丁基羰基較為優(yōu)選。
可能提及的烯基羰基基團(tuán)為取代或未取代的C2～C10-烯基羰基鏈，例如，乙烯基羰基，丙烯基羰基，1-丁烯基羰基，2-丁烯基羰基，3-丁烯基羰基，2-甲基丙烯基羰基，1-戊烯基羰基，2-戊烯基羰基，3-戊烯基羰基，4-戊烯基羰基，1-甲基-1丁烯基羰基，2-甲基-1丁烯基羰基，3-甲基-1丁烯基羰基，1-甲基-2丁烯基羰基，2-甲基-2丁烯基羰基，3-甲基-2丁烯基羰基，1-甲基-3丁烯基羰基，2-甲基-3丁烯基羰基，3-甲基-3丁烯基羰基，1，1-二甲基-2-丙烯基羰基，1，2-二甲基-1-丙烯基羰基，1，2-二甲基-2-丙烯基羰基，1-乙基-1-丙烯基羰基，1-乙基-2-丙烯基羰基，1-己烯基羰基，2-己烯基羰基，3-己烯基羰基，4-己烯基羰基，5-己烯基羰基，1-甲基-1-戊烯基羰基，2-甲基-1-戊烯基羰基，3-甲基-1-戊烯基羰基，4-甲基-1-戊烯基羰基，1-甲基-2-戊烯基羰基，2-甲基-2-戊烯基羰基，3-甲基-2-戊烯基羰基，4-甲基-4-戊烯基羰基，1-甲基-3-戊烯基羰基，2-甲基-3-戊烯基羰基，3-甲基-3-戊烯基羰基，4-甲基-3-戊烯基羰基，1-甲基-4-戊烯基羰基，2-甲基-4-戊烯基羰基，3-甲基-4-戊烯基羰基，4-甲基-4-戊烯基羰基，1，1-二甲基-2-丁烯基羰基，1，1-二甲基-3-丁烯基羰基，1，2-二甲基-1-丁烯基羰基，1，2-二甲基-2-丁烯基羰基，1，2-二甲基-3-丁烯基羰基，1，3-二甲基-1-丁烯基羰基，1，3-二甲基-2-丁烯基羰基，1，3-二甲基-3-丁烯基羰基，2，2-二甲基-3-丁烯基羰基，2，3-二甲基-1-丁烯基羰基，2，3-二甲基-2-丁烯基羰基，2，3-二甲基-3-丁烯基羰基，3，3-二甲基-1-丁烯基羰基，3，3-二甲基-2-丁烯基羰基，1-乙基-1-丁烯基羰基，1-乙基-2-丁烯基羰基，1-乙基-3-丁烯基羰基，2-乙基-1-丁烯基羰基，1-乙基-2-丁烯基羰基，2-乙基-3-丁烯基羰基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基羰基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基羰基，1-乙基-2-甲基-1-丙烯基羰基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基羰基，1-庚烯基羰基，2-庚烯基羰基，3-庚烯基羰基，4-庚烯基羰基，5-庚烯基羰基，6-庚烯基羰基，1-辛烯基羰基，2-辛烯基羰基，3-辛烯基羰基，4-辛烯基羰基，5-辛烯基羰基，6-辛烯基羰基，7-辛烯基羰基，壬烯基羰基或癸烯基羰基。乙烯基羰基，丙烯基羰基，丁烯基羰基或戊烯基羰基較為優(yōu)選。
可能提及的芳基基團(tuán)為取代或未取代的芳基基團(tuán)，它們?cè)诃h(huán)或環(huán)系統(tǒng)中含有6-20個(gè)碳原子。環(huán)系統(tǒng)中可能含有稠合在一起的芳香環(huán)或通過(guò)烷基，烷基羰基，烯基或烯基羰基鏈，羰基，氧或氮連接的芳香環(huán)。在適當(dāng)情況下，芳基基團(tuán)還可經(jīng)C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-環(huán)烷基鏈連接于基礎(chǔ)框架。苯基或萘基較為優(yōu)選。
可能提及的芳基羰基基團(tuán)為取代或未取代的芳基羰基基團(tuán)，它們?cè)诃h(huán)或環(huán)系統(tǒng)中含有6-20個(gè)碳原子。環(huán)系統(tǒng)中可能含有稠合在一起的芳香環(huán)或通過(guò)烷基，烷基羰基，烯基或烯基羰基鏈，羰基，氧或氮連接的芳香環(huán)。苯基羰基或萘基羰基較為優(yōu)選可能提及的雜芳基基團(tuán)為取代或未取代的，單一的或稠合的芳香環(huán)系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有一個(gè)或多個(gè)3-7員的芳香環(huán)，該環(huán)可能含有一個(gè)或多個(gè)雜原子，如N，O或S，并且在適當(dāng)情況下還可經(jīng)C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-環(huán)烷基鏈連接于基礎(chǔ)框架。這一類型的雜環(huán)芳基基團(tuán)的例子有吡唑，咪唑，噁唑，異噁唑，噻唑，三唑，吡唑，喹啉，異喹啉，吖啶，嘧啶，噠嗪，吡嗪，吩嗪，嘌呤或蝶啶。雜環(huán)芳基基團(tuán)可以經(jīng)過(guò)雜原子或經(jīng)過(guò)環(huán)或環(huán)系統(tǒng)中的各種碳原子或經(jīng)過(guò)取代基團(tuán)連接于基礎(chǔ)框架。雜環(huán)芳基羰基指的是通過(guò)一個(gè)羰基基團(tuán)連接于基礎(chǔ)框架的雜芳香取代基團(tuán)。吡唑，咪唑，嘧啶，嘌呤，吡嗪或喹啉較為優(yōu)選。
對(duì)所述的R4基團(tuán)較適合的取代基為諸如鹵素，如氟、氯或溴，硫代，硝基，氨基，羥基，烷基，烷氧基，烯基，烯基氧基，炔基或其它芳香類或其他飽和或不飽和的非芳香類環(huán)或環(huán)體系這樣的一種或多種取代基。較優(yōu)選的為諸如C1～C6-烷基這樣的烷基基團(tuán)，例如，甲基、乙基、丙基或丁基，以及諸如氟、氯或溴這樣的鹵素，羥基或氨基。
優(yōu)選的R4基團(tuán)為氫。
在NR4R5中的R5為氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，雜芳基或雜芳基羰基，其中烷基，烯基，芳基和雜環(huán)芳基的含義同上文所述。較優(yōu)選的為氫或C1～C10-烷基，例如甲基，乙基或丙基。
對(duì)所述的R5基團(tuán)較適合的取代基為諸如鹵素，如氟、氯或溴，硫代，硝基，氨基，羥基，烷基，烷氧基，烯基，烯基氧基，炔基或其它芳香類或其他飽和或不飽和的非芳香類環(huán)或環(huán)體系這樣的一種或多種取代基。較優(yōu)選的為諸如C1～C6-烷基這樣的烷基基團(tuán)，例如，甲基、乙基、丙基或丁基，還有芳基，例如苯基，以及諸如氟、氯或溴這樣的鹵素，羥基或氨基。
兩個(gè)鄰近的R4或R5基團(tuán)還進(jìn)一步有可能一起形成另一個(gè)取代或未取代的芳香族的飽和或部分飽和的環(huán)，環(huán)中有5-6個(gè)原子并可能含有雜原子，如O，N或S。
結(jié)構(gòu)式I和II中的R1，R2和R3取代基中有一個(gè)為芳基是有好處的，例如苯基。結(jié)構(gòu)式I和II中的R1，R2和R3取代基中有一個(gè)為羥基并且有一個(gè)為氫或甲基則更為優(yōu)選。
在pH為4-11下進(jìn)行本發(fā)明的方法是有益的，優(yōu)選情況下pH為4-9。
在方法中使用重量百分比為0.01-10％的腈或者重量百分比為0.01-10％的相對(duì)應(yīng)的醛或酮以及重量百分比為0.01-10％的氫氰酸是進(jìn)一步有益的。在氫氰酸過(guò)量的情況下進(jìn)行本發(fā)明的方法是有益的。在某些情況下，這導(dǎo)致氫氰酸含量超過(guò)前述量。不同量的腈被用于該反應(yīng)，這取決于腈的種類。對(duì)于處于與對(duì)應(yīng)的醛和氫氰酸的平衡之中的腈(氰醇)，使用最小量(＝重量百分比為0.01-5％)的腈是有益的。由于醛通常對(duì)于微生物或酶是有毒的。同樣，揮發(fā)性的腈的有益的使用量為重量百分比0.01-5％。較大量的氰醇或腈可延遲反應(yīng)。在腈具較低的可溶性或不具實(shí)際的可溶性的情況下，或當(dāng)腈僅少量溶于水介質(zhì)時(shí)，腈的使用量多于上文提及的量是可能并有益的。為提高轉(zhuǎn)換量和產(chǎn)量，進(jìn)行反應(yīng)時(shí)有控制地添加外消旋的腈是有益的。產(chǎn)物可在反應(yīng)結(jié)束后分離或在旁路途徑中連續(xù)除去。
上文提及的適當(dāng)?shù)娜┖屯傅氖且恍┗衔?，它們?cè)谠撊┗蛲c氫氰酸經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)乃岽呋M(jìn)行反應(yīng)后可形成腈。醛與氫氰酸的反應(yīng)形成氰醇，氰醇的優(yōu)點(diǎn)在于其處于同醛與氫氰酸的平衡之中。建立一個(gè)同氰醇之間的平衡意味著在只轉(zhuǎn)化腈的一種對(duì)映體的酶的作用下可以獲得100％的理論產(chǎn)率，這是因?yàn)橥庀碾姹怀掷m(xù)地補(bǔ)充。對(duì)于其余的腈，不被酶轉(zhuǎn)化的腈(＝“錯(cuò)誤的”或其它的對(duì)映體)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)被有益地外消旋化并返回方法以達(dá)到100％的理論產(chǎn)率，或者被棄去或在保持立體中心的情況下被純化和化學(xué)水解。
在0℃-80℃下進(jìn)行本發(fā)明的方法是有益的，優(yōu)選情況下為10℃-60℃，特別優(yōu)選的情況下為15℃-50℃。
本發(fā)明中的方法中的外消旋腈指的腈類物質(zhì)是由兩種對(duì)映體的50∶50的混合物或一種對(duì)映體較之另一種更為富集的混合物組成。
本發(fā)明中的方法中的手性羧酸指的是表現(xiàn)出對(duì)映體的富集的羧酸。在優(yōu)選情況下，該方法產(chǎn)生的對(duì)映體純度至少為90％ee，在較優(yōu)選的情況下對(duì)映體純度至少為95％ee，在特別優(yōu)選的情況下對(duì)映體純度至少為98％ee，在非常優(yōu)選的情況下對(duì)映體純度至少為99％ee。
本發(fā)明的方法使得將大量的外消旋腈轉(zhuǎn)化為手性羧酸成為可能。在該方法中，每毫克蛋白或每克干重微生物每小時(shí)轉(zhuǎn)化至少25mmol的腈是可能的，優(yōu)選情況下至少轉(zhuǎn)化30mmol腈，特別優(yōu)選的情況下至少轉(zhuǎn)化40mmol腈，非常特別優(yōu)選的情況下至少轉(zhuǎn)化50mmol腈。
將生長(zhǎng)中的含有本發(fā)明的核酸，核酸構(gòu)建物或載體用于本發(fā)明的方法是可能的。也可使用休眠或被破碎的細(xì)胞。被破碎的細(xì)胞指的是，例如，經(jīng)諸如溶劑這樣的方法處理而具透性的細(xì)胞或者被酶處理、機(jī)械處理(例如，F(xiàn)rench壓力法或超聲)或其它任何方法處理而解體的細(xì)胞。通過(guò)這些途徑獲得的粗抽提物對(duì)于本發(fā)明的方法是適合并且有益的。該方法還可使用純化的或部分純化的酶。固定化的微生物體或酶同樣適合并且可有利地用于該反應(yīng)。
在本發(fā)明的方法中制備的手性羧酸可有利地通過(guò)抽提或結(jié)晶或抽提和結(jié)晶從水反應(yīng)溶液中分離。為此目的，以一種酸來(lái)酸化該水相反應(yīng)溶液，例如，無(wú)機(jī)酸(例如，HCl或H2SO4)或有機(jī)酸，pH值低于2較為有利，隨后以一種有機(jī)溶劑來(lái)抽提該水相反應(yīng)溶液。該抽提方法可重復(fù)數(shù)次以提高產(chǎn)量。可以使用的有機(jī)溶劑主要為同水表現(xiàn)出界限的所有溶劑，在適當(dāng)?shù)那闆r下為加入鹽后表現(xiàn)出界限。有利的溶劑為諸如甲苯、苯、己烷、甲基三丁基醚或乙酸乙酯這樣的溶劑。
濃縮有機(jī)相后通常可以分離出化學(xué)純度良好的產(chǎn)物，即其純度大于90％。然而，含有產(chǎn)物的有機(jī)相在抽提后還可以只經(jīng)過(guò)部分地濃縮，并且該產(chǎn)物可以被結(jié)晶。為此目的，該產(chǎn)物被有利地冷卻至0℃-10℃。還可以直接在有機(jī)溶液中結(jié)晶。該結(jié)晶產(chǎn)物可以在相同或不同的用于重結(jié)晶的溶劑中被吸收并被再一次結(jié)晶。根據(jù)共晶組成成分的位置，至少一次的后結(jié)晶可能進(jìn)一步提高產(chǎn)物的對(duì)映體純度。
在以酸進(jìn)行酸化處理至pH有利地低于2后，該手性羧酸還可以直接從水反應(yīng)溶液中結(jié)晶出來(lái)。在有利的情況下，這需要通過(guò)加熱將該水溶液濃縮10％-90％，優(yōu)選情況下濃縮20-80％，特別優(yōu)選情況下濃縮30-70％。優(yōu)選情況下該結(jié)晶方法在冷卻條件下進(jìn)行。在0℃-10℃之間的溫度對(duì)于結(jié)晶是優(yōu)選的。出于成本原因，從水溶液中直接結(jié)晶較為優(yōu)選。經(jīng)抽提逐步產(chǎn)生手性羧酸同樣較為優(yōu)選，在適當(dāng)?shù)那闆r下可隨后進(jìn)行結(jié)晶。
經(jīng)過(guò)這些優(yōu)選的生產(chǎn)方法，本發(fā)明的方法的產(chǎn)物以60-100％產(chǎn)量被分離，優(yōu)選情況下產(chǎn)量為80％-100％，特別優(yōu)選情況下產(chǎn)量為60％-100％，產(chǎn)量的計(jì)算基于用于本反應(yīng)的腈。該分離產(chǎn)物具有大于90％的高化學(xué)純度，優(yōu)選情況下純度大于95％，特別優(yōu)選情況下純度大于98％。另外，該產(chǎn)物具有較高的對(duì)映體純度，該純度可經(jīng)進(jìn)一步的結(jié)晶來(lái)提高。
以該途徑獲得地產(chǎn)物適合用作有機(jī)合成的起始材料以制備藥品或農(nóng)用化學(xué)品，也可用作外消旋拆分的起始材料。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及到一種經(jīng)分離的核酸序列，該序列編碼一種具有腈水解酶活性的多肽，該序列選自以下群體a)一個(gè)核酸序列，它具有在SEQ ID NO1中所描述的序列，b)一些核酸序列，它們來(lái)自在SEQ ID NO1中所描述的序列，是遺傳密碼簡(jiǎn)異的結(jié)果，c)在SEQ ID NO1中所描述的序列的變體，它們編碼一些多肽，這些多肽具有SEQ ID NO2中所描述的序列并且在氨基酸水平上具有至少80％的同源性，該多肽的酶活性無(wú)實(shí)質(zhì)性降低，本發(fā)明的SEQ ID NO1序列的核酸序列同源物指的是等位基因變體，在全序列范圍內(nèi)，該變體在所產(chǎn)生的氨基酸水平上具有至少95％的同源性，在優(yōu)選的情況下具有至少97％的同源性，在特別優(yōu)選的情況下具有至少98％的同源性。在該序列的區(qū)域形成部分上具較高的同源性是可能并且有利的。來(lái)自SEQ ID NO1的氨基酸序列可見于SEQ ID NO2。等位基因變體特別包括功能性變體，該類變體可通過(guò)對(duì)SEQ ID NO1所描述的序列進(jìn)行缺失，插入或替換而獲得，對(duì)于向一個(gè)有機(jī)體進(jìn)行的一個(gè)或多個(gè)基因的引入，無(wú)論如何完成該引入，所產(chǎn)生的蛋白在酶活性上應(yīng)只有可忽略的降低。本發(fā)明因此還涉及到氨基酸序列，這些氨基酸序列由上述核酸序列群體所編碼。本發(fā)明有利地涉及到由SEQ ID NO1序列所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO1的同源物還指，例如，真菌或細(xì)菌同源物，截短序列，單鏈DNA或編碼或非編碼DNA序列的RNA。在SEQ ID NO1所示的DNA全序列范圍內(nèi)，SEQ ID NO1的同源物在DNA水平上至少具有60％的同源性，在優(yōu)選的情況下至少70％，在特別優(yōu)選的情況下至少80％，在非常特別優(yōu)選的情況下至少90％。
SEQ ID NO1的同源物還指一些衍生物，例如，啟動(dòng)子衍生物。在所述的核酸序列之前的啟動(dòng)子可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷交換，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子的功能性或效能無(wú)負(fù)面影響的插入或缺失而被修飾。這些啟動(dòng)子還可能通過(guò)對(duì)其序列的修飾，或者可以以來(lái)自有機(jī)體或其它物種的更高效啟動(dòng)子來(lái)完全替代這些啟動(dòng)子的序列提高其效能。
衍生物還指一些變體，其在起始密碼子前的-10～-200區(qū)域的序列和終止密碼子后的0～1000堿基對(duì)被修飾，修飾以改變基因表達(dá)和/或蛋白表達(dá)的方式進(jìn)行，在優(yōu)選情況下提高基因表達(dá)和/或蛋白表達(dá)。
SEQ ID NO1或其同源物可通過(guò)技術(shù)人員所知的方法有利地從細(xì)菌中分離，優(yōu)選情況下從革蘭氏陰性菌中分離，特別優(yōu)選情況下產(chǎn)堿桿菌屬的細(xì)菌中分離，非常特別優(yōu)選情況下糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)中分離。
SEQ ID NO1或其同源物或這些序列的一部分可以從其它真菌或細(xì)菌中分離，例如通過(guò)傳統(tǒng)的雜交方法或PCR技術(shù)。這些DNA序列在標(biāo)準(zhǔn)條件下同本發(fā)明中的序列進(jìn)行雜交。在優(yōu)選情況下，該雜交同保守區(qū)域的短寡聚核苷之間進(jìn)行，保守區(qū)域如來(lái)自活性中心的區(qū)域，，這些區(qū)域可以技術(shù)人員所知的方式通過(guò)同其它腈水解酶或腈水合酶的比較加以鑒別。然而，在雜交中使用本發(fā)明的核酸的較長(zhǎng)片段或全序列也是可行的。標(biāo)準(zhǔn)條件根據(jù)所使用的核酸寡聚核苷，較長(zhǎng)片段或全序列，或根據(jù)雜交所用的是RNA還是DNA而變化。例如，DNA∶DNA雜交體的退火溫度比同樣長(zhǎng)度的DNA∶RNA雜交體低10℃。
例如，根據(jù)核酸，標(biāo)準(zhǔn)條件為溫度在42℃到58℃之間，水緩沖液含0.1～5×SSC(1×SSC＝0.15 M NaCl，15 mM檸檬酸鈉，pH7.2)或再加上50％的甲酰胺，如42℃，5×SSC，50％甲酰胺。用于DNA∶DNA雜交體的雜交條件有利地包括0.1×SSC和溫度在20℃到45℃之間，在優(yōu)選情況下溫度在30℃到45℃之間。用于DNA∶RNA雜交體的雜交條件有利地包括0.1×SSC和溫度在30℃到55℃之間，在優(yōu)選情況下溫度在45℃到55℃之間。對(duì)于雜交所提到的溫度為退火溫度，該溫度的示例性計(jì)算所根據(jù)的核酸長(zhǎng)約100核苷，G＋C含量為50％，不含甲酰胺。DNA雜交所用的實(shí)驗(yàn)條件在相關(guān)的遺傳學(xué)教科書中有描述，例如，Sambrook et al.，″Molecular Cloning″，Cold Spring HarborLaboratory，1989，這些條件可根據(jù)技術(shù)人員所知的公式計(jì)算，如根據(jù)該核酸的長(zhǎng)度，雜交體的性質(zhì)或G＋C含量。技術(shù)人員還可在下列教科書中找到進(jìn)一步的雜交信息Ausubel et al.，(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic AcidsHybridizatonA Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford；Brown(ed)，1991，EssentialMolecular BiologyA Pratical Approach.IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建物指的是SEQ ID NO1或其類似物的腈水解酶基因，在有利情況下，該基因功能地連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控信號(hào)以增強(qiáng)表達(dá)。這些調(diào)控序列為，例如，可被誘導(dǎo)物或抑制物結(jié)合并由此而調(diào)控該核酸表達(dá)的序列。除這些新的調(diào)控序列之外，這些序列的天然調(diào)控還可能存在于實(shí)際的結(jié)構(gòu)基因之前，并在適當(dāng)情況下經(jīng)遺傳學(xué)上的修飾以關(guān)閉該天然調(diào)控并且該基因的表達(dá)已被增強(qiáng)。然而，該核酸構(gòu)建物還可具有較簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，即在SEQ ID NO1或其類似物之前并不插入額外的調(diào)控序列并且不缺失該天然啟動(dòng)子及其調(diào)控。作為替代，該天然調(diào)控序列經(jīng)突變以使調(diào)控消失，并且該基因的表達(dá)被增強(qiáng)。在有利情況下，該核算機(jī)構(gòu)體可以額外地含有一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子序列，增強(qiáng)子序列可使該核酸序列表達(dá)的提高成為可能，該序列與啟動(dòng)子功能性地連接。在DNA序列的3’末端插入額外的有益序列是可行的，例如，其它調(diào)控元件或終止子。本發(fā)明的該核酸序列可能在該構(gòu)建物中存在一個(gè)或多個(gè)拷貝。為便于構(gòu)建物的選擇時(shí)，該構(gòu)建物可能還含有進(jìn)一步的標(biāo)記，如抗生素抗性或營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因。
對(duì)于本發(fā)明的方法有利的調(diào)控序列為，例如，在啟動(dòng)子中存在的序列如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL啟動(dòng)子，它們可在革蘭氏陰性菌中有利地使用。進(jìn)一步有利的調(diào)控序列存在于，例如，革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2，真菌或酵母啟動(dòng)子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH。與此聯(lián)系的其它有利的序列為丙酮酸脫羧酶和乙醇氧化酶，它們來(lái)自漢遜酵母屬。使用人工啟動(dòng)子用于調(diào)控也是可行的。
該核酸構(gòu)建物被有利地插入一種載體以用于在宿主機(jī)體中表達(dá)，例如，一種質(zhì)粒，一種噬菌體或其它DNA，該載體可使該基因的最大表達(dá)成為可能。這些載體為本發(fā)明的進(jìn)一步開發(fā)。在大腸桿菌中的適當(dāng)載體的例子有pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11或pBdCI，在鏈霉菌中的適當(dāng)載體的例子有pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽孢桿菌中的適當(dāng)載體的例子有pUB110，pC194或pBD214，在棒狀桿菌中的適當(dāng)載體的例子有pSA77或pAJ667，在酵母中的適當(dāng)載體的例子有2μM，pAG-1，Yep6，Yep13或pEMBLYe23，在植物中的適當(dāng)載體的例子有pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51。所述的載體為可行的質(zhì)粒的一小部分選擇。進(jìn)一步的質(zhì)粒為技術(shù)人員所熟知，它們可見于，例如，Cloning Vectors(eds.Pouwels P.H.et al.Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。
對(duì)于其它存在的基因的表達(dá)，該核酸構(gòu)建物還可有利地含有額外的3’和/或5’終止調(diào)控序列以增強(qiáng)表達(dá)，它們根據(jù)所選用的宿主有機(jī)體和基因而被選出以進(jìn)行最佳的表達(dá)。
這些調(diào)控序列的目的在于使該基因的特異表達(dá)和蛋白的表達(dá)成為可能。這意味著，根據(jù)諸如宿主有機(jī)體這樣的因素，該基因只在誘導(dǎo)后表達(dá)或過(guò)表達(dá)或者被直接表達(dá)和或過(guò)表達(dá)。
進(jìn)一步，該調(diào)控序列或因子可能優(yōu)選地正性影響并因此而增強(qiáng)被誘導(dǎo)基因的表達(dá)。這樣，該調(diào)控元件的增強(qiáng)作用可以有利地在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。然而，通過(guò)諸如提高mRNA的穩(wěn)定性以額外地增強(qiáng)翻譯也是可行的。
在載體的另一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建物或核酸的載體可能被有利地以線性DNA的形式引入微生物體并通過(guò)異源或同源重組而整合入該宿主有機(jī)體的基因組中。該線性DNA可以由一個(gè)線性化載體組成，例如一種質(zhì)粒，或僅僅由該核酸構(gòu)建物或核酸組成。
對(duì)于異源基因在有機(jī)體中的最佳表達(dá)，修飾核酸序列以使其同在該有機(jī)體中所特異使用的密碼子的使用相一致是有益的。密碼子的使用可在對(duì)在相關(guān)有機(jī)體的其它已知基因的計(jì)算機(jī)分析基礎(chǔ)上較容易地確立。
適合于本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)提或核酸的宿主有機(jī)體主要為所有的原核和真核有機(jī)體?？捎欣厥褂玫乃拗饔袡C(jī)體為微生物體，如細(xì)菌，真菌或酵母。使用革蘭氏陰性或革蘭式陽(yáng)性細(xì)菌是有利的，在優(yōu)選情況下為腸細(xì)菌或諾卡氏菌家族的細(xì)菌，特別優(yōu)選的情況下為埃希氏桿菌屬，假單胞菌屬或紅球菌屬的細(xì)菌。非常特別優(yōu)選的情況下為大腸埃希氏桿菌。
本發(fā)明的宿主有機(jī)體進(jìn)一步優(yōu)選地含有至少一種蛋白性質(zhì)的試劑以用于折疊它合成的蛋白并且含有具有本發(fā)明所述的腈水解酶活性的核酸序列和/或編碼該試劑的基因，該試劑的存在量高于所考慮的有機(jī)體中的基礎(chǔ)含量。編碼這以試劑的基因存在于染色體或染色體外元件如質(zhì)粒中。
在第12和13分鐘之間洗脫下腈水解酶。這對(duì)應(yīng)于SDS-PAGE上的37 kDa帶。使用Applied Biosystem 494 Promise蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì)該帶進(jìn)行部分測(cè)序。通過(guò)該途徑獲得39個(gè)氨基酸的N末端序列被稱為后文的SEQ ID NO3。該序列被包含于附加的序列表中，為Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala AlaSer Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile GluLeu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly。5.胰蛋白酶肽的制備來(lái)自Mono Q層析(步驟4)的樣品進(jìn)行如下預(yù)處理以12.5％的TCA沉淀蛋白，以1ml的乙醚/乙醇(1∶1)洗滌沉淀3次。在0.2ml的6M鹽酸胍，25mM Tris/HCl，pH 8.5，溶液中溶解沉淀。2.6μl的1M DTT溶液被加入該溶液以還原二硫橋。該樣品在黑暗中振蕩1小時(shí)。隨后該蛋白同1.5μl的4-乙烯基嘧啶溶液(35％)在黑暗中反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)加入2.6μl的1M DTT溶液溫浴1小時(shí)來(lái)終止反應(yīng)。如上文所述通過(guò)RP-HPLC來(lái)純化vinylpyrrilidated酶。保留時(shí)間現(xiàn)在為10到11分鐘之間。通過(guò)分子量鑒別出的活性組分被收集并濃縮至0.02ml。這一組分可經(jīng)加入0.01ml的乙腈和0.1M，pH 8.5的Tris/HCl調(diào)節(jié)至0.2ml。再加入0.05ml 0.1M的NaOH來(lái)校正pH值。該樣品(蛋白含量約0.3mg)同0.032ml 1mg/ml胰蛋白酶相混合并在37℃下溫浴過(guò)夜，該胰蛋白酶處于0.1M，pH 8.5的Tris/HCl和5％乙腈中。以0.01ml的乙酸終止該消化，隨后進(jìn)行離心。在C18(洗脫系統(tǒng)緩沖液A水，0.1％TFA，緩沖液B乙腈，0.1％TFA)上以RP-HPLC分離該上清。收集肽(在205nm和280nm下檢測(cè))并測(cè)序。使用的是Applied Biosystems 494 Procise蛋白測(cè)序儀。在內(nèi)部的21個(gè)氨基酸的肽序列在后文被稱為SEQ ID NO4，在內(nèi)部的11個(gè)氨基酸的肽序列在后文被稱為SEQ ID NO5。SEQ ID NO4和5被包括在附加的序列表中，它們是SEQ ID NO4Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser ValAla Ile Ser His Pro GlnSEQ ID NO5Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys6.純化的腈水解酶對(duì)苯乙醇腈的活性根據(jù)實(shí)施例2所述探測(cè)了純化的腈水解酶對(duì)苯乙醇腈的活性。純化的腈水解酶對(duì)苯乙醇腈的特異活性為12，380 u/克蛋白。實(shí)施例2從Alcaligenes faecalis 1650中對(duì)腈水解酶的克隆被合成的核苷探針來(lái)自于實(shí)施例1中所描述的肽序列SEQ IDNO3和4。來(lái)自SEQ ID NO3，N末端肽序列的核苷探針是一個(gè)64倍(mal)簡(jiǎn)并的23基體(mer)(在該核苷探針序列中，A，C，G和T被N替代；A或G被R替代；C或G被S替代)。文獻(xiàn)中所描述的產(chǎn)堿桿菌屬菌株中的高比率GC意味著對(duì)于谷氨酸和異亮氨酸，其密碼子第三位的選擇已經(jīng)預(yù)先確定。在后文被稱為SEQ ID NO6的核苷探針是以下的PCR的5’引物，其中S＝C或G并且N＝A，C，G或T，該序列為SEQ ID NO65’-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3’一個(gè)作為核苷探針的256倍簡(jiǎn)并的20基體來(lái)自于SEQ ID NO4，該序列為內(nèi)部的肽序列(在核苷堿基序列中，A，C，G和T被N替代；A或G被R替代；C或G被S替代)。產(chǎn)堿桿菌屬菌株中的高比率GC意味著對(duì)于賴氨酸，其密碼子第三位的選擇已經(jīng)預(yù)先確定。該核苷序列是以下的PCR的3’引物，它在在后文被稱為SEQ ID NO7。SEQ IDNO7被包括在附加的序列表中，它是SEQ ID NO75’-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3’SEQ ID NO6和7這對(duì)引物被用于進(jìn)行對(duì)來(lái)自糞產(chǎn)堿菌1650的染色體的PCR。根據(jù)技術(shù)人員已知的經(jīng)典方法以溶菌酶和蛋白酶處理使細(xì)胞裂解，此后進(jìn)行對(duì)染色體DNA的分離(Ausbel，F(xiàn).M.et al.(1994)Current protocols in molecular biology，John Wiley andSons)。
使用Pwo多聚酶進(jìn)行的PCR包括在95℃下3分鐘；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中在95℃下變性1分鐘，引物在58℃下退火1分30秒，在72℃下多聚化1分30秒；在72℃下5分鐘完成多聚化。
在這些條件下從來(lái)自Alcaligenes faecalis 1650的染色體中擴(kuò)增出了大小約1kb的片段。為克隆該載體，在上述兩個(gè)引物上均附加了一個(gè)XbaI限制性切點(diǎn)和兩個(gè)額外的核苷(5’-AATCTAGA和5’-AATCTAGA)，在上述的條件下重復(fù)PCR反應(yīng)。一個(gè)大小約1kb的片段再一次被擴(kuò)增出來(lái)，該片段經(jīng)純化和XbaI消化后被連接入經(jīng)同樣消化的pUC18。在對(duì)大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化并將所產(chǎn)生的質(zhì)粒進(jìn)行分離之后，該DNA通過(guò)測(cè)序和隨后的基因組Southern印記被純化。用于分離全長(zhǎng)腈水解酶基因(nit)的分子生物學(xué)和微生物學(xué)的方法是技術(shù)人員所已知的經(jīng)典的方法。全長(zhǎng)腈水解酶基因見SEQ ID NO1。實(shí)施例3與其他蛋白的同源性，該同源序列的鑒另同來(lái)自SWISSPROT蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行的比較表明，本發(fā)明的腈水解酶基因同已知的腈水解酶在氨基酸水平上具有11到96％的同源性。這一巨大的序列同源性見于該酶同來(lái)自糞產(chǎn)堿菌JM3的芳基乙腈特異的腈水解酶之間(Nagasawa et al.，Eur.J.Biochem.1990，194，765-772)。在一個(gè)1071bp區(qū)域內(nèi)，這兩種腈水解酶基因在核苷水平上具有93.2％的相同性。所產(chǎn)生的氨基酸序列在一個(gè)356個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)具有96.1％的相同性。最小的相同性為在534個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)具有11.4％的相同性，這見于該基因同來(lái)自RhodococcuSerythropolis SK92的腈水解酶之間。實(shí)施例4腈水解酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)nit基因被擴(kuò)增用以克隆入表達(dá)載體pJOE2702。在該情況下被選中用于PCR的5’引物為上述的SEQ ID NO3，該引物在nit的5’末端附加有一個(gè)與翻譯起始密碼子重疊的NdeI切點(diǎn)。該引物在下文被稱為SEQ ID NO8，它被包括入附加的序列表。被選用的3’引物是nit基因的3’區(qū)域的一個(gè)24基體，該引物在終止密碼子附近添加有一個(gè)BamHI切點(diǎn)。該引物在下文被稱為SEQ ID NO9，它被包括入附加的序列表。
5′-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3′(＝SEQ ID NO8)5′-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3′(＝SEQ ID NO9)使用Pwo多聚酶的PCR包括在94℃下3分鐘；進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中在93℃下變性1分鐘，引物在55℃下退火1分30秒，在72℃下多聚化1分30秒；在72℃下5分鐘完成多聚化。所產(chǎn)生的PCR片段被純化，經(jīng)過(guò)NdeI/BamHI消化并整合入經(jīng)同樣消化的pJOE2702(Volff et al.，1996 Mol.Microbiol.，21(5)，1037-1047)。所產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為pDHE19.2并在圖3中有描述。通過(guò)NdeI/BamHI切點(diǎn)的整合意味著在質(zhì)粒pDHE19.2中該nit基因處于啟動(dòng)子rhap的控制之下，該啟動(dòng)子存在于pJOE2702中并由在大腸桿菌中的正性調(diào)控的L-鼠李糖操縱子rhaBAD起始(Egan & Schleif，1994，J.Mol.Biol.，243，821-829)。nit基因轉(zhuǎn)錄的終止和翻譯的起始同樣通過(guò)載體序列進(jìn)行。另外，該治理含有一個(gè)賦予氨芐青霉素抗性的基因ApR。
通過(guò)含質(zhì)粒pDHE19.2的大腸桿菌JM109菌株表現(xiàn)出腈水解酶的異源表達(dá)。為此目的，在含100μg/ml的氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)菌株JM109(pDHE19.2)。OD600達(dá)到1.7時(shí)，按1∶200將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入新鮮TB培養(yǎng)基并在30℃震蕩培養(yǎng)，該新鮮培養(yǎng)基含用于誘導(dǎo)腈水解酶的0.2％(w/v)的L-鼠李糖。8小時(shí)后收集細(xì)胞，在10mM，pH7.2的Na/K磷酸緩沖液中洗滌，重懸浮于同樣的磷酸緩沖液中至OD600為10，處理后進(jìn)行超聲破碎。實(shí)施例5重組菌株大腸桿菌JM109(pDHE19.2)的腈水解酶的活性的測(cè)定1.細(xì)胞的產(chǎn)生大腸桿菌JM109(pDHE19.2)在含100μg/ml的氨芐青霉素的TB培養(yǎng)集中37℃下震蕩培養(yǎng)6小時(shí)。OD600達(dá)到4時(shí)，用100ml的預(yù)培養(yǎng)物注入含8L新鮮TB培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐，該培養(yǎng)基中含100μg/ml的氨芐青霉素和2g/l的L-鼠李糖。pH值，溫度，空氣流速和攪拌速度為7.2，30℃，300 l/h和400-650rpm。16小時(shí)后收集細(xì)胞。這時(shí)在600nm下的光密度為18，該值對(duì)應(yīng)于7.8g/l的干重細(xì)胞。2.苯乙醇腈的酶活性的測(cè)定如實(shí)施例1所述獲取細(xì)胞，在10mM，pH7.2的Na/K磷酸緩沖液中洗滌。2mg的干重細(xì)胞被重懸浮于1ml的10mM，pH6.8的Na/K磷酸緩沖液中，加入8.3mM苯乙醇腈以起始反應(yīng)。該反應(yīng)在40℃下振蕩進(jìn)行。通過(guò)取樣并隨后以高效液相色譜(ODS Hypersil)來(lái)跟蹤外消旋的拆分動(dòng)力學(xué)。在這一條件下測(cè)定苯乙醇腈，苯甲醛，mandelamide和苯基乙醇酸。苯基乙醇酸的形成速度為403 U每克干重細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率30％，在此1U定義為在40℃下每分鐘形成1μmol苯基乙醇酸。實(shí)施例6使用在懸浮物中的大腸桿菌JM109(pDHE19.2)通過(guò)水解苯乙醇腈而進(jìn)行的R-苯基乙醇酸的合成在10個(gè)小時(shí)的期間內(nèi)測(cè)量1L的10mM，pH6.8的Na/K磷酸緩沖液中的含量為1.3g/l的苯乙醇腈，該溶液含有濃度為2g/l的大腸桿菌JM109(pDHE19.2)，在40℃下以槳式攪拌器進(jìn)行攪拌。測(cè)量根據(jù)腈的消耗來(lái)進(jìn)行。R-苯基乙醇酸的消耗速度按實(shí)施例5中的描述來(lái)跟蹤。結(jié)果見圖4所示。實(shí)施例7通過(guò)從懸浮物中的大腸桿菌JM109(pDHE19.2)進(jìn)行苯乙醇腈水解而產(chǎn)生的反應(yīng)混合物中提取來(lái)分離R-苯基乙醇酸在實(shí)施例6中所獲得的水相苯基乙醇酸反應(yīng)混合物經(jīng)離心來(lái)除去細(xì)胞，以酸調(diào)節(jié)pH值至2并以四丁基醚(MTBE)抽提三次。通過(guò)蒸發(fā)從苯基乙醇酸抽提物中除去有機(jī)溶劑后，所產(chǎn)生的白色苯基乙醇酸晶體被重新溶解并以高效液體色譜檢測(cè)其化學(xué)和旋光純度。該化學(xué)純度為99％，R-苯基乙醇酸的旋光純度為97.4％ee。實(shí)施例8通過(guò)在懸浮物中的大腸桿菌JM109(pDHE19.2)進(jìn)行苯乙醇腈水解而產(chǎn)生的反應(yīng)混合物而進(jìn)行冷卻結(jié)晶來(lái)分離R-苯基乙醇酸在實(shí)施例6中所獲得的水相苯基乙醇酸反應(yīng)混合物經(jīng)離心來(lái)除去細(xì)胞，通過(guò)加熱并攪拌來(lái)將其濃縮至初始體積的40％并且以酸調(diào)節(jié)pH值至2。通過(guò)冰浴使苯基乙醇酸結(jié)晶析出，通過(guò)抽氣濾出所產(chǎn)生的白色晶體并干燥。該晶體被重新溶解并以高效液體色譜檢測(cè)其化學(xué)和旋光純度。該化學(xué)純度為99.1％，R-苯基乙醇酸的旋光純度為99.8％ee。實(shí)施例9各種腈的轉(zhuǎn)化率該大腸桿菌菌株(見實(shí)施例6)或原來(lái)的產(chǎn)堿桿菌菌株被用來(lái)轉(zhuǎn)進(jìn)行培養(yǎng)化各種腈類。該產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞在30℃下在400ml的產(chǎn)堿桿菌培養(yǎng)基中(見上文的培養(yǎng)基A)160rpm培養(yǎng)16小時(shí)(＝h)。離心收集該細(xì)胞(4℃，5000rpm，30分鐘)。向微量滴定板中每孔加入細(xì)胞懸浮物150μl。隨后離心該板。吸去上清并以Na2HPO4(1.42g/l，溶于finnaqua中，pH 7.2)洗滌細(xì)胞沉淀兩次。加入底物溶液(150μl)并重懸浮細(xì)胞。向微量滴定板每排12孔加入一種底物。只有底物而無(wú)細(xì)胞的一排被用作參照(＝空白)。
該微量滴定板被置于振蕩溫浴器，在200rpm和30℃下2小時(shí)。隨后離心沉淀細(xì)胞并使用Biomek儀器來(lái)測(cè)定上清中產(chǎn)生的NH4的量。測(cè)量在620nm下使用以各種NH4OH溶液構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)圖來(lái)進(jìn)行(見圖5)。所用的底物為苯乙醇腈(＝1)，2-苯基丙腈(＝2)，2-苯基丁腈(＝3)，苯乙腈化物(＝4)，4-氯苯乙腈化物(＝5)，4-溴苯乙腈化物(＝6)，丙腈(＝7)，2-甲基丁腈(＝8，2-氰基丁烷)，geranonitrile(＝9)，valeronitrile(＝10)，3-氰基吡啶(＝11)，3-二苯基-2-羥基丁腈(＝12)，4-氟苯基氰化物(＝13，4-氟苯甲基乙腈(acetronitrile))和α-(3-庚酸)-硝基-三乙腈(＝14)。每種底物均制成在甲醇中的0.2摩爾的儲(chǔ)存溶液，該溶液被以Na2HPO4(1.42g/l，溶于finnaqua中，pH 7.2)稀釋至10mM。該細(xì)胞懸浮物經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化至2g每升干生物物質(zhì)。袁II所示為微量滴定板中一排的轉(zhuǎn)化平均值。
表II腈水解酶1650對(duì)各種腈類的轉(zhuǎn)化率
圖6所示為作為活性的轉(zhuǎn)化的結(jié)果序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱BASF Aktiengesellschaft(B)街道Car-Bosch-strasse 38(C)城市Ludwigshafen(D)州/省/邦Rheinland Palatinate(E)國(guó)家德意志聯(lián)邦共和國(guó)(F)郵編D-67056(ii)申請(qǐng)題目一種通過(guò)使用腈水解酶或含有腈水解酶的微生物來(lái)從腈類物質(zhì)中制備手性羧酸的方法(iii)序列數(shù)9(iv)機(jī)讀格式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1071個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vi)說(shuō)明
(A)NAME/KEYCDS(B)位置1…1071(vii)序列描述SEQ ID NO1ATG CAG ACA AGA AAA ATC GTC CGG GCA GCC GCC GTA CAG GCC GCC TCT48Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser15 10 15CCC AAC TAC GAT CTG GCA ACG GGT GTT GAT AAA ACC ATT GAG CTG GCT96Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala20 25 30CGT CAG GCC CGC GAT GAG GGC TGT GAC CTG ATC GTG TTT GGT GAA ACC144Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr35 40 45TGG CTG CCC GGA TAT CCC TTC CAC GTC TGG CTG GGC GCA CCG GCC TGG 192Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp50 55 60TCG CTG AAA TAC AGT GCC CGC TAC TAT GCC AAC TCG CTC TCG CTG GAC 240Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp65 70 75 80AGT GCA GAG TTT CAA CGC ATT GCC CAG GCC GCA CGG ACC TTG GGT ATT288Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile85 90 95TTC ATC GCA CTG GGT TAT AGC GAG CGC AGC GGC GGC AGC CTT TAC CTG336Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu100 105 110GGC CAA TGC CTG ATC GAC GAC AAG GGC GAG ATG CTG TGG TCG CGT CGC384Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg115 120 125AAA CTC AAA CCC ACG CAT GTA GAG CGC ACC GTA TTT GGT GAA GGT TAT432Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr130 135 140GCC CGT GAT CTG ATT GTG TCC GAC ACA GAA CTG GGA CGC GTC GGT GCT480Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala145150 155 160CTA TGC TGC TGG GAG CAT TTG TCG CCC TTG AGC AAG TAC GCG CTG TAC528Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr165 170 175TCC CAG CAT GAA GCC ATT CAC ATT GCT GCC TGG CCG TCG TTT TCG CTA576Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu180 185 190TAC AGC GAA CAG GCC CAC GCC CTC AGT GCC AAG GTG AAC ATG GCT GCC624Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala195 200 205TCG CAA ATC TAT TCG GTT GAA GGC CAG TGC TTT ACC ATC GCC GCC AGC672Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser210 215220AGT GTG GTC ACC CAA GAG ACG CTA GAC ATG CTG GAA GTG GGT GAA CAC720Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His225 230 235 240AAC GCC CCC TTG CTG AAA GTG GGC GGC GGC AGT TCC ATG ATT TTT GCG768Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala245 250 255CCG GAC GGA CGC ACA CTG GCT CCC TAC CTG CCT CAC GAT GCC GAG GGC816Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His ASp Ala Glu Gly260 265 270TTG ATC ATT GCC GAT CTG AAT ATG GAG GAG ATT GCC TTC GCC AAA GCG864Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala275 280 285ATC AAT GAC CCC GTA GGC CAC TAT TCC AAA CCC GAG GCC ACC CGT CTG912Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu290 295 300GTG CTG GAC TTG GGG CAC CGA GAC CCC ATG ACT CGG GTG CAC TCC AAA960Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys305 310 315 320AGC GTG ACC AGG GAA GAG GCT CCC GAG CAA GGT GTG CAA AGC AAG ATT 1008Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile325 330 335GCC TCA GTC GCT ATC AGC CAT CCA CAG GAC TCG GAC ACA CTG CTA GTG 1056Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val340 345 350CAA GAG CCG TCT TGA 1071Gln Glu Pro Ser355(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度365個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 5 10 15Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala20 25 30Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr35 40 45Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp50 55 60Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp65 70 75 80Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile85 90 95Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu100 105 110Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg115 120 125Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Ty130 135 140Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala145 150 155 160Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr165 170 175Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu180 185 190Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala195 200 205Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser210 215 220Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His225 230 235 240ASh Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala245 250 255Pro ASp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly260 265 270Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala275 280 285Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu290 295 300Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys305 310 315 320Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile325 330 335Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val340 345 350Gln Glu Pro Ser355(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)構(gòu)型線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)片段類型N-末端(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vii)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 510 15Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala20 25 30Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly35(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)構(gòu)型線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vii)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xii)序列描述SEQ ID NO4Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala1 5 10 15Ile Ser His Pro Gln20(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)構(gòu)型線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vii)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xiii)序列描述SEQ ID NO5Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys1 510(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vi)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xi)序列描述SEQ ID NO6ATGCAGACNA GNAARATCGT SCG23(8)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vi)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xii)序列描述SEQ ID NO7TNGCSACNGA NGCRATCTTG 20(9)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vi)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xiii)序列描述SEQ ID NO8TTAATCATAT GCAGACAAGA AAAATCGTCC G31(10)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義非(v)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞產(chǎn)堿菌(B)菌株1650(vi)直接來(lái)源(B)克隆腈水解酶(xiv)序列描述SEQ ID NO9AAGGATCCTC AAGACGGCTCTTGCACTAGC AG 3權(quán)利要求
1.一種被分離的核酸序列，該序列編碼一種具有腈水解酶活性的多肽，該核酸序列選自以下群體a)一個(gè)核酸序列，該序列具有在SEQ ID NO1中所描述的序列，b)一些核酸序列，它們衍生自SEQ ID NO1所描述的序列，使遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，c)SEQ ID NO1所描述的核酸序列的衍生體，這些衍生體編碼的多肽具有在SEQ ID NO2中所描述的氨基酸序列并且在氨基酸水平上具有至少95％的同源性，這些多肽在酶活性上沒有實(shí)質(zhì)性降低。
2.一個(gè)氨基酸序列，該序列由權(quán)利要求1中所要求的核酸序列編碼。
3.權(quán)利要求2所要求的氨基酸序列，該序列由SEQ ID NO1所描述的序列編碼。
4.一種核酸構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有權(quán)利要求1所要求的核酸序列，該核酸序列被連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控信號(hào)。
5.一種載體，該載體含有權(quán)利要求1所要求的核酸序列或權(quán)利要求4所要求的核酸構(gòu)建物。
6.一種微生物體，該微生物體含有至少一種權(quán)利要求1所要求的核酸序列或至少一種權(quán)利要求4所要求的核酸構(gòu)建物。
7.一種權(quán)利要求6所要求的微生物體，其中該微生物體是埃希氏菌屬、假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬的細(xì)菌。
8.一種方法，該方法用于制備手性羧酸，該羧酸具通式I 該方法包括轉(zhuǎn)化具通式II的外消旋腈 該轉(zhuǎn)化在權(quán)利要求2或3所要求的氨基酸序列存在或存在生長(zhǎng)中的、休眠的或破碎的權(quán)利要求6或7所要求的微生物體的情況下進(jìn)行，其中每毫克蛋白或者每克干重每小時(shí)至少將25mmol腈轉(zhuǎn)化成為手性羧酸，其中通式I和II重的取代基和變量具有以下的意義*一個(gè)旋光活性中心R1，R2，R3各自獨(dú)立地為氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，雜芳基，OR4或NR4R5，其中基團(tuán)R1，R2，R3總是各不相同，R4氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，雜芳基或雜芳基羰基，R5氫，取代或未取代的及分支或無(wú)分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，芳基或雜芳基。
9.權(quán)利要求8所要求的方法，其中取代基R1，R2，R3之一為R4。
10.權(quán)利要求8或9任一所要求的方法，其中取代基R1，R2，R3之一為芳基。
11.權(quán)利要求8到10任一所要求的方法，其方法在一種含水反應(yīng)溶液中進(jìn)行，pH值在4到11之間。
12.權(quán)利要求8到11任一所要求的方法，其中重量比為0.01～10％的腈或者重量比為0.01～10％的相應(yīng)的醛或酮或重量比為0.01～10％的氰氫酸在該方法中被轉(zhuǎn)化。
13.權(quán)利要求8到12任一所要求的方法，其方法在溫度0℃至80℃之間進(jìn)行。
14.權(quán)利要求8到13任一所要求的方法，其中該手性羧酸從反應(yīng)溶液中通過(guò)提取或結(jié)晶或提取和結(jié)晶來(lái)分離，產(chǎn)率從60到100％。
15.權(quán)利要求8到14任一所要求的方法，其中該手性羧酸所具有的旋光純度至少為90％ee。
全文摘要
本發(fā)明涉及到編碼具腈水解酶活性的多肽的核酸序列,含有該核酸序列的核酸構(gòu)建物以及含有該核酸序列或該核酸構(gòu)建物的載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到被該核酸序列所編碼的氨基酸序列,以及含有該核酸序列、該核酸構(gòu)建物或含有該核酸序列或該核酸構(gòu)建物的載體的微生物。本發(fā)明還涉及到從外消旋的腈類物質(zhì)中制備手性羧酸的方法。
文檔編號(hào)C12N9/78GK1331743SQ99814765
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期1999年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月19日
發(fā)明者M·雷斯-萊施克, T·弗里德里希, B·豪爾, R·馬特斯, D·恩格爾斯 申請(qǐng)人:Basf公司