專(zhuān)利名稱(chēng)：犬細(xì)小病毒的pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病的診斷技術(shù)，涉及對(duì)犬的犬細(xì)小病毒的檢測(cè)方法。
犬細(xì)小病毒(CPV)是犬的一種烈性傳染病。臨床表現(xiàn)以急性出血性腸炎和非化膿性心肌炎為特征。對(duì)于犬細(xì)小病毒的檢測(cè)方法，目前主要有病毒分離培養(yǎng)、電鏡和免疫電鏡技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)等。但這些方法均存在一些缺點(diǎn)和不足。病毒分離培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，還需要必要的實(shí)驗(yàn)室條件；電鏡和免疫電鏡技術(shù)需昂貴的儀器設(shè)備；熒光抗體技術(shù)僅局限于檢測(cè)病理組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)除敏感性不高外，還易受干擾因素的影響；血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)需隨時(shí)準(zhǔn)備新鮮的敏感紅細(xì)胞，送檢糞樣稀釋倍數(shù)低時(shí)，含有非特異性凝集素，還需做血凝抑制試驗(yàn)加以驗(yàn)證。PCR是一種具有敏感性高、特異性強(qiáng)的靶DNA快速檢測(cè)方法，標(biāo)本中含有痕量CPV-DNA就能檢出。目前雖已有對(duì)犬CPV的PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，但未形成完整的試劑盒檢測(cè)技術(shù)，其樣品處理過(guò)程復(fù)雜且需要時(shí)間長(zhǎng)，循環(huán)條件沒(méi)有得到最佳優(yōu)化。
本發(fā)明的目的是提出一種以PCR試劑盒檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的犬細(xì)小病毒的PCR檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)犬細(xì)小病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確、快速的標(biāo)準(zhǔn)化。
本發(fā)明所建立的犬細(xì)小病毒的PCR檢測(cè)方法包括以下內(nèi)容(一)設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括(1)PCR試劑管，試劑管內(nèi)含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，所述的引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)陽(yáng)性對(duì)照，該對(duì)照為經(jīng)CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細(xì)小病毒DNA模板；(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為不含犬細(xì)小病毒并經(jīng)熱處理的糞樣；(4)Taq酶；(5)普通瓊脂糖；(6)溴化乙錠溶液；(7)溴酚蘭上樣緩沖液；(二)按照以下操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理糞樣+滅菌生理鹽水或PBS(PH7.2)，充分振蕩后，離心去沉淀，取上清放入另一支滅菌離心管中，隔水煮沸使蛋白質(zhì)變性，放入冰水降溫后離心去沉淀，吸取上清放入另一離心管中保存?zhèn)溆茫?2)PCR在PCR試劑管中加入經(jīng)稀釋的樣品，同時(shí)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照，稍離心，94～96℃變性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍離心混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)循環(huán)條件采用降落(TD)PCR程序，一般操作不少于20循環(huán)；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析將瓊脂糖溶于電泳緩沖液，把溫?zé)崮z倒入放好梳子的膠膜中，凝膠凝固后，移去梳子，將凝膠放入有電泳緩沖液的電泳槽，將樣品擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚蘭上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內(nèi)，蓋上電泳槽并通電60～100V恒壓電泳，使DNA向陽(yáng)極方向移動(dòng)，電泳完成后，切斷電源，取出凝膠，將此凝膠經(jīng)溴化乙錠溶液浸泡后取出，放在透射紫外燈下觀察，將樣品孔出現(xiàn)的電泳帶比對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以判定樣品為犬細(xì)小病毒陽(yáng)性或陰性。
本發(fā)明所設(shè)置的PCR檢測(cè)試劑盒，一般可采用以下配置(1)PCR試劑管，試劑管內(nèi)含10×buffer1.5～2.5μl，2.5mMdNTP1.5～3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.3～0.6μl，25mM MgCl20.6μl；(2)陽(yáng)性對(duì)照，該對(duì)照為經(jīng)CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細(xì)小病毒DNA模板；(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為不含犬細(xì)小病毒并經(jīng)熱處理的糞樣；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通瓊脂糖0.8g；(6)10μg/μl溴化乙錠溶液1ml；(7)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
本發(fā)明在設(shè)計(jì)特異引物并成功建立犬細(xì)小病毒PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研制成簡(jiǎn)單快速敏感的PCR檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)化了試劑配制和樣品制備時(shí)間，并首次采用降落PCR程序進(jìn)行反應(yīng)，提高了本試劑盒的特異性和敏感性。本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是建立起一套標(biāo)準(zhǔn)方法，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出供檢樣品中的CPV，可應(yīng)用于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，也為寵物犬和軍犬、肉用犬等各種犬的疾病診斷提供簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的方法。
以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明1、試劑盒的組成(1)PCR試劑管，試劑管內(nèi)含10×buffer 2μl，2.5mMdNTP 3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.5μl，25mM MgCl20.6μl，用滅菌三蒸水補(bǔ)至15μl，其中引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)陽(yáng)性對(duì)照，該對(duì)照為經(jīng)CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細(xì)小病毒DNA模板；(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為不含犬細(xì)小病毒并經(jīng)熱處理的糞樣；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通瓊脂糖0.8g，可配成100ml；(6)10μg/μl溴化乙錠溶液1ml，可配成終濃度為0.5μg/ml；(7)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
2、試劑盒檢測(cè)操作規(guī)程取被測(cè)糞樣50μl放入滅菌離心管中，加50μl PBS(pH7.2)，充分振蕩后，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；取上清放入另一支滅菌離心管中，隔水煮沸10分鐘，放入冰水中5分鐘后，10000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，將上清按1/20稀釋后取2μl加入PCR試劑管中，同時(shí)取2μl陰陽(yáng)對(duì)照分別加入另外兩支PCR試劑管中，每管再補(bǔ)3μl滅菌無(wú)離子水；稍離心后，96℃變性10分鐘，取出每管加入Taq酶0.3μl，稍離心混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)循環(huán)條件采用降落(TD)PCR程序94℃2分鐘，退火溫度從58℃開(kāi)始，逐步降至48℃，每2個(gè)循環(huán)降低1℃，退火時(shí)間1分鐘，72℃30秒，如此進(jìn)行22個(gè)循環(huán)，再94℃2分鐘，55℃1分鐘，72℃30秒進(jìn)行10循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；將樣品擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入電泳槽中凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)；100V恒壓電泳，電泳完成后，切斷電源，取出凝膠，將此凝膠浸泡在含溴化乙錠溶液中，5～7分鐘后取出，放在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔出現(xiàn)和陽(yáng)性對(duì)照同樣的電泳帶，而陰性對(duì)照無(wú)相同帶出現(xiàn)，則判此樣品為犬細(xì)小病毒陽(yáng)性，否則為陰性。
權(quán)利要求
1．一種犬細(xì)小病毒的PCR檢測(cè)方法，其特征在于(一)設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括(1)PCR試劑管，試劑管內(nèi)含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，所述的引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)陽(yáng)性對(duì)照，該對(duì)照為經(jīng)CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細(xì)小病毒DNA模板；(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為不含犬細(xì)小病毒并經(jīng)熱處理的糞樣；(4)Taq酶；(5)普通瓊脂糖；(6)溴化乙錠溶液；(7)溴酚蘭上樣緩沖液；(二)按照以下操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)；(1)樣品處理糞樣+滅菌生理鹽水或PBS(PH7.2)，充分振蕩后，離心去沉淀，取上清放入另一支滅菌離心管中，隔水煮沸使蛋白質(zhì)變性，放入冰水降溫后離心去沉淀，吸取上清放入另一離心管中保存?zhèn)溆茫?2)PCR在PCR試劑管中加入經(jīng)稀釋的樣品，同時(shí)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照，稍離心，94～96℃變性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍離心混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)循環(huán)條件采用降落(TD)PCR程序；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析將瓊脂糖溶于電泳緩沖液，把溫?zé)崮z倒入放好梳子的膠膜中，凝膠凝固后，移去梳子，將凝膠放入有電泳緩沖液的電泳槽，將樣品擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚蘭上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內(nèi)，蓋上電泳槽并通電60～100V恒壓電泳，使DNA向陽(yáng)極方向移動(dòng)，電泳完成后，切斷電源，取出凝膠，將此凝膠經(jīng)溴化乙錠溶液浸泡后取出，放在透射紫外燈下觀察，將樣品孔出現(xiàn)的電泳帶比對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以判定樣品為犬細(xì)小病毒陽(yáng)性或陰性。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬細(xì)小病毒的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述的PCR檢測(cè)試劑盒包括(1)PCR試劑管，試劑管內(nèi)含10×buffer1.5～2.5μl，2.5mMdNTP1.5～3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.3～0.6μl，25mM MgCl20.6μl；(2)陽(yáng)性對(duì)照，該對(duì)照為經(jīng)CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細(xì)小病毒DNA模板；(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為不含犬細(xì)小病毒并經(jīng)熱處理的糞樣；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通瓊脂糖0.8g；(6)10μg/μl溴化乙錠溶液1ml；(7)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬細(xì)小病毒的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的PCR反應(yīng)循環(huán)條件為采用降落(TD)PCR程序，不少于20循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種犬細(xì)小病毒的PCR檢測(cè)方法,本發(fā)明的內(nèi)容包括一套由PCR試劑管、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、Taq酶、普通瓊脂糖、溴化乙錠溶液、溴酚蘭上樣緩沖液組成的PCR檢測(cè)試劑盒以及一套檢測(cè)操作程序。本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是建立起一套標(biāo)準(zhǔn)方法,可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出供檢樣品中的犬細(xì)小病毒,可應(yīng)用于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬的質(zhì)量監(jiān)測(cè),也為寵物犬和軍犬、肉用犬等各種犬的疾病診斷提供簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1298025SQ9911726
公開(kāi)日2001年6月6日 申請(qǐng)日期1999年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月2日
發(fā)明者劉忠華, 鐘翎 申請(qǐng)人:廣東省昆蟲(chóng)研究所