專利名稱：重組人源錳超氧化物歧化酶制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人源錳超氧化物歧化酶(rhMnSOD)的制備工藝。
超氧化物歧化酶(SOD)主要有防衰老、抗炎、防輻射三大功能，可廣泛用于化妝品、保健品、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。
目前國內(nèi)生產(chǎn)的SOD主要從天然生物體中提取。如中國專利申請?zhí)?2105141、93103774、93103820公開說明了提取天然生物體SOD的方法。由于血制品SOD存在外源感染的危險(xiǎn)性和非人源制品SOD用于人體有抗原性，在醫(yī)療領(lǐng)域中很難發(fā)揮其應(yīng)有的作用?，F(xiàn)在雖然能從人血紅細(xì)胞中制備天然的人銅鋅SOD，但是由于人血來源困難，而且人血制品SOD還有外源感染的危險(xiǎn)性(如，愛滋病毒、肝炎病毒等)，因此不易推廣使用；而動物血SOD(同樣有外源感染的危險(xiǎn)性)和其它生物制品SOD對人體有抗原性，在醫(yī)用上受到限制。本發(fā)明專利發(fā)明人于97年中清的發(fā)明專利《重組人源銅鋅超氧化物歧化酶制備工藝》(專利申請?zhí)?7103939.9)雖然克服了從生物體中提取SOD的許多不足和人源來源問題，但是作為“銅鋅超氧化物歧化酶”，其本身半衰期只有4～10分鐘，這導(dǎo)致了在以后的臨床應(yīng)用中用藥量會很大，因此造成腎毒性等副作用。
本發(fā)明的目的是“重組人源錳S0D”的半衰期在6小時(shí)以上，大大超過“重組人源銅鋅SOD”的半衰期。因此，本發(fā)明提供了一種半衰期長，更符合實(shí)際應(yīng)用的“重組人源錳SOD”制備工藝，作為直接用于人體的藥物可更好地發(fā)揮其預(yù)防、治療作用。
本發(fā)明目的實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案要點(diǎn)是(1)挑取工程菌的單菌落接種在裝有含LB培養(yǎng)基的搖瓶中，32℃振蕩培養(yǎng)到OD600=0.5～0.8，轉(zhuǎn)入裝有含錳鹽培養(yǎng)基的搖瓶中，32℃培養(yǎng)約10小時(shí)，再經(jīng)42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2～4小時(shí)后收集菌體。
(2)取菌體，用PH8.0,50mMTrisHCL-1mMEDTA-100mMNaCl(TES緩沖液)洗兩遍，沉淀懸于0.2倍原體積50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)，4℃超聲破菌，60℃加熱30～60分鐘，離心取上清，4℃超濾濃縮至原體積的1％～5％，加30～50倍濃縮液體積2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)繼續(xù)超濾濃縮至原體積的1％～3％。
(3)DE-52柱層析將超濾平衡的溶液加在經(jīng)2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)平衡好的DE-52柱上，先用2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)洗下雜蛋白，再用20mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)洗脫。
(4)CM-52柱層析收集含hMnSOD部分，先用40mM醋酸鉀緩沖液(PH5.5)超濾后上柱，再用醋酸鉀梯度洗脫，超濾濃縮，脫鹽，冷凍干燥。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于錳SOD半衰期大大超過銅鋅SOD，且所獲錳SOD為可溶性蛋白，無需蛋白復(fù)性。因此產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、工藝簡化、單位成本低、更符合臨床應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例1．?dāng)U增工程菌挑取工程菌(MnSOD/PRT/POP2136)的單菌落接種在含LB擴(kuò)增培養(yǎng)基(每升含蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉5g，硫胺素1mg，四環(huán)素20mg)的搖瓶中，32℃振蕩培養(yǎng)10小時(shí)到0D600=0.7，轉(zhuǎn)入6個(gè)含100ml LB培養(yǎng)基(LB擴(kuò)增培養(yǎng)基含0.6mM硫酸錳)的搖瓶中，32℃培養(yǎng)10小時(shí)，42℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，離心收集菌體。
2．表達(dá)產(chǎn)物抽提取濕菌體6g，用PH8.0,50mMTrisHCL-1mMEDTA-100mMNaCl(TES緩沖液)洗兩遍，沉淀懸于120ml 50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8),4℃下超聲破菌60秒1～2次，待菌體破裂，加PMSF到2mM,60℃加熱40分鐘，4℃以10000rpm離心10分鐘，收集上清，4℃超濾濃縮至10ml,加100ml,2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)繼續(xù)超濾濃縮二遍。
3．表達(dá)產(chǎn)物純化用2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)充分平衡好DE-52柱后，上樣，先用2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)洗下雜蛋白，再用20mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)洗脫。收集含hMnSOD部分，用100ml，40mM醋酸鉀緩沖液(PH5.5)超濾至2m1，加100ml,40mM醋酸鉀緩沖液(PH5.5)超濾平衡，上樣到預(yù)先用40mM醋酸鉀緩沖液(PH5.5)充分平衡好的CM-52柱，用醋酸鉀梯度洗脫，超濾濃縮，脫鹽，冷凍干燥，獲得rhMnSOD 36毫克，比活性3200單位/毫克(NBT法)。
權(quán)利要求
1．一種重組人源錳超氧化物歧化酶的制備工藝，其特征是(1)挑取工程菌的單菌落接種在裝有含LB培養(yǎng)基的搖瓶中，32℃振蕩培養(yǎng)到OD600=0.5～0.8，轉(zhuǎn)入裝有含錳鹽培養(yǎng)基的搖瓶中，32℃培養(yǎng)約10小時(shí)，再經(jīng)42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2～4小時(shí)收集菌體；(2)取菌體，用PH8.0,50mMTrisHCL-1mMEDTA-100mMNaCl(TES緩沖液)洗兩遍，沉淀懸于0.2倍原體積50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)中，4℃超聲破菌，60℃加熱30～60分鐘，離心取上清，4℃超濾濃縮至原體積的1％～5％，加30～50倍濃縮液體積2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)繼續(xù)超濾濃縮至原體積的1％～3％；(3)DE-52柱層析將超濾平衡過的溶液加在經(jīng)2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)平衡好的DE-52柱上，先用2mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)洗下雜蛋白，再用20mM磷酸鉀緩沖液(PH7.8)洗脫；(4)CM-52柱層析收集含hMnSOD部分，先用40mM醋酸鉀緩沖液(PH5.5)超濾，上柱，再用醋酸鉀梯度洗脫，超濾濃縮，脫鹽，冷凍干燥。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備工藝，其特征是蛋白獲得率為5～10毫克/克菌。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備工藝，其特征是復(fù)性蛋白比活性為3000～3500單位/毫克(NBT法)。
全文摘要
一種重組人源錳超氧化物歧化酶的制備工藝,本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,其特點(diǎn)是先進(jìn)行工程菌擴(kuò)增,收集菌體,然后將菌體裂解,加熱處理后離心取可溶部分,經(jīng)離子交換柱層析純化。本發(fā)明具有工藝流程簡便、SOD半衰期長、質(zhì)量穩(wěn)定、單位成本低等特點(diǎn),產(chǎn)品不僅可用于化妝品、保健品等民用領(lǐng)域,更適用于醫(yī)療領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/08GK1210146SQ9811147
公開日1999年3月10日 申請日期1998年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月25日
發(fā)明者徐垚, 徐憤, 費(fèi)如珍 申請人:徐垚, 徐憤, 費(fèi)如珍