專利名稱：節(jié)桿菌及其在礦物燃料脫硫中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠選擇性地打開含碳物中存在的硫化有機(jī)分子的C-S鍵的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)菌株及其在從礦物燃料中脫除有機(jī)硫的方法中的應(yīng)用。
礦物燃料是指原油及其餾分、石油餾出物、石油蒸餾的殘余物等等。
目前眾所周知的是，使用硫含量高的礦物燃料是酸雨現(xiàn)象的主要原因，而酸雨時(shí)常造成極其嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。為此，在北美、歐洲和日本已存在或?qū)l(fā)布的法規(guī)趨向于盡可能限制硫含量高的礦物燃料的使用。例如，在美國(guó)，環(huán)境保護(hù)局(EPA)要求自1994年起柴油機(jī)燃料中硫的百分比要從0.27％降至低于0.05％。
另外，EEC法規(guī)也要求依照美國(guó)已施行的規(guī)定降低硫含量。北歐國(guó)家(瑞典和芬蘭)實(shí)行更為嚴(yán)格的限制。
很明顯，能達(dá)到這些新規(guī)定的礦物燃料將被迅速耗盡，而探尋在礦物燃料最終使用前從其中脫除硫的高效、經(jīng)濟(jì)的技術(shù)將很有必要。
實(shí)際上，原油以及石油餾分和各種石油產(chǎn)品往往含有大量的硫。例如，原油中存在0.025-5％的硫而重餾分中硫含量也達(dá)10％。原油中存在少量的元素硫、硫酸鹽和硫化氫形式的硫，而硫主要以各種取代的硫醚、硫醇、噻吩、苯并和硫芴形式存在于有機(jī)基體中。具體地說(shuō)，在象Texas石油這樣的一些粗制品中，大約70％的硫是以硫芴(DBT)及其烷基衍生物的形式存在的。
雖然可以用物化處理法很容易地脫除無(wú)機(jī)硫化合物，但脫除有機(jī)硫卻是一個(gè)大問(wèn)題。
目前采用的常規(guī)的石油工業(yè)脫硫法是使用加氫脫硫技術(shù)(HDS)，該技術(shù)的要點(diǎn)是通過(guò)在高壓、高溫和存在金屬催化劑的條件下將氫與燃料反應(yīng)來(lái)把C-S鍵還原為硫化氫(H2S)。雖然對(duì)所謂不穩(wěn)定化合物的脫硫而言HDS法似乎不會(huì)產(chǎn)生技術(shù)上的問(wèn)題，但是，由于帶有含雜原子的芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子(難裂化分子)的加氫脫硫困難而使進(jìn)一步分離受阻，反之亦然。這些難裂化分子通常需要加氫脫硫(Deep HDS)的操作條件，這些操作條件非常劇烈，造成大量烴類的降解。此外，石油中的高濃度重金屬限制了加氫脫硫的應(yīng)用，這是因?yàn)橄笕藗円阎哪菢?，重金屬使該方法中所用的催化劑中毒。由于煉制過(guò)程中硫化化合物的濃度和重金屬的濃度都增加，從殘余燃料油中脫除有機(jī)硫的問(wèn)題更難解決。為此，這些已知方法不是解決這個(gè)問(wèn)題的可接受的方案。
這闡明了為什么過(guò)去五十多年來(lái)對(duì)預(yù)燃燒期間用微生物脫除燃料中存在的有機(jī)硫化化合物的可能性進(jìn)行大量研究的原因。
文獻(xiàn)中描述了脫除有機(jī)硫的許多方法，這些方法基于使用厭氧硫酸鹽還原微生物(導(dǎo)致H2S的產(chǎn)生)和好氧氧化微生物(導(dǎo)致象硫酸鹽和硫酸這樣的水溶性無(wú)機(jī)形式的形成)。大多數(shù)好氧微生物采用Kodama所述代謝途徑將作為模型分子的硫芴(DBT)降解(Agr.Biol.Chem，34，1320，(1970))。
按照這種代謝作用，DBT從一個(gè)苯環(huán)開始分解，得到苯并噻吩衍生物，因此分子中仍含有硫。盡管用水提取(由于其水溶性)來(lái)脫除該化合物在技術(shù)上是可能的，但考慮到因脫除DBT和類似DBT的化合物的含碳結(jié)構(gòu)而造成的能量損失，涉及用這些微生物處理石油、再脫除含硫的水溶性產(chǎn)品的脫硫方法將會(huì)成本太高。
如果使該代謝進(jìn)行到起始硫化分子的完全降解，將得到類似結(jié)果。
本領(lǐng)域中已描述了一些微生物，這些微生物通過(guò)代謝途徑(也稱4S途徑，亞砜-砜-磺酸鹽-硫酸鹽)從硫芴中脫除硫。已證實(shí)這種途徑對(duì)脫硫具有特異性，因?yàn)樵撏緩綇腄BT中脫除硫，使含碳結(jié)構(gòu)不受破壞而積累2-羥基聯(lián)苯(

圖1)。
例如，Kilbane等人已描述了一種玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)菌株的分離，該菌株采用代謝“4S”途徑從硫芴中脫除硫，產(chǎn)生2-羥基聯(lián)苯(U.S.5.358.870，U.S.5.132.219，PCT/US92/01868，EP0 445896A2)。
但用這種微生物進(jìn)行操作時(shí)，有必要使用表面活性劑以保持石油產(chǎn)品與微生物懸浮液的密切接觸。這些試劑的采用以及工藝總成本的大幅度提高造成后繼相分離步驟的的巨大困難。
采用這種微生物的方法通常是這樣進(jìn)行的1.在碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物存在下進(jìn)行微生物發(fā)酵；2.從培養(yǎng)基中分離生物量；3.采用該生物量作為脫硫反應(yīng)的催化劑，該反應(yīng)是在完全混合反應(yīng)器中、有大量水存在下(以油的體積計(jì)，至少為1∶1)進(jìn)行的；4.用適宜設(shè)備進(jìn)行構(gòu)成反應(yīng)部分的各相的分離；5.在洗出和補(bǔ)入一定量之后，將由催化劑組成的漿相循環(huán)回脫硫反應(yīng)器以維持催化性能恒定；6.過(guò)濾水相以使催化劑回收達(dá)最大；7.在出口處向水流中加入鈣鹽(生石灰或熟石灰)或銨鹽(氫氧離子)，使硫氧化所得到的硫酸鹽得以脫除；(使用銨離子可預(yù)知溶液的濃度，以使硫酸銨由于其高溶解性而得以分離)；以及8.采用高效分離器(靜電分離器)從脫硫油相中脫除水。
這些已知技術(shù)的方法具有如下的主要缺點(diǎn)——采用大量水以利于生物催化劑的性能(該催化劑在占優(yōu)勢(shì)的含水環(huán)境中發(fā)揮其活性)；——在反應(yīng)混合物中采用高濃度的表面活性劑(0.5％)以便于油相在水相中的分散并且有助于基質(zhì)向生物催化劑中的遷移現(xiàn)象；——在生物反應(yīng)器出口處采用相分離用的高效設(shè)備以分散用表面活性劑所產(chǎn)生的乳狀液；——掩埋所產(chǎn)生的硫酸鈣而造成的高處理成本或者必須用工業(yè)方法處理另外產(chǎn)生的硫酸銨的必要性；——將硫酸鹽大體上循環(huán)回脫硫反應(yīng)器(20℃下硫酸鈣的溶解度為0.2/100g，而硫酸銨是易溶的)，可能引起產(chǎn)物抑制。
文獻(xiàn)中描述了一種短桿菌屬(Brevibacterium)菌株DO(VanAfferden等，Arch.Microbiol.，153324-328，1990)，該菌株沿“4S”途徑經(jīng)前三個(gè)步驟，達(dá)到DBT的完全礦化，進(jìn)行另外一個(gè)代謝步驟，該步驟按圖2所示圖形導(dǎo)致苯甲酸鹽的產(chǎn)生。
最近，Grossman等已描述了一種生物脫硫方法，該方法基于采用能夠從BDT和4，6-二乙基硫芴中脫除硫的節(jié)桿菌屬菌株(CA2097217；Appl.and Envirom.Microbiol.，614362-4366，1995)。
即使這種方法也還存在缺點(diǎn)。事實(shí)上，這些菌株的脫硫活性被低濃度(1mM)硫酸根離子抑制。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用節(jié)桿菌的一種新菌株可能克服上述已知技術(shù)的缺陷，該菌株能夠選擇性地打開含碳物中存在的硫化有機(jī)分子的C-S鍵而不降解分子自身的含碳結(jié)構(gòu)，不需表面活性劑。這使水消耗得以降低，采用簡(jiǎn)單設(shè)備即可對(duì)離開生物反應(yīng)器的各相進(jìn)行分離。另外，本發(fā)明菌株的脫硫活性不受達(dá)到46mM硫酸根離子的濃度的影響。
該菌株的樣品于1996年2月9日保藏于the Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)，得到的保藏號(hào)為CBS 208.96。
附圖簡(jiǎn)述圖1按照4-S途徑的硫芴降解途徑。
圖2針對(duì)短桿菌提出的硫芴降解途徑。
圖3反應(yīng)開始時(shí)，用HPLC對(duì)“靜息細(xì)胞”提取物進(jìn)行的分析。譜峰是2-羥基聯(lián)苯(RT＝10.85)，DBT(RT＝15.30)；圖3a最佳條件下反應(yīng)2小時(shí)后，用HPLC對(duì)“靜息細(xì)胞”提取物進(jìn)行的分析。反應(yīng)開始時(shí)存在的DBT已轉(zhuǎn)化成2-HBP。
圖3b對(duì)4℃下保存7天的細(xì)胞樣品進(jìn)行HPLC分析。由這種分析證實(shí)了“4-S”途徑；DBT-SO(7.7)；DBT-砜(9.4)。
圖4用GC-MS分析“靜息細(xì)胞”提取物。峰相當(dāng)于保留時(shí)間，67乙酸乙酯；129 2-羥基聯(lián)苯；209 DBT；372 DBT氧化物。
圖5酶復(fù)合物的生成動(dòng)力學(xué)。
為了分離能通過(guò)“4S”途徑降解DBT的微生物菌株，使用采自一定場(chǎng)所的生物除污中試工廠的土壤，所述場(chǎng)所被硫含量高的原油所污染。
通過(guò)在含有碳源和作為唯一硫源的DBT的培養(yǎng)基中的連續(xù)富集和純化步驟進(jìn)行分離。所得結(jié)果表明存在能利用DBT的菌株。純培養(yǎng)基中微生物的后繼分離(該微生物分別在以DBT為唯一硫源的培養(yǎng)基上重新培養(yǎng)過(guò))能夠選擇出能利用作為唯一硫源的DBT的單一菌株。該菌株用縮寫DS7初步表示。
為了證實(shí)DBT不是同時(shí)作為碳源，在兩種培養(yǎng)基DS3(其中所含DBT作為唯一碳源)和DS4(其中所含DBT作為碳源和硫源)中培養(yǎng)DS7菌株。在這兩種培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)導(dǎo)致這樣的假設(shè)，即DBT對(duì)這部分菌株的唯一用處是通過(guò)“4S”途徑降解。
為證實(shí)這種假設(shè)，在DS2培養(yǎng)基(DBT作為唯一硫源)上培養(yǎng)菌株，使用DBT上“靜息細(xì)胞”中的生物量。用乙酸乙酯提取反應(yīng)產(chǎn)物并用HPLC和GC/MS進(jìn)行分析。分析證實(shí)，存在著按“4S”途徑的DBT的中間體和最終降解產(chǎn)物(2-羥基聯(lián)苯)(圖3和圖4)。
通過(guò)在含碳源和作為唯一硫源的DBT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DS7菌株，可以獲得各種生長(zhǎng)階段中脫硫所涉及酶的生成動(dòng)力學(xué)(圖5)。所得結(jié)果表明如下幾點(diǎn)——經(jīng)指數(shù)生長(zhǎng)期的一半(28小時(shí))后，細(xì)菌表現(xiàn)其最大酶活性；——酶體系的穩(wěn)定性良好，因?yàn)榧词归L(zhǎng)期保存生物量之后(7天，4℃)也能保持酶活性；——菌株DB7對(duì)主要類型的硫化分子顯示活性，這些硫化分子存在于直餾氣油、加氫脫硫氣油和石油常壓蒸餾得到的主要餾分(餾分70-160℃、160-230℃和230-350℃)；——菌株DS7能夠產(chǎn)生可形成良好微乳狀液/微分散液的乳化劑，而不需外加這些試劑；——形成微乳狀液/微分散液的相可以容易地分離。
為鑒定菌株DS7，參考了下列文獻(xiàn)所描述的方法Bergey’sManual of Systematic Bacteriology(Volumes 1-4)，Ed.1989，Williams & Wilkins，Baltimore。形態(tài)學(xué)和染色學(xué)特征——革蘭氏反應(yīng)+(24小時(shí)后可變)——形態(tài)型多形，帶V細(xì)胞——大小 0.6×1μm(穩(wěn)定期)——遷移度無(wú)——內(nèi)生孢子 無(wú)——莢膜 無(wú)—Ziehl-Neelsen -(24小時(shí)后)——異染粒-培養(yǎng)特征——營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落 Beige/pinkish，濕潤(rùn)的——立體 凸形——生色 無(wú)——色素(用酸)無(wú)——色素(用堿)無(wú)——表面 光滑、有光澤——邊緣 完整——大小(直徑)1.5mm(24小時(shí)后)——乳化性迅速，水中——在Y.E.培養(yǎng)基中的顏色變化 堿性生理特征β-半乳糖苷酶 +細(xì)胞色素氧化酶-過(guò)氧化氫酶+脲酶 +明膠酶-精氨酸脫氫酶 -賴氨酸脫羧酶 -色氨酸脫氨酶 -硝酸鹽→亞硝酸鹽還原 -硝酸鹽→N2還原 -耐受330mM NaCl+碳源的利用甘油 +(氧化)D-葡糖 -D-果糖 -D-甘露糖 +(弱氧化)半乳糖 +(弱氧化)L-山梨糖 -鼠李糖 -半乳糖醇 -肌醇 +(弱氧化)甘露糖醇 +(弱氧化)山梨醇 +(弱氧化)赤蘚醇 -D-阿拉伯糖 -L-阿拉伯糖 -核糖 +(弱氧化)D-木糖 -L-木糖 -核糖醇 -熊果苷 -七葉苷 +(水解)水楊苷 -纖維二糖 -麥芽糖 -乳糖 +(弱氧化)蜜二糖 -蔗糖 -海藻糖(Trealose) -菊粉 -松三糖 -D-棉子糖 -可溶性淀粉 -糖原 -木糖醇 -龍膽二糖 -D-松二糖 -D-Lysose -D-塔格糖 -D-巖藻糖 -D-阿糖醇 +(弱氧化)L-阿糖醇 -Amigdalin-β-甲基-木糖苷 -蘋果酸 -乙酸 -苯甲酸 -檸檬酸 -葡糖酸 +(弱氧化)α-甲基-D-葡糖苷 -α-甲基-D-甘露糖苷 -N-乙?；?葡糖胺 -根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)檢驗(yàn)的結(jié)果可以斷定，本發(fā)明的菌株DS7不屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、Nocardioides、赭者菌屬(Oerskovia)和蛛網(wǎng)菌屬(Arachnia)菌種。實(shí)際上，與這些菌種不同，DS7沒(méi)有嚴(yán)格的營(yíng)養(yǎng)需求，它在短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)，在瓊脂化營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上不產(chǎn)生絲狀物(菌絲、氣生菌絲體)，對(duì)按照Z(yǔ)iehl-Neelsen進(jìn)行的酸處理不具抗性。
菌株DS7具有確定的氧化代謝能力，沒(méi)有屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的兼性呼吸菌株的多樣性或沒(méi)有以厭氧型蛛網(wǎng)菌屬形式生長(zhǎng)的能力。
另外，鑒于其生理特征以及對(duì)所用碳源的獨(dú)特表現(xiàn)，可以排除它屬于紅球菌屬(Rhodococcus)。實(shí)際上，屬于這個(gè)屬的菌株能利用廣譜的碳源并且不含β-半乳糖苷酶。特別是玫瑰色紅球菌從果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖產(chǎn)生酸，并且不在乳糖上生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)膜脂的對(duì)比分析也支持該菌株不屬于紅球菌屬這一論斷。其染色和有限的酶學(xué)特征使其區(qū)別于擴(kuò)展短桿菌(B revibacterium linens)菌株，擴(kuò)展短桿菌菌株有液化明膠的能力、如用堿或酸進(jìn)行處理可產(chǎn)生一種不能洗掉的“細(xì)胞莢膜”和一種橙色色素。
菌株D7的下列情況使該菌株似乎是屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬，即不需要生長(zhǎng)因子(它不需補(bǔ)充維生素或其它物質(zhì))、“正規(guī)”的形態(tài)發(fā)生周期(新鮮培養(yǎng)物中為帶V細(xì)胞的橢桿菌，隨成熟變?yōu)闄E球菌)，與氧的反應(yīng)(它是需氧菌)、它利用碳源的方式(僅是氧化的)、某些酶活性的精確表達(dá)(明膠酶、β-半乳糖苷酶)、染色特征(革蘭氏反應(yīng)可變、Ziehl-Neelsen陰性、無(wú)莢膜或內(nèi)生孢子)。
分離菌株在乙酸鹽和苯甲酸鹽上不能生長(zhǎng)表明，盡管它與Grossman等所述節(jié)桿菌菌株屬同一類型，但為不同的種。
利用本發(fā)明的節(jié)桿菌菌株進(jìn)行的脫硫方法在于，使該菌株或由該菌株分離到的酶復(fù)合物與待脫硫底物乳狀液或懸浮液在水介質(zhì)中接觸(反之亦然)。懸浮液或乳狀液是不用表面活性劑，在有機(jī)械系統(tǒng)的裝置中或在不帶活動(dòng)部件的混合器(例如，基于噴射系統(tǒng)的混合器)中得到的?；旌显谑覝?、常壓下進(jìn)行，待脫硫底物與水相之間的體積比為1∶1～7∶1，優(yōu)選3∶1。這樣就可能得到一種微乳狀液或微懸浮液，它對(duì)氧化反應(yīng)器中的停留時(shí)間是穩(wěn)定的，而停留時(shí)間通常隨石油餾分的種類和相對(duì)硫含量而變化。
本發(fā)明的脫硫方法可用于原油、經(jīng)真空下常壓蒸餾的熱處理的餾分(燃料油)、以及來(lái)自HDS廠有待強(qiáng)制脫硫的氣油。
本發(fā)明的脫硫方法可以間歇進(jìn)行或連續(xù)進(jìn)行，優(yōu)選連續(xù)進(jìn)行，其特征在于下列主要操作步驟(1)細(xì)菌DS7的培養(yǎng)由細(xì)菌DS7或其酶衍生物構(gòu)成的生物催化劑是通過(guò)在任何類型發(fā)酵器中培養(yǎng)細(xì)胞(優(yōu)選連續(xù)培養(yǎng))而制備的。含水培養(yǎng)基含有可同化的碳源、氮源以及各種陽(yáng)離子和陰離子。
例如，制皂工業(yè)副產(chǎn)品形式的含甘油水可用作低成本碳源?？捎糜诒景l(fā)明方法的氮源可選自，例如，象硝酸銨、氯化銨或碳酸銨這樣的銨鹽，或者脲。
下列陽(yáng)離子和陰離子同等地適合于本發(fā)明的目的鉀離子、鈉離子、鎂離子、鐵離子、鈣離子、磷酸根和氯離子。
培養(yǎng)基另外含有硫源，該硫源能誘導(dǎo)和保持具有脫硫活性的酶復(fù)合物的合成，所述硫源選自DBT、石油或其硫化有機(jī)分子含量高的衍生物。制備培養(yǎng)基所必需的水相可得自后續(xù)步驟(4)。
細(xì)胞是在溫度20-35℃(優(yōu)選30℃)、攪拌、通氣(0.5-1體積空氣/反應(yīng)器體積/分鐘)下進(jìn)行的。pH大致維持在中性。(2)生物催化劑的制備用生物工程中典型的方法和設(shè)備收集培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞并從培養(yǎng)基中分離。按照這一處理方法，細(xì)胞被濃縮于液流中，該液流將提供給后續(xù)的生物脫硫反應(yīng)。
此外，也可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行催化活性更高的酶提取物的分離。同樣可以按通常的生物技術(shù)手段進(jìn)行這些操作(細(xì)胞破碎、核酸分離等)。(3)生物脫硫反應(yīng)可以在連續(xù)或間歇反應(yīng)器中進(jìn)行該反應(yīng)?；钊骰驍嚢枋竭B續(xù)反應(yīng)器(連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器)都是優(yōu)選的。后者可設(shè)計(jì)成單級(jí)或多級(jí)形式。
CSTR多級(jí)設(shè)計(jì)是最適合的。在活塞流反應(yīng)器中，待脫硫的底物懸浮液加入預(yù)先形成的水介質(zhì)中。
在CSTR反應(yīng)器中，乳狀液可在相同反應(yīng)器中制備。這樣制備是為了使生物催化劑與待脫硫的油相以及氣相(空氣、壓縮空氣)接觸，硫的生物氧化過(guò)程所必需的氧就是從上述氣相中獲得的。
考慮到菌株DS7嚴(yán)格的親油(oleophilous)性質(zhì)，反應(yīng)可以在沒(méi)有表面活性劑的情況下進(jìn)行，使用的水量減少。方便地采用待脫硫物質(zhì)與水之間的體積比，即1∶1～7∶1，優(yōu)選3∶1。
油相和水相可逆流加入，這樣形成可用相關(guān)生物反應(yīng)進(jìn)行液-液萃取的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)中(其中，每一級(jí)由一個(gè)混合器和一個(gè)分離器組成)，可用得自硫酸鹽脫除(參見(jiàn)(5))的水生產(chǎn)新鮮催化劑。因此，可用最高效率實(shí)現(xiàn)脫硫活性。
脫硫反應(yīng)在溫度20～40℃、優(yōu)選25～35℃，pH5～9、優(yōu)選6.5～7.5下進(jìn)行。(4)在反應(yīng)器出口處進(jìn)行相分離使用能使重力場(chǎng)有適度增加的相分離器(以有限轉(zhuǎn)數(shù)進(jìn)行的離心，旋液分離器等)足以進(jìn)行分離。
分離得到下列三股液流a)脫硫油相，脫水后可送交使用。脫水操作不成問(wèn)題，因?yàn)樗饕c生物催化劑相結(jié)合，其脫除并不困難。b)含有少量生物催化劑的水相，生物催化劑可用常規(guī)技術(shù)(離心、過(guò)濾等)脫除?？蓪?duì)剩余水流進(jìn)行如(5)中所述的硫酸鹽脫除步驟，再循環(huán)至步驟(1)。c)主要由生物催化劑、油和水組成的粘液相。根據(jù)硫酸鹽含量的不同，可將這種液流直接循環(huán)到脫硫反應(yīng)器或進(jìn)行硫酸鹽的脫除，脫除硫酸鹽是通過(guò)使粘液流重新懸液于水中并對(duì)混合物進(jìn)行離心而進(jìn)行。將殘留水流與b)中所述的水流連接起來(lái)。(5)硫酸鹽的脫除得自(4)的水源匯合在一起，并用硫酸鹽還原厭氧細(xì)菌進(jìn)行硫酸鹽的脫除。這種處理可以在厭氧過(guò)濾式常規(guī)厭氧反應(yīng)器(用吸附在固態(tài)載體上的生物量進(jìn)行操作)或Up-flow Anaerobic SludgeBlanket式常規(guī)厭氧反應(yīng)器(UASB，用聚集的生物量進(jìn)行操作)中進(jìn)行。
這一步驟中，硫酸鹽被還原成可溶性硫化物。石油工業(yè)中所用普通設(shè)備中可能有的痕量硫化氫可被脫除，而可溶性硫化物在采用需氣的或微需氣的微生物生物量的后續(xù)生物步驟中可再次氧化成元素硫。所述微生物的例子有下列各屬硫桿菌屬(Triobacillus)，貝日阿托菌屬(Beggiatoa)、發(fā)硫菌屬(Thiotrix)、辮硫菌屬(Thioploca)、副球菌屬(Paracoccus)等。
用吸附或聚集的生物量進(jìn)行操作的反應(yīng)器也可用于將硫化物氧化成硫的反應(yīng)。不過(guò)，所需氧供應(yīng)有限，使下列情況成為優(yōu)選的在微需氧微生物的情形中，使用其中生物量吸附于旋轉(zhuǎn)載體上的反應(yīng)器(旋轉(zhuǎn)式生物接觸器，RBC)；而在需氧微生物的情形中，使用在高度方向上在頂部設(shè)有一個(gè)沉降器的結(jié)構(gòu)。
鑒于上述微生物的中溫性質(zhì)，最好在接近室溫的溫度下使用這些微生物，最好控制在大約30-35℃。優(yōu)選的操作pH接近中性，但可達(dá)到酸值，操作壓力為常壓。
通過(guò)沉降、洗滌、固體物過(guò)濾操作、硫的熔化及其分離，可以從水相中和從生物量中分離離開反應(yīng)器的硫。130℃下發(fā)生硫的熔化，得到一定純度的產(chǎn)品。該純度的硫可市售供生產(chǎn)硫酸。
除硫的一系列操作產(chǎn)生一定硫酸鹽含量的水，該硫酸鹽含量的水與營(yíng)養(yǎng)物結(jié)合后，可將其一部分循環(huán)到培養(yǎng)細(xì)菌DS7的步驟(1)，另一部分再次用于重新懸浮生物量。采用這些操作，也可得到凈化的沖洗液流，該液流可直接或在簡(jiǎn)單的常規(guī)需氧后處理之后排入表面水生系統(tǒng)中。后一操作可以在石油工業(yè)常見(jiàn)的水處理廠中進(jìn)行。
下列實(shí)施例的唯一目的是更好地闡述本發(fā)明，絕不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1節(jié)桿菌的分離為分離一種能通過(guò)“4S”途徑降解DBT的微生物菌株，使用采自一定地點(diǎn)生物除污中試工廠的土壤，該地點(diǎn)污染有(約1.6％w/w)有機(jī)硫含量約為6％的Sowedi原油。
向200ml水中加入100g土壤，劇烈攪拌再進(jìn)行沉降后，取出兩份5ml上清液等分試樣。
將兩份試樣用于接種兩個(gè)250ml燒瓶，每個(gè)燒瓶含50ml兩種不同的培養(yǎng)基(DS1和DS2)，其在雙蒸餾水中的組成為表1.
組分 DS1 DS2KH2PO410.0g/l10.0g/lNH4Cl2.0g/l 2.0g/lMgCl2.6H2O 0.2g/l 0.2g/lDBT - 0.5g/l琥珀酸4.0g/l 4.0g/lFeCl310.0mg/l 10.0mg/lCaCl220.0mg/l 20.0mg/lpH(用NaOH)6.46.4將兩個(gè)燒瓶置于30℃、200rpm的定軌NBS培養(yǎng)箱中。在同樣的培養(yǎng)基上連續(xù)進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)，間隔為72小時(shí)，接種量為5％(v/v)。
DS1培養(yǎng)基用作對(duì)照，以顯示由于其它營(yíng)養(yǎng)物中存在的硫雜質(zhì)引起的基本生長(zhǎng)。在DS2上的生長(zhǎng)水平高得多，證實(shí)了DBT中的硫?qū)ε囵B(yǎng)基中存在的微生物的作用。
將在DS2上5次傳代培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)基用于接種(以不同的稀釋率)含最大瓊脂化培養(yǎng)基(Nutrient Agar，DIFCO)的培養(yǎng)皿，讓其在30℃培養(yǎng)48小時(shí)。在生長(zhǎng)的所有菌落中，選擇出7個(gè)在形態(tài)和/或色素特征方面相互明顯不同的菌落。
首先在上述Nutrient Agar上的單獨(dú)培養(yǎng)皿中分離這7個(gè)菌株，然后接種到含DS2培養(yǎng)基的燒瓶中，以檢驗(yàn)它們利用DBT作硫源的能力。結(jié)果證實(shí)，僅有一個(gè)菌株能在這些條件下生長(zhǎng)。實(shí)施例2降解途徑的證實(shí)A)把能在作為硫源的DBT上生長(zhǎng)的唯一菌株(DS7)用作培養(yǎng)基DS3和DS4的接種物，培養(yǎng)基DS3和DS4具有表2所示組成。
表2組分DS3DS4KH2PO410.0g/l10.0g/lNH4Cl 2.0g/l 2.0g/lMgCl2.6H2O - 0.2g/lMgSO4.7H2O 0.2g/l 0.5g/lDBT0.5g/l 0.5g/l琥珀酸 - -FeCl310.0mg/l 10.0mg/lCaCl220.0mg/l 20.0mg/lpH(用NaOH) 7.27.2在這些培養(yǎng)基中，DBT既作為唯一碳源(DS3，以硫酸鹽形式提供硫)，也作為硫源和碳源(DS4)。
在這些培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)被認(rèn)為是DS7脫硫活性的表現(xiàn)。B)檢驗(yàn)“4S”途徑中間體和終產(chǎn)物(2HBP)的存在把菌株DS7于30℃在DS2培養(yǎng)基上培養(yǎng)28小時(shí)；將收集的培養(yǎng)基離心并用10g/l磷酸緩沖液(pH7.2)洗滌2次。
將生物量(約為100mg干物質(zhì))懸浮于25ml同種磷酸緩沖液中并置于燒瓶中。攪拌下，向燒瓶中加入0.625ml的4mM硫芴乙醇溶液。所以，反應(yīng)介質(zhì)中硫芴的初始濃度為1mM。將得到的2ml混合物置于密封的安瓿中并用2巴的氧加壓。在預(yù)定的培養(yǎng)時(shí)間后，把2ml乙酸乙酯加入安瓿中以進(jìn)行DBT及其衍生物的萃取。所得提取物用HPLC(圖3)和GC/MS(圖4)進(jìn)行分析。
圖3和圖3a中所示結(jié)果表明，反應(yīng)2小時(shí)后DBT幾乎全部轉(zhuǎn)化成2-羥基聯(lián)苯。應(yīng)指出的是，圖3中證實(shí)的2-羥基聯(lián)苯可能是DBT直接轉(zhuǎn)化成的2-HBP，也可能是發(fā)酵期中微生物所生物吸附的2-HBP。在圖3b中可以證實(shí)DBT按“4S”途徑的所有降解產(chǎn)物的存在。僅對(duì)催化活性降低的細(xì)胞才能觀察到這些產(chǎn)物(正如在4℃保持7天后所發(fā)生的那樣)，或用氧限制下的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)得到。實(shí)施例3A)酶生成的動(dòng)力學(xué)為證實(shí)各生長(zhǎng)期中脫硫所涉及的酶的生成趨勢(shì)，用菌株DS7接種含500ml DS2培養(yǎng)基的2l燒瓶，所述培養(yǎng)基為具有更低的誘導(dǎo)物濃度(從0.5g DBT/l到20mg DBT/l)而進(jìn)行了改進(jìn)。由預(yù)先在三角瓶中進(jìn)行的同種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)而得到25ml接種物。在上述相同條件下對(duì)燒瓶進(jìn)行保溫。
在16小時(shí)、22小時(shí)、28小時(shí)和39小時(shí)從培養(yǎng)液中取樣。測(cè)定樣品的下列參數(shù)660nm處的光密度、干重和比脫硫活性。用雙蒸餾水洗滌生物量后，以105℃下恒定的殘留物來(lái)測(cè)定干重。測(cè)定20ml培養(yǎng)液試樣的比活性。將試樣在8000g下離心10分鐘，再懸浮于20mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)中，再次離心。使生物量再懸浮于相同的緩沖液中以使終體積為9.75ml。將所得細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)入其中已添加了0.25ml 40mM DBT乙醇溶液的50ml燒瓶中。把燒瓶于攪拌下在30℃保溫，在預(yù)定的時(shí)間取出混合物試樣并用HPLC進(jìn)行分析。所得結(jié)果示于圖5。從圖5可以看出，當(dāng)細(xì)菌處于超過(guò)其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的一半的情況時(shí)，酶活性的最大表現(xiàn)是如何計(jì)錄的。B)用石油餾分誘導(dǎo)酶活性為此，在DS2培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株DS7，所述DS2培養(yǎng)基中作為誘導(dǎo)物和硫源的硫芴被下列物質(zhì)替代(a)含13600ppm硫的0.5ml/l石油餾分，230-350℃，(b)得自HDS、硫含量為2000ppm的1ml/l氣油。按A)中所述方法在500ml燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。44小時(shí)后，對(duì)20ml培養(yǎng)液中所含的生物量進(jìn)行分析以測(cè)定比活性。對(duì)樣品(a)而言，該參數(shù)為4.3mg干DBT/g/h；對(duì)樣品(b)而言，該參數(shù)為2.6mg干DBT/h。這些結(jié)果指出，所研究的石油產(chǎn)品能誘導(dǎo)酶復(fù)合物的合成。實(shí)施例4氣油的脫硫試驗(yàn)使用一種經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)HDS脫硫處理、殘留硫含量約為2000ppm、帶有47ppm流化添加劑DODIFLOWV 3905-2的氣油。同時(shí)用含硫10200ppm的未脫硫氣油進(jìn)行試驗(yàn)。連續(xù)培養(yǎng)(稀釋率0.09h-1，培養(yǎng)基類似于實(shí)施例2A)的培養(yǎng)基)后獲得的生物量用離心法分離并用pH7.2的Tris-HCl緩沖液洗滌2次。然后將其再懸浮于相同緩沖液中，使干產(chǎn)物濃度達(dá)38mg/ml。
再將7.5ml細(xì)胞懸浮液和2.5ml氣油置于53ml轉(zhuǎn)筒中。把轉(zhuǎn)筒放在2.0巴壓力下的氧中，并于30℃、200rpm攪拌下保溫(標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn))。為證實(shí)該反應(yīng)條件(含水的氧化環(huán)境)下可能有的副反應(yīng)，進(jìn)行一個(gè)參照試驗(yàn)，其中用Tris-HCl緩沖液代替細(xì)胞懸浮液。還在石油餾分和細(xì)胞存在下進(jìn)行第三個(gè)試驗(yàn)(作為零時(shí)刻)。24小時(shí)后終止標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)和參照試驗(yàn)。對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行離心(8000g，20分鐘)。通過(guò)氣相色譜法分析回收到的油相，所述色譜法采用裝有原子發(fā)射檢測(cè)器(Atomic Emisson Detector，AED，Mod.HP 5921-A)的Hewlett-Packard設(shè)備(Mod.5890)。用J.W.S.的DB-1型毛細(xì)管柱進(jìn)行色譜分離。表3給出了扣除零時(shí)刻貢獻(xiàn)后的結(jié)果。應(yīng)指出的是，參照試驗(yàn)未表現(xiàn)出任何平行現(xiàn)象。
表3氣油硫，ppm 脫硫％直餾10,20013.5得自HDS 2,00019.7從該表可以看出，細(xì)菌DS7對(duì)測(cè)試的兩種氣油都具有活性。
此外，正如從表4中所示數(shù)據(jù)觀察到的，菌株DS7對(duì)測(cè)試的氣油中所含的主要類型的硫化分子具有活性。
表4分子脫硫％(24小時(shí))直餾 得自HDSC3-BT 10.2 18.9DBT 10.3 16.8C1-DBT 10.3 22.9C2-DBT 7.1 5.1實(shí)施例5有和沒(méi)有乳化劑時(shí)的脫硫用一模型系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，該系統(tǒng)由硫芴濃度為0.3和3％的十二烷構(gòu)成。
用0.3％的DBT進(jìn)行操作，進(jìn)行三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)乳化劑對(duì)菌株DS7脫硫活性的影響。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有添加乳化劑，第二個(gè)和第三個(gè)則分別含0.25和0.5％Triton N-101。
對(duì)所有試驗(yàn)采用下列步驟把油相等分試樣(2.5ml)置于容積為53ml的8個(gè)(每個(gè)試驗(yàn)2個(gè))轉(zhuǎn)筒中。然后向每個(gè)轉(zhuǎn)筒加入含細(xì)胞的7.5ml Tris-HCl緩沖液(20mM，pH7.2)，含細(xì)胞的緩沖液中比例為12.5mg干物質(zhì)/ml(每個(gè)轉(zhuǎn)筒干物質(zhì)總重大約為100mg)。封閉轉(zhuǎn)筒，用氧使壓力達(dá)2巴。8個(gè)轉(zhuǎn)筒中的代表零時(shí)刻的4個(gè)轉(zhuǎn)筒在加氧后立刻置于冰浴中并如下所述立即進(jìn)行分析。另4個(gè)轉(zhuǎn)筒在30℃恒溫浴槽中于攪拌(200rpm)下保溫16小時(shí)。
把8個(gè)轉(zhuǎn)筒中所含反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入玻璃試管并在8000g下離心15分鐘。將十二烷試樣用乙酸乙酯適當(dāng)稀釋并用HPLC分析。扣除零時(shí)刻之后的結(jié)果示于表5中。
表5乳化劑 DBT脫硫(Triton N-101) ％ ％- 0.335.10.25 0.314.60.50.316.4- 3 3.1上述結(jié)果表明，細(xì)菌DS7不需商用乳化劑來(lái)實(shí)現(xiàn)其脫硫活性。相反，應(yīng)指出的是，外加乳化劑具有很大的抑制作用。實(shí)施例6模型系統(tǒng)中的脫硫試驗(yàn)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的目的是為了說(shuō)明菌株DS7的親油性(oleoficity)減少該方法的耗水量。
為此，在每個(gè)試驗(yàn)中采用0.3％DBT的十二烷溶液和一定量的生物量，進(jìn)行了3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)。第1個(gè)試驗(yàn)使用2ml細(xì)胞懸浮液(19.8mg干物質(zhì)/ml水)和4ml十二烷(油相∶水相比2∶1)。用相同方式進(jìn)行第二個(gè)試驗(yàn)，但提高十二烷+DBT(比例3∶1)的體積至6ml。將這兩個(gè)試驗(yàn)與第三個(gè)試驗(yàn)(其中油相∶水相之比為1∶1)相比較。
將混合物在650ml安瓿中進(jìn)行反應(yīng)(2×試驗(yàn))。把氧通入安瓿達(dá)1.5巴，密封并于30℃、攪拌下保溫。把零時(shí)刻的三個(gè)安瓿和20小時(shí)時(shí)的另三個(gè)安瓿減壓。進(jìn)行相分離后，取出有機(jī)相試樣，加入乙酸乙酯(4體積/體積)并用HPLC進(jìn)行分析。
表6表示在第20小時(shí)時(shí)獲得的扣除了零時(shí)刻之后的結(jié)果。
表6十二烷/水相之比脫硫mg 降解的DBT/g干物質(zhì)1∶1 38.12∶1 36.13∶1 34正如從該表可以看出的那樣，在水量較少時(shí)脫硫水平也是近似的。實(shí)施例7硫酸鹽濃度對(duì)菌株DS7脫硫活性的影響采用三個(gè)相同量的干DS7生物量(13mg/ml)進(jìn)行試驗(yàn)——第一個(gè)(空白)，懸浮于pH7.2、20mM Tris-HCl緩沖液中；——第二個(gè)，懸浮于含15.5mM Na2SO4的相同緩沖液中(相當(dāng)于500ppm硫)；——第三個(gè)，懸浮于含46.5mM Na2SO4的相同緩沖液中(1500ppm硫)。
添加DBT(1mM)后，于30℃、200rpm的攪拌槽中進(jìn)行這三個(gè)實(shí)驗(yàn)。2小時(shí)和4小時(shí)后，測(cè)定殘留的DBT濃度。表7表示了所得結(jié)果。
表7硫酸鹽 脫硫(％)mM2小時(shí)4小時(shí)0 75 10015.5 55 10046.5 50 100實(shí)施例8石油餾分的脫硫試驗(yàn)使用由總硫含量為1.36％的原油(Belaym原油)常壓蒸餾得到的下列餾分1)70-160℃餾分；2)160-230餾分；3)230-350℃餾分。每一餾分中的硫含量分別為400，2400和13600ppm。另外，向每一餾分中加入160ppm硫(以硫芴形式加入)。這是為了獲得精確的參照化合物。
把5ml石油餾分與5ml 0.1M磷酸緩沖液(pH7)混合。使用兩種不同濃度的細(xì)胞，即分別為16和32mg干物質(zhì)/ml緩沖液。用氧使含有反應(yīng)混合物的安瓿達(dá)到1，5巴并密封。使用由相同混合物構(gòu)成的對(duì)比樣品，其中在把細(xì)胞與油相接觸之前，通過(guò)把溫度升高至121℃達(dá)20分鐘而使細(xì)胞失活。在預(yù)定的時(shí)刻(24和48小時(shí))，對(duì)各個(gè)安瓿中的全部?jī)?nèi)含物進(jìn)行離心(8000g，20分鐘)并按實(shí)施例4所述用GC/AED進(jìn)行分析。采用J.W.S的DB-1型毛細(xì)管柱進(jìn)行色譜分離。所得總脫硫水平示于表8。
表8餾分 細(xì)胞16mg/l32mg/l脫硫 ％ 脫硫 ％24小時(shí)48小時(shí) 24小時(shí) 48小時(shí)70-160℃2.5 4.6160-230℃ 3.2 5.4 4.1 8.5230-350℃ 4.1 7.9 8.2 14.1空白 - - --
還測(cè)定了最后一種餾分中下列主要種類化合物的脫硫水平甲基-苯并噻吩(C1-BT)、乙基-苯并噻吩(C2-BT)、丙基-苯并噻吩(C3-BT)和烷基(Alchyl)-硫芴(C1-C3-DBT)。所得結(jié)果示于表9。
表9分子細(xì)胞16mg/l 32mg/l脫硫％脫硫％24小時(shí)48小時(shí) 24小時(shí)48小時(shí)C1-BT 3.57.7 5.9 14.3C2-BT 4.28.1 8.4 16.2C3-BT 4.58.3 7.7 15.1C1-C3-DBT 3.47.6 8.9 17.9實(shí)驗(yàn)例9水-油乳狀液的分離試驗(yàn)和催化劑的回收把細(xì)胞在0.1M、pH7的磷酸緩沖液中的均勻懸浮液100ml(32mg干物質(zhì)/ml)與等體積實(shí)施例4中所用相同脫硫氣油相接觸。把容器封密、置于2巴的氧氣氛中，在30℃、200rpm攪拌下保溫。通過(guò)向混合物中添加比例為0.25％(v/v)的Triton N-10而進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。24小時(shí)后，以2000g、4000g和8000g離心混合物?；厥盏牟煌嗟捏w積示于表10。
表10重力有乳化劑 無(wú)乳化劑所得到的相(ml) 所得到的相(ml)油水 乳狀液油水 乳狀液2,000 762 122 8338794,000 813 116 8941708,000 836 111 914861從這張表可以看出，在所有情況下，不加乳化劑時(shí)回收的油相和水相比加了乳化劑時(shí)要高。應(yīng)指出的是，在加了乳化劑的情況中，所回收的水相其實(shí)可以忽略不計(jì)。
采用表面活性劑時(shí)，在脫除硫酸鹽之后，待循環(huán)至反應(yīng)器的水相的分離似乎極為困難。
采用菌株DS7(它不需使用乳化劑)所獲得的優(yōu)點(diǎn)十分明顯。實(shí)際上，在低重力下離心就能分離——透明的脫硫油相；——有待分離硫酸鹽的透明水相；以及——乳化相，它含有可循環(huán)至氧化反應(yīng)器的所有活性脫硫細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種節(jié)桿菌生物學(xué)純培養(yǎng)物CBS 208.96，它能選擇性地打開礦物燃料中存在的硫化有機(jī)分子的C-S鍵，而不破壞含碳結(jié)構(gòu)。
2.一種通過(guò)選擇性地打開硫化有機(jī)分子的C-S鍵而從礦物燃料中脫除有機(jī)硫的方法，該方法包括(a)在pH5～9、溫度20～40℃、壓力為常壓至3巴的氧化氣氛中，使所述礦物燃料的乳狀液或懸浮液與微生物即節(jié)桿菌CBS 208.96接觸；(b)從(a)中獲得的反應(yīng)混合物中分離脫硫油相、水相和由生物催化劑節(jié)桿菌CBS 208.96及油和水組成的粘液相；(c)把粘液相循環(huán)至脫硫步驟(a)；(d)用能夠通過(guò)把硫酸鹽轉(zhuǎn)化成硫而脫除硫酸鹽的厭氧和需氧微生物處理水相；(e)把完全脫除了硫的水循環(huán)至步驟(a)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(a)中，礦物燃料乳狀液是這樣獲得的在沒(méi)有表面活性劑的條件下，采用礦物燃料/水的體積比為1∶1～7∶1，使礦物燃料與水混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中體積比為3∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(c)中，粘液相在循環(huán)至步驟(a)之前先用水洗滌，并且按步驟(d)和(e)所述對(duì)洗水進(jìn)行處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(a)中的pH為6.5～7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(a)中的溫度為25～35℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中礦物燃料為原油、石油餾分、石油餾出物以及石油蒸餾的殘留物。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的方法，該方法是連續(xù)進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能選擇性地打開含碳物中存在的硫化有機(jī)分子的C-S鍵的節(jié)桿菌菌株CBS208.96及其在從礦物燃料中選擇性脫除有機(jī)硫的方法中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1167147SQ9710346
公開日1997年12月10日 申請(qǐng)日期1997年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月12日
發(fā)明者E·法斯塞逖, E·達(dá)達(dá)里奧, R·吉亞納, P·薩塞杜, L·瑟伯利斯卡, A·羅伯逖勞 申請(qǐng)人:埃尼里塞奇公司