專利名稱：轉(zhuǎn)錄控制序列和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件植物組織中定性的調(diào)節(jié)元件和定量的調(diào)節(jié)元件，前者正調(diào)節(jié)其下游基因?qū)τ谇秩氩≡⑸?，釋放素和其它誘導(dǎo)性化學(xué)信號(hào)物質(zhì)等的脅迫的反應(yīng)；后者增加相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
背景技術(shù)：
植物體對(duì)于病原性真菌，細(xì)菌和病毒的抗病性和一種叫超敏反應(yīng)(HR)的植物反應(yīng)相聯(lián)系。超敏反應(yīng)的結(jié)果，被潛在的植物病原菌侵入的部位發(fā)生定點(diǎn)細(xì)胞死亡，據(jù)推測(cè)HR帶來(lái)的定點(diǎn)植物細(xì)胞死亡包含入侵的微生物或病毒，這樣使得其鄰近組織細(xì)胞免于感染。另外一些植物防御反應(yīng)包括產(chǎn)生能阻止病原菌侵入的植物抗毒素(抗生素)和/或溶菌酶和/或修飾細(xì)胞壁，修飾細(xì)胞壁可增強(qiáng)其抵抗病原菌產(chǎn)生的物理性和/或酶的破壞。
植物包括煙草的超敏反應(yīng)能產(chǎn)生植物抗毒素作為抵抗病原微生物侵染的反應(yīng)之一?？刮⑸锉栋胼剖菬煵?Nicotiana tabacum)對(duì)病原微生物入侵反應(yīng)過(guò)程中形成的一類化合物。
細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供了關(guān)于萜烯生物合成調(diào)節(jié)的有用信息。類異戊二烯在自然界廣泛存在，它們和其它類異戊二烯化合物如甾醇，類胡蘿卜素，多萜醇，泛醌和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(如赤霉素)等具有共同的早期生物合成途徑，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)被稱為初生代謝物質(zhì)，被稱為次生代謝物質(zhì)的類異戊二烯化合物不為生長(zhǎng)所必需，它們包括單萜，倍半萜，二萜。這些次生代謝物-類異戊二烯是植物和其環(huán)境相互作用過(guò)程中的重要介導(dǎo)者。
許多化合物可以作為釋放素誘導(dǎo)植物抗毒素合成。他們包括但不限于一種或多種毒性離子，如汞離子，其它化學(xué)上明確的成分，代謝抑制劑，細(xì)胞壁聚糖，一些糖蛋白，一些酶，真菌孢子，脫乙酰幾丁質(zhì)，一些脂肪酸，一些來(lái)自植物細(xì)胞壁的寡糖[參看Sequeira L，(1983)微生物學(xué)年評(píng)(Annu.Rev Microbiol.)3751-79，以及所引用的參考文獻(xiàn)]。一些疫霉的細(xì)胞壁碎片和綠色木霉纖維素酶能增強(qiáng)表-5-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶活性，但日本曲霉果膠酶卻不能[Chappell等，(1991)，植物生理學(xué)(Plant Phyiol.)97693-698]。受到其它植物病原菌或相似的無(wú)毒菌株的攻擊，煙草也會(huì)誘導(dǎo)合成植物抗毒素，例如，流淚假單胞菌誘導(dǎo)煙草倍半萜的生物合成[Guedes等，(1982)植物化學(xué)(Phytochemistry)212987-2988]。
釋放蛋白是由植物病原菌或潛在的植物病原菌產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，該蛋白能誘發(fā)煙草的超敏反應(yīng)。寄生疫霉釋放蛋白的氨基酸和核苷酸編碼序列已經(jīng)公布[Kamoun等，(1993)植物-微生物相互作用分子生物學(xué)(Mol.Plant-Microbe Interactions)，6573-581]。植物病原病毒，包括但不限于煙草花葉病毒(TMV)，誘導(dǎo)被感染植物超敏反應(yīng)。感染植物的細(xì)菌也能誘導(dǎo)超敏反應(yīng)，從而誘導(dǎo)抗病性；刺激超敏反應(yīng)形成的代表性細(xì)菌包括但不限于土壤桿菌屬的種類，黃單胞菌屬的種類，丁香假單胞菌等。植物病原真菌(也包括一些無(wú)毒菌株)也能誘導(dǎo)植物超敏反應(yīng)，這些真菌包括但不限于寄生疫霉和煙草霜霉。
用一種釋放素處理煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，鯊烯合成酶就受到抑制，于是阻止了正常途徑中生物合成的前體物質(zhì)形成甾醇，同時(shí)伴隨著倍半萜環(huán)化酶基因的表達(dá)，導(dǎo)致這些前體物質(zhì)合成倍半萜。釋放素處理煙草組織中，從法呢醇二磷酸合成倍半萜植物抗毒素Capsidiol的第一步反應(yīng)是由5-表-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS)所催化的，EAS是一種倍半萜環(huán)化酶。煙草EAS基因家族中的一種已被克隆，其基因序列和推測(cè)的氨基酸序列已經(jīng)公布[Facchini and Chappell，(1992)，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl Acad Sci.USA)，8911088-11092]。釋放素誘導(dǎo)EAS家族的一個(gè)或幾個(gè)成員的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)一直想得到保護(hù)植物，尤其是農(nóng)作物免于受植物病原菌侵害的方法，這些病原菌包括但不限于植物病原性病毒，真菌和細(xì)菌。從經(jīng)濟(jì)學(xué)和環(huán)境保護(hù)的角度來(lái)看，生物防治或自然防治顯得尤其重要的，而不是靠給農(nóng)作物施加化學(xué)藥品的化學(xué)防治。本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)也一直想得到用于控制轉(zhuǎn)基因植物中異源DNA表達(dá)的植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。
發(fā)明概述總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的特色是一種包含可誘導(dǎo)的植物抗病調(diào)節(jié)元件的重組核酸分子?？偟恼f(shuō)來(lái)，這種重組的核酸分子和天然存在的可誘導(dǎo)的植物抗病調(diào)節(jié)元件至少有80％的同源性，即是說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)DNA序列中高達(dá)20％的堿基對(duì)可以被其它堿基對(duì)替換(如G-C替換成A-T，T-A或C-G)，只要改造的序列促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的活性和標(biāo)準(zhǔn)序列相同或更高即可。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子來(lái)源于一種編碼萜環(huán)化酶(如一種倍半萜環(huán)化酶)的基因，例如，本發(fā)明的重組調(diào)節(jié)元件來(lái)源于一種表-5-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS)基因，該基因包含一段如圖3A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO14)或由此產(chǎn)生的一種可誘導(dǎo)的植物抗病片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子的核苷酸序列如圖3A所示(SEQ ID NO14)。
在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含下列任何序列SEQ ID NO2中核苷酸463-473；SEQ ID NO2中核苷酸406-486；SEQ ID NO2中核苷酸463-572；SEQ ID NO2中核苷酸371-463；SEQ ID NO2中核苷酸411-457。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子來(lái)源于一種雙子葉植物(如茄科植物的一個(gè)成員，如煙草屬)。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子來(lái)源于一種單子葉植物，裸子植物，或松柏類植物。
在另外的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子是基因組DNA，化學(xué)合成DNA，或者是基因組DNA和化學(xué)合成DNA的組合；基因組DNA和cDNA的組合；化學(xué)合成DNA和cDNA的組合；或者基因組DNA，cDNA和化學(xué)合成DNA的組合。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子的誘導(dǎo)受植物病原菌的介導(dǎo)，這些植物病原菌如本文所述的真菌(如疫霉屬)，細(xì)菌(如假單胞菌屬)或者病毒(如煙草花葉病毒)。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，這種誘導(dǎo)是由釋放素(如真菌或細(xì)菌釋放素)介導(dǎo)的。
在另一方面，本發(fā)明的核酸分子與編碼異源多肽的核苷酸序列可操縱地連接并調(diào)節(jié)其可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選該異源多肽能使植物具有抗病性。例如，異源多肽可以是釋放蛋白(如疫霉屬ParA1多肽等真菌釋放蛋白，harpin等細(xì)菌釋放蛋白或者是纖溶酶原激活物等藥物多肽)。這種異源多肽的表達(dá)受一種或幾種外源介質(zhì)(如乙烯或甲基茉莉酮酸酯)的介導(dǎo)。在另外的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子能以細(xì)胞特異性方式表達(dá)異源多肽。
在另一方面，本發(fā)明的特色是一種含本發(fā)明的核酸分子的載體，一種通過(guò)將該載體導(dǎo)入細(xì)胞(如一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞)而指導(dǎo)多肽表達(dá)的方法，一種含該載體的細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明的特色是一種向轉(zhuǎn)基因植物提供抗病性的方法，這種方法的步驟包括(a)產(chǎn)生本發(fā)明的核酸整合到其基因組中的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；及(b)由該植物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，其中本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植物具有抗病性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物(如茄科的一個(gè)成員，如煙草屬)，單子葉植物，裸子植物，或松柏類植物。
在另一方面，本發(fā)明的特色是一種增加轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中位于下游的DNA序列的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的方法，這種方法的步驟包括(a)產(chǎn)生包含本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中核酸整合到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的基因組上，其插入的位置能增加下游DNA序列的轉(zhuǎn)錄；及(b)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞得到轉(zhuǎn)基因植株。
除了上述特色之外，本發(fā)明還提供了定性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)，在植物組織中調(diào)節(jié)其下游基因?qū)ο铝幸蜃影l(fā)生反應(yīng)的表達(dá)一種或多種釋放素，其它明確的誘導(dǎo)化合物，或者入侵的植物病原菌的脅迫，和定量的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列)，它能增加其下游序列的轉(zhuǎn)錄。正如本文舉例具體說(shuō)明的，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在自然界中被發(fā)現(xiàn)位于煙草表-5-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS4)基因的上游，并操縱性地和該基因連接；當(dāng)和一段編碼序列(并且存在操縱性連接的啟動(dòng)子元件，該啟動(dòng)子元件來(lái)源于EAS4基因或一個(gè)異源的可以在植物中表達(dá)的基因)操縱性地連接時(shí)，植物體或植物組織受到潛在植物病原菌(如病毒，真菌或細(xì)菌)的入侵，或者受到綠色木霉纖維素酶等釋放素刺激，或者植物，植物組織和/或植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞受到植物或真菌細(xì)胞壁碎片刺激，這些序列介導(dǎo)該編碼序列可誘導(dǎo)地轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這種潛在的植物病原菌可以是病毒，包括但不限于煙草花葉病毒或煙草葉脈斑駁病毒；細(xì)菌，包括但不限于丁香假單胞菌，野油菜黃單胞菌或根癌農(nóng)桿菌；真菌，包括但不限于疫霉屬之一種(如寄生疫霉)或霜霉之一種(如煙草霜霉)。EAS4啟動(dòng)子包含可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列，它們?cè)诒疚腟EQ ID NO2中列出。在SEQ ID NO2中，EAS4啟動(dòng)子的CAAT同源序列位于第513到516核苷酸，TATA-序列基元位于第540到543核苷酸。
煙草EAS4基因上游區(qū)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的實(shí)例是SEQ ID NO2中458位到473位核苷酸，454位到473位核苷酸和413位到473位核苷酸。
本發(fā)明的另一方面是來(lái)自EAS4啟動(dòng)子和啟動(dòng)子相關(guān)序列的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件。該序列操縱性地連接到一個(gè)起始序列和需要表達(dá)的異源DNA序列的上游。
本發(fā)明的另一方面是經(jīng)過(guò)遺傳改造含有并表達(dá)目的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，植物組織，植株，優(yōu)選編碼序列，反義序列，及其它在可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)之下的序列。本發(fā)明的目的之一是提供一些核苷酸序列，它們能在植物受到釋放素刺激，潛在植物病原菌侵入或一些其它的外源誘導(dǎo)信號(hào)如甲基茉莉酮酸酯和乙烯作用時(shí)介導(dǎo)其下游編碼序列的誘導(dǎo)表達(dá)。釋放素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的實(shí)例之一來(lái)自煙草EAS4基因的5’側(cè)翼序列；正如本文舉例具體說(shuō)明的，這段序列在SEQID NO2的第410位核苷酸到473位核苷酸列出。和這段示例的核苷酸序列等價(jià)的序列是那些能類似指導(dǎo)其下游核苷酸序列誘導(dǎo)表達(dá)的序列。優(yōu)選該可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和EAS4啟動(dòng)子和啟動(dòng)子相關(guān)序列(如兩者的組合如SEQ ID NO2中410位到573位核苷酸所示，優(yōu)選SEQ IDNO2中361位到573位核苷酸，更優(yōu)選SEQ ID NO2中1位到573位核苷酸)相關(guān)聯(lián)。
“抗病調(diào)節(jié)元件”指的是一種能調(diào)節(jié)與植物防御反應(yīng)(如超敏反應(yīng))相關(guān)的基因產(chǎn)物表達(dá)的DNA序列，對(duì)于自然界中的植物體而言，這種植物的防御反應(yīng)用來(lái)對(duì)付病原菌。該術(shù)語(yǔ)也包括足以開(kāi)啟疾病相關(guān)的外源信號(hào)或介質(zhì)(如本文所述的病原菌或釋放素誘導(dǎo)信號(hào)或介質(zhì))誘導(dǎo)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件(以及如下文所述的，調(diào)節(jié)元件的片段)?？偟膩?lái)說(shuō)，抗病調(diào)節(jié)元件位于一個(gè)基因的5’區(qū)，但并不僅限于此。
“可誘導(dǎo)”指一種調(diào)節(jié)元件在植物細(xì)胞和病原菌或釋放素相互作用時(shí)能介導(dǎo)提高的基因表達(dá)(如mRNA或多肽形成)。本發(fā)明也包括以細(xì)胞或組織特異性方式指導(dǎo)可誘導(dǎo)基因表達(dá)的抗病調(diào)節(jié)元件。
“來(lái)源于一個(gè)基因”是指調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列基于天然存在的植物基因(如煙草EAS4基因)中包括的序列信息。一旦確定，本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件既可以從天然資源中取得，也可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)方法(如通過(guò)重組方法或化學(xué)合成方法)制備?？偟膩?lái)講，這種重組的核酸分子與天然存在的可誘導(dǎo)植物抗病調(diào)節(jié)元件至少有80％的同源性，即是說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)DNA序列中高達(dá)20％的堿基對(duì)可以被其它堿基對(duì)置換(如G-C可用T-A，A-T或C-G代替)，只要改造后的序列促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的活性和標(biāo)準(zhǔn)序列相同或更高即可。
“可誘導(dǎo)的植物抗病片段”是指任何長(zhǎng)度的核苷酸，在植物細(xì)胞和病原菌或釋放素相互作用中足以指導(dǎo)增高的基因表達(dá)(如mRNA或蛋白質(zhì)形成)?！捌巍眱?yōu)選長(zhǎng)度為6-10核苷酸。然而，本發(fā)明的DNA調(diào)節(jié)元件長(zhǎng)度范圍在10-100核苷酸，100-300核苷酸，甚至超過(guò)300核苷酸。這種片段通過(guò)常規(guī)方法制備(如適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化或化學(xué)合成得到該片段)?；蛑锌烧T導(dǎo)的植物抗病DNA片段的鑒定可以采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(如本文所述的方法)。在一個(gè)具體實(shí)例中，可誘導(dǎo)的植物抗病片段的鑒定可以采用標(biāo)準(zhǔn)的啟動(dòng)子缺失分析完成。含與報(bào)導(dǎo)基因可操縱地連接并使報(bào)導(dǎo)基因病原菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的抗病啟動(dòng)子的構(gòu)建體可以自5’，3’逐步缺失和/或巢式缺失，直到病原菌對(duì)于報(bào)導(dǎo)基因的作用減弱或消失。為了確證這種病原菌誘導(dǎo)性元件的鑒定，可以向該元件中引入點(diǎn)突變。測(cè)定轉(zhuǎn)錄變化的另一種方法是將推測(cè)的基因調(diào)節(jié)元件連接到報(bào)導(dǎo)基因上。檢測(cè)完整啟動(dòng)子，可將該DNA片段直接置于缺少內(nèi)源啟動(dòng)子活性的報(bào)導(dǎo)基因之前。通過(guò)上述技術(shù)，可鑒定任何可誘導(dǎo)的植物抗病調(diào)節(jié)元件片段。
“組織特異性的”指相對(duì)于另外的組織(如韌皮部)，在一種組織(如木質(zhì)部)中能優(yōu)先增加某種基因產(chǎn)物(如mRNA或多肽)的表達(dá)。
“細(xì)胞特異性的”是指相對(duì)于其它細(xì)胞(如表皮細(xì)胞)，在一種細(xì)胞(如薄壁細(xì)胞)中能優(yōu)先增加某種基因產(chǎn)物(mRNA或多肽)的表達(dá)。
“表-5-馬兜鈴烯(aristocholene)合酶”或“EAS”是一種催化反，反法尼基二磷酸環(huán)化成二環(huán)中間物表-5-馬兜鈴烯(aristocholene)的酶。
“病原菌”是指一種侵染活的植物組織細(xì)胞，刺激該組織產(chǎn)生抗病反應(yīng)的生物。
“釋放素”指任何一種能引發(fā)植物防御反應(yīng)的分子。釋放素的實(shí)例包括但不限于一種或多種毒性離子如汞離子，其它化學(xué)上明確的成分，代謝抑制劑，細(xì)胞壁聚糖，某些糖蛋白，某些酶，真菌孢子，脫乙酰殼多糖，某些脂肪酸，某些植物細(xì)胞壁來(lái)源的寡糖和釋放蛋白(如harpin，cryptogein，pariscein)。
“釋放蛋白”是指一種蛋白質(zhì)釋放素。
“可操縱地連接”是指調(diào)節(jié)序列和基因以這樣一種方式連接，在這種方式下，當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?如轉(zhuǎn)錄活化蛋白)結(jié)合到調(diào)節(jié)序列上時(shí)，調(diào)節(jié)序列允許基因表達(dá)。
“異源多肽”指任何在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中由相對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞部分或全部是外源的(即不是天然存在的)基因表達(dá)的多肽。
“多肽”指任何氨基酸鏈，可以是任意長(zhǎng)度，可以經(jīng)過(guò)翻譯后修飾(如糖基化或磷酸化)。
“轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞”指通過(guò)重組DNA技術(shù)(如本文所述的技術(shù))已向其中(或其上代細(xì)胞中)導(dǎo)入重組的核苷酸序列(如EAS4啟動(dòng)子(-1147到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因或gEAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子parA1成熟釋放蛋白基因)的細(xì)胞。
“植物細(xì)胞”指任一由半透膜包圍自我增殖并含有質(zhì)體的細(xì)胞。其進(jìn)一步增殖也需要細(xì)胞壁。本文中植物細(xì)胞包括但不限于藻類，藍(lán)細(xì)菌，種子，懸浮培養(yǎng)物，胚胎，分生區(qū)，愈傷組織，葉片，根，芽，配子體，孢子體，花粉和小孢子。
“轉(zhuǎn)基因的”指任何含有人工插入其中并且成為由其發(fā)育成的機(jī)體基因組一部分的一段DNA序列的細(xì)胞。在本文中，轉(zhuǎn)基因有機(jī)體一般指轉(zhuǎn)基因植物，人工導(dǎo)入DNA到有機(jī)體的基因組中。
“基本上純的DNA”是指沒(méi)有在提供本發(fā)明DNA的有機(jī)體的天然基因組中位于該基因或調(diào)節(jié)元件側(cè)翼的基因或輔助核苷酸的DNA。該術(shù)語(yǔ)因而包括如插入載體的重組DNA；插入自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒的重組DNA；或插入原核或真核生物基因組的重組DNA；或作為獨(dú)立的分子(如由PCR擴(kuò)增的或限制性內(nèi)切酶切割得到的cDNA，基因組DNA片段或cDNA片段)不依賴于其它序列存在的重組DNA。它也包括作為編碼另外的多肽序列的雜合基因或調(diào)節(jié)元件的一部分的重組DNA。
本發(fā)明的其它特色和優(yōu)點(diǎn)由下面的優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求的敘述中可以體現(xiàn)出來(lái)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1所示為受EAS3和EAS4啟動(dòng)子區(qū)序列調(diào)節(jié)的GUS的瞬時(shí)表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)照為CaMV 35S-GUS構(gòu)建體(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子-β-葡糖醛酸酶報(bào)導(dǎo)基因)。通過(guò)電擊法將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)?！皼](méi)有誘導(dǎo)的”EAS-GUS構(gòu)建體的表達(dá)水平相對(duì)較高，這是因?yàn)樵谥苽湓|(zhì)體時(shí)用到了消化植物細(xì)胞壁的真菌酶。y軸表示GUS活性單位，EAS上游5’端中止的位置列在圖中每一條塊的下面。其上，標(biāo)有相對(duì)于EAS4的自然轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(或相對(duì)應(yīng)的EAS3堿基)的數(shù)目；EAS4(SEQ ID NO2)起點(diǎn)在核苷酸573，EAS3(SEQ IDNO2)可能的起點(diǎn)在核苷酸489處。
圖2A-B所示為本發(fā)明的瞬時(shí)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的信息。圖2A圖解說(shuō)明EAS4啟動(dòng)子區(qū)控制GUS報(bào)導(dǎo)基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。圖2B所示為EAS4啟動(dòng)子相關(guān)序列通過(guò)CaMV 35S最小化啟動(dòng)子控制GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的“功能獲得”方法分析結(jié)果，。在圖2A和2B中，EAS4上游區(qū)核苷酸位置序數(shù)為相對(duì)于EAS4基因天然轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(也可參看SEQ ID NO2，其中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)對(duì)應(yīng)于核苷酸573)的數(shù)目。2A和2B兩圖中，GUS表達(dá)活性用每毫克蛋白質(zhì)的熒光單位表示。
圖3A-B圖解EAS4基因5’上游區(qū)DNA序列和帶有EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)的GUS報(bào)導(dǎo)基因的結(jié)構(gòu)。圖3A所示為為EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)5’上游區(qū)核苷酸序列。CAAT和TATA盒用粗體表示，+1標(biāo)記為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。圖3B圖解說(shuō)明EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的結(jié)構(gòu)。雙元載體pBI101.1中EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)5’側(cè)翼序列和GUS報(bào)導(dǎo)基因按正確的閱讀框連接。
圖4A-B所示為在含EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株根，莖，葉中釋放素誘導(dǎo)的GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)。圖4A曲線圖所示為釋放素誘導(dǎo)煙草葉片GUS報(bào)導(dǎo)基因在18個(gè)小時(shí)中的表達(dá)。06i，08r和09p分別代表不同的含EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)化系。水(作為對(duì)照)和25nM cryptogein同時(shí)對(duì)稱地滲入葉片(遠(yuǎn)軸部位)，然后在18個(gè)小時(shí)內(nèi)取下葉片滲透區(qū)測(cè)定GUS活性。給出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。圖4B是一條形圖，所示為在含EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草莖和根中釋放素誘導(dǎo)的GUS活性。03f和09p代表兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)化系。C-0(空框)代表沒(méi)有釋放素處理的根段和莖段GUS活性；C-18(陰影框)和E-18(實(shí)框)分別表示用水或100nM釋放素cryptogein溫育18小時(shí)后的根段和莖段的GUS活性。每個(gè)轉(zhuǎn)基因系取5個(gè)獨(dú)立的植株計(jì)算。
圖5條形圖所示為轉(zhuǎn)基因煙草中寄生疫霉煙草變種的生理小種0和生理小種1的病原菌誘導(dǎo)的GUS活性。一個(gè)含EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草系(09p)離體葉片以培養(yǎng)2天的寄生疫霉煙草變種菌絲藥栓接種，在27℃，24小時(shí)連續(xù)熒光下培養(yǎng)。對(duì)照葉片以無(wú)菌的燕麥片瓊脂藥栓接種。測(cè)定葉片組織感染區(qū)GUS活性。每條的數(shù)值是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝5)。
圖6是一條形圖，所示為病原菌和釋放素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物GUS活性的比較，病原菌是丁香假單胞菌丁香致病變種61和它的hrpH突變體，釋放素是純化的細(xì)菌釋放素harpin。含有EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草系(09-P)葉片，滲透50μg/mL純化的解淀粉歐文氏菌釋放素harpin，或丁香假單胞菌丁香致病變種61野生型或它的hrpH突變體的細(xì)胞懸液(A600＝0.05)。溫育12個(gè)小時(shí)，隨后檢測(cè)葉片滲透區(qū)GUS活性。對(duì)照值為觀測(cè)到的用水滲透處理的葉組織樣品GUS活性。圖中每條上的數(shù)值為5株植物所得結(jié)果的平均值。
圖7A-B所示為煙草植物組織中5-表-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS)誘導(dǎo)的Western印跡分析。蛋白樣品分別從對(duì)照和釋放素處理的煙草葉片，莖和根中提取。等量蛋白樣品(每泳道取葉片和莖的樣品25ug，取根的樣品15ug)經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)移條帶和EAS抗血清反應(yīng)，然后用偶聯(lián)于堿性磷酸酶的羊抗小鼠抗體顯色。圖7A所示為葉和莖組織樣品Western印跡分析。圖7B所示為根組織樣品Western印跡分析。
圖8A-L的彩圖所示為含EAS4啟動(dòng)子(-1147到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草中釋放素誘導(dǎo)的GUS活性的組織化學(xué)定位。一個(gè)典型轉(zhuǎn)基因煙草系葉片組織經(jīng)25或50nM cryptogein釋放素滲透。經(jīng)過(guò)大約8小時(shí)溫育后，組織切片用1mM X-gluc(5-溴4-氯3-吲哚β-葡糖苷酸)染色分析GUS活性。莖和根段經(jīng)水或100nM釋放素cryptogein滲透約12小時(shí)后顯色。圖8A彩圖為含EAS4啟動(dòng)子(-1147到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中釋放素誘導(dǎo)的GUS活性，誘導(dǎo)劑為兩種釋放素制品cryptogein和parasicein，兩者作用濃度為25nM和50nM(圖中分別表示為C25，C50，P25和P50)。圖8B彩圖為葉片橫切片圖，顯示cryptogein處理后釋放素誘導(dǎo)的GUS活性(放大75X)。圖8C彩圖為莖橫切片圖，顯示用cryptogein處理后釋放素誘導(dǎo)的GUS活性(放大75X)。圖8D-F三個(gè)彩圖所示為圖8C莖GUS染色的橫切片逐步放大(分別放大15X，60X和75X)。圖8G彩圖所示為根尖經(jīng)水處理并染色的GUS活性(放大60X)。圖8H彩圖為根尖縱切片，顯示經(jīng)cryptogein處理后釋放素誘導(dǎo)的GUS活性(放大60X)。圖8I彩圖為根縱切片，顯示經(jīng)水處理并染色的GUS活性(放大75X)。圖8J彩圖所示為根經(jīng)cryptogein處理后GUS活性染色的縱切片(放大75X)。圖8K彩圖所示為根經(jīng)水處理后GUS活性染色橫切片(放大95X)。圖8L彩圖所示為根經(jīng)cryptogeoin處理后GUS活性染色橫切片(放大95X)。C代表cryptogein，P代表parasicein，c代表皮層，ca代表形成層，e代表表皮，p代表柵欄薄壁組織，pe代表周皮，ph代表韌皮部，pi代表髓薄壁組織，s代表海綿薄壁組織，t代表表皮毛，x代表木質(zhì)部，vc代表維管柱。
圖9圖示說(shuō)明得到抗病植株的遺傳工程操作過(guò)程。用PCR技術(shù)分離ParA1釋放蛋白的編碼序列，得到具有BamHI和SstI末端的序列。gEAS4600-GUS-pBI101在EAS啟動(dòng)子的調(diào)控下指導(dǎo)GUS報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)，將其用BamHI和SstI雙酶切后，釋放GUS片段。然后將BamHI/SstI酶切的parA1擴(kuò)增引物連接到gEAS4600-GUS-pBI101消化后產(chǎn)生的大片段上形成gEAS4600-parA1-pBI101。經(jīng)適當(dāng)?shù)尼尫潘卣T導(dǎo)后，植物細(xì)胞或組織通過(guò)gEAS4600-parA1-pBI101合成ParA1釋放蛋白。
圖10是一條形圖，說(shuō)明含有g(shù)EAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子控制的parA1成熟釋放蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum cv.KY160)的不同轉(zhuǎn)基因系經(jīng)離體葉片接種寄生疫霉煙草變種生理小種0或生理小種1的發(fā)病率。y軸為72小時(shí)后葉片壞死斑數(shù)目(每片葉壞死斑點(diǎn)數(shù))。x軸為用于檢測(cè)抗病能力的對(duì)照和不同的轉(zhuǎn)基因煙草系。KY160代表沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的Nicotiana tabacum cv.KY160，G代表獨(dú)立的Nicotianatabacum cv.KY160轉(zhuǎn)基因系，以含gEAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子與GUS融合的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化；M代表獨(dú)立的Nicotiana tabacum cv.KY160轉(zhuǎn)基因系，以含gEAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子與成熟parA1釋放蛋白編碼序列融合的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化；S代表獨(dú)立的Nicotiana tabacum cv. KY160轉(zhuǎn)基因系，以含gEAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子與含有一段信號(hào)肽序列的成熟parA1釋放蛋白編碼序列融合的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。陰影框表示以寄生疫霉煙草變種生理小種0接種離體葉片，實(shí)框表示以寄生疫霉煙草變種生理小種1接種離體葉片。
發(fā)明詳述5-表-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS)是諸如茄科植物中倍半萜植物抗毒素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，這些植物包括但不限于煙草屬的種類(如煙草)，辣椒和鈍天仙子。EAS催化法呢基二磷酸形成(+)gemacrene A，生成桉葉烷碳正離子，最后形成5-表-馬兜鈴烯(aristolochene)，其它一些植物如松柏類植物體內(nèi)也有倍半萜環(huán)化酶。
誘導(dǎo)植物組織或植物細(xì)胞合成植物抗毒素的宿主防御反應(yīng)的物質(zhì)包括疫霉屬細(xì)胞壁碎片和綠色木霉纖維素酶。然而日本曲霉果膠酶不能作為煙草細(xì)胞培養(yǎng)物的釋放素。誘導(dǎo)倍半萜植物抗毒素合成的釋放素是在控制生物合成的關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平上起作用的〔Vogeli和Chappell(1990).植物生理學(xué)941860-1866〕。類似的情況在其它植物中也觀察到了，但是一直沒(méi)有這種介導(dǎo)對(duì)植物病原菌脅迫的基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄控制序列的描述。
煙草(N.tabacum)EAS家族有12-15個(gè)成員，EAS4的編碼序列已經(jīng)發(fā)表〔Facchini和Chappell(1992)同上〕。然而，從那時(shí)起，發(fā)明人注意到EAS3的表達(dá)似乎并不受釋放素的誘導(dǎo)，讓人感到奇怪的是，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物中EAS3上游核苷酸序列似乎不能介導(dǎo)嵌合基因構(gòu)建體的GUS報(bào)導(dǎo)基因?qū)︶尫潘氐恼T導(dǎo)反應(yīng)。要說(shuō)明的是1992年Facchini和Chappell發(fā)表的文章中對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的指定并不正確。如同F(xiàn)acchini和Chappell(1992)上文中出現(xiàn)的一樣，EAS4基因組克隆的核苷酸序列列出在SEQ ID NO7，推斷的氨基酸序列列出在SEQ IDNO8。
植物對(duì)植物病原微生物的侵入和感染的防御的其它方面包括超敏反應(yīng)，其標(biāo)志是組織壞死，即植物病原菌感染處的植物細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。上面所描述的釋放素處理也能誘導(dǎo)壞死反應(yīng)。
釋放蛋白是植物病原真菌產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，能誘導(dǎo)被侵染的植物發(fā)生超敏反應(yīng)。通常，但并不是必然地，定點(diǎn)細(xì)胞死亡是在被感染(或脅迫)的植物組織中釋放蛋白誘導(dǎo)反應(yīng)的結(jié)果。這些反應(yīng)介導(dǎo)對(duì)入侵的，潛在植物病原微生物破壞性感染的完全或部分抗性。從本發(fā)明的目的來(lái)看，在入侵植物組織或在植物組織中表達(dá)其編碼序列后誘導(dǎo)超敏反應(yīng)的植物病原菌或潛在植物病原菌的蛋白質(zhì)，屬于釋放蛋白的廣義定義之列。
了解相對(duì)清楚的植物病原真菌釋放蛋白是寄生疫霉的ParA1蛋白。parA1基因座是一種基因家族中的一員[Ricci等，1989歐洲生物化學(xué)雜志(Eur J.Biochem.)183555-563]。parA1基因產(chǎn)物的核苷酸序列和氨基酸序列由Kamoun等人(1993)在植物-微生物相互作用分子生物學(xué)(Mol. Plant-Microbe Interact.)4423-432上公布，在本文SEQID NO12和SEQ ID NO13中列出。
其它具有潛在釋放蛋白活性的植物病原菌蛋白的氨基酸序列和其它性質(zhì)已經(jīng)鑒定[參見(jiàn)，如Nespoulous等(1992)植物(Planta)186551-557；Huet等(1992)植物化學(xué)(Phytochemistry)311471-1476；Huet和Pernollet(1992)FEBS通訊(FEBS Lett)257302-306；Kamoun等(1993)植物-微生物相互作用分子生物學(xué)(Mol Plant-Microbe Interact)522-33]。一些具有釋放蛋白反應(yīng)活性的病原細(xì)菌的無(wú)毒基因也被鑒定，例如Keen N.T.(1990)在植物病理學(xué)年評(píng)[(Annu.Rev. Phytopathol.)24447-463]中描述了Fulva fulvia的一個(gè)無(wú)毒基因。Hammond-Kosack等(1994)在美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.NatlAcad.Sci USA)9110445-10449中報(bào)導(dǎo)了暗黃枝霉的avr基因，其功能與寄生疫霉釋放蛋白相同。
一些細(xì)菌性植物病原菌也表達(dá)對(duì)超敏反應(yīng)的效應(yīng)類似于寄生疫霉ParA1釋放蛋白的蛋白質(zhì)。從本發(fā)明的目的來(lái)看，這些蛋白質(zhì)屬于“釋放蛋白”范圍。野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種無(wú)毒基因avr Bs3的多個(gè)同源物也存在于其它的野油菜黃單胞菌致病變種[Bonas等(1989)分子發(fā)生遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)218127-136；Knoop等(1991)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1737142-7150]和黃單胞菌屬的其它種類中[De Feyter和Gabriel(1991)植物-微生物相互作用分子生物學(xué)(Mol.Plant-Microbe Interact.) 4423-432；Hopkins等(1992)植物-微生物相互作用分子生物學(xué)(Mol.Plant-MicrobeInteract)5451-459]。丁香假單胞菌番茄致病變種的avrD具有無(wú)毒基因作用；丁香假單胞菌大豆致病變種表達(dá)一個(gè)改變的avrD產(chǎn)物[Kobayashi等(1990)植物-微生物相互作用分子生物學(xué)(Mol.Plant-Microbe Interact.)3103-111]。
可以理解，使用病原菌反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(并具有在這些植物中有功能的最小化啟動(dòng)子)調(diào)控之下表達(dá)的釋放蛋白編碼序列產(chǎn)生具有提高的抗病性的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，釋放蛋白必須能夠促進(jìn)這些植物中防御基因(包括但不限于那些控制植物抗毒素合成的基因，控制超敏反應(yīng)的基因和/或控制定點(diǎn)組織壞死的基因)的表達(dá)才對(duì)本發(fā)明有用。本領(lǐng)域中已發(fā)現(xiàn)植物和植物病原菌的許多功能性組合，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何檢測(cè)特定釋放蛋白在特定的植物組織(或細(xì)胞)中啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡或植物抗毒素合成或類似過(guò)程中的功能。也可以理解，用某些真菌纖維素酶或植物多糖片段等成分處理植物細(xì)胞或組織能誘導(dǎo)宿主防御反應(yīng)(即超敏反應(yīng))。這些處理已經(jīng)作為研究實(shí)際病原菌攻擊或入侵的模型。
非自然產(chǎn)生的重組核酸分子，如重組DNA分子，是一種自然界沒(méi)有的分子，即是說(shuō)，它是經(jīng)過(guò)本領(lǐng)域已知的方法由天然過(guò)程產(chǎn)生的，但是在人為控制之下以產(chǎn)生所需結(jié)果或其是由來(lái)源于異源體的部分人工產(chǎn)生的，這些部分可以是自然產(chǎn)生的，或是化學(xué)合成的分子或由此產(chǎn)生的分子的一部分，并且這些部分通過(guò)連接或本領(lǐng)域中已知的其它方法組合。
轉(zhuǎn)基因植物是一種被遺傳改造的植物，它含有并表達(dá)異源DNA分子，或者作為調(diào)節(jié)RNA分子或者作為蛋白質(zhì)分子。正如本文舉例說(shuō)明的，轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)過(guò)遺傳工程改造，含有并表達(dá)異源DNA分子，該異源DNA分子可操縱地連接到正常情況下不調(diào)節(jié)該異源DNA分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的下面并受其調(diào)控，即處于煙草EAS4基因的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄控制序列的調(diào)節(jié)控制下。在本文中，轉(zhuǎn)基因植物也指由原始轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的后代，原始轉(zhuǎn)基因植物帶有異源編碼序列并能在本文所描述的定性的和/或定量的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)控制下表達(dá)該序列。帶有轉(zhuǎn)基因胚胎的種子也包括在該定義之中。
當(dāng)目的異源基因或編碼序列需要在可能的病原菌入侵或誘導(dǎo)劑(如釋放素)處理時(shí)表達(dá)，這種編碼序列就要以有義方向可操縱地連上適合的啟動(dòng)子，同時(shí)由與啟動(dòng)子作用方向相同的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)序列調(diào)控，有義(即具有翻譯功能)mRNA才能產(chǎn)生。在植物細(xì)胞內(nèi)作用的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以置于編碼序列的下游，在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記可共價(jià)連接于可誘導(dǎo)的表達(dá)單元，使得該DNA分子轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織，其存在可以被篩選出來(lái)，沒(méi)有轉(zhuǎn)化外源DNA的植物細(xì)胞或組織就會(huì)被殺死或出現(xiàn)生長(zhǎng)障礙。同樣地，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中，異源編碼序列可以在可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件的調(diào)控下表達(dá)，加入釋放素到細(xì)胞培養(yǎng)基中會(huì)誘導(dǎo)這種表達(dá)。
要在植物受到微生物病原菌，如植物病原真菌，入侵時(shí)抑制一個(gè)基因的表達(dá)，可以將該基因部分或全部編碼序列或cDNA序列可操縱地連接于能在植物細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子，其方向和啟動(dòng)子方向相反(即按反義方向連接)，這樣轉(zhuǎn)錄RNA序列和mRNA互補(bǔ)，病原菌入侵誘導(dǎo)表達(dá)反義分子。另外，可在指導(dǎo)反義RNA合成的核苷酸序列下游處加上轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
發(fā)明人已分離到一段DNA序列，在植物細(xì)胞受到潛在植物病原菌入侵和/或釋放素或其它化學(xué)信號(hào)處理時(shí)，介導(dǎo)其下游基因的誘導(dǎo)表達(dá)。例如，乙烯和甲基茉莉酮酸酯聯(lián)合作用可以通過(guò)定性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件誘導(dǎo)其下游基因表達(dá)。現(xiàn)在已經(jīng)很清楚，在該調(diào)節(jié)序列中可能存在多個(gè)序列基元，每個(gè)基元對(duì)應(yīng)于一個(gè)或幾個(gè)不同的環(huán)境信號(hào)。如本文舉例具體說(shuō)明的，該轉(zhuǎn)錄控制序列來(lái)源于煙草EAS4基因座，在SEQ ID NO7中列出。推測(cè)的EAS蛋白氨基酸序列在SEQ ID NO8中列出。EAS4基因的開(kāi)放閱讀框在SEQ ID NO7中列出，它包含有6個(gè)內(nèi)含子。
用計(jì)算機(jī)在Genbank中檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)和SEQ ID NO2明顯同源的序列。
Facchini和Chappell(1992，同上)用EAS探針和Southern雜交實(shí)驗(yàn)鑒定了煙草EAS基因的組織結(jié)構(gòu)。在嚴(yán)格雜交條件下，出現(xiàn)了多個(gè)雜交片段，顯示出煙草基因組中EAS是有12-16個(gè)成員的家族。但是，在這些實(shí)驗(yàn)中，用作探針的片段包括EAS編碼序列，而不包括啟動(dòng)子或啟動(dòng)子相關(guān)序列。
用判斷核苷酸序列同源性顯著程度的方法，能在煙草以外的植物中鑒定并分離EAS同源基因，即是說(shuō)，在中等至嚴(yán)格雜交條件下，和煙草EAS編碼序列探針進(jìn)行DNADNA雜交即可鑒定其它植物種類中的相應(yīng)基因。對(duì)雜交條件的討論見(jiàn)Hames和Higgins(1985)核酸雜交(Nucleic Acid Hybrdization，IRL Press，Oxfbrd U.K.)。一般來(lái)說(shuō)，在中等雜交條件下能檢測(cè)到的雜交，說(shuō)明兩序列之間至少有70％的核苷酸同源性。在這些情況下，一般優(yōu)選至少100個(gè)堿基的序列作為探針。本實(shí)驗(yàn)條件下，最優(yōu)選探針來(lái)源于EAS4編碼序列的一部分。對(duì)于雜交探針的標(biāo)記可包括但不限于同位素基團(tuán)，螢光基團(tuán)，結(jié)合有特異結(jié)合的配偶體(其也被標(biāo)記)的配體如生物素。正是通過(guò)標(biāo)記可以檢測(cè)到結(jié)合到靶核酸分子上的探針?；蛘?，熟知的廣泛采用的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)可以方便地?cái)U(kuò)增和靶序列有高度同源性的序列。
現(xiàn)在已經(jīng)知道，除SEQ ID NO7中列出的EAS編碼序列以外，還存在其它的核酸序列，其編碼序列和EAS4編碼序列是功能上同義的。如果核酸序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列相同，這兩個(gè)核酸序列是同義序列。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性是本領(lǐng)域所熟知的，即許多氨基酸，不止有一個(gè)編碼它的核苷酸三聯(lián)體。在蛋白質(zhì)序列中一些氨基酸的替換并不影響該蛋白質(zhì)的功能，這也是生物學(xué)領(lǐng)域所熟知的?？偟膩?lái)說(shuō)，保守氨基酸替換或相似氨基酸替換在不影響蛋白質(zhì)功能時(shí)是可以忍受的。相似氨基酸指氨基酸具有相近的大小和/或電荷性質(zhì)，如，天冬氨酸和谷氨酸，異亮氨酸和纈氨酸都是相似的氨基酸對(duì)。本領(lǐng)域中兩個(gè)氨基酸之間的相似性可以用多種方法進(jìn)行分析。例如，在此引作參考的Dayhoff等(1978)的《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜》(Atlas of Protein Sequence and StructureVol. 5 Suppl.，3pp345-352)中提供了一個(gè)氨基酸替換頻率表，利用表中數(shù)據(jù)可以判斷氨基酸之間的相似性。Dayhoff等的頻率表是通過(guò)比較多種不同進(jìn)化來(lái)源的相同功能的蛋白質(zhì)的氨基酸序列得到的。
萜烯環(huán)化酶基因存在于茄科植物，包括本文公開(kāi)的煙草和鈍天仙子，也存在于唇形科(Labitaceae)和大戟科植物，包括但不限于那些被證明含有高度同源序列的植物，也存在于絕大多數(shù)植物。優(yōu)選EAS4同源物選自茄科。這些序列的鑒定可以通過(guò)下列方法進(jìn)行核酸分子雜交，或在待測(cè)序列克隆到表達(dá)載體中時(shí)，通過(guò)與煙草EAS特異抗體交叉反應(yīng)，或采用本領(lǐng)域已知的其它方法，包括使用相應(yīng)于SEQ ID NO7中的寡核苷酸序列進(jìn)行PCR，優(yōu)選采用EAS編碼序列。采用Vogeli等[1990，植物生理學(xué)(Plant Physiol).93182-187]的方法純化出EAS免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以制備抗體，或使用肽結(jié)合物制備抗體，其中該肽的氨基酸序列來(lái)自EAS氨基酸序列(SEQ ID NO8)的親水部分。在本領(lǐng)域中單克隆抗體和多克隆抗體制備技術(shù)方便可行[參見(jiàn)Campbell(1994)，單克隆抗體技術(shù)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(Monoclonal AntibodyTechnology.Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology)，第十三卷Burdon和Knippenberg編Elsevier，Amsterdam；Harlow和Lane(1988)，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA LaboratoryManual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港(紐約)]。
或者，cDNA文庫(kù)(在表達(dá)載體中)可以用EAS特異性抗體篩選，或者EAS肽特異性抗體可使用EAS蛋白的親水區(qū)的肽序列(SEQ IDNO8)和本領(lǐng)域中相關(guān)的成熟技術(shù)制備。
專業(yè)技術(shù)人員知道可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以可操縱地連接于任何能在植物中作用的啟動(dòng)子；其中調(diào)節(jié)元件和啟動(dòng)子偶聯(lián)，通常所用啟動(dòng)子為截短的(或最小化)啟動(dòng)子，例如截短的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。截短形式的其它組成性啟動(dòng)子也用來(lái)提供CAAT和TATA同源區(qū)；這些啟動(dòng)子序列可由一些基因衍生而來(lái)，如根癌農(nóng)桿菌TDNA基因(如nos，ocs和mas)和植物病毒基因如CaMV19S基因?？梢岳斫鈱I(yè)技術(shù)人員的目的是確定用于可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的特定啟動(dòng)子。也可以理解當(dāng)一個(gè)能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡反應(yīng)的蛋白的要表達(dá)時(shí)，優(yōu)選在沒(méi)有誘導(dǎo)因子存在時(shí)，沒(méi)有基本轉(zhuǎn)錄(和翻譯)表達(dá)?？烧T導(dǎo)基因產(chǎn)物對(duì)于產(chǎn)生它的植物細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性時(shí)，在應(yīng)用這種基因表達(dá)時(shí)，盡量減少基本表達(dá)量就不是很重要。
最小化啟動(dòng)子含有RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始必需的DNA序列信號(hào)。對(duì)于RNA聚合酶II啟動(dòng)子，它有一個(gè)TATA同源序列基元位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約20-50bp處，一個(gè)CAAT同源序列基元位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約50-120bp處。專業(yè)人員習(xí)慣于用核苷酸數(shù)目表示位置，即從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開(kāi)始向上游(5’方向)逐漸增加。通常，最小化啟動(dòng)子控制的轉(zhuǎn)錄水平比較低，對(duì)于植物組織受到的環(huán)境信號(hào)或發(fā)育信息沒(méi)有正的或負(fù)的反應(yīng)。一個(gè)適合于植物的最小化啟動(dòng)子的實(shí)例是截短的CaMV 35S啟動(dòng)子，它由35S基因的-90到+8區(qū)段組成。
可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(定性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)位于EAS4基因相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的-167到-100區(qū)段(在SEQ ID NO2中的核苷酸406-473，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位于573核苷酸處)?？梢岳斫?，可能有多個(gè)序列基元能對(duì)特定的刺激發(fā)生反應(yīng)。將該序列可操縱地置于在植物細(xì)胞中有功能的最小化啟動(dòng)子的上游，就可使可操縱地融合于啟動(dòng)子下游的編碼序列，如異源編碼序列可誘導(dǎo)地表達(dá)。專業(yè)技術(shù)人員懂得編碼序列翻譯表達(dá)必要的空間及其它條件。這種異源編碼序列優(yōu)選是植物病原微生物(如病毒，細(xì)菌或真菌)釋放蛋白樣的蛋白質(zhì)編碼序列，如寄生疫霉parA1基因產(chǎn)物(釋放蛋白)的編碼序列，其中需要通過(guò)對(duì)入侵的潛在植物病原菌的超敏反應(yīng)的抗病性。一些植物病原細(xì)菌的harpin蛋白也能作為EAS4衍生的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)的表達(dá)的誘導(dǎo)物，加入EAS4基因另外的5’側(cè)翼序列能增加下游基因的表達(dá)水平。優(yōu)選使用EAS4序列-266到+1區(qū)(SEQ ID NO2核苷酸307到573)，更優(yōu)選的序列包括-567到+1(SEQ ID NO2核苷酸1到573)。
和融合EAS4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和異源最小化啟動(dòng)子等效的方法是使用與上游的啟動(dòng)子相關(guān)調(diào)節(jié)元件結(jié)合的EAS4啟動(dòng)子區(qū)。這樣應(yīng)用時(shí)，可用核苷酸307到463，為更大程度地調(diào)節(jié)下游序列的轉(zhuǎn)錄，更優(yōu)選SEQID NO2中核苷酸371到463，311到462，10到573。
象煙草這樣的植物中，瞬時(shí)的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件在植物病原菌入侵或一些成分如真菌纖維素酶和一些植物和真菌細(xì)胞壁碎片處理時(shí)介導(dǎo)下游基因表達(dá)的誘導(dǎo)。能開(kāi)啟這種表達(dá)的植物病原菌包括但不限于黃單胞菌屬，丁香假單胞菌，疫霉屬的種類包括寄生疫霉，和霜霉屬的種類(如煙草霜霉)。
將適合于植物中表達(dá)的編碼序列可操縱地置于調(diào)節(jié)啟動(dòng)子構(gòu)建體下游。可用嵌合基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，嵌合基因基本上由調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，任何其它的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列，帶有翻譯必需信號(hào)序列的所需編碼序列。其中抗病性最好在轉(zhuǎn)基因植物組織受到潛在植物病原菌侵害或用釋放素或其它能誘導(dǎo)EAS4基因表達(dá)的化學(xué)信號(hào)處理時(shí)誘生。編碼序列優(yōu)選編碼植物病原微生物的釋放蛋白，如寄生疫霉的parA1基因產(chǎn)物[如同Kamoun等所述(1993)，同上]。其它釋放蛋白樣蛋白在普通科學(xué)文獻(xiàn)中有報(bào)導(dǎo)，包括來(lái)源于疫霉屬，霜霉屬和黃單胞菌屬的種類以及其它種類的蛋白。
其它可以在目前的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄序列調(diào)控下表達(dá)從而增強(qiáng)(轉(zhuǎn)基因)植物或植物組織對(duì)于植物病原病毒，細(xì)菌和真菌的抗性的編碼序列包括但不限于幾丁質(zhì)酶，TMV殼蛋白或其它植物病毒殼蛋白，NIa病毒基因等。
另外，或可選擇地，調(diào)節(jié)性構(gòu)建體的誘導(dǎo)性可以被誘導(dǎo)，例如用釋放蛋白或病毒，細(xì)菌或真菌(優(yōu)選不是宿主植物病原菌)處理轉(zhuǎn)基因植物或組織，這些處理物質(zhì)能通過(guò)不能開(kāi)啟HR的編碼序列的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件誘導(dǎo)表達(dá)，或者直接獲得抗病性狀。這些可以優(yōu)先表達(dá)的編碼序列包括殺蟲(chóng)蛋白如蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白之一種，其表達(dá)能使植物免于有害昆蟲(chóng)的傷害。
由天然EAS4基因合成植物抗毒素或由本發(fā)明的調(diào)節(jié)性EAS4啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件與至少一種外源最小化啟動(dòng)子結(jié)合介導(dǎo)的基因表達(dá)誘導(dǎo)合成植物抗毒素，可通過(guò)使用多種明確的化學(xué)品、粗真菌培養(yǎng)物濾液、真菌細(xì)胞壁提取物和來(lái)自植物或真菌細(xì)胞壁的寡糖處理植物組織或細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)〔Albersheim和Valent(1978)細(xì)胞生物學(xué)雜志78627-643〕。能夠誘導(dǎo)HR的其它化合物包括某些纖維素酶，如綠色木霉纖維素酶和某些植物或真菌細(xì)胞壁的碎片等。
轉(zhuǎn)基因植物可以由本領(lǐng)域已知的任何方法得到，這些方法包括但不限于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，優(yōu)選用沒(méi)有攻擊力的T-DNA載體，電擊法，DNA直接轉(zhuǎn)移和粒子轟擊法[參見(jiàn)Davey等(1989)，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，13275，Walden和Schell(1990)，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur J.Biochem.)，192563，Joersbo和Burnstedt(1991)，植物生理學(xué)(Physiol.Plant)，81256；Potrykus(1991)，植物生理學(xué)及植物分子生物學(xué)年評(píng)(Annu.Rev Plant Physiol Plant Mol.Biol.)，42205；Gasser和Fraley(1989)，科學(xué)(Sci.)，2441293；Leemans(1993)，生物技術(shù)(Bio/Technology)，11522；Beck等(1993)，生物技術(shù)(Bio/Technology)111524；Koziel等(1993)生物技術(shù)(Bio/Technology)，11194；和Vasil等(1993)生物技術(shù)(Bio/Technology)，111533]。將DNA導(dǎo)入雙子葉和單子葉植物的技術(shù)在本領(lǐng)域中已經(jīng)比較成熟，同樣培養(yǎng)和再生這些植物組織的技術(shù)也十分成熟。包括小麥，玉米，大麥，水稻和天門冬屬植物的單子葉植物已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)化和再生。例如美國(guó)專利號(hào)5,350,689(1994，Shillito等)描述了轉(zhuǎn)基因玉米由原生質(zhì)體和原生質(zhì)體衍生細(xì)胞的再生。為了有效地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，用具有較高再生能力的植物組織來(lái)轉(zhuǎn)化是十分重要的。轉(zhuǎn)基因山楊組織已經(jīng)獲得并再生出轉(zhuǎn)基因植株(Devellard等(1992)C.R.Acad.Sci.Ser VIE 314291-298K；Nilsson等(1992)轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Res.)1209-220；Tsai等(1994)植物細(xì)胞報(bào)告(Plant Cell Rep.)1494-97)。楊樹(shù)也已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功[Wilde等(1992)，植物生理學(xué)(Plant Physiol)98114-120]。實(shí)驗(yàn)室操作，轉(zhuǎn)化和再生裸子植物的技術(shù)也已成功。例如美國(guó)專利號(hào)5,122,466(1992，Stomp等)描述了松柏類植物的生物導(dǎo)彈法轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的靶組織為分生組織，子葉和下胚軸。美國(guó)專利號(hào)5,041,382(1991，Gupta等)描述了松樹(shù)胚性細(xì)胞的富集方法。
轉(zhuǎn)化外源DNA到植物細(xì)胞和/或組織和篩選陽(yáng)性群體的技術(shù)及試劑已廣為人知。篩選植物細(xì)胞中外源DNA的遺傳標(biāo)記已眾所周知，如帶有抗生素抗性的基因，抗生素如卡那霉素，潮霉素，慶大霉素或博來(lái)霉素等。這些標(biāo)記使得篩選在含有適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞成為可能，因?yàn)樗鼈儙в邢鄳?yīng)的抗性基因。
其它采用表達(dá)盒的植物細(xì)胞和/或組織遺傳操作方法包括以下步驟先融合可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或嵌合啟動(dòng)子和異源編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列，將融合基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，電擊，微注射，粒子轟擊法或其它本領(lǐng)域中已知的方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織。表達(dá)盒最好還包括在植物細(xì)胞中選擇異源DNA的標(biāo)記，如帶有抗生素抗性的基因，抗生素如卡那霉素，潮霉素，慶大霉素或博來(lái)霉素。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，尤其是可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(或具有可誘導(dǎo)的和優(yōu)選轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列的EAS4啟動(dòng)子)對(duì)于控制懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞基因表達(dá)是十分有用的，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物表達(dá)作為轉(zhuǎn)基因植物體表達(dá)的替代物。例如，含有轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件的EAS4啟動(dòng)子可用于介導(dǎo)一個(gè)或幾個(gè)異源編碼序列在懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的表達(dá)。需要時(shí)，可以加入釋放素或其它誘導(dǎo)性化學(xué)信號(hào)物質(zhì)到培養(yǎng)物中誘導(dǎo)目的編碼序列表達(dá)。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于釋放素的反應(yīng)確實(shí)可以同完整植株相比較。異源編碼序列編碼的蛋白質(zhì)能介導(dǎo)藥物化合物的合成，如聚β-羥基丁酸合成或其它次生代謝物，纖維素，淀粉，糖，油脂，或者該異源序列也編碼藥物蛋白，殺蟲(chóng)毒蛋白，抗真菌蛋白，抗病毒蛋白(如調(diào)節(jié)抗病毒感染的殼蛋白)，Nla蛋白，幾丁質(zhì)酶，葡聚糖酶，雄性不育蛋白或序列，改善營(yíng)養(yǎng)成分質(zhì)量或含量的蛋白，或涉及發(fā)育和/或組織特異程序或型式的蛋白。可以理解，轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞一樣可以用于表達(dá)異源編碼序列。
轉(zhuǎn)基因植物被誘導(dǎo)合成植物抗毒素或表達(dá)處于EAS4啟動(dòng)子或由EAS4啟動(dòng)子衍生而來(lái)的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和/或EAS4啟動(dòng)子衍生的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列調(diào)控之下的異源編碼序列時(shí)，釋放素必須穿過(guò)植物角質(zhì)層才能發(fā)揮作用?；蛘呤怪参锝M織形成傷口，從而易于或允許吸收釋放素到其內(nèi)部。各種各樣的誘導(dǎo)成分，包括釋放素和其它化學(xué)信號(hào)，如乙烯和甲基茉莉酮酸酯組合，都能有效地吸收到轉(zhuǎn)基因植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)，這種培養(yǎng)物對(duì)于釋放素的吸收和/或感受很少有障礙。乙烯和甲基茉莉酮酸酯誘導(dǎo)基因表達(dá)時(shí)，乙烯的使用濃度為約1-50ppm，甲基茉莉酮酸酯使用濃度為約0.1mM到1mM。
下述實(shí)施例運(yùn)用了多種技術(shù)，這些技術(shù)對(duì)分子生物學(xué)，在植物組織中進(jìn)行重組DNA操作和轉(zhuǎn)基因植株再生培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知易行的。所用的酶均是商業(yè)化產(chǎn)品，根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明或作一些本領(lǐng)域所熟知的修改后使用。試劑，緩沖液和培養(yǎng)條件均是本領(lǐng)域已知的。提供標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)操作指南的參考書(shū)有Sambrook等(1989)分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview；NY；R Wu編輯(1993)酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，218；Wu等編輯酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，100和101；Glover編輯(1985)DNA克隆(DNA Cloning)，卷I和II，IRL出版社Oxford，UK；Hames和Higgins編輯(1985)核酸雜交(Nuceic Acid Hybridization)，IRL出版社Oxford，UK。有關(guān)操作，轉(zhuǎn)化植物組織的參考資料有R.A.Dixon(1985)編輯植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐方法(Plant Cell CultureA Practical Approach)，IRL出版社，Oxford，UK，Schuler and Zielinski(1989)植物分子生物學(xué)方法(Methods in Plant Molecular Biology)，Academic出版社，San Diego，CA；Weissbach and Weissbach(1988)編輯植物分子生物學(xué)方法(Methods in Plant Molecular Biology)，Academic出版社，San Diego，CA；I Potrykus(1991)植物生理學(xué)及植物分子生物學(xué)年評(píng)(Annu RevPlant Physiol.Plant Mol.Biol.)，42205；Weising等(1988)遺傳學(xué)年評(píng)(Annu.Rev.Genet.)22421；van Wordragen等(1992)植物分子生物學(xué)報(bào)告(Plant Mol.Biol.Rep)1912；Davey等(1989)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)13273；Walden and Schell(1990)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)192563；Joersbo and Brunstedt(1991)植物生理學(xué)(Physiol.Plant)81256和其它前面所提到的文獻(xiàn)。所采用縮寫(xiě)和名稱均被本領(lǐng)域視為標(biāo)準(zhǔn)用法并普遍地用于所引用的專業(yè)期刊上。
本申請(qǐng)所有引用的文獻(xiàn)在此引作參考。
下述的實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明，并非有意限制本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。專業(yè)技術(shù)人員對(duì)列舉的成分和方法的任何變動(dòng)都在本發(fā)明的范圍之列。
實(shí)施例實(shí)施例1 EAS特異抗體煙草EAS特異性單克隆和多克隆抗體按Vogeli等(1990)[植物生理學(xué)(Plant Physiol.)93182-187]所述方法制備。另一種制備多克隆抗體的方法是利用純化的EAS作為抗原或用眾所周知的方法將多肽序列接上一個(gè)載體蛋白作為抗原。用于抗體制備的氨基酸序列選自蛋白質(zhì)上一段特異的親水區(qū)(關(guān)于抗體制備技術(shù)，可以參看Campbell(1994)，單克隆抗體技術(shù)，生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(MonoclonalAntibody Technology，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology)，Vol.13 Burdon和Rnippenberg編輯Elsevier，Amsterdam；Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港NY)。
實(shí)施例2 DNA和蛋白質(zhì)序列測(cè)定單鏈和雙鏈DNA序列測(cè)定使用雙脫氧鏈中止法[Sanger等(1977)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)748073-8077]，采用美國(guó)生物化學(xué)公司(Cleveland，OH)測(cè)序試劑盒或熒光自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
實(shí)施例3全長(zhǎng)EAS克隆的構(gòu)建終濃度0.5ug/mL的綠色木霉纖維素酶(Type RS，Onozuka)處理處于快速生長(zhǎng)期的N.tabacumL.cv.KY14細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，誘導(dǎo)EAS表達(dá)。設(shè)置同樣的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，不加纖維素酶作為對(duì)照。加入纖維素酶釋放素到誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中4小時(shí)后，用溫和真空過(guò)濾法收集細(xì)胞。
由釋放素處理4小時(shí)后的煙草細(xì)胞提取PolyA+RNA，用pcDNAII(Invitrogen，San Diego，CA)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。采用示差雜交法使用由誘導(dǎo)和對(duì)照材料提取的PolyA+RNA篩選文庫(kù)。進(jìn)一步用篩選雜交選擇-體外翻譯-免疫沉淀法分析所得陽(yáng)性克隆，該方法見(jiàn)Alwine等(1979)酶學(xué)方法(Methods in Enzymol)，68220-242。
推測(cè)的陽(yáng)性EAS cDNA克隆作為雜交探針?lè)蛛x其它c(diǎn)DNA和基因組克隆。所篩選的基因組文庫(kù)是用N.tabacumL.cv.NK326下胚軸DNA經(jīng)MboI部分酶切后在λEMBL3中構(gòu)建(Clonetech Palo Alto，CA)。這樣篩選出8個(gè)獨(dú)立克隆，每個(gè)分別代表一個(gè)不同的染色體基因座。EAS4和EAS3基因組克隆由Facchini和Chappell(1992，同上)發(fā)表，現(xiàn)在知道它并不是完整序列。
Facchini和Chappell(1992，同上)當(dāng)時(shí)錯(cuò)誤地鑒定此處所述的基因組克隆中EAS3和EAS4編碼序列的起點(diǎn)。EAS3和EAS4編碼序列正確的翻譯起點(diǎn)被確定為位于原先鑒定的起點(diǎn)ATG上游165bp處的蛋氨酸密碼子。EAS4的正確起點(diǎn)是用鑒定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的引物延伸法和如上述的純化酶的額外N-端氨基酸序列信息共同得到的。
通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)制備110bp擴(kuò)增引物，以提供對(duì)應(yīng)于EAS4蛋白56-92位氨基酸[見(jiàn)SEQ ID NO12和Facchini和Chappell(1992)同上]的DNA序列。此擴(kuò)增引物作為雜交探針在pcdNAII(Invitrogen，San Diego，CA)中篩選cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)來(lái)自于釋放素(綠色木霉纖維素酶)處理4小時(shí)的煙草細(xì)胞培養(yǎng)物的PolyA+RNA。獲得該擴(kuò)增引物所用的引物為有義引物(ATGCTGTTAGCAACCGGAAGG，SEQ ID NO3)；反向引物(ATCCAAAATCTCATCAATTTC；SEQ ID NO4)；擴(kuò)增模板為基因組EAS4，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增[Saiki等(1988)科學(xué)(Science)239487-491]，110bp擴(kuò)增引物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后用DE-81濾紙(Whatman International，Inc.Clifton，NJ)分離。分離的片段隨后采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)以[α-32P]-dCTP標(biāo)記，作為雜交探針篩選上述cDNA文庫(kù)粗篩克隆[Hanahan和Meselson(1980)，基因(Gene)1063-67]。這些實(shí)驗(yàn)所得的最長(zhǎng)的片段似乎也缺少5’端編碼區(qū)的80bp。
為了得到全長(zhǎng)的克隆，采用RT/PCR方法。由經(jīng)釋放素誘導(dǎo)后的煙草細(xì)胞制備的PolyA+RNA合成第一鏈cDNA[Facchini和Chappell(1992)，同上]，采用的反向引物為ATGAGTCCTTACATGTGA(SEQ ID NO5)。該序列對(duì)應(yīng)于翻譯起點(diǎn)下游的459-477核苷酸。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為10ul(1ug PolyA+RNA，25pmol反向引物，10mM DTT，dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mM，8單位RNase Block[(Stratagene，La Jolla，CA)，根據(jù)商家(Stratagene)提供的說(shuō)明使用第一鏈合成緩沖液，37℃反應(yīng)1小時(shí)。99℃處理5分鐘終止反應(yīng)。加入40μl主PCR混合物到第一鏈反應(yīng)中，主PCR混合物含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％Tween-20，0.01％(W/V)明膠，0.01％NP-40，2.5mM各種dNTP，1單位TaqI聚合酶，25pmol正向引 物(GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGCAGTTGCAAACTAT，SEQ ID NO6，EcoRI和NcoI識(shí)別位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出，ATG轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)用粗體標(biāo)出)。PCR反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行[Back等(1994)，生物化學(xué)和生物物理雜志(Arch.Biochem.Biophys)315523-532]。
492 bp擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI和HindIII消化后，亞克隆到同樣消化的載體pBluescript SK(Stratagene)上。來(lái)自另一個(gè)部分消化的cDNA克隆的HindIII/XhoI片段克隆到5’端序列克隆的相應(yīng)位點(diǎn)，形成一個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆，命名為pBSK-TEAS。用pBSK-TEAS DNA使用CaCl2法〔Sambrook等(1989)同上〕轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1。插入片段的序列分析證實(shí)該質(zhì)粒具有預(yù)期和期望的結(jié)構(gòu)(雙脫氧鏈終止法，美國(guó)生物化學(xué)公司，Cleveland，OH)。
實(shí)施例4 EAS同源序列的鑒定。
按Murray和Thompson(1980)所述的方法[核酸研究(NucleicAcids Research)84321-4325]分離煙葉基因組DNA。用適當(dāng)限制酶消化樣品后，消化的DNA樣品采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，按大小分離的DNA分子轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用隨機(jī)引物放射標(biāo)記的cEAS1對(duì)DNA印跡進(jìn)行雜交，cEAS1在編碼序列的5’端截?cái)郲按Sambrook等(1989，同上)方法制備]，雜交在60℃下進(jìn)行，雜交體系為0.25M磷酸鈉緩沖液pH8.0，0.7％SDS，1％牛血清白蛋白，1mM EDTA。雜交膜在45℃下以2 X SSC，0.1％SDS洗兩次，；在0.2XSSC，0.1％SDS中洗兩次，(1 X SSC為0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉pH7.0)。相對(duì)雜交水平用圖像測(cè)密計(jì)(MilliGen/Biosearch，Ann Arbor，MI)測(cè)定放射自顯影圖確定。
Facchini和Chappell(1992，同上)曾報(bào)導(dǎo)Southern雜交顯示煙草基因組EAS同源體有12-16拷貝。為了證實(shí)大量的煙草EAS同源序列的存在，和這些序列在每個(gè)基因組的表觀數(shù)目，使用從其它植物中分離的DNA進(jìn)行Southern雜交分析。
經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后基因組DNA經(jīng)瓊脂糖電泳(0.8％瓊脂糖)分離后，轉(zhuǎn)移至Hybond-N+膜(Amersham Corp，Arlington Heights，IL)上。含EAS編碼序列的探針經(jīng)同位素標(biāo)記，雜交基本上按Sambrook等(1989，同上)方法進(jìn)行。采用中等強(qiáng)度雜交條件(4×SSC，65℃)，最后一次漂洗用1×SSC，65℃。
或者，采用熟知的方法進(jìn)行PCR，用靶DNA作為模板，反應(yīng)引物來(lái)自EAS4編碼序列中高度保守區(qū)(見(jiàn)SEQ ID NO7)。
實(shí)施例5 EAS蛋白的檢測(cè)采用Facchini和Chappell(1992，同上)和Back等(1994)[生物化學(xué)和生物物理雜志(Arch.Biochem.Biophys.)315527-532]的方法可以鑒定表達(dá)產(chǎn)物是否有酶的活性。
檢測(cè)EAS交叉反應(yīng)蛋白的存在，先提取總蛋白質(zhì)，100ul細(xì)菌培養(yǎng)物于微量離心機(jī)上離心2分鐘收獲并濃縮。去掉上清液，菌體沉淀重新懸浮于100ul 50mM Tris-HCl，pH6.8，10mM二硫蘇糖醇，2％十二烷基硫酸鈉，0.01％溴酚蘭，10％甘油，取15ul樣品經(jīng)11.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行免疫測(cè)定。35ul樣品同樣電泳后用于考馬斯亮藍(lán)染色。對(duì)可溶性蛋白樣品分析，細(xì)胞如測(cè)定酶活性的方法同樣處理(見(jiàn)Back等(1995)，同上或Facchini和Chappell(1992)同上)。取10ul按上述方法電泳后作免疫測(cè)定，10-50ul樣品電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。
樣品電泳后蛋白以考馬斯亮藍(lán)色，或如文獻(xiàn)〔見(jiàn)Towbin和Gordon(1984)免疫方法雜志72313-340〕所述將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，進(jìn)行免疫測(cè)定。5％低脂牛奶(用lXTBS配制，TBS20mMTris-HCl，pH7.5，500mM氯化鈉)溫育30分鐘，硝酸纖維素膜在含抗煙草EAS的單克隆抗體[1∶1000稀釋，Vogeli等(1990)植物生理學(xué)93182-187]的同樣緩沖液中溫育過(guò)夜，羊抗小鼠抗體連接于堿性磷酸酶，專門的顯色劑隨后進(jìn)行溫育以顯示EAS特異抗體與固定在硝酸纖維素膜上的蛋白的結(jié)合[Leary等，1983，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad Sci USA)，804045-4049]。
實(shí)施例6基因組EAS4克隆。
Facchini和Chappell(1992，同上)所述的5’截短的cDNA克隆cEAS1作為雜交探針，篩選用λEMBL3載體(Clontech，Palo Alto，CA)構(gòu)建的N.tabacumcv.NK326基因組文庫(kù)，采用常規(guī)亞克隆和DNA序列分析方法測(cè)定DNA序列。
EAS4基因組克隆DNA序列和由此推出的氨基酸序列列于SEQ IDNO7-8。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生為了分析EAS4基因上游非翻譯區(qū)部分的功能，DNA上游HindIII/Bam HI片段克隆到質(zhì)粒pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)中，這樣能監(jiān)視轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中β-葡糖醛酸酶(GUS)報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)。EAS3基因的5’側(cè)翼序列列出在SEQ ID NO1中，EAS4基因的5’側(cè)翼序列列出在SEQ ID NO2中。上述這些序列中翻譯起始位點(diǎn)(ATG)是最后三個(gè)核苷酸。通過(guò)引物延伸技術(shù)，EAS4轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)估計(jì)在SEQ ID NO2的573核苷酸處，CAAT盒和TATA盒基元分別標(biāo)記在SEQ ID NO1的429到432和456到459核苷酸處(EAS3)，在SEQ ID NO2的513到516和540到543核苷酸處(EAS4)。
采用修改的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。含有待導(dǎo)入植物組織的DNA的重組質(zhì)粒通過(guò)和大腸桿菌TB1(pBK2013)進(jìn)行三親交配，轉(zhuǎn)移至根癌農(nóng)桿菌菌株GV3850。處于不同生長(zhǎng)階段的煙草葉片切成1cm2大小，浸入農(nóng)桿菌懸液中(大約104到105細(xì)菌/ml)。3-10分鐘后，用無(wú)菌水漂洗小葉片，除去多余的農(nóng)桿菌，以減少在處理葉片中由于多余細(xì)菌生長(zhǎng)帶來(lái)的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)短暫干燥(30-60秒)后，處理葉片放在沒(méi)有加抗生素的植物組織培養(yǎng)基上，促進(jìn)葉片感染和DNA從細(xì)菌到植物組織的轉(zhuǎn)移。每升植物組織培養(yǎng)基含有4.31gMurashige和Skoog基礎(chǔ)鹽混合物(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)，2.5mg芐胺基嘌呤(溶于1N NaOH)，10ml 0.1mg/mL吲哚乙酸溶液，30g蔗糖，2mL Gamborg's維生素溶液(Sigma Chermical Co，St.Lousis，MO)和8g瓊脂。pH用NaOH調(diào)節(jié)在5.5到5.9之間，兩天后，葉片轉(zhuǎn)移至含有300ug/mL卡那霉素，500ug/mL噻吩甲氧頭孢菌素(Merck，Rahway，NJ)的植物組織培養(yǎng)基上，卡那霉素用于篩選轉(zhuǎn)化植物組織，噻吩甲氧頭孢菌素用于抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。
轉(zhuǎn)化過(guò)程中盡量減少外植物接觸農(nóng)桿菌的時(shí)間，從而避免在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞過(guò)程中調(diào)節(jié)性parA1編碼序列誘導(dǎo)表達(dá)，一旦ParA1表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡反應(yīng)。相應(yīng)地，將含可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制下的細(xì)胞自殺基因的異源DNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞的生物導(dǎo)彈法，是另一種很實(shí)用的轉(zhuǎn)化技術(shù)，因?yàn)樗恍枰棉r(nóng)桿菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞壁降解酶(它們用于產(chǎn)生原生質(zhì)體，供電擊轉(zhuǎn)化)，這兩者可以誘導(dǎo)在調(diào)節(jié)元件控制下的編碼序列。
轉(zhuǎn)基因植物的再生基本上按Horsch等(1985)[科學(xué)(Science)2271229-1231]所述方法進(jìn)行。
得到的轉(zhuǎn)基因植株在沒(méi)有誘導(dǎo)(對(duì)照)和誘導(dǎo)處理?xiàng)l件下，如Jefferson等[1987，EMBO J.63901-3907]所述，用5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸來(lái)檢測(cè)β-葡糖醛酸酶(GUS)報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)。誘導(dǎo)條件是在轉(zhuǎn)基因煙草組織胞外施用綠色木霉纖維素酶[用自動(dòng)加樣器加入50-100ul或10-100nM蛋白(如cryptogein)誘導(dǎo)成分至間質(zhì)組織]，對(duì)照不用纖維酶釋放素，但要進(jìn)行同樣操作。在一些實(shí)驗(yàn)中，用刀片劃開(kāi)煙草組織，以利于誘導(dǎo)化合物進(jìn)入細(xì)胞。
實(shí)施例8啟動(dòng)子和啟動(dòng)子相關(guān)區(qū)的缺失分析在其它反應(yīng)中，包含于相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-567到+67序列(SEQ IDNO2 EAS4核苷酸6到642)的EAS4衍生DNA序列替換GUS報(bào)導(dǎo)基因載體pBI221(Clonetech，Palo Alto，CA)中的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子〔Benfey等(1990 EMBO Journal)，91677-1684〕。EAS4上游區(qū)的缺失突變體用限制性內(nèi)切酶處理后分離。在電轉(zhuǎn)移的煙草細(xì)胞原生質(zhì)體(圖1)和穩(wěn)定的煙草轉(zhuǎn)化系(圖2A和表1)中對(duì)gEAS啟動(dòng)子-GUS構(gòu)建體進(jìn)行了分析。瞬時(shí)表達(dá)的初步數(shù)據(jù)表明SEQ ID NO1對(duì)釋放素誘導(dǎo)性沒(méi)有作用，SEQ ID NO2在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起作用。
各種EAS3和EAD4啟動(dòng)子-GUS報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)建體導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體，基因瞬時(shí)表達(dá)數(shù)據(jù)列出在圖1。從EAS4啟動(dòng)子5′端逐步缺失導(dǎo)致表達(dá)水平的降低，但-262，-202和-110構(gòu)建體(相對(duì)于SEQ IDNO2轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)573核苷酸處)保持誘導(dǎo)性。這些數(shù)據(jù)表明用兩種EAS3啟動(dòng)子區(qū)構(gòu)建體，GUS表達(dá)水平很低。同樣，只用CaMV 35S啟動(dòng)子時(shí)，釋放素處理沒(méi)有誘導(dǎo)效果。
圖2A-2B的數(shù)據(jù)顯示，缺失-567到-160區(qū)段遺傳物質(zhì)能降低下游基因表達(dá)水平，但并不能破壞表達(dá)的誘導(dǎo)性。因此，-567到-160之間DNA片段似乎有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性表現(xiàn)在-567到-212區(qū)段，但也有一些增強(qiáng)活性受相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-212到-160區(qū)段介導(dǎo)(在SEQ ID NO2中，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是核苷酸573，-567是核苷酸1，-212是核苷酸361，-160是核苷酸413)圖2B所示的功能獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，介導(dǎo)對(duì)釋放素處理的誘導(dǎo)反應(yīng)必需的DNA序列在相對(duì)于EAS4轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-160到-87之間，(即SEQ ID NO2中，核苷酸413和486之間)。在這些實(shí)驗(yàn)中，EAS4衍生序列置于一個(gè)截短的CaMV 35S啟動(dòng)子之前〔Benfey等(1990)EMBO J，91677-1684〕。此圖也說(shuō)明EAS4衍生轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)與異源最小化啟動(dòng)子融合時(shí)也能起作用。
在對(duì)其它轉(zhuǎn)化體的更廣泛分析中，或者是整個(gè)EAS4上游序列-567到+67或者是其5′缺失片段插入載體pBI101(Clonetech，Palo Alto，CA)中GUS(β-葡糖醛酸酶)報(bào)導(dǎo)基因的上游位置，然后分析在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下GUS報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)水平。雖然其它上游序列的存在可以介導(dǎo)表達(dá)活性增強(qiáng)，但EAS4基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游160bp序列足以指導(dǎo)調(diào)節(jié)GUS報(bào)導(dǎo)基因的調(diào)節(jié)性表達(dá)。在電擊轉(zhuǎn)移原生質(zhì)體中，含EAS4轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游最少167bp的構(gòu)建體能提供瞬時(shí)基因表達(dá)，并且使GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)受釋放素誘導(dǎo)(基因表達(dá)提高至少2.5倍)。相反，EAS3上游序列(SEQ ID NO1)在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，似乎不能支持報(bào)導(dǎo)基因高水平表達(dá)，也不能使下游基因受釋放素誘導(dǎo)。
有時(shí)，可以預(yù)期釋放素誘導(dǎo)的GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)出現(xiàn)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中，因?yàn)楫a(chǎn)生原生質(zhì)體時(shí)用到了真菌細(xì)胞壁降解酶，已經(jīng)證實(shí)這些酶在植物體中能誘導(dǎo)植物抗毒素合成和倍半萜環(huán)化酶基因的表達(dá)〔Chappell(1991)植物生理學(xué)(Plant Physiol) 97693-698〕這些原生質(zhì)體能對(duì)第二次釋放素處理發(fā)生反應(yīng)，可能的解釋是細(xì)胞在第二次誘導(dǎo)處理之前有6-8小時(shí)恢復(fù)期。這種恢復(fù)期使得細(xì)胞恢復(fù)對(duì)釋放素的反應(yīng)。
pBI101是Clontech(Palo Alto，CA)公司商業(yè)化產(chǎn)品。它包含在pUC19載體上的GUS報(bào)導(dǎo)基因上游的CaMV 35S啟動(dòng)子；這樣它能作為瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的載體，在瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中重組載體被導(dǎo)入植物原生質(zhì)體中。該質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒的存在可以通過(guò)在含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來(lái)選擇。在農(nóng)桿菌雙元質(zhì)粒載體pBIN19〔Bevan M.(1984)核酸研究(Nucl.Acids Res.)128711〕中一個(gè)“啟動(dòng)子減弱”GUS盒同樣帶有一個(gè)在植物中表達(dá)的卡那霉素抗性決定子。
實(shí)施例9可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的鑒定用S1核酸酶保護(hù)試驗(yàn)和引物延伸實(shí)驗(yàn)〔Sambrook等(1989)，同上〕對(duì)EAS3和EAS4基因組克隆5′側(cè)翼區(qū)作圖。含有從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)5′端1kb片段的亞克隆進(jìn)行序列分析并與pBI101質(zhì)粒中的β-葡糖醛酸酶(GUS)報(bào)導(dǎo)基因融合，以便在轉(zhuǎn)基因植物組織中研究。得到的重組質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體。采用瞬時(shí)表達(dá)法測(cè)量GUS活性，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系分離出來(lái)，測(cè)定GUS報(bào)導(dǎo)基因的誘導(dǎo)和表達(dá)水平。
制備含修飾的pBI101載體中EAS4轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游最少約200bp序列的構(gòu)建體，獲得β-葡糖醛酸酶(GUS)報(bào)導(dǎo)基因，用于分析驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)性GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的能力。200bp側(cè)翼序列似乎足以驅(qū)動(dòng)電轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體基因瞬時(shí)表達(dá)，并且提供GUS報(bào)導(dǎo)基因的釋放素誘導(dǎo)表達(dá)特性(誘導(dǎo)至少2.5倍)。類似地用EAS3側(cè)翼序列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明來(lái)自EAS3基因座的200bp序列不支持GUS報(bào)導(dǎo)基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中高水平瞬時(shí)表達(dá)或?qū)︶尫潘卣T導(dǎo)的反應(yīng)。疫霉屬纖維素酶和釋放蛋白〔Ricci等(1989)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem)183555-563〕有助于誘導(dǎo)EAS4衍生調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)的基因表達(dá)。
推斷出來(lái)的EAS4調(diào)節(jié)區(qū)經(jīng)過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)突變〔Kunkel(1985)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.USA)82488-492〕，進(jìn)一步對(duì)介導(dǎo)病原菌入侵時(shí)(如纖維素酶或釋放素)誘導(dǎo)基因表達(dá)的重要序列進(jìn)行鑒定。將EAS4轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)第-233到-234位(相當(dāng)于SEQ IDNO2核苷酸334-335)野生型核苷酸CA換成GT，用釋放素(纖維素酶)處理20小時(shí)，似乎并沒(méi)有改變測(cè)量到的GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)水平。
基本上如Sambrook等(1989)所述進(jìn)行的初步甲基化干涉試驗(yàn)和凝膠阻滯試驗(yàn)表明，以翻譯起點(diǎn)-233附近為中心(以SEQ ID NO2的334核苷酸為中心)有一個(gè)八聚體結(jié)合植物細(xì)胞核蛋白質(zhì)。甲基化干涉試驗(yàn)表明如果先和核提取物作用后，位于-233位處的G被優(yōu)先保護(hù)對(duì)抗DMS(硫酸二甲酯)的甲基化。凝膠阻滯試驗(yàn)結(jié)果和甲基化保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果一致，當(dāng)含有-343到-140區(qū)(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn))(相當(dāng)于SEQ ID NO2的核苷酸230到433區(qū)段)的DNA片段和核提取物作用后，在非變性凝膠電泳中的運(yùn)動(dòng)受到阻滯。如果將-234到-233處GT換成CA，其結(jié)合蛋白性質(zhì)消失。在對(duì)照和釋放素誘導(dǎo)的細(xì)胞提取物中得到相似的結(jié)果，報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)活性不受這種2bp核苷酸突變的影響。這樣，可以得出結(jié)論，-233附近區(qū)域并不直接涉及對(duì)于病原菌入侵或釋放素處理發(fā)生反應(yīng)的基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EAS4相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位置-253到-48(SEQID NO2中在320到525核苷酸之間)的DNA序列對(duì)其下游報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)具有定性和定量的影響。EAS4相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-110到-1(SEQ ID NO2中從463到572核苷酸處)的序列介導(dǎo)誘導(dǎo)反應(yīng)，而相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-202到-110(SEQ ID NO2中371到463)的序列能增強(qiáng)誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)細(xì)胞中報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)水平。
實(shí)施例10嵌合EAS4啟動(dòng)子(-1148到+68)GUS報(bào)導(dǎo)基因的構(gòu)建在另一系列實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)在轉(zhuǎn)基因煙草中的活化。要得到煙草EAS4基因啟動(dòng)子(-1148到+67)的5’側(cè)翼序列，首先從上述gEAS4基因組克隆中分離出包含EAS45’端部分序列的大約1.9kb HindIII-HindIII片段，將該片段克隆到pBluescript KS(+)質(zhì)粒載體(Stratagene)的多克隆位點(diǎn)。以含有EAS4 HindIII-HindIII片段的pKS(+)質(zhì)粒DNA作為模板，用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法擴(kuò)增出大約1.2kb EAS4啟動(dòng)子片段(-1148到+67)，該片段含有EAS4轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1148核苷酸序列和下游67bp序列。該片段的核苷酸序列見(jiàn)圖3A。這段含有EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)的1215bp HindIII-BamHI片段隨后與雙元載體pBI101.1中GUS編碼序列按正確的閱讀框連接。圖3B圖示說(shuō)明得到的EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例11釋放素和病原菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草嵌合基因EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)為了分析煙草EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)的功能，用釋放素或病原菌處理含有如圖3B所示的GUS報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因煙草，按下述方法測(cè)定GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)。
通過(guò)三親交配方法[Schardl等基因(Gene)，611-11，1987]將如圖3B所示EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到?jīng)]有攻擊力的根癌農(nóng)桿菌菌株GV3850中。用Horsch等[科學(xué)(Science)，2271229-1231，1985]葉盤轉(zhuǎn)化法將帶有GUS構(gòu)建體的沒(méi)有攻擊力的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum cv Xanthi)。在花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草也被得到再生植株作為對(duì)照。得到的再生轉(zhuǎn)基因煙草植株的種子在含100mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上萌發(fā)，得到的抗卡那霉素幼苗移栽到溫室土壤中生長(zhǎng)。按如上的方法，在沒(méi)有處理(水對(duì)照)和誘導(dǎo)(釋放素或病原菌處理)條件下，測(cè)定這些植株GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)水平。
為了測(cè)定EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的釋放素誘導(dǎo)特性，如下所述，用真菌釋放蛋白crypogein或水處理轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片，測(cè)定GUS活性。取生長(zhǎng)2個(gè)月的轉(zhuǎn)基因煙草全展葉(從植株下部往上數(shù)第八片葉)之一半，在遠(yuǎn)軸端用微量加樣器加大約50μl 25nM crypogein[根據(jù)Ricci等歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)183555-563，1989方法制備]對(duì)葉片進(jìn)行滲透；另一半葉片同樣地用約50ul水處理。滲透開(kāi)始后在不同時(shí)間從完整植株葉片分別取水和crypogein滲透處理區(qū)的葉片，分析GUS活性。
如圖4A所示，來(lái)自三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因煙草系的葉片經(jīng)25nM crypogein滲透處理后，以釋放素處理大約4小時(shí)后，誘導(dǎo)GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)。相形之下，釋放素處理不能誘導(dǎo)35S CaMV啟動(dòng)子GUS報(bào)導(dǎo)基因(數(shù)據(jù)未示出)。另外，用水處理含有EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因植物葉片后，GUS報(bào)導(dǎo)基因活性不能被誘導(dǎo)(圖4)。從顯微鏡中觀察，GUS活性限制在用釋放素處理的葉片組織，表明EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)沒(méi)有被其它信號(hào)所誘導(dǎo)(圖8A)。
按下述方法用釋放素crypogein處理轉(zhuǎn)基因煙草植株根和莖，測(cè)定GUS活性，從而確定EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)控制的GUS表達(dá)的器官特異性。從轉(zhuǎn)基因煙草植株取下的根放在無(wú)菌Murashige和Skoog培養(yǎng)基上備用。莖取自在溫室中生長(zhǎng)兩個(gè)月的轉(zhuǎn)基因煙草植株(從頂端而下1到1.5英寸左右取樣)。用釋放素處理前，根和莖切成大約15-30um片段。置于用100nM crypogein或水潤(rùn)濕的濾紙上，在室溫下處理18個(gè)小時(shí)。接著按上述方法測(cè)定根段和莖段的GUS活性。
圖4B為兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因煙草系的根和莖crypogein處理18個(gè)小時(shí)后誘導(dǎo)的GUS表達(dá)活性。在根和莖中分別可見(jiàn)GUS活性相對(duì)于用水處理(對(duì)照)的樣品增加15倍。根中GUS活性高于莖。這些結(jié)果表明在根和莖中釋放素處理可誘導(dǎo)EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)。
為了確定病原真菌是否能誘導(dǎo)EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)，按如下方法用寄生疫霉煙草變種的兩個(gè)不同生理小種處理轉(zhuǎn)基因植物葉片，測(cè)定GUS表達(dá)活性。取生長(zhǎng)約45天的轉(zhuǎn)基因煙草植株頂端幼葉，如Tedford等[Tedford等植物病(PlantDisease)，74313-316，1990]所述，用在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天的寄生疫霉煙草變種生理小種0和生理小種1菌絲體藥栓(直徑約1cm)感染。感染葉片置于培養(yǎng)箱中用蒸餾水潤(rùn)濕的濾紙上，于25℃用連續(xù)熒光處理24小時(shí)。對(duì)照葉片用空白燕麥片瓊脂藥栓接種。收集接種葉片，按上述方法測(cè)定GUS活性。
如圖5所示，用寄生疫霉煙草變種生理小種0或生理小種1處理，均誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS活性。雖然寄生疫霉煙草變種生理小種0和生理小種1一般誘導(dǎo)不同的病癥，但是它們處理轉(zhuǎn)基因N.tabacumcv.Xanthi時(shí)，沒(méi)有看到明顯的病癥上的差別。另外，我們觀察到寄生疫霉生理小種0和1誘導(dǎo)GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的能力相同。
為了確定病原細(xì)菌或釋放素是否誘導(dǎo)GUS報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)，按下述方法用丁香假單胞菌丁香致病變種61和它的hrpH突變體以及解淀粉歐文氏菌釋放素harpin處理轉(zhuǎn)基因煙草葉片，測(cè)定GUS活性。取生長(zhǎng)約45天的轉(zhuǎn)基因煙草頂端幼葉，用丁香假單胞菌丁香致病變種61或它的hrpH突變體細(xì)胞懸浮液(A600＝0.05)，harpin釋放素(50ug/mL)滲透，滲透按前面所述用加樣器進(jìn)行。對(duì)照為用水同樣滲透的葉片。大約12個(gè)小時(shí)，收集葉片按上述方法測(cè)定GUS活性。
如圖6所示，用假單胞菌，hrpH突變體，或harpin釋放素處理轉(zhuǎn)基因煙草葉片12小時(shí)，均能誘導(dǎo)GUS活性。相形之下，水處理的葉片只能檢測(cè)到低GUS活性。另外不論是用野生型丁香假單胞菌丁香致病變種61還是用純化的harpin釋放素滲透處理組織區(qū)12-15小時(shí)后，均能觀察到超敏反應(yīng)。這些結(jié)果表明無(wú)論病原細(xì)菌還是細(xì)菌來(lái)源的釋放素均能活化EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)。
實(shí)施例12免疫印跡分析如下所述，用標(biāo)準(zhǔn)Western印跡方法分析crypogein處理轉(zhuǎn)基因植物后不同組織中EAS表達(dá)情況。用Vogeli和Chappell(同上)所述方法從對(duì)照和crypogein釋放素處理的煙草組織中提取蛋白質(zhì)，煙草組織用含20％(w/v)甘油，10mM偏亞硫酸氫鈉，10mM抗壞血酸鈉，15mM氯化鎂和5mM β-巰基乙醇的80mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)勻漿。用Bio-Rad法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，按Voegeli和Chappell(同上)所述方法進(jìn)行免疫檢測(cè)。
如圖7A-B所示，用Western印跡實(shí)驗(yàn)在煙草葉片中沒(méi)有檢測(cè)到EAS蛋白質(zhì)。相形之下，用釋放素處理轉(zhuǎn)基因煙草后葉片中誘導(dǎo)出現(xiàn)EAS蛋白質(zhì)。莖段和根段在沒(méi)有釋放素處理時(shí)也能檢測(cè)到EAS蛋白質(zhì)，表明其中存在EAS多基因家族的一個(gè)或幾個(gè)成員，但根據(jù)上述組織化學(xué)定位數(shù)據(jù)可確定不是EAS4，它們?cè)谥参锸軅麜r(shí)活化。實(shí)施例13轉(zhuǎn)基因煙草中EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的細(xì)胞特異性表達(dá)型式圖8A-K所示為用釋放蛋白處理煙草不同轉(zhuǎn)基因系組織后GUS活性染色結(jié)果。圖8A-K數(shù)據(jù)表示圖3B中表達(dá)EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因煙草幾個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系一系列不同時(shí)間的觀察結(jié)果。轉(zhuǎn)基因組織中GUS活性染色按下面方法進(jìn)行組織切片用含50mM磷酸鈉，pH7.0，0.05％Triton X-100，0.1％β-巰基乙醇的1mM X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚β-葡糖苷酸)溶液于37℃保溫12-16小時(shí)，然后用50％乙醇，5％冰乙酸，10％甲醛固定2小時(shí)。切片在70％乙醇中溫育以除去適當(dāng)組織中的葉綠素，在Zeiss IIIRS顯微鏡下觀察染色的植物組織，用MC63顯微成像儀照相。
圖8B-F顯示，除了表皮細(xì)胞層GUS活性極微弱外，GUS活性存在于轉(zhuǎn)基因葉片的釋放素滲透區(qū)，表明在全部葉片組織中crypogein和parasicein滲透能活化EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)。在莖和根的表皮細(xì)胞中也看到類似的微弱染色(圖8G和8L)。盡管極微弱GUS活性出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因葉片的表皮細(xì)胞，但轉(zhuǎn)基因植物葉和根的表皮毛中也能觀察到GUS活性(圖8B和8L)。
另外，如圖8C-F和8L所示，釋放素誘導(dǎo)的GUS活性出現(xiàn)在莖和根切片的不同亞表皮層(圖8C-F和8L)。圖8F顯示莖組織中GUS活性也存在于形成層，韌皮層，和初生木質(zhì)部組織層；極微弱GUS活性也存在于莖的皮層區(qū)。并且，類似于莖，根中GUS活性也定位于維管系統(tǒng)(圖8L)。
cryptogein處理前后均未發(fā)現(xiàn)GUS活性存在于花瓣中，包括有色素和無(wú)色素的組織。
實(shí)施例14轉(zhuǎn)基因煙草植株中EAS4啟動(dòng)子(-1147到+67)5′缺失分析。
另外一系列實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)得到EAS4啟動(dòng)子(-1147到+67)的幾個(gè)5′缺失構(gòu)建體。這些缺失的啟動(dòng)子隨按上述方法與pBI101.1和pBI221載體中GUS報(bào)導(dǎo)基因融合并轉(zhuǎn)化煙草。表1
如表1所示，和植物中存在完整EAS4啟動(dòng)子(-1148到+67)相比，缺失-1148到-567區(qū)段的EAS4啟動(dòng)子使可誘導(dǎo)GUS活性降低50％。進(jìn)一步缺失到-212，使可誘導(dǎo)GUS活性平均降低90％，缺失到-160，GUS活性降低至具有完整啟動(dòng)子(-1148到+67)的植物的2％，缺失至-63，啟動(dòng)子仍然含有推測(cè)的CAAT盒和TATA盒，完全不能誘導(dǎo)對(duì)照和釋放素處理葉片中嵌合基因的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明煙草中控制EAS4的定量表達(dá)水平的多個(gè)正調(diào)節(jié)元件位于-1148到-160區(qū)段。
比較缺失至-567和缺失至-212區(qū)段的結(jié)果也可以看出，-567到-212區(qū)段影響表達(dá)水平，因?yàn)樵搮^(qū)段缺失導(dǎo)致表達(dá)水平降低4倍，大部分GUS活性喪失。雖然缺失到-160可誘導(dǎo)GUS活性大部分喪失，但發(fā)現(xiàn)-160下游序列足以指導(dǎo)葉片組織中可誘導(dǎo)的基因表達(dá)。如圖9B所示，用釋放素處理葉片，可以觀察到17倍的誘導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明釋放素誘導(dǎo)性的定性控制元件位于-160到-115之間。
實(shí)施例15轉(zhuǎn)基因植物抗病性按下述方法分離寄生疫霉生理小種0的parA1編碼序列分離基因組DNA，將其作為PCR模板，SIG正向引物為(CGTTGGATCCCCACCTCATCCGAAATGAAC；SEQ ID NO9，BamHI位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)；25-27位核苷酸相當(dāng)于翻譯起點(diǎn)，反向引物為(GGCTGAGCTCCTGGACGFCAGAGATCAAACC；SEQ ID NO10SstI位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)，以擴(kuò)增ParA1釋放蛋白包括信號(hào)肽序列的編碼區(qū)。為了分離相應(yīng)于ParA1釋放蛋白編碼序列的擴(kuò)增引物，使用MAT正向引物(GCCGGATCCTTATGACTAGTTGCACCACCACGCAGCAAACTG，SEQ ID NO11，BamHI位點(diǎn)GGATCC，SpeI位點(diǎn)ACTAGT均用下劃線標(biāo)出；翻譯起點(diǎn)在核苷酸12-14處)，反向引物同前(SEQ IDNO10)，以基因組DNA作為模板。
擴(kuò)增引物DNA用BamHI和SstI消化后，亞克隆到pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)或pEAS4構(gòu)建體。使用成熟蛋白的編碼序列時(shí)，用SpeI消化成熟釋放素/pEAS4構(gòu)建體，以便在開(kāi)放閱讀框的5′端插入植物信號(hào)肽序列。pEAS4-GUS載體用BamHI和SstI消化，大片段DNA用瓊脂糖凝膠電泳純化。
圖9說(shuō)明構(gòu)建抗病植株的分子操作過(guò)程。用PCR方法得到ParA1釋放蛋白編碼序列，使其具有BamHI和SstI末端。gEAS4600(環(huán)化酶)-GUS-pBI101在EAS啟動(dòng)子調(diào)控之下指導(dǎo)GUS報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)，將其用BamHI和SstI消化，釋放出GUS報(bào)導(dǎo)基因。將gEAS4600(環(huán)化酶)-GUS-pBI101消化后的大片段和BamHI/SstI消化的parA1擴(kuò)增引物連接，得到gEAS4600(環(huán)化酶)-parA1-pBI101，植物細(xì)胞或組織以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，用適當(dāng)?shù)尼尫潘卣T導(dǎo)，ParA1釋放蛋白就能合成。
為了分析對(duì)于植物病原菌的抗性，用上述通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法重新產(chǎn)生含有g(shù)EAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子控制的parA1成熟釋放蛋白基因(SEQ ID NO12中氨基酸21-118)或帶有信號(hào)序列的parA1釋放蛋白基因(SEQ ID NO12中氨基酸1-118)的轉(zhuǎn)基因煙草植株(Nicotiana tabacum cv.KY160)。得到的轉(zhuǎn)基因植株用于分析對(duì)寄生疫霉煙草變種生理小種0和1分離株的抗性，分析方法采用Tedford等(同上)的標(biāo)準(zhǔn)離體葉片法。
如圖10所示，和對(duì)照相比(即與沒(méi)有轉(zhuǎn)化的Nicotiana tabacumcv.KY160或含有g(shù)EAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子GUS報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因Nicotiana tabacum cv.KY160相比)，幾個(gè)含有g(shù)EAS4600(環(huán)化酶)啟動(dòng)子控制之下的parA1成熟釋放蛋白基因的獨(dú)立煙草轉(zhuǎn)基因系具有提高的對(duì)寄生疫霉煙草變種生理小種0和1的抗性。
盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的一些實(shí)施方案作了詳細(xì)說(shuō)明，但顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)λM(jìn)行修飾，擴(kuò)充，修改和優(yōu)化。正如在權(quán)利要求中列出的，必須清楚地認(rèn)識(shí)到這些修飾和修改等都在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Board of Trustees of the University of Kentucky(ii)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)錄控制序列和方法(iii)序列數(shù)14(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人Fish&Richardson，P.C.
(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國(guó)家US(F)郵政編碼02110-2804(G)電話(H)傳真(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Rekease#1.0版本#1.30(vi)現(xiàn)申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)申請(qǐng)日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/577,483(B)申請(qǐng)日1995年12月22日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/471,983(B)申請(qǐng)日1995年6月6日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)
(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/443,639(B)申請(qǐng)日1995年5月18日(C)分類(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名Paul T.Clark(B)登記號(hào)32,164(C)參考/備案號(hào)碼07678/003BRl(ix)電訊信息(A)電話(617)542-5070(B)傳真(617)542-8906(A)電傳200154(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度512堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)初始來(lái)源(A)生物煙草(xi)序列表述SEQ ID NO1CCGCGATTGG AGGATGTTGT ACGTCGAGCT ACGCGGCACC GCGCTTAATT TTACTCGGTC 60AAGAAGGAAC GGGGATGGTG GTCAACGAAA CACGACGGGC CCGACATCAT GCCTGACAAC 120CCGCCGTGGG TGAAGAAGTC GACGTTGGAA AAGAGCTACA GCCTGCTCCA CGCGGATGCG 180GGGATGGCCG CTGACTACAG AAAGTGCGTT TCCCGCCACC CGGGGCGAGC CCGGGTTTTG 240AAGATCAATG CTGACCGAAC CAGACGGCGG TACGTCATCC GCTTGAGGGT AGAGACGGAT 300CAGTTCTTGT TGTCGTGTGT CGAACTCGGG ACGTTTGTCA CATGGCTGGA CGGGTTATTC 360GCCGCCATCA ACGTGTCGCC GCCAATCGAC GAGCGCGACT TTCCCAGAGA CTTTAGCGTG 420CCACGGATCA ATTACATTAA CTAGTCTCTC ACCACTATAT ATACTTGTCC CTTCTCTTCC 480ATTTAAGTAG AGTTCCTTTC TTTCTTCCTT AA512(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度642堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)初始采源(A)生物煙草(xi)序列表述SEQ ID NO2TAGGTGAATG TCAGGGCTTA TGCTCCACGA TACTTATGCC CTGCCAGTAC ACCTCGCAGT 60GGGACTCGCT GAAAAAACGT CTTTGTTGTG AGAAATTGCA ATTTTGAACC TCTACAATTT 120CGACAAAACC TTGGTTCGTG AAAACTGTTT GATTAACTTT TAGACCATCC AGTCAATTTA 180ACTCTAAACT GACCTAAATA AATACTACGT ACACTAGTCT TTAAGTTCAT CAAAGTGGAC 240TCTGCATTAA TAATTGAAAT TTATGCCGCA ACAATGACAT TAGGTTTTAT AAATAAAGTA 300ATAGGAATTT GATAGTTCCA GGAAACAACT CTACAGTACT CCCTTATTTT GTGCCTTTTT 360AAATAATATT ATTCAGTTGA CGAAACAAAT AAATAAAATA TTTGGGAAAC TGGATCAATA 420GACCCCAGAC GCCAACAATG AATCAAAAGG CTGCTAGCTA GTGTAAAGTC TAGTAAGGCA 480ACTGGGAAAT TAAATGATTA GGTGCTTTTG ATCAATTACA TTAACTAGTC TCTCACCACT 540ATATATACTT GTCCCTTCTC TTCCATTTAA GTAGAGTTCC TTTCTTTCTT CCTTAAAACT 600TAAAAGAACA AGTAAAAATA CACTCATCTT TAATTAGCAA TG 642(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列表述SEQ ID NO3ATGCTGTTAG CAACCGGAAG G(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列表述SEQ ID NO4ATCCAAAATC TCATCAATTT C(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列表述SEQ ID NO5ATGAGTCCTT ACATGTGA(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義有(xi)序列表述SEQ ID NO6GGGAGCTCGA ATTCCATGGC CTCAGCAGCA GCAGTTGCAAACTAT(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4253堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)初始來(lái)源(A)生物煙草(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1216..1327(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1454..1718(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1805..2182(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置2259..2477(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置2609..2747(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置2902..3148(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置3261..3555(xi)序列表述SEQ ID NO7AAGCTTTACG AATTAGATGT AAAAAGACGC AAACTACTTA TATATATTAC CAAAGTAACT 60TGAAAGTTTA AAATTTCAAT TAGAACTATA GTAGGGTAAA ACTGTCTATT TAAAATCAGT 120ATTTAAAAAG GCATGAGCGA AAGATGAGGC GTTTTATCTA ACACGAAGCG AGGTGTAAGC 180CCCATGGTGT TTTATTTTTA TATTTTATAA ATTTATAAAA TCATTATATA AATCAGAAAA 240ATACACTAAA ATTGTGAAAA GTTAAAGAAA ATTATAGAAT TAATATATAT ATATATATAT 300ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT 360GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT 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1251Met Ala Ser Ala Ala Val Ala Asn Tyr Glu Glu Glu1 5 10ATT GTT CGC CCC GTC GCC GAC TTC TCC CCT AGT CTC TGG GGT GAT CAG 1299Ile Val Arg Pro Val Ala Asp Phe Ser Pro Ser Leu Trp Gly Asp Gln15 20 25TTC CTT TCA TTC TCC ATT GAT AAT CAG G TAATTTAACT AATACTAGTA 1347Phe Leu Ser Phe Ser Ile Asp Asn Gln30 35TTCTTTATTT ATATTTATAG TTTGTTCTCC ATTGATAATC AGGTAGTTTA TTTATGTTGA1407ACAACATTAA TTTTGCTAAT TTCAGTTTAA TGTACATTAC ATATAG GTT GCG GAA 1462Val Ala Glu1AAG TAT ATA TAT GCT CAA GAG ATT GAA GCA TTG AAG GAA CAA ACG AGG 1510Lys Tyr Ile Tyr Ala Gln Glu Ile Glu Ala Leu Lys Glu Gln Thr Arg5 10 15AGT ATG CTG TTA GCA ACC GGA AGG AAA TTG GCC GAT ACA TTG AAT TTG 1558Ser Met Leu Leu Ala Thr Gly Arg Lys Leu Ala Asp Thr Leu Asn Leu20 25 30 35ATT GAC ATT ATT GAA CGC CTT GGT ATA TCC TAC CAC TTT GAG AAA GAA 1606Ile Asp Ile Ile Glu Arg Leu Gly Ile Ser Tyr His Phe Glu Lys Glu40 45 50ATT GAT GAG ATT TTG GAT CAG ATT TAC AAC CAA AAC TCA AAC TGC AAT 1654Ile Asp Glu Ile Leu Asp Gln Ile Tyr Asn Gln Asn Ser Asn Cys Asn55 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ACC CGA TTC TTC ATC TCA TCA ATC TAT GAC AAG GAA CAA 2092Arg Val Glu Thr Arg Phe Phe Ile Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Glu Gln85 90 95TCG AAG AAT AAT GTG TTA CTT CGA TTT GCC AAA TTG GAT TTC AAC TTG 2140Ser Lys Asn Asn Val Leu Leu Arg Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Leu100 105 110CTC CAG ATG TTG CAC AAA CAA GAA CTT GCT CAA GTA TCA AGG 2182Leu Gln Met Leu His Lys Gln Glu Leu Ala Gln Val Ser Arg115 120 125TGCGATATAT AAAAACGATG AACCCTTTTT GATTCATCAT ATCTCAAGTA CTCATGTTAA2242TTTCTTATGC TGCAGG TGG TGG AAA GAT TTG GAT TTT GTA ACA ACA CTT2291Trp Trp Lys Asp Leu Asp Phe Val Thr Thr Leu1 5 10CCA TAT GCT AGA GAT CGA GTA GTT GAA TGC TAC TTT TGG GCA TTA GGA 2339Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Val Val Glu Cys Tyr Phe Trp Ala Leu Gly15 20 25GTT TAT TTT GAG CCT CAA TAC TCT CAA GCT CGC GTC ATG CTC GTT AAG 2387Val Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Gln Ala Arg Val Met Leu Val Lys30 35 40ACC ATA TCA ATG ATT TCG ATT GTC GAT GAC ACC TTT GAT GCT TAC GGT 2435Thr Ile Ser Met Ile Ser Ile Val Asp Asp Thr Phe Asp Ala Tyr Gly45 50 55ACA GTT AAA GAA CTT GAG GCA TAC ACA GAT GCC ATA CAA AGG 2477Thr Val Lys Glu Leu Glu Ala Tyr Thr Asp Ala Ile Gln Arg60 65 70TATGAACTTC ATCAATTCAC TTATTCCTTG ATAGTGAATG TCGTCGTGAA AAGATTAAGA2537CGAATTTCTA CTCATTATAG TTGTGCTCTT TCAAAATGCA TGAATTCACC TTAATTTTGT2597GATCCTGCAG A TGG GAT ATC AAC GAA ATT GAT CGG CTT CCT GAT TAC ATG 2647Trp Asp Ile Asn Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asp Tyr Met1 5 10AAA ATC AGT TAT AAA GCT ATT CTA GAT CTC TAC AAG GAT TAT GAA AAG 2695Lys Ile Ser Tyr Lys Ala Ile Leu Asp Leu Tyr Lys Asp Tyr Glu Lys15 20 25GAA TTG TCT AGT GCC GGA AGA TCT GAT ATT GTC TGC GAT GCA ATA GAA 2743Glu Leu Ser Ser Ala Gly Arg Ser His Ile Val Cys His Ala Ile Glu30 35 40 45AGA G TATGTTCGAG CAACTTAACT ATCGAAATAC ATTTTTTCCT TAATCCATTTT2797ArgCTCACTTTGG TTTACCTTGT GTTCGTCTTT TAGTGATTAG AAACTTGATA CAGTTCAATC2857AATATTTTCT AACACTTGAA CACATATATG TTTTTGTATTC ACAG ATG AAA GAA GTA 2913Met Lys Glu Val1GTA AGA AAT TAT AAT GTC GAG TCA ACA TGG TTT ATT GAA GGA TAT ATG 2961Val Arg Asn Tyr Asn Val Glu Ser Thr Trp Phe Ile Glu Gly Tyr Met5 10 15 20CCA CCT GTT TCT GAA TAC CTA AGC AAT GCA CTA GCA ACT ACC ACA TAT 3009Pro Pro Val Ser Glu Tyr Leu Ser Asn Ala Leu Ala Thr Thr Thr Tyr25 30 35TAC TAC CTC GCG ACA ACA TCG TAT TTG GGC ATG AAG TCT GCC ACG GAG 3057Tyr Tyr Leu Ala Thr Thr Ser Tyr Leu Gly Met Lys Ser Ala Thr Glu40 45 50CAA GAT TTT GAG TGG TTG TCA AAG AAT CCA AAA ATT CTT GAA GCT AGT 3105Gln Asp Phe Glu Trp Leu Ser Lys Asn Pro Lys Ile Leu Glu Ala Ser55 60 65GTA ATT ATA TGT CGA GTT ATC GAT GAC ACA GCC ACG TAC GAG G 3148Val Ile Ile Cys Arg Val Ile Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Glu70 75 80TATGATTTGC ATCTCAAGAA ATTATATCAT TATATGGGAT TTGGACAAAC AAAGTGTTGC 3208GACGACAATT AAGGCAATAT AAAAGCTAAC CTTTAATTTA TCTGCTTTCT AG GTT 3263Val1GAG AAA AGC AGG GGA CAA ATT GCA ACT GGA ATT GAG TGC TGC ATG AGA 3311Glu Lys Ser Arg Gly Gln Ile Ala Thr Gly Ile Glu Cys Cys Met Arg5 10 15GAT TAT GGT ATA TCA ACA AAA GAG GCA ATG GCT AAA TTT CAA AAT ATG 3359Asp Tyr Gly Ile Ser Thr Lys Glu Ala Met Ala Lys Phe Gln Asn Met20 25 30GCT GAG ACA GCA TGG AAA GAT ATT AAT GAA GGA CTT CTT AGG CCC ACT 3407Ala Glu Thr Ala Trp Lys Asp Ile Asn Glu Gly Leu Leu Arg Pro Thr35 40 45CCC GTC TCT ACA GAA TTT TTA ACT CCT ATT CTC AAT CTT GCT CGT ATT 3455Pro Val Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Ile Leu Asn Leu Ala Arg Ile50 55 60 65GTT GAG GTT ACA TAT ATA CAC AAT CTA GAT GGA TAC ACT CAT CCG GAG 3503Val Glu Val Thr Tyr Ile His Asn Leu Asp Gly Tyr Thr His Pro Glu70 75 80AAA GTC TTA AAA CCT CAC ATT ATT AAC CTA CTT GTG GAC TCC ATC AAA 3551Lys Val Leu Lys Pro His Ile Ile Asn Leu Leu Val Asp Ser Ile Lys85 90 95ATT T GAGCTGCCAT TTGTTGCTCA TCTCAAGGAA ACTTCATTCT TCTTTGTGCA 3605IleGTTGTGCAGT AGACTTCCTA ACTAGGAGCT TCTTAAGATC CTTGTAAGAA ATAATCTTCA 3665AGTGTTATGA ATCCGCATTG TGGAGAAATC TTTTTATATG ACAATAAGTT ATGTTATGAA 3725GAAGTTTATG GGGGTCTCTT ATGACCTATT TGTCAGTGTA TGAAGTAATC TGAGCCTGTC 3785GAAAAAAAAG GTAATCTGAG CCTTTTGCTC GTCCTTCCTT TAGTATTTCT TTTTATCATA 3845CTTGGTCTCA CAAAAATTAG TTTTTGGCAC CTTTGTTTTT CCTTGTGGCG CATGTGTATA 3905TACATCTGAA ACATATACTT AAAGGTTAAG 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His Gly Phe Asn Ile Ser Pro Glu Ile Phe115 120 125Ser Lys Phe Gln Asp Glu Asn Gly Lys Phe Lys Glu Ser Leu Ala Ser130 135 140Asp Val Leu Gly Leu Leu Asn Leu Tyr Glu Ala Ser His Val Arg Thr145 150 155 160His Ala Asp Asp Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ala Phe Ser Thr Ile His165 170 175Leu Glu Ser Ala Ala Pro His Leu Lys Ser Pro Leu Arg Glu Gln Val180 185 190Thr His Ala Leu Glu Gln Cys Leu His Lys Gly Val Pro Arg Val Glu195 200 205Thr Arg Phe Phe Ile Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Glu Gln Ser Lys Asn210 215 220Asn Val Leu Leu Arg Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Leu Leu Gln Met225 230 235 240Leu His Lys Gln Glu Leu Ala Gln Val Ser Arg Trp Trp Lys Asp Leu245 250 255Asp Phe Val Thr Thr Leu Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Val Val Glu Cys260 265 270Tyr Phe Trp Ala Leu Gly Val Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Gln Ala275 280 285Arg Val Met Leu Val Lys Thr Ile Ser Met Ile Ser Ile Val Asp Asp290 295 300Thr Phe Asp Ala Tyr Gly Thr Val Lys Glu Leu Glu Ala Tyr Thr Asp305 310 315 320Ala Ile Gln Arg Trp Asp Ile Asn Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asp Tyr325 330 335Met Lys Ile Ser Tyr Lys Ala Ile Leu Asp Leu Tyr Lys Asp Tyr Glu340 345 350Lys Glu Leu Ser Ser Ala Gly Arg Ser His Ile Val Cys His Ala Ile355 360 365Glu Arg Met Lys Glu Val Val Arg Asn Tyr Asn Val Glu Ser Thr Trp370 375 380Phe Ile Glu Gly Tyr Met pro Pro Val Ser Glu Tyr Leu Ser Asn Ala385 390 395 400Leu Ala Thr Thr Thr Tyr Tyr Tyr Leu Ala Thr Thr Ser Tyr Leu Gly405 410 415Met Lye Ser Ala Thr Glu Gln Asp Phe Glu Trp Leu Ser Lys Asn Pro420 425 430Lys Ile Leu Glu Ala Ser Val Ile Ile Cys Arg Val Ile Asp Asp Thr435 440 445Ala Thr Tyr Glu Val Glu Lys Ser Arg Gly Gln Ile Ala Thr Gly Ile450 455 460Glu Cys Cys Met Arg Asp Tyr Gly Ile Ser Thr Lys Glu Ala Met Ala465 470 475 480Lys Phe Gln Asn Met Ala Glu Thr Ala Trp Lys Asp Ile Asn Glu Gly485 490 495Leu Leu Arg Pro Thr Pro Val Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Ile Leu500 505 510Asn Leu Ala Arg Ile Val Glu Val Thr Tyr Ile His Asn Leu Asp Gly515 520 525Tyr Thr His Pro Glu Lys Val Leu Lys Pro His Ile Ile Asn Leu Leu530 535 540Val Asp Ser Ile Lys Ile545 550(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列表述SEQ ID NO9CGTTGGATCC CCACCTCATC CGAAATGAAC(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義有(xi)序列表述SEQ ID NO10GGCTGAGCTC CTGGACGCAG AGATCAAACC(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物(反向)”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義有(xi)序列表述SEQ ID NO11GCCGGATCCT TATGACTAGT TGCACCACCA CGCAGCAAAC TG(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度593堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)初始來(lái)源(A)生物寄生疫霉(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置207..563(xi)序列表述SEQ ID NO12GTCGACGAAA GCCGAAGTGC GTGGCAGATC TTGCCGTTCG AATGCTACGC GCCACGGCAA 60AACCTACACG GTACAACAGC TTCAAATAAA CCTGCAAGCG AGCCGCCAGC CCAACTCCAG 120CTAGTCAAGC CTAGTTTGCC TCCAACTGCC ATTGTACAAT TTGCTCTCAT CCACACCCAC 180CCCACTTCTC CCCCACCTCA TCCGAA ATG AAC TTC CGC GCT CTG TTC GCC GCC 233Met Asn Phe Arg Ala Leu Phe Ala Ala555 560ACC GTC GCC GCC CTC GTC GGC TCC ACC TCC GCC ACC ACG TGC ACC ACC 281Thr Val Ala Ala Leu Val Gly Ser Thr Ser Ala Thr Thr Cys Thr Thr565 570 575ACG CAG CAA ACT GCG GCG TAC GTG GCG CTC GTA AGC ATC CTC TCG GAC 329Thr Gln Gln Thr Ala Ala Tyr Val Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp580 585 590ACG TCG TTC AAC CAG TGC TCG ACG GAC TCT GGC TAC TCA ATG CTG ACG 377Thr Ser Phe Asn Gln Cys Ser Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr595 600 605GCC ACC TCG TTG CCC ACG ACG GAG CAG TAC AAG CTC ATG TGC GCG TCG 425Ala Thr Ser Leu Pro Thr Thr Glu Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala Ser610 615 620ACG GCG TGC AAG ACG ATG ATC AAC AAG ATC GTG ACG CTG AAC CCG CCC 473Thr Ala Cys Lys Thr Met Ile Asn Lys Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro625 630 635 640GAC TGC GAG TTG ACG GTG CCT ACG AGC GGC CTG GTA CTC AAC GTG TTC 521Asp Cys Glu Leu Thr Val Pro Thr Ser Gly Leu Val Leu Asn Val Phe645 650 655ACG TAC GCG AAC GGG TTC TCG TCT ACG TGC GCG TCA CTG TAA 563Thr Tyr Ala Asn Gly Phe Ser Ser Thr Cys Ala Ser Leu660 665GCGGGTTTGA TCTCTGCGTC CAGAATCGAT593(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQ ID NO13Met Asn Phe Arg Ala Leu Phe Ala Ala Thr Val Ala Ala Leu Val Gly1 5 10 15Ser Thr Ser Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gln Gln Thr Ala Ala Tyr20 25 30Val Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp Thr Ser Phe Asn Gln Cys Ser35 40 45Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr Ala Thr Ser Leu Pro Thr Thr50 55 60Glu Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala ser Thr Ala Cys Lys Thr Met Ile65 70 75 80Asn Lys Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro Asp Cys Glu Leu Thr Val Pro85 90 95Thr Ser Gly Leu Val Leu Aan Val Phe Thr Tyr Ala Asn Gly Phe Ser100 105 110Ser Thr Cys Ala Ser Leu115(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1368堿基對(duì)(b)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)錁?gòu)型兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO14AAGCTTTACG AATTAGATGT AAAAAGACAC AAACTACTTA TATATATTAC CAAAGTAACT 60TGAAAGTTTA AAATTTCAAT TAGAACTATA GTAGGGTAAA ACTGTCTATT TAAAATCAGT 120ATTTAAAAAG GCATGAGCGA AAGATGAGGC GTTTTATCTA ACACGAAGCG AGGTGTAAGC 180CCCATGGTGT TTTATTTTTA TATTTTATAA ATTTATAAAA TCATTATATA AATCAGAAAA 240ATACACTAAA ATTGTGAAAA GTTAAAGAAA ATTATAGAAT TAATATATAT ATATATATAT 300ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT 360GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT 420ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT 480ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT 540TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA 600AAAACTAGAG CGATACCAAA GGAAATTTTA AATTCAAAAA CTAACTTGAA ATTAATATAT 660TTAAAATTTC ATTTTTTTTT GTGTGGAGAA AACAAAGCAT AACACTTTGC TTTGTAACAC 720TTTGCCTAGG TGAATGTCAG GGCTTATGCT CCACGATACT TATGCCCTGC CAGTACACCT 780CGCAGTGGGA CTCGCTGAAA AAACGTCTTT GTTGTGAGAA ATTGCAATTT TGAACCTCTA 840CAATTTCGAC AAAACCTTGG TTCGTGAAAA CTGTTTGATT AACTTTTAGA CCATCCAGTC 900AATTTAACTC TAAACTGACC TAAATAAATA CTACGTACAC TAGTCTTTAA GTTCATCAAA 960GTGGACTCTG CATTAATAAT TGAAATTTAT GCCGCAACAA TGACATTAGG TTTTATAAAT1020AAAGTAATAG GAATTTGATA GTTCCAGGAA ACAACTCTAC AGTACTCCCT TATTTTGTGC1080CTTTTTAAAT AATATTATTC AGTTGACGAA ACAAATAAAT AAAATATTTG GGAAACTGGA1140TCAATAGACC CCAGACGCCA ACAATGAATC AAAAGGCTGC TAGCTAGTGT AAAGTCTAGT1200AAGGCAACTG GGAAATTAAA TGATTAGGTG CTTTTGATCA ATTACATTAA CTAGTCTCTC1260ACCACTATAT ATACTTGTCC CTTCTCTTCC ATTTAAGTAG AGTTCCTTTC TTTCTTCCTT1320AAAACTTAAA AGAACAAGTA AAAATACACT CATCTTTAAT TAGCAATG 1368
權(quán)利要求
1.一種含有可誘導(dǎo)的植物抗病調(diào)節(jié)元件的重組核酸分子。
2權(quán)利要求1的核酸分子，其中調(diào)節(jié)元件來(lái)源于一種編碼萜烯環(huán)化酶的基因。
3權(quán)利要求2的核酸分子，其中萜烯環(huán)化酶是一種倍半萜環(huán)化酶。
4.權(quán)利要求3的核酸分子，其中調(diào)節(jié)元件指導(dǎo)表-5-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS)的表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的核酸分子，該核酸分子包括圖3A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO14)，或由此產(chǎn)生的一個(gè)可誘導(dǎo)的植物抗病片段。
6.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該核酸分子具有圖3A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO14)。
7.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸463-473。
8.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸406-486。
9.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸463-572。
10.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸371-463。
11.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸411-457。
12.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子來(lái)源于雙子葉植物。
13.權(quán)利要求12的核酸分子，其中雙子葉植物是茄科的一個(gè)成員。
14.權(quán)利要求13的核酸分子，其中茄科植物是煙草屬的一個(gè)成員。
15.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子來(lái)源于單子葉植物。
16.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子來(lái)源于裸子植物。
17.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子來(lái)源于松柏類植物。
18.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子為基因組DNA。
19.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子為化學(xué)合成DNA。
20.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子為基因組DNA和化學(xué)合成DNA的組合。
21.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子為基因組DNA和cDNA的組合或基因組DNA，cDNA和化學(xué)合成DNA的組合。
22.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由植物病原菌介導(dǎo)。
23.權(quán)利要求22的核酸分子，其中植物病原菌是一種真菌。
24.權(quán)利要求23的核酸分子，其中病原真菌是疫霉屬的一個(gè)成員。
25.權(quán)利要求22的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由病原細(xì)菌介導(dǎo)。
26.權(quán)利要求25的核酸分子，其中病原細(xì)菌是假單胞菌屬的一個(gè)成員。
27.權(quán)利要求22的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由病原病毒介導(dǎo)。
28.權(quán)利要求27的核酸分子，其中病原病毒為煙草花葉病毒。
29.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由釋放素介導(dǎo)。
30.權(quán)利要求29的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由真菌釋放素介導(dǎo)。
31.權(quán)利要求29的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由細(xì)菌釋放素介導(dǎo)。
32.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核酸分子可操縱地與編碼異源多肽的核苷酸序列連接。
33.權(quán)利要求32的核酸分子，其中異源多肽能使植物具有抗病性。
34.權(quán)利要求33的核酸分子，其中異源多肽是一種釋放蛋白。
35.權(quán)利要求33的核酸分子，其中釋放蛋白是一種真菌釋放蛋白。
36.權(quán)利要求35的核酸分子，其中真菌釋放蛋白來(lái)源于疫霉屬。
37.權(quán)利要求36的核酸分子，其中釋放蛋白包括ParA1多肽。
38.權(quán)利要求33的核酸分子，其中釋放蛋白是一種細(xì)菌釋放蛋白。
39.權(quán)利要求38的核酸分子，其中細(xì)菌釋放蛋白是肝素。
40.權(quán)利要求32的核酸分子，其中所說(shuō)的誘導(dǎo)由一種或多種外源介質(zhì)介導(dǎo)。
41.權(quán)利要求32的核酸分子，其中該核酸分子能以細(xì)胞特異性方式表達(dá)所說(shuō)的異源多肽。
42.權(quán)利要求32的核酸分子，其中所說(shuō)的異源多肽是一種藥用蛋白質(zhì)。
43.一種包括權(quán)利要求1的DNA的載體。
44.權(quán)利要求43的載體，該載體能在含載體的細(xì)胞中可誘導(dǎo)地調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)。
45.權(quán)利要求44的載體，所說(shuō)的核苷酸序列編碼一種異源多肽。
46.一種含有整合至其基因組中的權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物。
47.一種含有整合至其基因組中的權(quán)利要求32的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物。
48.一種來(lái)自權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
49.一種來(lái)自權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
50.一種來(lái)自權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞。
51.一種來(lái)自權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞。
52.一種向轉(zhuǎn)基因植物提供抗病性的方法，該方法包含下列步驟(a)產(chǎn)生含有整合至其基因組中的權(quán)利要求32的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；以及(b)從所說(shuō)的植物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，其中權(quán)利要求32的核酸分子的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植物具有抗病性。
53.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是一種雙子葉植物。
54.權(quán)利要求53的轉(zhuǎn)基因植物，其中雙子葉植物是茄科的一個(gè)成員。
55.權(quán)利要求54的轉(zhuǎn)基因植物，其中茄科植物是煙草屬的一個(gè)成員。
56.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是一種單子葉植物。
57.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是一種裸子植物。
58.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是一種松柏類植物。
59.一種增加轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中下游DNA序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生含有權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，該核酸分子整合到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞基因組中，并且位于增加下游DNA序列轉(zhuǎn)錄的位置；(b)從所說(shuō)的植物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了定性和定量的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列,前者在植物、植物組織和植物細(xì)胞的可誘導(dǎo)基因表達(dá)中發(fā)揮功能,后者在植物、植物組織和植物細(xì)胞中增加下游遺傳信息的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明也公開(kāi)了提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法和重組DNA分子,尤其是一種控制能夠引發(fā)植物超敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1191565SQ96195657
公開(kāi)日1998年8月26日 申請(qǐng)日期1996年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月18日
發(fā)明者J·查佩爾, C·A·G·科爾內(nèi)特, 殷紹輝 申請(qǐng)人:肯塔基州州立大學(xué)托管委員會(huì)