專利名稱：冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌的深層培養(yǎng)液。
冬蟲夏草是傳統(tǒng)的名貴中藥之一，具有益腎陽、補(bǔ)肺、止血化痰、補(bǔ)虛損等功效。它常用于治療虛弱癥、肺結(jié)核出血、老年衰弱的慢性咳喘、盜汗貧血等。由于野生資源有限人們采用人工方法來彌補(bǔ)野生資源的不足。其中人工有性栽培冬蟲夏草工序復(fù)雜、培養(yǎng)條件嚴(yán)格；費(fèi)時(shí)費(fèi)工、周期長(zhǎng)產(chǎn)量低，因而人們又轉(zhuǎn)向人工無性培養(yǎng)。如在《微生物與生物工業(yè)》(門大鵬等科學(xué)出版社1989年12月第一版P290)中介紹冬蟲夏草菌的搖瓶培養(yǎng)物(深層培養(yǎng)物)成分與天然冬蟲夏草成分類似，具有平補(bǔ)肺腎、填精益髓、強(qiáng)化體質(zhì)等功能。經(jīng)臨床300多例驗(yàn)證，冬蟲夏草人工無性培養(yǎng)物對(duì)甲狀腺機(jī)能減退、冠心病、變態(tài)反應(yīng)性鼻炎、自覺耳鳴、慢性支氣管炎等有明顯療效。另外它還具有一定的免疫增強(qiáng)功能，但是效果不理想。
本發(fā)明的目地在于提供一種免疫增強(qiáng)效果較明顯的冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)物。
本發(fā)明的目的由以下措施來實(shí)現(xiàn)一種冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)液，其特征在于它是冬蟲夏草菌在復(fù)合液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的產(chǎn)物，其中復(fù)合液體培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與中藥水提取液的混合物，兩者的體積比為4∶1，中藥水提取液是由枸杞子、白術(shù)、女貞子、黃芪、茯苓、無花果、黨參、黃精、薏苡仁中的三味與山藥、玉竹、肉蓯蓉中的一味組成配方，各味藥用量相等，煎煮時(shí)所加水量是各組藥重量之和的10倍，煎煮后得到的中藥水提取液是所加水重量的1/2。一種冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于①種子液的制備將斜面上培養(yǎng)出的菌絲移種到沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，于25～31℃溫度搖床培養(yǎng)5天，②中藥水提取液的制備取甲組中藥材3味乙組中藥材1味加水煎煮，沸騰后文火煎煮35～50分鐘，使得到的水提取液是所加水體積的一半，過濾備用，③配制將沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與中藥水提取液按4∶1的體積比混合成復(fù)合液體培養(yǎng)基，再按種子液復(fù)合液體培養(yǎng)基＝1∶50(體積比)的比例將種子液加入復(fù)合培養(yǎng)基中，④培養(yǎng)在25～31℃溫度搖床或發(fā)酵罐培養(yǎng)7天。
本發(fā)明主要是向普通培養(yǎng)基中加入中藥水提取液，用該復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)冬蟲夏草菌進(jìn)行深層培養(yǎng)所獲得的產(chǎn)物即為本發(fā)明的產(chǎn)物。
本發(fā)明所采用的菌為冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis(Berk)sacc)。復(fù)合液體培養(yǎng)基中的普通培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(即40.0克葡萄糖、10.0克蛋白胨、1000毫升蒸餾水)。復(fù)合液體培養(yǎng)基中的中藥水提取液它是選用具有增強(qiáng)免疫功能、抗癌和升白作用的中藥材如枸杞子、白術(shù)、女貞子、黃芪、茯苓、無花果、黨參、黃精、薏苡仁(甲組)及傳統(tǒng)的保健藥品如山藥、玉竹、肉蓯蓉等(乙組)。其中每方含有甲組中藥材3味，乙組中藥材1味，而且各味藥材用量相等，煎煮時(shí)所加水量是各組藥量(重量)之和的10倍。煎煮后得到的中藥水提取液是所加水重量(或體積)的1/2。沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與上述中藥水提取液的體積比為4∶1。
本發(fā)明的深層培養(yǎng)液的制備方法如下
1、種子液的制備將冬蟲夏草菌種保存培養(yǎng)于沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，其中葡萄糖10.0克、蛋白胨10.0、瓊脂20.0克、蒸餾水1000毫升。將斜面上培養(yǎng)出的菌絲用接種鉤移種到沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基每1000毫升含40.0克葡萄糖、10.0克蛋白胨、0.3克磷酸二氫鉀、0.3克磷酸氫二鉀、0.2克硫酸鎂，于28±3℃溫度搖床(120轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)5天，得到的產(chǎn)物簡(jiǎn)稱為種子液。
2、中藥水提取液的制備取含甲組中藥材3味、乙組中藥材一味的一組中藥材，加水煎煮，沸騰后文火煎煮35～50分鐘，使得到的水提取液是所加水體積的一半，過濾備用。
3、配制將沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與中藥水提取液按4∶1的體積比配制成復(fù)合液體培養(yǎng)基，再按種子液復(fù)合液體培養(yǎng)基＝1∶50(體積比)的比例將種子液加入復(fù)合培養(yǎng)基中。
4、培養(yǎng)在28±3℃溫度、搖床(120轉(zhuǎn)/分)或發(fā)酵罐(以120轉(zhuǎn)/分速度攪拌)培養(yǎng)7天。如果采用發(fā)酵罐還要向罐內(nèi)通入無菌空氣。
5、后處理將培養(yǎng)液過濾，濾餅為菌絲體，其經(jīng)加工可制成藥品。濾液為深層培養(yǎng)液，經(jīng)滅菌即可分裝。如將其制成口服液還需加入糖和香精調(diào)整口感。
本發(fā)明的產(chǎn)物除具有普通冬蟲夏草深層培養(yǎng)液的作用外，更具有較強(qiáng)免疫增強(qiáng)功能，尤其是抗腫瘤效果十分顯著。
例1
將冬蟲夏草菌種保存培養(yǎng)于沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，其中葡萄糖0.1克、蛋白胨0.1克、瓊脂0.2克、蒸餾水10毫升。將斜面上培養(yǎng)出的菌絲用接種鉤移種到300毫升沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含12克葡萄糖，3克蛋白胨，0.09克磷酸二氫鉀、0.09克磷酸氫二鉀、0.06克硫酸鎂。在25～31℃溫度搖床培養(yǎng)5天(120轉(zhuǎn)/分)得到內(nèi)含直徑0.1～1.5mm菌絲球的淡黃色懸濁液即為種子液。
取無花果、茯苓、白術(shù)、山藥各20克加水800毫升，煮沸后改文火煎煮35～50分鐘，得水提物400毫升，過濾備用。取200毫升沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與50毫升中藥水提取液混合，得到250毫升復(fù)合液體培養(yǎng)基。再取5毫升種子液將其加到250毫升復(fù)合培養(yǎng)基中，在25～31℃溫度搖床(120轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)7天，過濾培養(yǎng)物得到外觀為淡棕黃色液體，即為深層培養(yǎng)液，經(jīng)滅菌后即可分裝。
例2
重復(fù)例1的操作，其中中藥配方的組成為枸杞子、黃芪、黃精和玉竹各20克。
例3
重復(fù)例1的操作，其中中藥配方的組成為女貞子、黨參、薏苡仁和肉蓯蓉各20克。
將本發(fā)明的深層培養(yǎng)液分別與冬蟲夏草在沙氏液體培養(yǎng)基中的深層培養(yǎng)液(簡(jiǎn)稱單純培養(yǎng)物)及中藥水提取液給小鼠口服進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如下
由上表可見本發(fā)明產(chǎn)物的抑癌率明顯優(yōu)于其它兩者，并且也高于其它兩者之和。
2、在測(cè)定荷瘤鼠腹腔巨噬細(xì)胞殺瘤活性實(shí)驗(yàn)中
由上表可見口服本發(fā)明產(chǎn)物的荷瘤小鼠其腹腔巨噬細(xì)胞的殺瘤活性明顯高于其它兩對(duì)照組。
3、在測(cè)定腫瘤特異性殺傷T細(xì)胞殺瘤活性實(shí)驗(yàn)中
由上表可見口服本發(fā)明產(chǎn)物的荷瘤小鼠其腫瘤特異性殺傷T細(xì)胞的殺癌活性明顯高于其它兩對(duì)照組。
4、在對(duì)健康BAL B/C純系小鼠進(jìn)行的免疫指數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中
刀豆蛋白A(Con A)刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)(StimulationIndex SI)反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，脂多糖(LPS)刺激的SI反映機(jī)體體液免疫功能狀態(tài)。由上表可見本發(fā)明產(chǎn)物的免疫增強(qiáng)作用優(yōu)于其它兩組。
權(quán)利要求
1、一種冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)液，其特征在于它是冬蟲夏草菌在復(fù)合液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的產(chǎn)物，其中復(fù)合液體培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與中藥水提取液的混合物，兩者的體積比為4∶1，中藥水提取液是由構(gòu)杞子、白術(shù)、女貞子、黃芪、茯苓、無花果、黨參、黃精、薏苡仁中的三味與山藥、玉竹、肉蓯蓉中的一味組成配方，各味藥用量相等，煎煮時(shí)所加水量是各組藥重量之和的10倍，煎煮后得到的中藥水提取液是所加水重量的1/2。
2、一種冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于①種子液的制備將斜面上培養(yǎng)出的菌絲移種到沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，于26～31℃溫度搖床培養(yǎng)5天，②中藥水提取液的制備取甲組中藥材3味乙組中藥材1味加水煎煮，沸騰后文火煎煮35～50分鐘，使得到的水提取液是所加水體積的一半，過濾備用，③配制將沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與中藥水提取液按4∶1的體積比混合成復(fù)合液體培養(yǎng)基，再按種子液復(fù)合液體培養(yǎng)基＝1∶50(體積比)的比例將種子液加入復(fù)合培養(yǎng)基中，④培養(yǎng)在25～31℃溫度搖床或發(fā)酵罐培養(yǎng)7天。
全文摘要
一種冬蟲夏草菌深層培養(yǎng)液,它是冬蟲夏草菌在由沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基與中藥水提取液組成的復(fù)合液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的產(chǎn)物。中藥水提取液是由枸杞子、白術(shù)、女貞子、黃芪、茯苓、無花果、黨參、黃精、薏苡仁中的三味與山藥、玉竹、肉蓯蓉中的一味組成的配方。將由菌絲培養(yǎng)出的種子液在復(fù)合液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7天,得到的液體即為本發(fā)明的產(chǎn)物。本發(fā)明產(chǎn)物除具有普通冬蟲夏草深層培養(yǎng)液的作用外,更具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)功能。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1176107SQ9611558
公開日1998年3月18日 申請(qǐng)日期1996年9月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月6日
發(fā)明者于芒 申請(qǐng)人:于芒