專利名稱：球形固定化細(xì)胞/酶粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化生物催化劑的制備方法，更確切地說是一種固定化細(xì)胞/酶的制備方法。
采用包埋法制備固定化細(xì)胞/酶所用的載體有兩類。一類是天然高分子材料，如明膠、瓊脂和海藻酸鈣等，由于其機(jī)械強(qiáng)度一般都較差，難以適用于生物反應(yīng)器中，尤其是流化床類型生物反應(yīng)器中長期地連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。另一類是合成高分子材料，如聚丙烯酰胺等，主要由于其單體往往對菌體或酶有毒性，或者在制備過程中條件相對苛刻，易于損傷酶的活性，且一般亦難以制成球形顆粒，以適應(yīng)流化床生物反應(yīng)器操作。近幾年來，不少專利文獻(xiàn)報導(dǎo)了用聚乙烯醇(PVA)作為載體，在將聚乙烯醇水溶膠凝膠化，改進(jìn)成形技術(shù)使之成為球形，提高凝膠化粒子機(jī)械強(qiáng)度，緩和微生物細(xì)胞包埋時載體凝膠化工藝條件以及減少酶活力損失方面已取得顯著成果。如日本特許昭61-100193A采用硼酸成形方法使聚乙烯醇水溶膠凝膠化，制得了球形的固定化細(xì)胞/酶粒子，且機(jī)械強(qiáng)度好。但是該過程使用了對細(xì)胞/酶具有毒性的硼酸，勢必將損傷細(xì)胞/酶的活性，因此不適宜PH呈酸性范圍的微生物細(xì)胞/酶的固定化。最近中國專利文獻(xiàn)CN1076488報導(dǎo)對該硼酸法進(jìn)行了改進(jìn)，采用了硼酸一磷酸的二階段成形的方法，縮短了細(xì)胞/酶與硼酸的接觸時間，但還是擺脫不了硼酸，且所用的磷酸鹽濃度也較高，約在3～20％。此外，迄今為止所發(fā)表的專利文獻(xiàn)中都未提及固定化微生物催化劑制備過程中有關(guān)孔隙率的調(diào)節(jié)，使之適應(yīng)不同大小細(xì)胞/酶和不同底物的要求，致使所制備的固定化生物催化劑通透性好，傳質(zhì)阻力小，機(jī)械強(qiáng)度高。
本發(fā)明的目的在于提供一種球形固定化細(xì)胞/酶粒子的制備方法。依此方法制備的固定化細(xì)胞/酶，具有規(guī)則的球形顆粒，有彈性與韌性，機(jī)械強(qiáng)度高，耐磨，其內(nèi)部有豐富的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且孔隙率大小可以進(jìn)行調(diào)整，用在生化反應(yīng)過程中通透性好，傳質(zhì)阻力小，固定化細(xì)胞/酶活力高。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的。采用無毒聚乙烯醇、海藻酸鈣、硅溶膠復(fù)合材料，將其制成混合水溶膠，并按比例加入微生物細(xì)胞/酶，均勻混合后在多價金屬離子溶液中初步形成規(guī)則的球形粒子，粒子再經(jīng)2次以上冷凍與部分風(fēng)干過程，然后再置于低濃度的致孔劑中，放置一定時間后便可得到所需的固定化細(xì)胞/酶粒子。上述制備過程中其技術(shù)特征在于1.使用的無毒聚乙烯醇復(fù)合載體，它是由聚乙烯醇、海藻酸鈣及硅溶膠所制成的復(fù)合物凝膠，它們在水溶膠中的重量百分?jǐn)?shù)為聚乙烯醇6～15％，海藻酸鈣為0.5～1.5％，硅溶膠為0.3～5.0％；2.所使用的多價金屬離子溶液為CaCl2水溶液，其濃度為0.1～0.5M；3.所使用的致孔劑為低濃度的磷酸或磷酸鹽，如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉或相應(yīng)鉀鹽等，其濃度為0.03～0.55％(重量)。
本發(fā)明的具體實施過程是首先將聚乙烯醇、海藻酸鈣和硅溶膠按照上述比例制成混合水溶膠后，高壓滅菌消毒。然后加入微生物細(xì)胞濕菌體，其含量一般為1～10％(重量)，充分混均，再將含有該微生物細(xì)胞的混合水溶膠在含有多價金屬離子的水溶液中初步制成規(guī)則的球形顆粒。制粒方式可以采用離心式制?；蚨鄧娮靿毫κ街屏?，實驗室可采用蠕動泵滴加制粒。多價金屬離子水溶液可以是CaCl2水溶液，其濃度一般為0.1～0.5M。初具球形顆粒的固定化細(xì)胞粒子在CaCl2水溶液中需保持2～6小時，隨后在室溫下解凍風(fēng)干，脫除部分水份，如此冷凍、解凍和部分風(fēng)干兩次以上，再用生理鹽水洗滌后，浸于含有0.03～0.55％(重量)的磷酸或磷酸鹽(如磷酸氫二鈉)的緩沖溶液中，使之進(jìn)一步形成所需的具有一定孔隙率的固定化細(xì)胞粒子。
縱觀固定化細(xì)胞粒子的形成過程，影響其粒子大小的主要因素在于混合水溶膠的組成和粘度，以及噴嘴的大小和溶膠在噴嘴處的噴出速度。而影響粒子的孔徑和孔隙率的因素在于，聚乙烯醇海藻酸鈉及硅溶膠在水溶膠中的含量，培養(yǎng)基或緩沖液中磷酸根離子的濃度和凝膠粒子在該培養(yǎng)基或緩沖液中停留時間，還有凝膠的風(fēng)干脫水程度等。這些因素也直接影響到固定化細(xì)胞粒子的強(qiáng)度。
以本發(fā)明所制得的固定化細(xì)胞/酶粒子，外觀呈規(guī)則的球形顆粒，其粒徑一般1.5～3.0mm，有彈性、機(jī)械強(qiáng)度好、耐磨損、抗擠壓，其內(nèi)部具有豐富網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的附著與生長，在進(jìn)行生化反應(yīng)時，通透性好，傳質(zhì)阻力小。在厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2極易排出。用于連續(xù)的流化床或固定床反應(yīng)器中，固定化細(xì)胞粒子無漂浮現(xiàn)象，保證了反應(yīng)器正常運(yùn)轉(zhuǎn)，并且在使用中具有酶活高和壽命長的特點。
將用上述方法制得的固定化酵母細(xì)胞粒子，置于含有0.04％磷酸培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞增殖，約經(jīng)過28小時，其內(nèi)酵母菌濃度達(dá)(2～4)×109個細(xì)胞/毫升粒子，其粒徑約為3mm，然后將其置于二級噴射環(huán)流移動床反應(yīng)器和一個多段固定床反應(yīng)器串聯(lián)的反應(yīng)系統(tǒng)中，以糖蜜為原料進(jìn)行酒精發(fā)酵。該固定化酵母細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)無漂浮現(xiàn)象，流動狀態(tài)好，機(jī)械強(qiáng)度高。當(dāng)?shù)孜锾菨舛葹?6％時，空時為5.01時，其終了酒精濃度為8.5％(體積)，糖轉(zhuǎn)化率為94.4％，對糖收率為93.4％，生產(chǎn)能力為48.07克酒精/(催化劑·小時)。該固定化酵母細(xì)胞使用壽命達(dá)3個月以上。
下面以實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例一聚乙烯醇40克(聚合度為1750±50，醇解度大于97％)；海藻酸鈉5克；硅溶膠40毫升(濃度為28％)；水400毫升；酵母濕菌體10克；氯化鈣水溶液1升(0.3M)。
將聚乙烯醇、海藻酸鈉、硅溶膠與水于85℃～95℃下充分混合制成混合水溶膠，并進(jìn)行高壓滅菌消毒。待該水溶膠冷卻至30℃左右，加入已培養(yǎng)好且經(jīng)過高速離心后的酵母濕菌體，充分混合均勻，然后通過蠕動泵滴入預(yù)先配制好的氯化鈣水溶液中，成為3～4mm球形顆粒，并在該氯化鈣溶液中緩慢攪拌2小時。濾去氯化鈣溶液，用生理鹽水洗滌一次后，移入冰室，于-25℃條件下冷凍10小時，再取出于28～30℃下解凍風(fēng)干8小時，如此反復(fù)冷凍及風(fēng)干三次，再將其置于28℃下的含有0.04％(重量)磷酸的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞增殖，經(jīng)過28小時，便制得所需的固定化酵母細(xì)胞粒子，其粒徑為3mm，該固定化酵母球形粒子內(nèi)酵母菌濃度高達(dá)(2～4)×109個細(xì)胞/毫升粒子，并且有彈性與韌性，耐磨抗壓，其結(jié)合了合成高分子和天然高分子作為固定化載體的優(yōu)點。
實施例二聚乙烯醇9克(聚合度為1750±50，醇解度大于97％)；海藻酸鈉1.2克；水90毫升；簡單節(jié)桿菌濕菌體5克；氯化鈣水溶液200毫升(0.3M濃度)。
制備固定化節(jié)桿菌粒子方法同實施例一。將所制備的固定化節(jié)桿菌粒子置于含有0.5％磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基中，溫度為32℃，時間為48小時，便制得所需的固定化節(jié)桿菌球形催化劑，將其用于醋酸可的松脫氫制醋酸強(qiáng)的松的過程中，其Δ1.2脫氫酶的活力可提高3.8倍。進(jìn)行搖瓶實驗，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mg/ml時，反應(yīng)時間僅需13小時便可達(dá)到98％的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mg/ml時，反應(yīng)時間也僅17小時便可達(dá)到97％的轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
1.一種球形固定化細(xì)胞/酶粒子的制備方法，它是以聚乙烯醇復(fù)合材料與水混合成水溶膠后，按比例加入微生物細(xì)胞/酶，均勻混合后在成形劑中制成初具球形粒子膠體，膠體粒子再經(jīng)2次以上冷凍、解凍與部分風(fēng)干過程后，再置于致孔劑中便可獲得外觀呈球形、內(nèi)部呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞/酶粒子。該方法的技術(shù)特征在于a.聚乙烯醇復(fù)合材料由聚乙烯醇、海藻酸鈣及硅溶膠組合而成，它們在水溶膠中的重量百分比分別為6～15％，0.5～1.5％和0.3～5.0％；b.成形劑為多價金屬離子的CaCl2水溶液，其濃度為0.1～0.5M；c.致孔劑為低濃度的磷酸、磷酸鹽(如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)或相應(yīng)鉀鹽，如磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等，其濃度為0.03～0.55％(重量)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固定化生物催化劑的制備方法。該方法是以無毒的聚乙烯醇復(fù)合材料為載體，先將其制成混合水溶膠，并按比例加入微生物細(xì)胞或酶，均勻混合后在多價金屬離子溶液中初步形成規(guī)則的球形粒子，粒子再經(jīng)多次冷凍與部分風(fēng)干過程，然后再置于低濃度的致孔劑中，便可得到所需的固定化細(xì)胞或酶粒子。按本方法所制成的固定化生物催化劑粒子，酶活高、機(jī)械強(qiáng)度好、耐磨損、抗擠壓、內(nèi)部具有豐富網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，應(yīng)用時通透性好，傳質(zhì)阻力小。
文檔編號C12N11/00GK1143112SQ9610159
公開日1997年2月19日 申請日期1996年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月1日
發(fā)明者張瑛, 甘一如, 元英進(jìn), 王大中 申請人:天津大學(xué)