專利名稱：：生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺有關(guān)的多肽、編碼這些多肽的dna序列、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對編碼多肽之DNA順序的準確鑒定，所說的多肽與鈷胺素和/或鈷胺酰胺的生物合成有關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的主題在于這些DNA序列和由于基因編碼的簡并性而造成的所有同源DNA序列，以及可與這些序列或其片段雜交的和/或顯示出有意義之同源性的，并編碼鈷胺素和/或鈷胺酰胺生物合成所涉及之多肽的所有來源(天然的、合成的、重組的)的DNA序列。本發(fā)明還涉及含有這些DNA序列的基因。用根據(jù)根瘤土壤桿菌和臭味假單胞菌之cob突變體的互補作用，由菌株MB580(US3018225)衍生的工業(yè)菌株(脫氮假單胞菌SC510)分離得到本發(fā)明的DNA序列?？山柚迦朕D(zhuǎn)座子Tn5衍生物用同位素掃描法精確地分析所得到的這些克隆。這些基因研究工作可在有限的范圍內(nèi)確定cob基因的位置，并能夠測定它們的序列。而對開放區(qū)段的分析則能顯示出這些DNA片段的編碼區(qū)。本發(fā)明還涉及根據(jù)這些核苷酸序列克隆其他細菌的cob基因。對于催化同樣活性的蛋白質(zhì)，其序列以岐異進化的形式得以保留(Wein-Hsiungetal.，1985)。本發(fā)明中已表明，不同微生物內(nèi)編碼鈷胺素和/或鈷胺酰胺生物合成所需之多肽的核苷酸序列之間存在著顯著的同源性。而出現(xiàn)差異則是由于進行簡并性造成的，即由于基因組密碼簡并性造成的，后者則與所研究的基因組中GC的百分率有關(guān)(Wein-Hsiungetal.，1985)。根據(jù)本發(fā)明，與密碼子的使用和所研究之細菌的DNA中GC百分比相適應(yīng)，可使用一個或多個脫氮假單胞菌的DNA序列或這些序列的片段，或使用具有特性簡并性的類似序列的探針。在這些條件下，有可能探查到探針與待研究細菌之基因組DNA片段間的特定雜交信號;這種雜交信號相當于探針與該細菌之等功能cob基因的雜交。然后即可分離，純化并鑒定這些cob基因及其產(chǎn)物。本發(fā)明還提供一種通過雜交獲得核苷酸序列以及所有微生物生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺時所涉及之多肽的方法。本發(fā)明還涉及一種重組DNA，該重組DNA至少含有一個編碼生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺有關(guān)之多肽的DNA序列，特別是有一個或多個處于表達信號控制下之序列的重組DNA。在這方面，尤其可定位啟動區(qū)之DNA序列的5′端。這些區(qū)域可以是與DDNA序列同源或異源的。具體地說，可使強細菌啟動子，如色氨酸操縱子的Ptrp啟動子或大腸桿菌之乳糖操縱子的Plac啟動子。入噬菌體的左或右啟動子、細菌噬菌體的強啟動子(如棒狀桿菌屬)、革蘭氏陰性細菌中的功能性啟動子，如大腸桿菌的Ptac啟動子、質(zhì)粒TOL之二甲苯分解代謝基因的PxylS啟動子、枯草芽胞桿菌之淀粉酶的Pamy啟動子。還可列舉出由酵母的糖酵群基因衍生的啟動子，如編碼磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、乳糖酶或烯醇酶之基因的啟動子，當在真核生物宿主中引入重組DNA時，這些啟動子均可使用。核糖體的固定同樣位在DNA序列的5′側(cè)，并且可能是同源或異源的，如入噬菌體之CⅡ基因的核糖體的固定位置。轉(zhuǎn)錄終止所需的信號可位于DNA序列的3′側(cè)。另外，本發(fā)明的重組DNA可直接引入與選擇之表達信號相容的宿主細胞內(nèi)，或克隆到質(zhì)粒載體上，以便將所述的DNA序列穩(wěn)定地引入宿主細胞中。本發(fā)明的另一個內(nèi)容涉及如此制得的質(zhì)粒，它們含有編碼與生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺有關(guān)之多肽的DNA序列。更確切地說，這些質(zhì)粒還含有功能性復制系統(tǒng)和選擇標志。本發(fā)明還涉及其中已引入一個或多個如上限定的DNA序列或如上限定的質(zhì)粒的宿主細胞。本發(fā)明還涉及制備與生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺有關(guān)之多肽的方法。根據(jù)該方法，用上面敘述的DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細胞，在能夠表達所述序列的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的細胞，然后回收所生成的多肽。能用于這一目的宿主細胞可以是原核細胞、真核細胞、動物細胞或植物細胞。但最好是細菌細胞，特別是大腸桿菌、脫氮假單胞菌、根瘤病土壤桿菌或苜蓿根瘤菌細胞。本發(fā)明之DNA序列的另一個應(yīng)用，在于提供以DNA重組技術(shù)放大鈷胺素和/或鈷胺酰胺生產(chǎn)的方法。事實上，如果是由于生物合成過程中酶的活性限制了鈷胺素和/或鈷胺酰胺生物合成的代謝流，那么就可借助于DNA重組技術(shù)(基因擴增、用更有效的信號代替已有的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯信號)，通過增加該酶的表達來提高其活性，進而增加鈷胺素和/或鈷胺酰胺的生物合成能力。再有一種可能是通過生物化學調(diào)節(jié)因素來限制鈷胺素和鈷胺酰胺的生產(chǎn)。在這種情況下，可以體外特異地誘變一種或多種對應(yīng)于調(diào)節(jié)酶的cob基因，以得到突變基因，使之去掉不利于生產(chǎn)能力的調(diào)節(jié)因素。本發(fā)明的方法包括用如前定義的DNA序列轉(zhuǎn)化鈷胺素和/或鈷胺酰胺的生產(chǎn)菌，或轉(zhuǎn)化只能產(chǎn)生上述化合物的微生物(即在一個或多個步驟中生物合成酶有缺陷的微生物)，進而在在能表達所述序列和合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺的條件下培養(yǎng)這些微生物，最后回收鈷胺素和/或鈷胺酰胺產(chǎn)物。這樣一種方法適用于本文第4頁上列舉的所有微生物，特別是脫氮假單胞菌、苜蓿根瘤菌或根瘤病土壤桿菌等微生物。對于最佳實施方案，所用微生物是脫氮假單胞菌，特別是菌株SC510。對于上述可能產(chǎn)生的微生物，所用DNA序列是那些相應(yīng)于微生物不可能完成的生物合成步驟中的DNA序列。按照本發(fā)明，并采用上面公開的各種策略，可使所有產(chǎn)生(或可能產(chǎn)生)鈷胺素和/或鈷胺酰胺之微生物的鈷胺素和/或鈷胺酰胺生產(chǎn)能力得到改善。為生產(chǎn)鈷胺素和表達引入的DNA序列，只需在適當條件下培養(yǎng)這些已重組的微生物就夠了。培養(yǎng)過程可間斷或連續(xù)進行。可以工業(yè)水平已使用的方法純化鈷胺素(florent，1986)。這些方法包括ⅰ)增溶鈷胺素并使之轉(zhuǎn)變成氰基化物(如在亞硝酸鈉存在下，用氰化鉀加熱處理發(fā)酵液)，然后ⅱ)以不同步驟純化氰鈷胺素，這些步驟例如是a)用不同的基質(zhì)，如離子交換樹脂amberliotIRC50、Dowex1×2或amberliteXAD2進行吸附，然后用水-乙醇或水-苯酚混合物淋洗，然后b)有機溶劑提取，最后c)或者加入反應(yīng)物，或用適當溶劑稀釋，或蒸發(fā)，使之從有機相中沉淀或結(jié)晶出來。本發(fā)明還顯示，有可能借助DNA重組技術(shù)改善鈷胺素生產(chǎn)菌的鈷胺素產(chǎn)率，同時兼獲多重改進。所獲得的第一方面改進已如上所述，繼之還可借助DNA重組技術(shù)，如對鈷胺素生物合成基因進行擴增，以在上述改進的基礎(chǔ)上再次改進。本發(fā)明的另一個內(nèi)容涉及參予生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺的多肽。已描述了這些多肽的氨基酸序列，以及它們的某些物理化學特性。酶促活性或這些特性分別與這些多肽序列相關(guān)聯(lián)。具體地說，本發(fā)明涉及由上述DNA序列編碼的、參予鈷胺素和/或鈷胺酰胺之生物合成過程的所有多肽、或其衍生物或這些多肽的片段。此外，可利用前述雜交探針，由其他微生物分離的基因，去鑒定并分離其他微生物的同功能多肽。從而，本發(fā)明顯示了脫氮假單胞菌的COB蛋白質(zhì)序列與具有同類型活性其他微生物蛋白質(zhì)序列是顯著同源的。在不同微生物中完成相同催化反應(yīng)的這些COB蛋白質(zhì)之間，只是導致進化距離的變化(Wein-Hsiungetal.，1985)。本發(fā)明還涉及這些同功能多肽。賦予特定的酶促活性，是基于按不同策略進行分析已得知的。對SAM(S腺苷-L-甲硫氨酸)的親和性(體外試驗)的研究可歸因于一種能固定SAM的蛋白質(zhì)，即甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，及其參予尿卟啉原Ⅲ與鈷胺醇酰胺之間產(chǎn)生之甲基的轉(zhuǎn)移步驟。估價這些多肽活性的另一種方法是檢測積聚于不能表達這些多肽之突變體內(nèi)的鈷胺素生物合成途徑的中間體(借助互補實驗鑒定)。由這些分析可以推測出，所研究的多肽與所積聚的中間體底物有關(guān)，從而可定位并限定其在生物合成中的活性。本發(fā)明還涉及定量檢測應(yīng)用于所有鈷胺素和/或鈷胺酰胺生產(chǎn)菌株生物合成所需酶促活性的方法?；谶@種定量檢測，可得以純化來自生產(chǎn)這些化合物之所有菌株的待測酶催活性。根據(jù)已純化的活性，便可以測定所研究之COB蛋白質(zhì)的NH2末端順序，或其亞單位的序列，從而得以鑒定編碼所研究之活性的一個或多個結(jié)構(gòu)基因。就脫氮假單胞菌來說，鑒定編碼生物合成有關(guān)活性的結(jié)構(gòu)基因，便可在發(fā)現(xiàn)每個NH2末端序列時發(fā)現(xiàn)具有相同NH2末端序列的COB蛋白質(zhì)。本發(fā)明還描述了在鈷胺素生產(chǎn)菌株中，鑒定和檢測生物合成鈷胺素或其他類咕啉的中間體。如同它們在細胞內(nèi)一樣，在培養(yǎng)液中也檢測到這些中間體?？蓹z測到的中間體除鈷啉酸外，還有鈷啉酸單酰胺、鈷啉酸二酰胺、鈷啉酸三酸胺、鈷啉酸四酰胺、鈷啉酸五酰胺、鈷啉胺酸、鈷啉醇酰胺、磷酸鈷啉醇酰胺、GDP-鈷啉醇酰胺、磷酸輔酶B12和輔酶B12，即在鈷啉酸之后，已發(fā)現(xiàn)了所有生物合成途徑中的類咕啉。用這種技術(shù)也可檢測到這些未腺苷化形式的產(chǎn)物。本發(fā)明的其他內(nèi)容和優(yōu)點可具體體現(xiàn)在本文下述的附圖和實施例中，這些實施例和附圖只是闡述而不是限制本發(fā)明。所用述語和縮寫詞的定義是ACDAS鈷啉酸a，c-二酰胺合酶DNA重組能使非天然的DNA序列在同一微生體內(nèi)結(jié)合，或使DNA片段產(chǎn)生特異性誘變的技術(shù)組合。ATP5′-三磷酸腺苷BSA牛血清白蛋白CLHP高效液相層析cluster基因的組群Cob相當于鈷胺素生產(chǎn)之減低水平(至少比對照組低10倍)的表型Codenstop轉(zhuǎn)譯的終止密碼子Corrinoides具有咕啉核的鈷啉酸衍生物dGTP5′-三磷酸脫氧鳥苷DMBI二甲基苯并咪唑dNTP5′-三磷酸脫氧核苷DTT二硫蘇糖醇genecob由尿卟啉原Ⅲ生物合成鈷胺素時所涉及的基因genecor由尿卟啉原Ⅲ生物合成類唑啉時所涉及的基因kb千堿基ORF開放相pb堿基對PPAHBY帶有氫化咕啉酸(acidehydrogenobyrinique)的蛋白質(zhì)ProteineCOB或者在生物合成鈷胺素過程中作為催化劑，或者在cob基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)中作為調(diào)節(jié)蛋白，或兼有兩種作用的蛋白質(zhì)。ProteineCOR或者在生物合成類咕啉過程中作為催化劑，或者在cor基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)中作為調(diào)節(jié)蛋白，或者兼有兩種功能的蛋白質(zhì)。SAMS腺苷基-L-甲硫氨酸SDS十二烷基磺酸鈉SP2MTSAM-L-甲硫氨酸前咕啉-2甲基轉(zhuǎn)移酶SUMTSAM尿卟啉原Ⅲ甲基轉(zhuǎn)移酶UrogenⅢ尿卟啉原Ⅲ附圖說圖圖1輔酶B12的結(jié)構(gòu);其中，對于甲基鈷胺素，5′脫氧腺苷基被甲基取代;對于氰基鈷胺素，5′脫氧腺苷基被氰基取代;對于羥鈷胺素，5′脫氧腺苷被羥基取代。圖2鈷胺素的生物合成及其生物合成的不同步驟。X鈷的軸向配位體;配位體a不同于配位體b。R鈷的配位體a，它限定了鈷胺素的類型(見圖1)。圖3尿卟啉原Ⅲ、前咕啉-1、前咕啉-2和前咕啉-3的結(jié)構(gòu)。圖4尿卟啉原Ⅲ和鈷啉酸的展開化學結(jié)構(gòu)式。在尿卟啉原Ⅲ與鈷啉酸之間，于C2、C7、C20、C17、C12、C1、C15和C5位上相繼進行8次依賴SAM的甲基轉(zhuǎn)移，在C12位進行一次脫羧，在C20位除去碳并嵌入鈷原子。X鈷的軸向配位體;配位體a可與配位體b不同。圖5生物合成鈷胺素的最后幾個步驟。為圖面清楚起見，略去了咕啉核的細微結(jié)構(gòu)。其中五個酶促步驟代表1、鈷胺酰胺激酶;2、磷酸鈷胺酰胺鳥苷基轉(zhuǎn)移酶;3、5′-磷酸鈷胺合酶;4、5′-磷酸鈷胺磷酸水解酶;5、煙酸核苷DMBI磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶。圖65.4kb之ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段;8.7kb之EcoRI片段;4748pb之SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI和3855pb之SstI-SstI-BamHI片段的限制圖。只示出20種限制酶，這些酶很少切斷DNA。各酶的切割位點均用垂直短線示出。圖7脫氮假單胞菌之雙股5378pbCla-HindIII-HindIII-HindIII片段的核苷酸序列。上面一列從左向右看是5′至3′方向，此相應(yīng)于圖6所示限制圖中片段的從左向右方向。發(fā)現(xiàn)ClaI位點處于23位(即酶切位點的起點)，因為如此確定的序列中可找到便于在多位點中進行克隆選擇的PstI、SalI和XbaI限制性位點。因此，ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段應(yīng)由23位開始。圖8脫氮假單胞菌的雙股8753pb之EcoRI片段的核苷酸序列。位于上方的一股片段從左向左是5′至3′方向，這相應(yīng)于圖6所示限制圖中之片段的從左到右方向。圖9利用Staden和Maclachlan(1982)的程序，對讀出5378pbclaI-HindIII-HindIII-HindIII-HindIII片段之序列的六個相根據(jù)所用密碼子分析出編碼相的概率。對于出現(xiàn)于同一編碼鏈上的相，最可能的相是對應(yīng)于由點連成線的、沒有被codenstop中斷的相，該相位于該相概率線下方。1、由核苷酸1至核苷酸1200的序列。基于分析，已鑒定出開放相1，它是從549位的ATG開始，終止在1011位的TGA。2、由核苷酸1000至核苷酸2200的序列。基于分析，已鑒定出開放相2，它是從1141位的ATG開始到1981位的TGA終止。3、由核苷酸1800至核苷酸3400的序列?；诜治?，已鑒定出開放相3，它是從1980位的ATG開始到3282位的TGA終止。4、由核苷酸3000至核苷酸4500的序列。基于分析，已鑒定出開放相4，它是從3281位的ATG開始到4280位的TGA終止。5、由核苷酸3800至核苷酸5378的序列?；诜治觯谚b定出開放相5，它是從4284位的GTG開始到5253位的TGA終止。圖10利用Staden和Maciachlan(1982)的程序，對讀出8753pb之EcoRI片段的六個相根據(jù)所用密碼分析出編碼相的概率。對于出現(xiàn)在同一編碼鏈上的相，最可能的相是相應(yīng)于由點連成線的、沒有被codensstop中斷的相。該相位于其概率線下方。1、由核苷酸650至核苷酸1650的序列?；谶@一分析，已鑒定出開放相6，它是由736位的ATG開始到1519位的TAG終止。2、由核苷酸1400至核苷酸3100的序列?；谶@一分析，已鑒定出開放相7，它是由1620位ATG開始到2997位TAG終止。3、由核苷酸2700至核苷酸3700的序列?；谶@一分析，已鑒定出開放相8，它是由3002位ATG開始到3632位TGA終止。4、由核苷酸3500至核苷酸4100的序列?；谶@一分析，已鑒定出開放相9，它是由3631位GTG開始到4366位TGA終止。5、由核苷酸4150至核苷酸5150的序列。基于這一分析，已鑒定出開放相10，它是由4365位ATG開始到5127位TGA終止。6、由核苷酸5000至核苷酸6000的序列?；谶@一分析，已鑒定出開放相11，它是由5893位ATG開始，到5110位TAG終止。7、由核苷酸5700至核苷酸7200的序列。基于這一分析，已鑒定出相12，它是由5862位的ATG，到7101位的TAA終止。8、由核苷酸7000至核苷酸8000的序列?；谶@一分析，已鑒定出開放相13，它是由7172位ATG開始，到7931位TTG終止。圖11質(zhì)粒pXL556、pXL545和pXL723的構(gòu)建。從5.4kb片段切掉含cobA和cobE基因的2.4kb之claI-EcoRV片段，然后純化。在EcoRV位點加入一個EcoRI“接頭”，然后將該片段在ClaI-EcoRV位點之間插入pXL59中。如此構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pXL556。pXL545的構(gòu)建與之差不多從5.4kb片段上切下1.9kb之ClaI-HindIII-HindIII片段，然后純化。該片段只含cobE基因。在HindIII位點加入一個EcoRI“接頭”，然后將該片段在ClaI-EcoRI位點間插入pXL59中。按下述方法構(gòu)建質(zhì)粒pXL723從5.4kb片段上切掉2.3kb之EcoRI-HindIII片段，純化之，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段填充末端。將該片段克隆到已用EcoRI消化過的pRK290中，然后用大腸桿菌的DNA聚合酶I大片段處理以填充末端。括號內(nèi)所示的限制位點相當于用大腸桿菌DNA聚合酶之大片段處理后消失的位點。1、RSF1010的PstI-SstI片段(DeGraffetal.，1978);2、pACYC177的PstI-BamHI片段(Bagdasarianetal.，1981);3、含有大腸桿菌乳糖操縱子而無其啟動子，并含有操縱基因、轉(zhuǎn)譯起始位點和LacZ(Casadabanetal.，1983)之前8個非必需密碼子的BamHI-SstI片段;4、臭味假單胞菌KT2440(Bagdasarianetal.，1981)的Sau3AI片段;Ori，復制原點;nic，松弛的位點;mob，流動所必需的座位;kmr，卡那霉素抗性基因(Bagdasarianetal.，1981);B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI，H，HindIII;P.PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI。圖12在5378bp片段中插入轉(zhuǎn)座子Tn55pr和Tn5的研究。如圖14所示，在質(zhì)粒pXL723中插入轉(zhuǎn)座子Tn5;將轉(zhuǎn)座子Tn55pr插入菌株SBF27Rifr的染色體中;按照卡那霉素抗性基因轉(zhuǎn)錄的方向，在插入序號下用箭頭表示將攜帶卡那霉素抗性基因(1630到1631)的暗盒插入SC510Rifr染色體中。圖中有由該序列推測出的開放相(從cobA到cobE);轉(zhuǎn)座子或卡那霉素抗性基因盒的多插入下的十或一號，表示該插入對不同突變體的互補作用是無活性的(-)還是有活性的(+)(在插入轉(zhuǎn)座子Tn5的情況下)，或表示因為插入而消除了本身會產(chǎn)生鈷胺素之菌株的鈷胺素生產(chǎn)能力。當重組突變體比衍生突變體合成鈷胺素的合成水平低2倍以下時，即表明沒有補償作用。在其端部可看到的限制性位點代表質(zhì)粒pXL545Ω、pXL1500、pXL1397和pXL302的插入段?？稍谟袕V泛宿主的質(zhì)粒pXL435和pXL59(Cameronetal.，1989)中克隆這些插入段。質(zhì)粒pXL545Ω相當于圖11中所描述的pXL545，但還具有pHP45Ω(PrentkietKrisch)的2kbBamHI片段，pHP45Ω含有已克隆到pXL545之BamHI位點中的壯觀霉素抗性基因。質(zhì)粒pXL1500相當于克隆到圖30所示pKT230(Bagdasarianetal.，1981)之BamHI和SstI位點的、此圖已示出的4.2kbBglII-SstI位點;pXL1397相當于本圖所示，已插入到圖30所述pXL435(Cameronetal.，1989)多位點之HindIII和SstI位點中的2.4kbHindIII-SstI片段;質(zhì)粒pXL302相當于本圖所示，已插入到圖30所述pXL59(Cameronetal.，1989)之EcoRI和HindIII位點中的2.3kb之EcoRI-HindIII片段，其中使用的HindIII位點是從pXL59之克隆多位點中選出的位點;pXL723與pXL545均如圖11中所示。各插入之上方的+或-號，用以表示上述的染色體插入所研究的質(zhì)粒有無互補作用。C，Cla;E，EcoRI;H，HindIII;Rv，EcoRV;Sau，Sau3AI;S，SstI。圖13質(zhì)粒pXL253和pXL365的構(gòu)建。由質(zhì)粒pXL151上切掉8.7kb的EcoRI片段，然后純化之。克隆到pKT230的EcoRI位點，得到pXL253。將同一片段插入pRK290(Dittaetal.，1981)的EcoRI位點，以得到pXL367。1、RSF1010(DeGraffetal.，1978)的PstI-SstI片段。2、pACYC177(Bagdasarianetal.，1981)的PstI-BamHI片段;ori，復制原點;nic，松弛的位點;mob，游動所需的座位(Bagdasarianetal.，1981);B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindⅢ;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;tetr，四環(huán)素抗性基因;kmr，卡那霉素抗性基因。圖14在克隆到pRK290(Dittaetal.，1980)中之8.7kbEcoRI片段內(nèi)插入轉(zhuǎn)座子Tn31acZ和Tn5的研究。與轉(zhuǎn)座子Tn5的插入相反，著重在轉(zhuǎn)座子Tn31acZ的插入。圖上給出根據(jù)其序列(cobF到cobM)推測出的開放相，以及8組失活插入(標有序號1-8，在每個轉(zhuǎn)座子的下面標有+或-號，以表明該插入對不同突變體的互補作用是失活(-)還是不失活)(+)。當重組突變體合成維生素B12比衍生突變體菌株的合成水平低2倍以下時，即沒有互補作用。這組失活插入相應(yīng)于下列突變體1，G615;2，G614和G616;3，G613和G614;4，G620;5，G638;6，G610和G609;7，G612;8，G611。這些突變體是已描述過的根瘤病土壤桿菌之cob突變株(Cameranetal.，1989)。該圖下部示出了8.7kb片段的限制圖。圖15已標明5.4kb片段的各基因編碼序列，它們分別是cobA至cobE。這些序列編碼的蛋白質(zhì)序列cobA至cobE示于相應(yīng)編碼序列的下方，即cobA至cobE。還分別列出了從cobA至cobE蛋白質(zhì)的氨基酸組成(以含量和百分比計)、以及分子量、極性指數(shù)、等電點、純化的蛋白質(zhì)溶液(1mg/ml)于260nm和280nm處的光密度值。列出了各蛋白質(zhì)(相當于cobA至cobE)的親水性分布圖，并根據(jù)Hopp和Wods(1981)程序進行了計算。正值相當于親水蛋白質(zhì)的區(qū)域。圖中橫座標標出氨基酸的位置，而縱座標上標出親水性指數(shù)值;當這些值為正值時，該蛋白質(zhì)的區(qū)域是親水的。圖16標出8.7kb片段上分別為cobF至cobM的各基因編碼序列。由這些序列編碼的蛋白質(zhì)(COBF至COBM)序列示于這些序列的下面。該圖的附注與圖15相同。我們從736位的ATG開始蛋白質(zhì)coBF;但751位的ATG則可能是該蛋白質(zhì)的真正起始密碼子。圖17由鈷啉酸a，c-二酰胺合酶催化的反應(yīng)。ACDAS催化鈷啉酸外周乙酸鏈a和c羧酸官能團的酰胺化作用，以得到鈷啉酸二酰胺;酶催試驗中使用的胺基團供體是L-谷氨酰胺，后者得自L-谷氨酸脫胺反應(yīng)。X相當于鈷的軸向配位體，各配位體可互不相同。圖18由SP2MT催化的反應(yīng)。SP2MT可催化SAM甲基向dihydrasirohydrochlorine或前咕啉-2轉(zhuǎn)移，得到前咕啉-3。上述甲基轉(zhuǎn)移到卟啉環(huán)的C20位上。圖19氫化咕啉酸和氫化咕啉酸-a，c-二酰胺的結(jié)構(gòu)。圖20COBA和COBF蛋白質(zhì)對SAM的親合力。曲線顯示以任意單位加到TSK-25柱上的各種蛋白質(zhì)在出口處測得的放射活性。滯留時間以分鐘表示。于10分30秒時間內(nèi)觀察到相當于游離SAM的放射活性峰。圖21COBA和COBI之序列的比較。圖中所示1，2和3區(qū)域顯示出顯著的同源性。符號＝位于完全相同的殘基之間，符號-則在同源殘基之間(HKR，LIVM，AGST，YFW，DEQNBZ，P，C)。圖22脫氮假單胞菌之COBA蛋白質(zhì)和大腸桿菌之CYSG蛋白質(zhì)一級序列的比較。按照Kanehisa(1984)的程序?qū)⑺鼈円灰粚R。完全相同的殘基之間標以＝號，同源殘基之間標以-號(HKR，LIVM，AGST，YEW，DEQNBZ，P，C)。區(qū)域1、2、3相當于蛋白質(zhì)間的強同源區(qū)域。圖23大腸桿菌CYSG與脫氮假單脫菌COB蛋白質(zhì)(COBA、COBF、COBI、COBJ、COBL和COBM)之序列的比較。這一比較是針對CYSG、COBA與COBI之間存在的強同源區(qū)域1、2和3的。圖中標出了存在同源區(qū)域之蛋白質(zhì)序列的位置。我們認為有下列同源的殘基組群HKR，LIVM，AGST，YEW，DEQNBZ，P，C。如果在同一位置找到至少三個同源殘基，我們便將這些氨基酸劃入框內(nèi)。圖24質(zhì)粒pXL1148和pXL1149的構(gòu)建。按下述程序構(gòu)建pXL1148純化含cobH和cobI基因之8.7kb片段的1.9kbBamHI-BamHI-SstI-SstI片段，將XbaI和EcoRI“接頭”分別接在末端BamHI和SstI位點上。然后在XbaI和EcoRI位點之間將該片段插入有廣譜宿主的質(zhì)粒pXL59(Cameronetal.，1989)中，得到質(zhì)粒pXL1148。如果起始純化的片段只是1.5kb的BamHI-BamHI-SstI片段，而不是還含有用于pXL1148的400pbSstI小片段，則可如構(gòu)建pXL1148的同樣方法構(gòu)建pXL1149。然后使該片段在pXL59中受到同樣的酶學處理和克隆。1，RSF1010(DeGraffetal.，1981)的PstI-SstI片段;2，pACY-C177(Bagdasarianetal.，1981)3，含有無啟動子之大腸桿菌乳糖操縱子、操縱基因、轉(zhuǎn)譯起始位點和1acZ(Casadabanetal.，1983)之前8個非必需密碼子的BamHI-SstI片段;4，臭味假單胞菌KT2440(Bagdasarinetal.，1981);Ori，復制原點;nic，松弛的位點;Kmr，卡那霉素抗性基因;mob，移動所需的座位(Bagdasarianetal.，1981);B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI。圖25按已述方法，用10%PAGE-SDS分析菌株SC510RifrpKT230、SC510RifrpXL1148、SC510RifrpXL1149的總蛋白質(zhì)。細菌在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，然后分析所有溶胞產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。泳道1，SC510Rifr;泳道2，SC510RifrpXL1149;泳道3，SC510RifrpXL1148;泳道4，SC510RifrpKT230。圖中示出了分子量標志物的分子量，及蛋白質(zhì)COBI和COBH的遷移位置。圖26質(zhì)粒pXL1496和pXL1546的構(gòu)建。質(zhì)粒pXL1496可過表達大腸桿菌的COBF蛋白質(zhì)，而質(zhì)粒pXL1546可過表達脫氮假單胞菌的COBF蛋白質(zhì)。從8.7kb片段上切掉2.2kbEcoRI-XhoI片段并純化之。將其克隆到噬菌體M13mp19的EcoRI位點，得到質(zhì)粒pXL1405。然后，如前所述，經(jīng)控制性誘變將NdeI位點引入該片段的733位;如此發(fā)現(xiàn)NdeI位點正好在推測的cobF基因的起始密碼子上。所得到的新質(zhì)粒被定名為pXL1406。1.5kb之NdeI-SphI-SphI片段含有從推測的起始密碼子開始的cobF基因，用適當?shù)拿高M行部分消化后，純化上述片段并與質(zhì)粒pXL694的適當片段相連接(含有大腸桿菌表達信號(見正文)的120pbEcoRI-NdeI片段，含有氨芐青霉素抗性基因、同一質(zhì)粒之復制功能及大腸桿菌rrnB操縱子之終止信號的3.1kbEcoRI-SphI片段已如文中所述)。如此構(gòu)建的質(zhì)粒定名為pXL1496。按下述方法構(gòu)建pXL1546用適當酶部分消化已純化的2kbEcoRI-BamHI-BamHI片段;該片段含有大腸桿菌的表達信號，以及cobF基因和cobG基因的5′部分，如正文中所述，它們本身則接在大腸桿菌rrnB操縱子之終止信號的后面。將該片段克隆到圖30所示多宿主質(zhì)粒pKT230(Bagdasarianetal.，1987)中。B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;Kmr，卡那霉抗性基因;Amp，氨芐青霉素抗性基因。圖27按已述方法，用10%PAGE-SDS分析菌株SC510Rifr、SC510RifrpKT230、SC510RifrpXL1546的總蛋白質(zhì)。將細菌在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，然后檢測含總蛋白質(zhì)的溶胞產(chǎn)物。泳道1，SC510Rifr;泳道2，SC510RifrpKT230;泳道3，SC510RifrpXL1546。示出了分子量標志物的分子量及COBF蛋白質(zhì)的遷移位置。圖28按已述方法用10%PAGE-SDS分析大腸桿菌菌株B和大腸桿菌菌株BpXL1496的總蛋白質(zhì)。泳道1，沒有加色氨酸培養(yǎng)的大腸桿菌pXL1496;泳道2，有色氨酸時在同樣條件下培養(yǎng)的大腸桿菌pXL1496;泳道3，沒有加色氨酸培養(yǎng)的大腸桿菌;泳道4，有色氨酸時在同樣條件下培養(yǎng)的大腸桿菌。示出了分子量標志物的分子量及COBF蛋白質(zhì)的遷移位置。圖29質(zhì)粒pXL525和pXL368的構(gòu)建。按下述方法構(gòu)建pXL368由質(zhì)粒pXL556(B.Cameronetal.，1989)出發(fā)純化2.4kbEcoRV-ClaI片段(含有cobA和cobE基因)，如此可得到末端有BamHI位點和XbaI位點的片段;將該片段在BamHI和XbaI位點克隆到pXL203中。為了構(gòu)建pXL525，在8.7kb之EcoRI片段的右端EcoRI位點加入XbaI“接頭”;然后將2.4kbEcoRI-XbaI與8.7kbEcoRI-XbaI片段共克隆，以提供pXL556并含有cobA和cobE。示于括號內(nèi)的限制性位點相當于用大腸桿菌DNA聚合酶之大片段處理后消失的位點。1，RSF1010(DeGraffetal.，1981)的PstI-SstI片段;2，pACYC177(Bagdasarianetal.，1981)的PstI-BamHI片段;ori，復制原點;nic，松弛的位點;mob，移動所需的座位;kmr，卡那霉素抗性基因(Bagdasarianetal.，1981);B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;tet，四環(huán)素抗性基因;Ampr和Amp，氨芐青霉素抗性基因。圖30在革蘭氏陰性菌中有廣譜宿主的Q非相容性組群質(zhì)粒。這些質(zhì)粒已在文獻中述及(Cameronetal.，1989)，并可用于本發(fā)明。1，RSF1010(DeGraffetal.，1978)的PstI-SstI片段;2，pACYC177(Bagdasarianetal.，1981)的PstI-BamHI片段;3，含有大腸桿菌的無啟動子之乳糖操縱子、操縱基因、轉(zhuǎn)譯起始位點和lacZ(Casadabanetal.，1983)之前8個非必需密碼子的BamHI-SstI片段;4，臭味假單胞菌KT2440(Bagdasarianetal.，1981)的Sau3AI片段;ori，復制原點;nic，松弛的位點;kmr，卡那霉素抗性基因;smr，鏈霉素抗性基因;mob，移動所需的座位(Bagdasarianetal.，1981);B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI。圖31不同類咕啉樣品(1mg/份樣品)在實施例7所述的分離系統(tǒng)中的滯留時間。所用柱子是NucleosilC-18柱(Macherey-Nagel)。根據(jù)各吸收峰，標示出上述類咕啉樣品對應(yīng)的數(shù)值。橫軸為滯留時間，縱軸為371nm處的吸光率。1，鈷啉酸;2，鈷啉酸-a-酰胺;3，鈷啉酸-9-酰胺;4，鈷啉酸-a，g-二酰胺;5，鈷啉酸-a-酰胺;6，鈷啉酸c，g-二酰胺;7，鈷啉酸a，c-二酰胺;8，鈷啉酸a，c，g-三酰胺;9，鈷啉酸四酰胺;10，鈷啉酸五酰胺;11，鈷啉胺酸;12，GDP-鈷啉醇酰胺;13，磷酸鈷啉醇酰胺;14，鈷啉醇酰胺;15，s′-磷酸氰鈷胺素;16，氰鈷胺素。圖32脫氮假單胞菌之雙股4748pbSalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段的核苷酸序列。高處的一股從左向右看是5′至3′方向，它相當于圖6限制圖中所示片段的由左向右方向。圖33脫氮假單胞菌之雙股3855pbSstI-SstI-BamHI片段的核苷酸序列。處于高處的一股從左向右看是5′至3′方向，它相應(yīng)于圖6所示限制圖中之片段的由左向右方向。圖34利用Staden和Maclachlan(1982)和程序，根據(jù)所使用的密碼子，分析讀出的4748pbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI之六個相上編碼相出現(xiàn)的概率。對于在同一編碼鏈上出現(xiàn)的許多相，最可能是相當于由點連成線的、未被終止密碼子隔斷的相，其位于該相概率線下方。4a，對相當于核苷酸200至800之序列的分析。這一分析可鑒定出開放相14，它由660位的ATG開始，終止于379位的TGA。4b，對相當于核苷酸800-1500之序列的分析。這一分析可鑒定出開放相15，它開始于925位的GTG，終止在1440位的TAA。4c，對相當于核苷酸1450-2600之序列的分析。這一分析可鑒定出開放相16，它由1512位的ATG開始，終止于2510位的TGA。4d，對相當于核苷酸2500-4650之序列的分析。這一分析可鑒定出開放相17，它開始于2616位的GTG，終止于4511位的TGA。圖35利用Staden和Maclachlan(1982)的程序，根據(jù)所使用的密碼子，分析讀出的3855pbSstI-SstI-BamHI片段之六個相中編碼相的概率。對于同一編碼鏈上出現(xiàn)的許多相，最可能的相相當于由點形成線的、未被終止密碼子隔斷的相，其示于該相概率線下方。5a，對相當于核苷酸1至905之序列的分析。該分析可鑒定開放相18，它開始于809位的ATG，終止于108位的TGA。5b，對相當于核苷酸955至2105之序列的分析。該分析可鑒定出開放相19，它開始于1971位的ATG，終止于1063位的TGA。5c，相當于核苷酸2000至3300之序列的分析。該分析可鑒定出開放相20，它開始于2099位的ATG，終止于3115位的TAG。5d，對相當于核苷酸3250至3855之序列的分析。該分析可鑒定出開放相21，它開始于3344位的ATG，終止于3757位的TGA。圖36由pXL154開始構(gòu)建質(zhì)粒pXL233、pXL843和pXL1558。以下述方式構(gòu)建這些質(zhì)粒。從pXL154上切掉含有已截短之cobS基因和上游序列的3.5kb之EcoRI片段，純化后將其克隆到pKT230的EcoRI位點中。如此構(gòu)建成稱為pXL233的質(zhì)粒。由pXL154開始，經(jīng)部分消化切掉含cobT基因和下游序列的3.5kb之EcoRI-XhoI-XhoI片段，并純化之。由pXL154開始，切掉含cobS基因及上游序列的4.3kb之EcoRI-EcoRI-EcoRI片段并純化之，然后連接到上述3.5kb片段上。將如此制得的8kbEcoRI-XhoI片段克隆到pXL59的EcoRI和SalI位點中，以得到質(zhì)粒pXL843。按下述方法構(gòu)建質(zhì)粒pXL1558從pXL154上切掉12kb之HindIII-HindIII片段并純化之，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段填充未端。用EcoRI消化克隆到pRK290(Dittaetal.，1981)中的這個插入段，然后用大腸桿菌DNA聚合酶的大片段處理，以得到恢復不受約束的未端。示于括號內(nèi)的限制性位點相當于在克隆過程中消失的位點。1，RSF1010(Degraffetal.，1978)的PstI-SstI片段;2，pACYC177(Bagdasarianetal.，1981)的PstI-BamHI片段;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;Tet，四環(huán)素抗性基因;kmr，卡那霉素抗性基因;Smr，氨芐青霉素抗性基因。圖37在pXL154的12kb插入段HindIII-HindIII上插入轉(zhuǎn)座子Tn5sp的研究。圖解顯示在克隆到pXL1558中的12kb之HindIII-HindIII插入段上插入轉(zhuǎn)座子。菌株SC510Rifr內(nèi)有染色體插入即劃入方框中，否則則引入菌株SBL27Rifr中。在每處插入下方標示+或-號，以顯示有此插入之菌株的cob表型。沒有(或有)由質(zhì)粒pXL1558∷Tn5sp所致互補作用的菌株G2035，在各插入下方標以-(或+)號。標出了同圖36中所示的質(zhì)粒插入段。質(zhì)粒上方與轉(zhuǎn)座子插入一一對齊的+(或-)號，圖解顯示突變菌株有或沒有因質(zhì)粒內(nèi)轉(zhuǎn)座子插入所致的互補作用。圖中還標示了由該序列推測的開放相(ORF14至17)及相應(yīng)的cob基因(cobB和cobT)。E，EcoRI;H，HindIII;X，XhoI。圖38由pXL519開始構(gòu)建質(zhì)粒pXL1286、pXL1303、pXL1324、pXL1490B和pXL1557。在基因的組群限制圖上部分有已測知序列的位置;此涉及3.9kbSstI-SstI-BamHI片段。按下述方法構(gòu)建這些質(zhì)粒由pXL519上切掉含有cobV及下游序列的2kbBglII-EcoRI片段，然后純化并克隆到pKT230的BamHI和EcoRI位點，以得到質(zhì)粒pXL1286。由pXL519上切掉含有被截短之cobV基因、cobU基因及下游序列的2.7kbSstI-EcoRI片段，然后純化并克隆到pKT230的SstI和EcoRI位點，以得到質(zhì)粒pXL1324。由pXL519上切掉含截短之cobV基因及下游序列的1.6kbSstI-SstI片段，然后純化并克隆到pKT230的SstI位點，以得到質(zhì)粒pXL1303。用BamHI完全消失并用SstI部分消化pXL519后，純化3.85kb的SstI-SstI-BamHI片段，然后克隆到pKT230的BamHI和SstI位點上，以得到pXL1490B。按下述方法構(gòu)建質(zhì)粒pXL1557由pXL519上切掉9kb的HindⅢ-BamHI片段，然后純化并用大腸桿菌之DNA聚合酶的大片段充填未端。將該插入段克隆到已用EcoRI消化的pRK290(Dittaetal.，1981)中，然后用大腸桿菌DNA聚合酶的大片段處理，以產(chǎn)生不受約束的末端。標在括號內(nèi)的限制性位點相當于克隆過程中消失的那些位點。1，RSF1010(Degraffetal.，1978)的PstI-SstI片段;2，pACYC177(Bagdasarianetal.，1981)的PstI-BamHI片段;B，BamHI;Bg，BglII;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;Tetr，四環(huán)素抗性基因;kmr，卡那霉素抗性基因;Smr，氨芐青霉素抗性基因。圖39在pXL519之9kbHindIII-BamHI插入段內(nèi)插入轉(zhuǎn)座子Tn5Sp的研究。圖解顯示了轉(zhuǎn)座子被插入到已克隆到pXL1557上的9kbHindIII-BamHI插入段中。菌株SC510Rifr內(nèi)有染色體插入的劃入方框中，否則即為引入菌株SBL27Rifr中。在每處插入下方標以+或-號，以顯示有此插入之菌株的cob表型。沒有(或有)由質(zhì)粒pXL1557∷Tn5sp所致互補作用的G2040菌株，在各插入的下方標以-(或+)號。標出了如圖6中所示的質(zhì)粒插入段。質(zhì)粒上方與轉(zhuǎn)座子插入一一對齊的+(或-)號，圖解顯示突變菌株有或沒有因質(zhì)粒內(nèi)轉(zhuǎn)座子的插入所致的互補作用。圖中還給出了由該序列推測出的開放相(ORF18至21)，及相當?shù)腸ob基因(cobU和cobV)。圖40圖示了編碼各基因之4.8kb片段的序列，分別編碼cobX、cobS和cobT。在cobX、cobS和cobT之編碼序列的下面給出了由這些序列編碼的COBX、COBS和COBT的氨基酸序列。有關(guān)說明同圖15。圖41顯示了分別編碼cobU和cobV基因之3.9kb片段的序列。在cobU和cobV之編碼序列的下面給出了由這些序列編碼之COBU和COBV的氨基酸序列。對該附圖有關(guān)說明同圖15。圖42A、用10%PAGE-SDS分析大腸桿菌BL21pLysSpET3b、大腸桿菌BL21pLysSpXL1937菌株的總蛋白質(zhì)。泳道1，大腸桿菌BL21pLysSpET3b;泳道2，大腸桿菌BL21pLysSpXL1937。B、用10%PAGE-SDS分析大腸桿菌BL21、大腸桿菌BL21pXL1874和大腸桿菌BL21pXL1875菌株的總蛋白質(zhì)。泳道1，大腸桿菌BL21;泳道2，大腸桿菌BL21pXL1874;泳道3，大腸桿菌BL21pXL1875。列出了標記物的分子量。用箭頭標示出相應(yīng)于過表達到蛋白質(zhì)的帶?？寺　⒎肿由飳W及生物化學的一般技術(shù)。文獻中已描述了有關(guān)的分子生物學經(jīng)典方法，如將質(zhì)粒DNA在氯化銫-溴乙錠梯度下離心，用限制酶消化、凝膠電泳、由瓊脂糖凝膠中電洗脫DNA片段，以及在大腸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)化等(Maniatisetal.，1982;Ausubeletal.，1987)。限制酶由New-EnglandBiolabs、BethesdaReseachLaborabories(BRL)或AmershamLtd(Amersham)提供。寡核苷酸“接頭”由Biolabs提供。對于連接，可在0.7%瓊脂糖凝膠或8%丙烯酰胺凝膠上根據(jù)DNA片段大小分離之，然后用電洗脫法洗脫、用苯酚提取并用乙醇沉淀后，在T4噬菌體之DNA連接酶(Biolabs)存在下，在50mMTris-HCl(pH7.4)、10mMMgCl2、10mMDTT、2mMATP的緩沖液中保溫。必要時，可在緩沖液(含100mM甘氨酸、1mMMgCl2、1mMZnCl2，pH10.5)中，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP，Pharmacia)37℃下處理30分鐘，使具有突出之5′末端的DNA片段脫磷酸。為了使突出的3′末端脫磷酸，可使用同樣方法進行，但酶處理的條件是37℃下15分鐘，然后于56℃下處理15分鐘。在1%SDS和100mMNaCl存在下，將反應(yīng)混合物于68℃加熱15分鐘，以使酶失活，然后用苯酚-氯仿提取并在乙醇中沉淀。用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段(Biolabs)填充突出的5′末端。在含50mMTris-HCl(pH7.2)、0.4mMdNTP、10mMMgSO4、0.1mMDTT、50mg/mlBSA的緩沖液中，室溫下反應(yīng)30分鐘。按照制造商推薦的方法，在T4噬菌體的DNA聚合酶(Biolabs)存在下，填充突出的3′末端。按照制造商推薦的方法，用核酸酶S1(BRL)作有限處理以消化突出的末端。按已述方法(Maniatis，1982)，將寡核苷酸“接頭”連接到該DNA片段的末端上。按照Tayler等人(1985)所述的方法，利用Amersham提供的藥盒，對寡聚脫氧核苷進行體外誘變。對用于噬菌體M13衍生之復制形式的大腸桿菌TG1[D(lacproA，B)，SupE，thi，hsdD5/F′traD36，proA+，B+，lacIq，lacZDM15]，可使用該DNA連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株大腸桿菌MC1060[D(lacIOPZYA)X74，gulU，galK，strAr，hsdR]。按照Birnboim和Doly(1979)所述的技術(shù)純化質(zhì)粒DNA。按照Klein等人(1980)的方法制得質(zhì)粒DNA的微量制品。按已述方法(Cameronetal.，1989)制備革蘭氏陰性菌的染色體DNA。按照已詳細說明的方法(Rigbyetal.，1977)經(jīng)缺口轉(zhuǎn)譯制備放射活性探針。按已述方法(Cameronetal.，1989)，在硝酸纖維素濾膜上進行DNA序列雜交和核酸固定。當發(fā)現(xiàn)所研究的重組體克隆的概率很小時，可按已述方法(Maniatisetal.，1982)在濾膜上雜交以找該克隆。用鏈終止法(Sangeretal.，1977)測定DNA片段的核苷酸序列。其中用7-脫氮-dGP代替dGTP，以避免進行丙烯酰胺凝膠電泳時因DNA中的高GC百分比例所造成的電泳帶被壓縮。細菌學中使用的培養(yǎng)基已在文獻中述及(Maniatisetal.，1982)。在pS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法如文獻所述(Cameronetal.，1989);可按下述方法在pS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)脫氮假單胞菌SC510和G2Rifr菌株將在L培養(yǎng)基(Miller，1972)中作1/100稀釋的飽和預培養(yǎng)物接種到含25mlPS4培養(yǎng)基的250ml培養(yǎng)瓶(Erlenmeyers)中，必要時其中還含有對各菌株所攜帶之質(zhì)粒有選擇性的抗生素，培養(yǎng)物于30℃下保溫6天，然后分析之，以滴定鈷胺素或參予合成過程之酶的酶促活性。于30℃下培養(yǎng)根瘤病土壤桿菌、臭味假單胞菌和苜蓿根瘤菌菌株;除特別指出者外，均在L培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按已描述的方法(Cameronetal.，1989)結(jié)合細菌。按已描述的方法提取總蛋白(Ausubeletal.，1987)。按已描述的方法，在變性條件下以丙烯酰胺凝電泳法(SDS-PAGE)分析蛋白質(zhì)(Ausubeletal.，1987)。分析中使用了利用Laemli不連續(xù)緩沖系統(tǒng)(Laemli，1970)的phastSystem裝置(Pharmacia);其中依據(jù)待分析蛋白質(zhì)的分子量及其純度來選用不同的凝膠PhastGel梯度為8-25;均-PhastGel為12.5。按照制造商提供的說明書，借用商品名為PhastGelBlueR(Pharmacia)的考馬斯亮蘭或同時使用PhastGel銀染色藥盒(Pharmacia)的硝酸銀進行染色。利用Edman降解技術(shù)，以自動序列測定儀(AppliedBiosystems，407A型)，并配合鑒定苯基酶硫因(phenylthiohydantoines)衍生物的CLHP裝置，測定蛋白質(zhì)的NH2末端序列。實施例1分離含cob基因的脫氮假單胞菌的DNA片段本實施例描述攜帶cob基因之脫氮假單胞菌DNA片段的分離。這些片段是依據(jù)根瘤病土壤桿菌和臭味假單胞菌之cob突變株的補償試驗得以證實的(Cameronetal.，1989)。這些Cob突變株是按照Miller的技術(shù)(Milleretal.，1972)用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍進行誘變，或插入轉(zhuǎn)座子Tn5而得到的。自此，已證實了不能合成鈷胺素的菌株，特別是來自味假單胞菌的cob突變株G572，和根瘤病土壤桿菌的cob突變株G159、G161、G164、G169、G171、G258、G609、G610、G611、G612、G613、G614、G615、G616、G620、G634、G638、G643、G2034、G2035、G2037、G2038、G2039、G2040、G2041和G2042。同時，在限制酶存在下，消化5μgDNA在有廣泛宿主的可運動載體(pX59)中建立脫氮假單胞菌的基因組DNA庫(Cameronetal.，1989)?；诨パa作用，已分離子許多能夠與臭味假單胞菌及根瘤病土壤桿菌之cob突變體互補的質(zhì)粒。其中應(yīng)特別指出的是質(zhì)粒pXL151、pXL154、pXL157和pXL519。已分離了這些質(zhì)粒，切割和純化了DNA片段，并用限制性酶切法進行了分析。圖6中示出了這些片段5.4kb的ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段、8.7kb的EcoRI-EcoRI片段、4.8kb的SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI及3.9kb的SstI-SstI-BamHI片段。實施例2分離之DNA片段的序列分析本實施例闡述了測定脫氮假單胞菌SC510的cob基因之DNA序列的方法。2.1.5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段的DNA序列測定實施例1中所述的質(zhì)粒pXL157中含有該片段。切割后，在兩個方向上將5.4kb片段的亞片段克隆到噬菌體M13mp18或M13mp19(Norranderetal.，1983)，或M13tg130或M13tg131(Kienyetal.，1983)中。然后按Henikoff(1987)所述方法體外造成缺失。然后用“通用引物”作為以鏈終止反應(yīng)進行合成的引發(fā)物，然后定出這些缺失的順序?；謴瓦@些不同的缺失部分即可確定5.4kb片段之兩條鏈的總序列(圖7)。該片段包括5378pb。圖7所示的序列中，在ClaI位點之前有三個限制性位點(即Sst.SalI和XbaI)，這三個位點是在克隆的多位點中為測定所研究之片段序列而出現(xiàn)的。當我們在本發(fā)明中提到這個CalI-HindIII-HindIII-HindIII片段的DNA序列中，即是指圖7所示的序列，但前22個堿基并不與脫氮假單胞菌DNA相符(為此，限制性位的所有位置及開放相的起始位置都要參照圖7中所列的序列)。2.2.8.7kbEcoRI-EcoRI片段的核苷酸序列該片段包含在實施例1所述的pXL151中。其中EcoRI位點及其右側(cè)相鄰的70pb來自于載體pXL59，可通過在該載體內(nèi)克隆脫氮段單胞菌SC510的Sau3AI片段而構(gòu)建成pXL151。在切割之后，在兩個方向上將8.7kb片段的亞片段克隆到噬菌體M13mp18或M13mp18(Norranderetal.，1983)，或M13tg130或M13tg131(Kienyetal.，1983)中。然后按Henikoff的方法(1987)于體外造成缺失。用“通用引物”作為以鏈終止反應(yīng)進行合成的引發(fā)物，然后定出這些缺失的順序。根據(jù)這些不同缺失的恢復即可確定8.7kb片段之兩條鏈的總序列(圖8)。該片段包含8753pb。2.3.4.8kb之SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段的序列分析該片段包含在實施例1所述的質(zhì)粒pXL154中。分析程序與實施例2.2相同。圖32中列出了4.8kb片段之兩條鏈的總序列。該片段含4749pb。2.4.3.9kb之SstI-SstI-BamHI片段的核苷酸序列該片段包含在實施例1所述的質(zhì)粒pXL519中。其序列分析程序與實施例2.2中所述相同。圖33中列出了3.9kb片段之兩條鏈的總序列。該片段含3855pb。由這些核苷酸序列，得到有很少切點的酶切限制圖(圖6)。脫氮假單胞菌SC150之DNA有相當高比例的堿基GC(65.5%)，并且在序列凝膠上以壓縮的形式顯現(xiàn)?？商峁﹥煞N辦法來避免這些問題ⅰ)在序列分析反應(yīng)中用7-脫氮-dGTP代替dGTP，以盡可能地減小電泳時在序列凝膠中形成的二級結(jié)構(gòu);ⅱ)測定兩條鏈的序列實施例3分析這些核苷酸序列-確定開放相5.6kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段(圖7)、8.7kbEcoRI-EcoRI片段(圖8)、4.8kbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段(圖32)和3.9kbSstI-SstI-BamHI片段(圖33)的核苷酸序列均可用于限定開放相。由于DNA鏈中GC的百分比例很高，且其開放相也是大量的，故很少能看到轉(zhuǎn)譯終止密碼子。利用Staden和MacLachlan的方法(1982)，根據(jù)所使用的密碼子研究編碼相出現(xiàn)的幾率。這一概率是假單胞菌屬細菌DNA序列上對已測定序列的基因密碼子之使用的函數(shù)，故這些概率可比同一條鏈上的其他相有更好的概率并更好地表征開放相。3.1.鑒定5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段之五個開放相的結(jié)構(gòu)特征。它們被定名為相1至5，且在5.4kb片段之序列上的位置如下所述(在從ClaI位點到HindIII位點的5′-3′序列上)表5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段之可能的開放相。該序列上的位置相當于圖7中所示之序列上的位置。編碼鏈為5′-3′的鏈，相當于圖中上面的一條鏈。圖9中所示者代表編碼相的開放相的概率，同時有對其他相(共五個相)所觀察的概率。這五個相均編碼在同一條鏈上。其中四個相(開放相1至4)具有轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)之編碼的特征(Normaketal.，1983)，即相X+1的轉(zhuǎn)譯起始密碼子與相X的轉(zhuǎn)譯終止密碼子或其鄰近的密碼子交迭。3.2.鑒定8.7kbEcoRI-EcoRI片段之八個相的特征。這些相分別被定名為相6至13，它們在該8.7kb片段之序列上的位置如下所述。表8.7kbEcoRI片段之可能的開放相。該序列上的位置相當于圖8所示序列上的位置;該圖中上方的一條鏈為編碼鏈。圖10中列出了這些開放相的概率，同時還列出了由其他相(共6個相)觀察到的概率。除相11外，各相均以同一條鏈編碼。其中四個相具有轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)之編碼相的特征(Normarketal.，1983)，即相X+1的轉(zhuǎn)譯起始密碼子與相X的轉(zhuǎn)譯終止密碼子或其鄰近密碼子相交迭。3.3.鑒定4.8kbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段之四個開放相的特征。這些相被命名為相14-17，它們在4.8kb片段之序列上的位置如下所述(由SalI位點到BglI位點的序列5′-3′上)。表4.8kbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段之可能的開放相。該序列上的位置與圖32上所示的位置相一致，其上方一條鏈為5′-3′方向。相15、16和17與相14相反，前者由上面一條鏈編碼。圖34中列出了這些開放相的概率，同時給出其他相(共4個)所觀察到的概率。相14、15、16和17由同一股鏈編碼，而相14則由互補鏈編碼。3.4.鑒定3.9kbSstI-SstI-BamHI片段之四個相的特征。這些相分別被命名為相18-21，它們在3.9kb片段之序列上的位置示于下表中。表3.9kbSstI-SstI-BamHI片段之可能的開放相。該序列上的位置相當于圖33所示的位置，圖33中上面一條鏈的極向是5′-3′。相18和19與相20和21不同，前者由下面一條鏈編碼。圖35中示出了這些開放相的概率，同時還有就其他相(共4個相)所觀察到的概率。相19和20以不同的方式轉(zhuǎn)錄。實施例4對具有cob基因之DNA片段的遺傳學研究本實施例表明前面鑒定的不同開放相與在生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺中涉及的、這些同樣片段所具有的基因間的關(guān)系。這些基因在下述的遺傳學研究中得以進一步鑒定。4.1.對5.4kb片段的遺傳學研究質(zhì)粒pXL723即含有2264pbEcoRI-HindIII片段的質(zhì)粒pRK290(Dittaetal.，1980)，其相當于所研究的、克隆到pRK290之EcoRI位點中之片段的右側(cè)部分(圖11)。圖11和12的中描述了用于這項研究的其他質(zhì)粒(pXL302、pXL1397、pXL545、pXL545Ω、pXL556和pXL1500)的構(gòu)建。利用Bruijn和Lupski(1984)的技術(shù)，得到在pXL723上的插入。對質(zhì)粒pXL723上轉(zhuǎn)座子Tn5的插入進行選擇，并圖解顯示在5.4kb片段中(圖12)。pXL723補償臭味假單胞菌的cob突變株G572和根瘤病土壤桿菌的cob突變株G634的缺陷。這些插入可分為兩組失活的插入或者是不能再使cob突變株G634得到補償?shù)牟迦耄蛘呤窍齝ob突變株G634之補償作用的插入(圖12)。失活G572突變株之互補作用的插入圖解顯示于開放相4中(涉及插入15、27、68、81和97);開放相4相當于cob基因。該基因被定名為cobC。失活突變株G634之互補作用的插入圖解顯示于相5中(即插入66和107，圖12);開放相5相當于cob基因。該基因被定名為cobD。另外完成了轉(zhuǎn)座子Tn5Spr的插入。在實驗室中構(gòu)建轉(zhuǎn)座子Tn5Spr并克隆到轉(zhuǎn)座子Tn5(Jorgensenetal.，1979)的BamHI位點，該暗盒含有得自質(zhì)粒pHP45Ω(PrentkietKrisch，1984)的壯觀霉素抗性基因。在脫氮假單胞菌SBL27Rif菌株的染色體中進行這些插入。菌株SBL27是脫氮假單胞菌經(jīng)多次誘變產(chǎn)生的衍生株。在PS4培養(yǎng)基中，SBL27的鈷胺素產(chǎn)率比SC510少9倍。在具有多轉(zhuǎn)座子插入的菌株SBL27Rifr的10000個克隆上，其中有30個以上的克隆失去了合成鈷胺素的能力。某些克隆具有本實施例中所研究之片段的插入。按照Southern的方法(Southern，1975)經(jīng)限制性酶切分析，圖解顯示這些插入。在cob基因中可找到這些插入中之序號為2639的一個插入;該插入由具有含cobC基因之片段的質(zhì)粒pXL302補償(圖12)。開放相3中有兩處插入(定名為2636和2638)。這些突變在鈷胺素生物合成中被阻斷，它們可由含有開放相3的質(zhì)粒pXL1397補償，但不能由含有cobC和cobD基因的質(zhì)粒pXL302補償(圖12)。這兩處插入處于其他基因中。我們將cobB基因加入到開放相3內(nèi)。2933插入是位于開放相2中;它可由含開放相2的質(zhì)粒pXL1500補償;該插入未能由含有基因cobB的質(zhì)粒pXL1397補償，而使cobB中的兩處插入得到補償。這里涉及到在另一個基因中的插入;我們將定名為cobA的基因加到開放相2中。將得自質(zhì)粒pUC4K的卡那霉素抗性基因暗盒(Barangetal.，1985)引入已克隆到質(zhì)粒pUC8(VieraetMessing，1982)中之ClaI(該序列上的0位置)-RsaI(該序列上的1686位)片段的NotI位點;它涉及到位于相1中771位的NotI位點(見圖7上的序列);兩處插入均保留相當于抗性基因暗盒的不同方向。將各自均具抗性基因暗盒之插入的片段克隆到質(zhì)粒pRK404(Dittaetal.，)中，以得到質(zhì)粒pXL1630和1631。通過接合轉(zhuǎn)移，然后在對質(zhì)粒沒有選擇性的抗生素(四環(huán)素)存在下，經(jīng)一系列培養(yǎng)-稀釋過程，將這些質(zhì)粒引入脫氮假單胞菌的SC510Rif菌株中，發(fā)現(xiàn)其中具有質(zhì)粒片段與染色體片段交換和具有質(zhì)粒丟失的雙重重組體。兩菌株的特征是ⅰ)在被命名為SC5101631Rif的菌株中，發(fā)現(xiàn)卡那霉素抗性基因暗盒在NotI位點(存在于相1中)被插入染色體內(nèi);卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄極性與開放相1相反。ⅱ)另一個被命名為SC5101630Rif的插入是在同一位點被插入抗性基因暗盒中，但抗性基因的轉(zhuǎn)錄具有與整個開放相1相同的極性。這兩個菌株的鈷胺素合成率均至少比SC510低100倍。質(zhì)粒pXL545Ω相當于在BamHI位點插入了pHP45Ω質(zhì)粒之壯觀霉素抗性基因暗盒的質(zhì)粒pXL545。該含有814pbClaI-HindIII片段(只有開放相1是完整的)的質(zhì)粒(圖12)只能使突變體SC5101630Rif得到補償。既然該突變體可由僅含完整開放相1的質(zhì)粒補償，便足以確定為新基因。開放相1相當于合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺中的基因。該基因被定名為cobE。質(zhì)粒pXL545Ω對突變體SC5101631Rif沒有補償作用，這可能是由于下述事實cobA、cobB、cobC、cobD和cobE或其部分均屬于同樣的操縱子，而且cobE中的插入保留了操縱子轉(zhuǎn)錄意義上的轉(zhuǎn)錄，但該插入只可由cobE基因的反向表達來補償。與突變體SC5101631Rif相反，它只能由允許在cobA至cobE基因進行反向表達的質(zhì)粒來補償。5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段含有分別定名為cobA、cobB、cobC、cobD和cobE的五個cob基因。4.2.對8.7kb片段的遺傳學研究質(zhì)粒pXL367是含有克隆到EcoRI位點中之8.7kbEcoRI片段的pRK290(Dittaetal.，1980)(圖13)。借助已描述過的技術(shù)，選擇質(zhì)粒pXL367上轉(zhuǎn)座子Tn5的插入(BruijnetLupski，1984)。圖解顯示出8.7kb片段中的插入。按已述方法(Stacheletal.，1985)，以同樣方式得到轉(zhuǎn)座子Tn31acZ的插入，并以圖解顯示之。也顯示出29處轉(zhuǎn)座子Tn5的插入和13處轉(zhuǎn)座子Tn31acZ的插入。圖14中列出了在8.7kb片段上這些插入的確切位置。這些質(zhì)粒在8.7kb片段上各自都有一個唯一的插入，并通過接合轉(zhuǎn)移被引入到根瘤病土壤桿菌之cob突變體G164、G609、G610、G611、G612、G613、G614、G615、G616、G620、G638中。這些突變體都是由質(zhì)粒pXL367補償?shù)摹Ｔ芯窟^那些不再能補償各突變體的插入。它們相當于負責補償相應(yīng)突變體之基因中的插入。圖14中列出補償有不同鈷胺素(cob表型)生產(chǎn)特性之突變體的結(jié)果。如果重組突變體產(chǎn)生的鈷胺素比沒有質(zhì)粒pXL367的同一突變體產(chǎn)率低2倍以下，即認為沒有補償作用。對于所研究的突變體G164、G609、G610、G611、G612、G613、G614、G615、G616、G620、G638，已觀察到八類導致突變表型的、失活轉(zhuǎn)座子的不同插入。這些不同類插入的特征在于具有這些同樣插入的質(zhì)粒pXL367，沒有因插入而對一種或多種突變體產(chǎn)生補償作用。每類相當于一個突變基因。已觀察，到在同類中出現(xiàn)的插入是一些插入在另一些插入的一側(cè)被定位的。所觀察到的八類插入可限定八種基因。每類插入應(yīng)被限定在含相應(yīng)基因的最小片段內(nèi)。與限制圖相符，圖14顯示由各類插入限定的區(qū)域間有很好的相關(guān)性，而且也顯示了前面描述的各開放相(實施例3)。事實上，對于每類插入來說，已證明轉(zhuǎn)座子正是被插入到含在單一開放相中的8.7kb片段部分內(nèi)。可見開放相和單一開放相與各類插間是相聯(lián)系的。上面提到的各開放相可編碼各個生物合成鈷胺素和/或鈷胺酰胺過程中所涉及的蛋白質(zhì)。每種開放相均對應(yīng)于參予鈷胺素和/或鈷胺酰胺生物合成的各不同的酶。這些開放相(即相6-13)分別被定名為cobF、cobG、cobH、cobI、cobJ、cobK、cobL和cobM。圖14中列出了這些基因相對于其在限制圖上的位置。4.3.對4.8kb片段的遺傳學研究質(zhì)粒pXL1558是含有克隆到pRK290(Dittaetal.，1980)之EcoRI位點中的pXL154(Cameronetal.，1989)之12kbHindIII-HindIII片段的質(zhì)粒pRK290(圖36)。本項研究中所使用的其他質(zhì)粒(pXL233和pXL843)的構(gòu)建已在圖36的中述及。在質(zhì)粒pXL1558上制得Tn5Sp插入。首先構(gòu)建含轉(zhuǎn)座子Tn5Sp的菌株;這是借助質(zhì)粒pRK2013Tn5Sp(Blancheetal.，1989)轉(zhuǎn)化菌株C2110(Stacheletal.，1985)而實現(xiàn)的;具有復制原點COLE1的質(zhì)粒pRK2013Tn5Sp在菌株C2110(polA-)中不能復制。轉(zhuǎn)化后所得到的菌落是抗壯觀霉素的，在它們?nèi)旧w中有轉(zhuǎn)座子Tn5Sp;然后分離菌落，并按已述方法(Miller，1972)在菌株MC1060中借助噬菌體P1轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)座子的插入。用質(zhì)粒pXL1558轉(zhuǎn)化菌株MC1060Tn5Sp;然后借助C600Rifr中的pRK2013，通過接合使質(zhì)粒pXL1558游動。再選擇四環(huán)素抗性接合體(對于質(zhì)粒pXL1558)和壯觀霉素抗性接合體(對于轉(zhuǎn)座子);這些接合體應(yīng)含有插入了轉(zhuǎn)座子Tn5Sp的質(zhì)粒pXL1558。用限制性消化方法鑒定質(zhì)粒pXL1558上之插入，準確地說是在12kb片段中之插入的特征;得到23處插入并圖示于12kb片段上;圖37中顯示了這些片段上不同插入的位置。在pXL1558∷Tn5Sp接合轉(zhuǎn)移并引入質(zhì)粒pR751之后，在菌株SC510Rifr的染色體上引入這23處插入。質(zhì)粒pR751是抗三甲氧芐二氨嘧啶的、與pXL1558有不相容性的同組質(zhì)粒(incP，ThomasetSmith，1987)。如已描述的那樣，利用標記物的交換技術(shù)，經(jīng)雙股同源重組，從對pXL1558無選擇性(沒有四環(huán)素)，但對pR751和轉(zhuǎn)座子有選擇性(存在三甲氧芐二氨嘧啶和壯觀霉素)的培養(yǎng)物中，獲得具有染色體內(nèi)pXL1558∷Tn5Sp之突變交換以及pXL1558分離(Schelletal.，1988)的菌株。如此選擇的菌株的染色體內(nèi)帶有轉(zhuǎn)座子。經(jīng)Southern分析(Southern，1975)證實了其雙股同源重組。用該方法已鑒定出12kb片段中的23個SC510Rifr∷Tn5Sp菌株。另一方面，按照Southern方法(Southern，1975)經(jīng)限制性酶切分析在圖37中圖示出其他的Tn5Sp插入，這些Tn5Sp插入是基于對菌株SBL27Rifr(Blancheetal.，1989)中的轉(zhuǎn)座子進行隨機誘變而得到的;所得菌株被定名為SBL27Rifr∷Tn5Sp1480。依照已述的方案(Cameronetal.，1989)，在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)這24個菌株，以測定鈷胺素的合成率，而cob表型則歸屬于維生素B12比親代SC510Rifr菌株(resp.SBL27Rifr)低1000倍以下的菌株(圖37)。還觀察到導致出現(xiàn)脫氮假單菌之cob表型的六個染色體插入;它涉及插入31.1、41.3、45、55、22.1和1480。在具有cob表型為SC510Rifr∷Tn5Sp31.1、SC510Rifr∷Tn5Sp45、SBL27Rifr∷Tn5Sp1480的三個菌株中，經(jīng)接合轉(zhuǎn)移引入三個質(zhì)粒pXL233、pXL837(Cameronetal.，)和pXL843。這三個突變株都有合成鈷胺素能力方面的不同程度之補償作用的特征。事實上，SBL27Rifr∷Tn5Sp1480是由pXL837和pXL843而不是由pXL233補償?shù)?突變株SC510Rifr∷Tn5Sp45只由pXL843補償;而突變株SC510Rifr∷Tn5Sp31.1則由質(zhì)粒pXL843及質(zhì)粒pXL233補償(見圖37)。根據(jù)對三種突變體所作補償試驗的結(jié)果，所提供的材料可以得出這三種突變體不相同、且對于它們中的每一個來說，轉(zhuǎn)座子Tn5Sp均插入不同的cob基因中的結(jié)論。另一方面，通過接合轉(zhuǎn)移，可將質(zhì)粒pXL1558∷Tn5Sp41.3、pXL1558∷Tn5Sp45和pXL1558∷Tn5Sp22.1引入菌株G2035(Cameronetal.，1989)中，而沒有使其得到補償。與質(zhì)粒pXL1558∷Tn5Sp31.1相反，質(zhì)粒pXL1558可使該突變株得到補償。表型和補償作用的數(shù)據(jù)可使我們限定這三類插入;其中每類都可由以下插入表示第1類，31.1;第2類，45，41.3、55和22.1;第3類，1480。對于每類插入，轉(zhuǎn)座子總是被插入到單一開放相(如實施例3中限定的ORF14、ORF16和ORF17)中4.8kb片段的部分。各類插入均與單一開放相相關(guān)聯(lián)。上面指出的開放相編碼參予鈷胺素和/或鈷胺酰胺生物合成的蛋白質(zhì)。將這些開放相(相14、16和17)分別定名為cobX、cobS和cobT。圖37中給出了這些基因在限制性酶切圖上的位置。開放相15不是cob基因。4.4.對39kb片段的遺傳學研究質(zhì)粒pXL1557是含有被克隆到pRK290(Dittaetal.，1980)中EcoRI位點之pXL519的9kbHindIII-BamHI片段的質(zhì)粒pRK290(圖38)。本項研究中使用的其他質(zhì)粒(pXL1286、pXL1303、pXL1324)的構(gòu)建已在圖38的中述及。另外將質(zhì)粒pXL519中的2kbBglII-XhoI片段(圖33所示序列的位置251和2234)克隆到質(zhì)粒pXL435(Cameronetal，.)的BamHI-SalI位點，以產(chǎn)生質(zhì)粒pXL699。按照實施例4.3.中所述的方法，在質(zhì)粒pXL1557上制得Tn5Sp插入。選擇稱為pXL1557∷Tn5Sp的在質(zhì)粒pXL1557上轉(zhuǎn)座子Tn5Sp的插入。如4.3節(jié)所述，在pXL1557∷Tn5Sp接合轉(zhuǎn)移并經(jīng)雙股同源重組以交換標記之后，將這些示于9kb片段上(圖39)的插入引入SC510Rifr的染色體中。用Southern的方法(Southern，1975)證實雙股同源重組，從而鑒定出20個SC510Rifr∷Tn5Sp菌株。另一方面，按照Southern的方法(Southern，1975)，經(jīng)限制性酶切分析在9kb片段上圖示出通過對菌株SBL27Rifr(Blancheetal.，1989)中的轉(zhuǎn)座子Tn5Sp進行隨機誘變所得到的兩處Tn5Sp插入，即圖39中所示的插入1003和1147。按照已述方案(Cameronetal.，1989)，檢測培養(yǎng)于PS4培養(yǎng)基中的22個菌株的鈷胺素合成率。而cob表型則屬于維生素B12產(chǎn)率比親代SC510Rifr(resp.SBL27Rifr)低1000倍(resp.100)以下的菌株(圖39)。通過脫氮假單胞菌中的cob表型表達僅有的4處插入1、1003、23和1147。通過接合轉(zhuǎn)移在具有cob表型SC510Rifr∷Tn5Sp1、SBL27Rifr∷Tn5Sp1003、SC510Rifr∷Tn5Sp23和SBL27Rifr∷Tn5Sp1147的四個菌株中引入四個質(zhì)粒pXL699、pXL1286、pXL1303和pXL1324。質(zhì)粒pXL699可補償前兩個突變株(SC510Rifr∷Tn5Sp1、SBL27Rifr∷Tn5Sp1003)，質(zhì)粒pXL1303則不能;質(zhì)粒pXL1324可補償另外兩個突變株(SC510Rifr∷Tn5Sp23和SBL27Rifr∷Tn5Sp1147)，而質(zhì)粒pXL1286則不能。另一方面，通過接合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pXL1557∷Tn5Sp引入菌株G2040中不能補償之，而通過接合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pXL1557、pXL1557∷Tn5Sp6A、pXL1557∷Tn5Sp54、pXL1557∷Tn5Sp48、pXL1557∷Tn5Sp21、pXL1557∷Tn5Sp8、pXL1557∷Tn5Sp23引入其中，則能夠補償之(見圖39)。根據(jù)表型和補償數(shù)據(jù)可限定兩類插入。對于各類插入，轉(zhuǎn)座子總是被插入到包含在單一開放相中的39kb片段之一部分內(nèi)(如實施例3中限定的ORF19和ORF20)。各類插入均與開放相相關(guān)聯(lián)。上面提到的開放相可編碼參予鈷胺素和/或鈷胺酰胺之生物合成的蛋白質(zhì)。這些開放相被定名為即相19和20的cobV和cobU。相18和21不是銨胺素生物合成中涉及的基因。圖39中示出了這些基因相對于限制圖中的位置。圖解顯示了基因cobU和cobV之間的插入48、21和8。實施例5基因和蛋白質(zhì)5.1.5.4kb片段在5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段上限定了五個基因(cobA、cobB、cobC、cobD和cobE)。它們分別編碼下列COB蛋白質(zhì)COBA、COBB、COBC、COBD和COBF。圖15中顯示了基因(cobA至cobE)的編碼部分，以及蛋白質(zhì)COBA至COBE的序列。還給出了各種蛋白質(zhì)的性質(zhì)(氨基酸組成、等電點、極性指數(shù)及親水性曲線)。5.2.8.7kb片段在8.7kb片段上限定了八個基因。這些基因(cobF至cobM)分別編碼下述COB蛋白質(zhì)COBF、COBG、COBH、COBI、COBJ、COBK、COBL、COBM。圖16上描繪了這些基因(cobF至cobM)的編碼部分，以及蛋白質(zhì)COBF至COBM的序列。其中還給出了這些蛋白質(zhì)的性質(zhì)(氨基酸組成、分子量、等電點、極性指數(shù)及親水性曲線)。5.3.4.8kb片段在4.8kbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI上限定了三個基因(cobX、cobS、cobT)。它們分別編碼下列蛋白質(zhì)COBX、COBS、COBT。圖40上描繪了這些基因的編碼部分，以及蛋白質(zhì)COBX、COBS和COBT的序列。最好選擇處于cobS之1512位的ATG，而不選擇1485位的ATG(見圖32)作為起始密碼子。圖中還給出了各蛋白質(zhì)的性質(zhì)(氨基酸組成、等電點、極性指數(shù)及親水性曲線)。COBT具有相當于氨基酸214至305的相近親水性。5.4.3.9kb片段在3.9kb之SstI-SstI-BamHI片段上限定了兩個基因(cobU和cobV)。它們分別編碼下列蛋白質(zhì)COBU和COBV。圖41中描繪了這些基因的編碼部分，以及蛋白質(zhì)COBU和COBV的序列。其中還給出了這些蛋白質(zhì)中每種蛋白質(zhì)的性質(zhì)(氨基酸組成、等電點、極性指數(shù)及親水性曲線)。根據(jù)用Hopp和Woods(1981)的程序獲得的親水性曲線可知，除COBV以外的所有COB蛋白質(zhì)均與膜蛋白相反，都具有任意可溶性質(zhì)，雖然也已證明其中沒有大的疏水區(qū)域。既然已證明COBV有4個長的疏水區(qū)域(見圖41)，可知其或者是膜蛋白，或者是具有內(nèi)部疏水區(qū)的胞漿蛋白質(zhì)。對于所有COB蛋白質(zhì)的氨基酸序列，都指出甲硫氨酸為NH2末端的第一個氨基酸。此可被認為是體內(nèi)切割所致(BenBassatetBauer，1984)。曾提出有關(guān)用甲硫氨酸氨肽酶切除NH2末端甲硫氨酸的規(guī)則(Hireletal.，1989)。另外，按照Kanehisa(1984)的程序，將該蛋白質(zhì)與Genpro的蛋白質(zhì)相比較，后者是增加編碼部分推測出200個以上氨基酸而得到的Genbak的蛋白質(zhì)抽提部分(譯本59)。除COBT外，利用Genbank的譯本59上的參數(shù)，均不能證明有明顯的同源性。事實上，蛋白質(zhì)COBT在其位置(以氨基酸計)224和293之間存在一個“酸性氨基酸核心”(見圖40);該蛋白質(zhì)的這個部分有多個氨基酸是谷氨酸或天冬氨酸殘基;按照Kanehisa(1984)的程序，該酸性氨基酸核心可提供在該區(qū)域上的同源蛋白質(zhì)，而其他這些同源蛋白質(zhì)也具有其同樣的酸性核心。有更好同源性的蛋白質(zhì)是惡性虐原蟲的GARP蛋白(Trigliaetal.，1988)，大鼠心肌的肌鈣蛋白T(JinetLin，1989)，人和大鼠的胸腺素原(EschenfeldetBerger，1986)與精胺相連之雄激素依賴性大鼠蛋白質(zhì)(Changetal.，1987)，人、大鼠和雞的“中等大小神經(jīng)細絲亞單位”蛋白質(zhì)(Myersetal.，1987;Levyetal.，1987;Zopfetal.，1987)。有關(guān)這些富酸性殘基之核心的功能特性尚不明確;但這些酸性核心可以固定Co++等金屬陽離子，從而將鈷之金屬硫因的作用提供給蛋白質(zhì)COBT，或使其與其他蛋白質(zhì)相互作用。實施例6酶學研究6.1.根據(jù)酶促活性鑒定COB蛋白質(zhì)及其基因本實施例說明由已純化的蛋白質(zhì)開始，在確定了其NH2末端序列后，有可能在已確定序列的cob基因中找到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因。1、鑒定由基因cobA編碼的蛋白質(zhì)COBA已描述過有關(guān)脫氮假單胞菌之SUMT的純化(F.Blancheetal.，1989)。按照上述技術(shù)測定已純化之蛋白質(zhì)的NH2末端序列。已鑒定出前10個氨基酸12345678910MetIleAspAspLeuPheAlaGlyLeuPro蛋白質(zhì)COBA的NH2末端序列(圖15)與此序列精確相符。以12.5%PAGE-SDS電泳估測的純化之SUMT的分子量為30，000。由其序列推測的蛋白質(zhì)COBA的分子量為29，234(圖15)。NH2末端序列及分子量間的一致性清楚地表明蛋白質(zhì)COBA即相當于SUMT?；騝obA即是SUMT的結(jié)構(gòu)基因。2、鑒定由基因cobB編碼的蛋白質(zhì)COBBa)鈷啉酸a，c-二酰胺合酶活性的定量分析本實施例說明未曾描述過的類咕啉生物合成途徑中之酶促活性的測定。這涉及鈷啉酸a，c-二酰胺合酶(ACDAS)，它催化咕啉核或脫二鈷咕啉上咕啉核之兩個羧酸官能團在a和c位的酰胺化(圖17)。NH2基因的供體是L-谷氨酸，且該反應(yīng)中每酰胺化一個羧酸官能團消耗1分子ATP。下述檢測方法適用于鈷啉酸的二酰胺化反應(yīng);對其稍加改進(特別是在330nm處檢測CLHP分離物)即可應(yīng)用于氫化咕啉酸的二酰胺化反應(yīng)。于30℃下將含有ATP(1mM)、AgCl2(2.5mM)、谷氨酰胺(100μM)、鈷啉酸(50μM)或氫化咕啉酸(50μM)、鈷啉酸a，c-二酰胺合酶(約1活性單位)的保溫混合物(250μl0.1MTris-HCl，pH8)保溫1小時。保溫結(jié)束后，向混合物內(nèi)加入125μKCN水溶液(2.6g/L)和125μl0.2MHCl，然后于80℃加熱10分鐘，以5000×g離心5分鐘。經(jīng)CLHP分析50μl離心上清液。將樣品注射到25cm的Nucleosr15-C18柱上，用加在緩沖液A中的0-100%緩沖液B梯度洗脫30分鐘;緩沖液A0.1M磷酸鉀(pH6.5)、10mMKCN;緩沖液B0.1M磷酸鉀(pH8)，10mMKCN/乙腈(1/1)。根據(jù)其在371nm處的吸光率檢測類咕啉。酶活性單位定義為在下述條件下，每小時合成1毫微摩爾酰胺基團所需的酶量。b)脫氮假單胞菌之鈷啉酸a，c-二酰胺合酶活性的純化本試驗說明如何純化參予鈷胺素生物合成的脫氮假單胞菌之蛋白質(zhì)。從實施例6.1.2a)所述的定量檢測開始，按下述方法純化脫氮假單胞菌的鈷啉酸a，c-二酰胺合酶在典型的純化實驗中，向菌株SC510Rif內(nèi)引入質(zhì)粒pXL1500(參見實施例4.1對pXL1500的描述及附圖12)，將7克上述菌株的濕細胞懸浮在30ml0.1MTris-HCl(pH7.7)中，并于4℃下超聲處理15分鐘，然后以50，000×g離心1小時，以回收粗提物，取10ml該提取物注入已用同樣緩沖液平衡過的MonoQHR10/10柱上。用KCl的線性梯度(0-0.5M)洗脫蛋白質(zhì)。合并含酶活性部分(由實施例6.2b所述的試驗證實)并濃縮到2.5ml。用1ml25mMTris-HCl(pH7.7)溶液稀釋后，將蛋白質(zhì)加入MonoQHR5/5柱上，利用上述KCl梯度(0-0.5M)分離之。合并各活性部分，在樣品內(nèi)加入1ml含1.7M硫酸銨的0.1MTris-HCl(pH7.7)溶液，然后在Phenyl-Superose(Pharmacia)柱上用硫酸銨遞減梯度(1.0M-0M)進行層析分離。收集含所研究之活性的部分，并在Bio-GelHPHT(Bio-Rad)柱上用磷酸鉀梯度(0-0.35M)進行層析分離。經(jīng)此步驟后，酶的純度大于95%，PAG-SDS分析顯示它不含有任何污染蛋白。這些蛋白質(zhì)純度可由NH2末端序列的獨特性得以證實。用該技術(shù)測得其分子量為45，000。下表中列出了ACDAS的純化步驟，連同它們的純化因數(shù)和產(chǎn)率。表ACDAS的純化1該因數(shù)是根據(jù)純化過程中各部分的比活性的增加計算的c)脫氮假單胞菌之鈷啉酸a，c-二酰胺合酶的NH2末端序列及編碼該活性之脫氮假單肥菌結(jié)構(gòu)基因的鑒定本實施例旨在闡明如何根據(jù)參予鈷胺素生物合成之蛋白質(zhì)的NH2末端序列鑒定編碼該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。按前述方法，也確知了按實施例6.1.2b)中所述純化的脫氮假單胞菌之鈷胺酸a，c-二酰胺合酶的NH2末端序列。鑒定出15個殘基12345678SerGlyLeuLeuIleAlaAlaPro9101112131415AlaSerGlySerGlyLysThr蛋白質(zhì)COBB的NH2末端序列(圖15)與該序列確切相符，如果是圖15中給出的這個序列，則甲硫氨酸是在經(jīng)直接序列分析測得之肽序列的前面。因此可知，氨基末端的甲硫氨酸肯定是在體內(nèi)被甲硫氨酸肽酶切掉的(BenBassatetBauer，1987)。由12.5%PAGE-SDS電泳估測純化之ACDAS的分子量為45，000。由COBB蛋白質(zhì)序列推算其分子量為45676(圖15)。NH2末端序列與分子量之間的一致性清楚地表明蛋白質(zhì)COBB即相當于ACDAS。cobB基因是ACDAS的結(jié)構(gòu)基因。3、鑒定由基因cobI編碼的蛋白質(zhì)COBIa)S-腺苷-L-甲硫氨酸前咕啉-2轉(zhuǎn)移酶活性的定量分析本實施例說明未曾描述過之類咕啉生物合成途徑中酶促活性的測定。這涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸前咕啉-2甲基轉(zhuǎn)移酶(SP2MT)，該酶催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到前咕啉-2上以得前咕啉3(圖18)。因子II和III分別是由薛氏丙酸桿菌的細胞提取物純化的前咕啉-2和前咕啉-3的氧化產(chǎn)物(BattersbyetMacDonald，1982;Scottetal.，1984);前咕啉-2和前咕啉-3作為推想的生物合輔酶B12的中間體已被確認，但此前還未曾象這樣被純化過?；谶@一原因，也就未曾測知相應(yīng)的活性。作為酶促反應(yīng)底物的前咕啉2，其分子很小，即使有痕量氧存在也可使其自發(fā)地氧化，故不能保存(BattersbyetMacDonald，1982)。該酶學試驗的原理建立在下述其暫時存在之可能性上，即借助引入了質(zhì)粒pXL1500之SC510菌株的酶提取物，可由SAM和δ-氨基-γ-酮戊酸即時生成前咕啉-2。應(yīng)在嚴格的厭氧條件下進行保溫。在5mMDTT、1mMEDTA、100μM[甲基-3H]-SAM(1μCi)、0.8mMδ-氨基-γ-酮戊酸和6mM脫氮假單胞菌S510RifpXL1500菌株之粗制酶提取物存在下，于1ml0.1MTris-HCl(pH7.7)緩沖液中將含SP2MT的部分30℃保溫3小時。S510RifpXL1500含有強活性SUMT(F.Blancheetal.，1989)。保溫時產(chǎn)生的四吡咯化合物被固定在DEAE-Sephadex陰離子交換柱上，并在無氧條件下于含5%硫酸的甲醇中使之酯化。然后利用二氯甲烷/甲醇(98.3/1.7)作洗脫系統(tǒng)，在二氧化硅薄層上層析分離尿卟啉原III的二甲基與三甲基衍生物(F.Blancheetal.，1989)。由所得三甲基衍生物的量在所收集的甲基(二和三甲基)衍生物產(chǎn)物之總量中的比例(作為蛋白質(zhì)量)來表示SP2MT的活性。在所使用的檢測條件下，試驗中加入的SC510RifpXL1500的提取物沒有顯示出可檢測的SP2MT活性(試驗中前咕啉-3產(chǎn)物與前咕啉-2產(chǎn)物的比例小于0.05)。b)脫氮假單胞菌之S-腺苷-L-甲硫氨酸前咕啉-2甲基轉(zhuǎn)移酶的純化本試驗說明當檢測上述活性時，如何純化參予鈷胺素生物合成途徑的脫氮假單胞菌蛋白質(zhì)。由含有質(zhì)粒pXL253的SC510Rif細胞純化其蛋白質(zhì)。這涉及到插入了8.7kbEcoRI片段的質(zhì)粒pKT230(圖13)。在該典型純化實驗中，將50克引入了質(zhì)粒pXL253之菌株SC510Rif的濕細胞懸浮在250ml含0.1M磷酸鉀(pH7.7)、5mMDTT中，并于4℃下超聲處理15分鐘。以50，000xg離心1小時，使其上清液通過DEAE-Sephadex柱(10ml凝膠)以除去四吡咯化合物。用0.1MKOH將如此制得之粗提物的pH調(diào)到pH7.7。收集在33%至45%硫酸銨飽和度間沉淀的蛋白質(zhì)，并溶解于40ml0.1Tris-HCl(pH7.7)、5mMDTT溶液中。使溶液通過SephadexG-25柱，用10mMTris-HCl(pH7.7)、5mMDTT洗脫后，將收集的蛋白質(zhì)注射到DEAE-Trisacryl-M柱上。再用0-0.25MKCl線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，合并含SP2MT活性的部分并第二次通過上述的SephadexG25柱。將蛋白質(zhì)部分注射到已用10mMTris-HCl(pH7.7)、5mMDTT平衡過的UltrogelHA(IBF)柱上。用含5mMDTT的0-50mM磷酸鉀(pH7.8)線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。合并含有所研究之活性的部分，并注射到用50mMTris-HCl(pH7.7)、5mMDTT平衡過和MonoQHR5/5(Pharmacia)柱上。用kCl線性梯度(0-0.25M)洗脫SP2MT。對MonoQ層析的流出物作PAGE-SDS(12.5%)電泳并用銀鹽顯色，結(jié)果表明酶的純度大于99%。此可由該蛋白質(zhì)之NH2末端序列的獨特性得到進一步證實。在變性條件下(12.5%PAGE-SDS)作電泳分析，算得其分子量為26，500。下表示出了SP2MT的各純化步驟及其產(chǎn)率。表SP2MT的純化1此因數(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率計算的c)SP2MT的NH2末端序列及對編碼該活性之結(jié)構(gòu)基因的鑒定本實施例說明如何由參予生物合成途徑之蛋白質(zhì)的NH2末端序列鑒定編碼該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。本實施例涉及SP2MT的結(jié)構(gòu)基因。按前述技術(shù)確定了純化之蛋白質(zhì)NH2末端的序列。鑒定出前15個氨基酸12345678SerGlyValGlyValGlyArgLeu9101112131415IleGlyValGlyThrGlyPro蛋白質(zhì)COBI的NH2末端序列(圖16)與該序列準確相符，如果只是圖16中給出的這個序列，則甲硫氨酸是在由核苷酸序列推導出的肽序列的前面。由此可知，氨基末端的甲硫氨酸肯定是在體內(nèi)被甲硫氨酸氨肽酶切掉的(BenBassatetBauer，1987)。經(jīng)12.5%PAGE-SDS電泳估測純化之SP2MT的分子量為26，500。由氨基酸序列推算之蛋白質(zhì)COBI的分子量為25，878(圖16)。NH2末端序列與分子量之間的一致性清楚地表明蛋白質(zhì)COBI即相當于SP2MT。cobI基因是SP2MT的結(jié)構(gòu)基因。4、鑒定由基因cobH編碼的蛋白質(zhì)COBHa)由脫氮假單胞菌重組菌株的培養(yǎng)物純化攜帶氫化咕啉酸的蛋白質(zhì)本實施例說明如何純化連接著從鈷胺素生物合成途徑之中間體衍生的中間產(chǎn)物或化合物的蛋白質(zhì)。其涉及攜帶氫化咕啉酸的蛋白質(zhì)(PPAHBY)。氫化咕啉酸相當于分子中心無鈷原子的鈷啉酸(圖19)。它涉及生物合成的中間體，或者生物合成的付產(chǎn)物。整體考慮的理由是，連接生物合成之中間體，或者連接由該生物合成衍生之產(chǎn)物的蛋白質(zhì)即為參予生物合成鈷胺素的蛋白質(zhì)。這里描述該蛋白質(zhì)的純化。對純化過程的檢測是檢測與蛋白質(zhì)連接之化合物的熒光。用于純化PPAHBY的菌株是脫氮假單胞菌菌株的衍生株;涉及到攜帶質(zhì)粒pXL253的菌株SC510Rif。還有在其EcoRI位點克隆了8.7kb片段的質(zhì)粒pKT230(圖13)。在典型的純化實驗中，將50克菌株SC510RifpXL253的濕細胞(在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的)懸浮在200ml0.1M磷酸鉀(pH7.7)緩沖液中并超聲處理12分鐘。以50，000xg離心1小時后，取上清液過DEAE-Sephadex柱(10ml凝膠)以除去四吡咯化合物。然后立即用1MKOH溶液將其pH調(diào)到7.7。離心收集在40-60%飽和度硫酸銨溶液中沉淀的蛋白質(zhì)部分，并溶于50ml0.1MTris-HCl(pH7.7)溶液中。然后將樣品注入到UltrogelACA54柱上(凝膠體積1000ml)，用50mMTris-HCl(pH7.7)以60ml/小時的流速洗脫蛋白質(zhì)。合并含待純化的、用熒光檢測(激發(fā)330nm，發(fā)射≥550mm)可見的蛋白質(zhì)部分，并注射到用50nmTris-HCl(pH7.7)平衡過的DEAE-TrisacrylM柱上，然后用0-0.2MKCl梯度洗脫。合并有熒光的部分并通過已用10mMTris-HCl(pH7.7)平衡過的SephadexG25柱。將蛋白質(zhì)部分注射到用10mMTris-HCl(pH7.7)平衡的UltrogelHA柱上，并用0-0.1M磷酸鉀(pH7.7)梯度洗脫這些蛋白質(zhì)。收集有熒光的部分并加到0.65M硫酸銨中，然后注射到已用0.65M硫酸銨中之10mM磷酸鉀(pH7.7)平衡過的PhenylSepharoseCL4B柱上。用0.65-0M硫酸銨線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。再合并這些含蛋白質(zhì)的部分。如此得到的蛋白質(zhì)的純度高于99%(根據(jù)12.5%PAGE-SDS電泳及銀鹽顯色結(jié)果)。由該蛋白質(zhì)之NH2末端序列的獨特性可進一步證實其純度。借助這一技術(shù)計算的分子量為22，000。下表中列出了PPAHBY的純化步驟及其產(chǎn)率。表PPAHBY的純化1該因子是根據(jù)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率計算的。b)攜帶氫化咕啉酸之蛋白質(zhì)的NH2末端序列及其結(jié)構(gòu)基因的鑒定本實施例說明如何以參予生物合成之蛋白質(zhì)的NH2末端序列來鑒定編碼該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。按上述方法確定該蛋白質(zhì)的NH2末端序列。鑒定出了15個殘基12345678ProGluTyrAspTyrIleArgAsp9101112131415GlyAsnAlaIleTyrGluArg蛋白質(zhì)COBH的NH2末端序列(圖16)與上示序列完全相符，如果只是圖16上所示的序列，甲硫氨酸應(yīng)在按前述序列測定法測定之肽序列的前面。由此可見，氨基末端甲硫氨酸肯定是在體內(nèi)由甲硫氨酸氨肽酶切掉的(BenBassatetBauer，1987)。第二個殘基是脯氨酸，故這一切除事實也得到已描述之規(guī)律的證實(Hireletal.，1989)。由12.5%PAGE-SDS電泳估測出純化之PPAHBY的分子量為22，000。由其序列推算的蛋白質(zhì)COBH的分子量為22，050(圖16)。蛋白質(zhì)COBH和PPAHBYNH2末端序列和分子量之間的一致性清楚地表明了蛋白質(zhì)COBH即相當于PPAHBY。cobH是PPAHBY的結(jié)構(gòu)基因，并且該蛋白質(zhì)參予鈷胺素的生物合成?？梢哉J為，如果在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)合的氫化咕啉酸，則氫化咕啉酸或者是底物，或者是該COBH蛋白質(zhì)催化之反應(yīng)的產(chǎn)物或其類似物。5、鑒定由基因cobU編碼的蛋白質(zhì)cobUa)活性的定量檢測煙酸核苷酸二甲基苯并咪唑磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(圖5，反應(yīng)5)。本實施例說明對直接參與鈷胺素生物合成途徑之酶活性的測定。它涉及煙酸核苷酸二甲基苯并咪唑磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(NNDMBIPRT)(EC2.4.2.21)。在1mMNaMN(煙酸單核苷酸)和10mMDMBI存在下，在500ml0.1M甘氨酸NaOH(pH9.7)緩沖液中將含有NNDMBIPRT活性(約1單位)的部分30℃保溫8分鐘。將反應(yīng)混合物于80℃下加熱10分鐘，然后用4體積水稀釋，并將100ml該溶液注射到15cmLHPNucleosil5-C8柱上，用0.1M磷酸鉀(pH2.9)乙腈(937)混合物以1ml/分鐘的流速洗脫。用熒光分析法(激發(fā)260nm;發(fā)射＞370nm)檢測并定量分析5′-磷酸α-核糖。酶的活性單位定義為在上述條件下每小時產(chǎn)生1毫微摩爾5′-磷酸α-核糖所需要的酶量。b)脫氮假單胞菌之NNDMBIPRT活性的純化本實驗說明如何純化參予鈷胺素生物合成的脫氮假單胞菌蛋白質(zhì)。從實施例6.1.5.a)所述的檢測開始，按下述步驟純化脫氮假單胞菌的NNDBIPRT。在典型的純化實驗中，使用了10克按前述方法引入了質(zhì)粒pXL1490B的菌株SC510Rif的濕細胞。質(zhì)粒pXL1490B如圖38所示;該質(zhì)粒是克隆繁殖pXL519(見圖8)的BamHI-SstI-SstI片段得到的，它攜帶有脫氮假單胞菌的cobU和cobV基因。這些細胞是按已述方法在添加青紫霉素(｜lividomycin)的PS4培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96小時后得到的。將細胞懸浮于25ml0.1MTris-HCl(pH7.2)緩沖液，并于4℃下超聲處理15分鐘。然后以50，000xg離心1小時以回收粗提物，并將該粗提物通過用同一緩沖液平衡過的DEAE-Tris-acrylM(IBF，F(xiàn)rance)柱。利用KCl梯度(0-0.6M)在MonoQHR10/10柱上分離上述10%洗脫物(120mg蛋白質(zhì))。合并活性部分并用超離心法濃縮到2ml，與1體積30mMTris-HCl(pH7.2)混合后，再在上述的MonoQHR5/5柱上第二次分級分離該樣品。合并各活性部分，加硫酸銨到1M，并在Phenyl-SuperoseHR5/5柱上進行層析分離，用硫酸銨遞減梯度(1M至OM)洗脫。收集含所研究之活性的各部分并用超離心法濃縮之，然后在Bio-Sil250凝膠過濾柱上層析，并用20mM磷酸鈉-50mM硫酸鈉(pH6.8)洗脫。此步驟之后，酶的純度達到95%。經(jīng)PAGE-SDS分析，未見有任何污染蛋白質(zhì)。這一純度可由NH2末端序列的獨特性得到進一步證實。用該技術(shù)估測的分子量為35，000。下表顯示了NNDBIPRT的各純化步驟及有關(guān)參數(shù)。表脫氮假單胞菌之NNDBIPRT的純化c)脫氮假單胞菌之NNDBIPRT的NH2末端序列及對編碼該酶活性之脫氮假單胞菌結(jié)構(gòu)基因的鑒定。按照上述技術(shù)，確定實施例6.1.5b)中純化的脫氮假單胞菌之NNDBIPRT的NH2末端序列。鑒定出前15個殘基12345678GlyLeuProPheAspAspPheArg9101112131415GluLeuLeuArgSerAlaSer蛋白質(zhì)COBU的NH2末端序列(圖41)與該序列相符，如果只是圖41中所示的序列，則甲硫氨酸是在以直接序列分析法測得之肽序列之第一個氨基酸的前面。由此可知，氨基未端的甲硫氨酸肯定是在體內(nèi)被甲硫氨酸氨肽酶切掉了(BenBassatetBauer，1987)。經(jīng)12.5%PAGE-SDS電泳估測純化之N-轉(zhuǎn)糖苷酶的分子量為35，000。由氨基酸序列推算之蛋白質(zhì)COBU的分子量為34，642(圖41)。NH2未端序列和分子量的一致性清楚地表明蛋白質(zhì)COBU即相當于NNDBIPRT?；騝obU是NNDBIPRT的結(jié)構(gòu)基因。d)NNDBIPRT對DBI的特異性。本實施例旨在說明為合成上述核苷酸堿基，如何利用脫氮假單胞菌之NNDBI的催化性質(zhì)，研究脫氮假單胞菌NNDBIPRT充許在脫氮假單胞菌內(nèi)生物合成各種鈷胺酰胺的特異性。用于合成鈷胺素的酶的底物是5，6-二甲基苯并咪唑。苯并咪唑和5-甲基苯并咪唑分別是反應(yīng)速度各自為157%和92%(與天然底物5，6-二甲基苯并咪唑相比)的反應(yīng)底物，NaMN的濃度固定在2mM。對于苯并咪唑核底物來說，脫氮假單胞菌之NNDBIPRT的特異性很差。利用脫氮假單胞菌SC510Rifr菌株(Cameronetal.，1989)，在分別用苯并咪唑或5-甲基苯并咪唑代替5，6-二甲基并咪唑的PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可在該細菌中分別合成Coa-(苯并咪唑基)-cob-氰基鈷胺酰胺、Coa-(5-甲基苯并咪唑基)-cob-氰基鈷胺酰胺。肯定還可以用這種方法合成其他的鈷胺酰胺。6、鑒定由基因cobV編碼的蛋白質(zhì)COBV本實施例說明如何定量檢測脫氮假單胞菌中參予輔酶B12生物合成途徑的酶活性，以及該活性的部分純化并如何得以鑒定脫氮假單胞菌中這種酶的結(jié)構(gòu)基因。a)GDP-鈷啉醇酰胺5′-磷酸a-核唑鈷啉醇酰胺磷酸轉(zhuǎn)移酶(即5′磷酸鈷胺素合酶)活性的定量檢測本實施例說明與鈷胺素生物合成途徑直接相關(guān)之活性的檢測方法。它涉及5′-磷酸鈷胺素合酶(CPS)。在1mMEDTA、12.5mMMgCl2、50mM5′-磷d-核唑及20mMGDP-鈷啉醇酰胺(以5-脫氧-5′-腺苷基(Ado)或輔酶形式)存在下，于30℃黑暗條件下在500ml0.3MTris-HCl(pH9.0)緩沖液中保溫含CPS活性的部分(約5至10單位)。保溫15分鐘后，加入500ml20mM氰化鉀并將該溶液于80℃加熱10分鐘。離心除去沉淀物后，按前述方法檢測存在于上清中的5′-磷酸維生素B12。1單位5′磷酸鈷胺素合酶定義為在上述條件下、每小時產(chǎn)生1毫微摩爾5′磷酸鈷胺素所需的酶量。b)5′磷酸鈷胺素合酶的部分純化本實施例說明如何部分純化參予鈷胺素生物合成途徑的脫氮假單胞菌的酶促活性。從上述的定量檢測開始，進行5′-磷酸鈷胺素合酶的純化。為此，在一典型的純化實驗中，按前述方法在10克菌株SC510Rifr的濕細胞內(nèi)引入質(zhì)粒pXL1490B。該質(zhì)粒pXL1490B已如圖48中所示;其相當于克隆到pKT230中的3.85kbSstI-SstI-BamHI片段。該質(zhì)粒帶有脫氮假單胞菌的基因cobU和cobV。脫氮假單胞菌SC510Rifr中存在這一質(zhì)粒，可使CPS活性放大50倍;故有可能質(zhì)粒pXL1490B所攜帶的插入段內(nèi)含有CPS的結(jié)構(gòu)基因;該基因只能是cobU或cobV。按前述方法，在添加青紫霉素的PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到SC510RifrpXL1490B細胞。離心分離細胞后懸浮于25mlTris-HCl(pH8.3)-1mMEDTA緩沖液(緩沖液A)中，并于4℃下超聲處理15分鐘。以50，000xg離心1小時以回收粗提物，并使之通過用緩沖液A平衡的SephadexG25柱。合并含蛋白質(zhì)的部分并注射到Superose12HR柱，然后用緩沖液A洗脫?；厥张懦霾糠郑c等體積緩沖液A-1.0M硫酸銨混合并在Phenyl-SuperoseHR5/5柱上層析分離。用緩沖液A中的硫酸銨遞減梯度(由0.5M至OM)，再用OM硫酸銨單純緩沖液A洗脫蛋白質(zhì)，以得到5′-磷酸鈷胺素合酶活性部分。按下表所述程序部分純化含酶部分時，其純化過程是基于開始時引入了75mg蛋白質(zhì)而完成的。表脫氮假單胞菌之5′-磷酸鈷胺素合酶的部分純化c)5′-磷酸鈷胺素合酶的特異性(Ado)GDP-鈷啉醇酰胺的Km值為0.9mM。但其酶對于底物之形式(CN，aq)卻具有相同的親合性和實際上完全一樣的反應(yīng)速度。酶對5′-磷酸α-核唑的Km值約2.7mM。較純的5′-磷酸鈷胺素合酶制劑可催化(Ado)GDP-鈷啉醇酰胺-5α-核唑的反應(yīng)以產(chǎn)生輔酶B12，在這些條件未見有任何5′-磷酸鈷胺素的積聚。用于5″-磷酸α-核唑之酶的km值為7.8mM。在上述培養(yǎng)條件下，于PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)SC510Rifr菌株生產(chǎn)鈷胺素時，用CLHP層析法檢測5′-磷酸α-核唑和α-核唑的細胞內(nèi)濃度分別為30和700mM。這表明在沒有5′-磷酸鈷胺素參予的情況下，可通過5′-磷酸鈷胺素合酶由(Ado)GDP-鈷啉醇酰胺直接產(chǎn)生輔酶B12。在脫氮假單菌SC510Rifr的培養(yǎng)物中沒有5′-磷酸鈷胺素的事實進一步證明了輔酶B12是由(Ado)GDP-鈷啉醇酰胺與5′-磷酸α-核唑在體內(nèi)直接反應(yīng)所產(chǎn)生的。已觀察到并在薛氏丙酸桿菌的體外實驗中描述了這種直接反應(yīng)(Ronzioetal.，1967;Renz，1968)。cobU或cobV只能作為CPS的結(jié)構(gòu)基因，因為攜帶脫氮假單胞菌這兩個cob基因的片段在脫氮脫假單胞菌中擴增可使CPS的活性增加50倍，且基因cobU是NNDBIPRT的結(jié)構(gòu)基因，而cobV是CPS的結(jié)構(gòu)基因。6.2.通過檢測生物合成途徑的中間產(chǎn)物來確定COB蛋白質(zhì)的性質(zhì)本實施例旨在說明怎樣可能將酶促活性歸功于脫氮假單胞菌的COB蛋白質(zhì)。該活性可根據(jù)在所提到的步驟中被阻斷之一個或多個突變體積聚之生物合成中間產(chǎn)物數(shù)據(jù)推斷出來。事實上，如果突變體積聚了某種生物合成的中間產(chǎn)物，那么很可能該突變體在利用上述中間體作底物的步驟中受到阻斷。1、蛋白質(zhì)COBC和COBD的性質(zhì)已在實施例1和4中述及的cob突變體G643(根瘤病土壤桿菌)和G572(臭味假單胞菌)在相當于蛋白質(zhì)COBC的步驟中被阻斷。事實上，這兩個突變體并不能由見于基因cobC中的轉(zhuǎn)座子Tn5失活插入來補償。按已述方法，將這兩個菌株即G643和G572，以及未突變的親代菌株[C5δ-C9Rif和KT2440Rif(Cameronetal.，1989)]在PS4′培養(yǎng)基(用于根瘤病土壤桿菌)和PS4′培養(yǎng)基(用于臭味假單胞菌)(PS4′和PS4″分別相當于鈷含量各低100倍和1000倍的前述PS4培養(yǎng)基)中培養(yǎng)3天。向該培養(yǎng)物內(nèi)加入57CoCl2(25ml培養(yǎng)物為2.5μCi/0.1μm)。分析細胞內(nèi)類咕啉。親代菌株不積聚其他類咕啉而只積聚輔酶B12。兩個突變株G643和G572則積聚腺苷化的鈷啉胺酸，其比例分別為11%和6%。這些比例(以百分數(shù)計)是與親代菌株合成輔酶B12的水平相比較而計算出來的。除鈷啉胺酸之外，突變株G643還積聚鈷啉酸五酰胺，其比例為2%;鈷啉酸五酰胺是鈷啉酸前面的中間產(chǎn)物。研究這些突變株的行動可知它們是在合成鈷啉胺酸之后被阻斷的。所有這些cob突變體均在尿卟啉原III與鈷啉醇酰胺之間，或在鈷啉醇酰胺與鈷啉素之間被阻斷。突變體G643和G572在尿卟啉原III與鈷啉醇酰胺之間被阻斷。然而，如果這些突變體在鈷啉醇酰胺之前被阻斷并積聚這兩種鈷啉胺酸，則由它們編碼的蛋白質(zhì)只能參予催化鈷啉胺酸通過氨基丙醇殘基酰胺化，以產(chǎn)生鈷啉醇酰胺的酶促(鈷啉醇酰胺合酶)步驟;如果其本身不是氨基丙醇，它們還可參予反應(yīng)底物的合成以提供氨基丙醇?；騝obC編碼或者是鈷啉醇酰胺合酶，或者是其亞單位的蛋白質(zhì)。用同樣方法分析在相當于基因cobD的步驟中被阻斷的根瘤病土壤桿菌的cob突變株G634。該突變株沒有因基因cobD中的失活插入而得到補償(實施例4.1.)。在該突變株內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一細胞內(nèi)類咕啉是腺苷化的鈷啉胺酸。如前所述的突變體一樣，該突變體編碼參予將鈷啉胺酸轉(zhuǎn)化為鈷啉醇酰胺的蛋白質(zhì)，或者可能編碼合成其他反應(yīng)底物的蛋白質(zhì)。這兩種不同的基因(cobC和cobD)編碼參予同一反應(yīng)步驟的兩種蛋白質(zhì)。2、蛋白質(zhì)COBF和COBM的性質(zhì)基于實施例4.2中所述的研究工作，已研究了其中各基因均被阻斷了的這些已知的根瘤病土壤桿菌突變體。這些突變體是G612(cobF)、G615(cobG)、G616(cobH)、G613(cobI)、G611(cobJ)、G620(cobK)、G638(cobL)和G609(cobM);括號內(nèi)示出了負責補償這些突變體的脫氮假單胞菌基因(實施例5)，它們相當于該突變體中已突變的基因。已在加有標記鈷的前述PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)了這些突變體。培養(yǎng)四天后，分析突變體細胞內(nèi)的類咕啉和脫鈷類咕啉含量。表脫氮假單胞菌8.7kb片段之基因內(nèi)，被阻斷的根瘤病土壤桿菌突變體積聚的中間產(chǎn)物HAB氫化咕啉酸HABM氫化咕啉酸一酰胺HABD氫化咕啉酸二酰胺＊事實上它涉及已描述過的菌株C58-C9RifNal(Cameronetal.，1989)1這些數(shù)值均以未突變親代菌株C58-C9RifNal中積聚的同一中間產(chǎn)物的百分數(shù)表示。這些結(jié)果表明，所有突變體均沒有積聚任何類咕啉(除基因cobF中失活的突變體(G612)外，它可積聚鈷胺酰胺，但所達到的水平很低，只相當于未突變菌株合成之鈷胺素的2.2%)。然而，某些突變體(G612、G615和G616)的鈷胺素合成水平卻在親代菌株鈷胺素水平的10%以上?；蛟S是所有這些突變體至少在鈷啉酸二酰胺之前都被阻斷。所有這些突變體積聚的氫化咕啉酸和氫化咕啉酸二酰胺的量都比未突變菌株低;據(jù)此它們很可能在氫化咕啉酸之前被阻斷。我們可以得出這樣的結(jié)論，即所有基因(cobF至cobG)均編碼參予氫化咕啉酸之前各合成步驟的蛋白質(zhì)。人們知道，突變體G613于基因cobI中發(fā)生突變，而基因cobI是編碼參予氫化咕啉酸之前合成步驟的SP2MT的。從本實施例的結(jié)果看，這種突變體積聚中間產(chǎn)物的情況與該突變體的失活步驟完全一致，即是說在氫化咕啉酸之后它不積聚任何高出見于未突變菌株之積聚水平的中間產(chǎn)物。這一涉及基因cobF、cobJ、cobL和cobM的結(jié)果與實施例6.4的基因密切相關(guān)，后者編碼可催化SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移，并從而在氫化咕啉酸之前干預生物合成的蛋白質(zhì)。除作為SP2MT之結(jié)構(gòu)基因的cobI之外，這些基因均在前咕啉-3之前參予合成途徑。事實上正如也不是SUMT和SP2MT的結(jié)構(gòu)基因一樣，它們是在前咕啉-3之后參予的(本發(fā)明述及的所有cob基因都在尿卟啉原III與鈷胺素之間參予該生物合成途徑)。基因cobF至cobH及cobJ至cobM均編碼參予前咕啉-3和氫化咕啉酸之間的酶類。由于還未證明氫化咕啉酸是生物合成的中間產(chǎn)物，所以我們還試圖重新找出突變體內(nèi)積聚的更前面的類咕啉，即已公認為生物合成之中間體的鈷啉酸二酰胺(Friedman，1975)。為此我們便可以說基因cobF至cobH和cobH至cobJ編碼介入前咕啉-3和鈷啉酸二酰胺之間的酶類。3、蛋白質(zhì)COBS和COBT的性質(zhì)實施例1和4.3中描述的突變體G2035在與蛋白質(zhì)COBS相應(yīng)的步驟中被阻斷。實施例1中描述的突變體G2037在與蛋白質(zhì)COBT相應(yīng)的步驟中被阻斷。在有放射活性鈷57CoCl2存在的PS4′培養(yǎng)基(其中氯化鈷濃度為PS4培養(yǎng)基的1/10)中培養(yǎng)這些菌株及其親代菌株(根瘤病土壤桿菌C58C9Rifr)共培養(yǎng)3天，并按照基本專利中已述及的方法分析了它們細胞內(nèi)脫鈷類咕啉及類咕啉含量。菌株G2035和G2037不積聚類咕啉，而且菌株G2035只積聚高濃度的氫化咕啉酸和氫化咕啉酸一酰胺與二酰胺(即高于由親代菌株中測得的濃度)。該突變體可能是在氫化咕啉酸二酰胺之后及鈷啉酸二酰胺之前的階段被阻斷。因此，基因cobS將編碼干預氫化咕啉酸轉(zhuǎn)化為鈷啉酸二酰胺的酶蛋白;該蛋白質(zhì)可能參予鈷的插入，或未腺苷化之鈷啉酸a，c-二酰胺的還原，或鈷啉酸-a，c-二酰胺的腺苷化作用。相反地，突變體G2037將在氫化咕啉酸的上游步驟中被阻斷?；騝obT則將編碼氫化咕啉酸上游和前咕啉-3下游之酶促步驟中所涉及的蛋白質(zhì)(也已鑒定了為介入前咕啉-3上游步驟的酶編碼的其他結(jié)構(gòu)基因)。正如實施例5.3中曾提到的那樣，蛋白質(zhì)COBT還有可能作為結(jié)合鈷的蛋白質(zhì)，和/或作為通過酸性核心而整合了其他蛋白質(zhì)(一種或多種)的蛋白質(zhì)參予生物合成途徑。4、蛋白質(zhì)cobV的性質(zhì)實施例1和4.4中已描述了突變體G2039和G2040在與蛋白質(zhì)COBV相對應(yīng)的步驟中被阻斷。將這些菌株及其親代菌株在PS4′培養(yǎng)基中，在放射活性鈷57CoCl2存在下培養(yǎng)3天，并按實施例9中所述方法分析細胞內(nèi)脫鈷類咕啉含量并測定類咕啉含量。突變株G2039和G2040可積聚鈷啉胺酸、鈷啉醇酰胺、磷酸鈷啉醇酰胺和GDP-鈷啉醇酰胺。這些突變體有可能在GDP-鈷啉醇酰胺上游的酶促步驟中被阻斷?；騝obV編碼參予由GDP-鈷啉醇酰胺轉(zhuǎn)化為鈷胺素之代謝步驟的酶(圖5)。這一結(jié)果與以(Ado)GDP-鈷啉醇酰胺作為底物之蛋白質(zhì)COBV(CP5)的活性完全相符。6.3.根據(jù)對SAM之親合性的研究確定COB蛋白質(zhì)的活性本實施例說明如何有可能由脫氮假單胞菌的純化之COB蛋白質(zhì)開始，經(jīng)體外實驗證明其固定SAM的活性。如果COB蛋白質(zhì)具有這樣的活性，則表明這種COB蛋白質(zhì)是該途徑中的甲基轉(zhuǎn)移酶，并參予在尿卟啉原III與鈷啉酸之間產(chǎn)生的八個甲基的轉(zhuǎn)移。a)SAM在已純化之蛋白質(zhì)上的親合性試驗本試驗所依據(jù)的原理是鈷胺素生物合成途徑中的甲基轉(zhuǎn)移酶肯定有一個SAM的固定位點。與沒有特異地固定該SAM的所有蛋白質(zhì)相比，應(yīng)證明該位點對SAM有較高的親合力。在過量放射標記之SAM存在下，保溫待研究的蛋白質(zhì)，然后用凝膠過濾層析法將其與游離的SAM分離開。由該蛋白質(zhì)分子量部分重新測得的放射活性即相當于保溫時被固定的SAM。層析應(yīng)在2℃下進行，以便最大程度地限制分離期間SAM的釋放。將此蛋白質(zhì)(約10μg)加在200μl含5mM[甲基-3H]-SAM(1μCi)的0.1MTris-HCl(pH7.7)中30℃保溫10分鐘。保溫后立即取100μl混合物注入TSK-125柱(Bio-Red)上，以1ml/分鐘的流速用50mM硫酸鈉/20mM磷酸二氫鈉(pH6.8)混合物通過該柱的分配閥進行洗脫。收集每管0.5ml洗脫物，并用液體閃爍計數(shù)儀計數(shù)。根據(jù)洗脫物在280nm處的吸收，直接得到蛋白質(zhì)與SAM的滯留時間。b)SAM在脫氮假單胞菌COBA和COBF上固定的體外研究1、蛋白質(zhì)COBF和COBA的純化按下述方法純化脫氮假單胞菌的蛋白質(zhì)COBF。在該典型純化實驗中，將5克在PS4中培養(yǎng)后得到的、已引入了質(zhì)粒pXL1546(見實施例7.3)的菌株SC510Rif的濕細胞懸浮于30ml0.1MTris-HCl(pH7.7)中，并于4℃下超聲處理15分鐘。然后以50，000xg離心1小時以回收粗提物，使上清通過DEAE-Sephadex柱(1ml凝膠)，以除去其中的四吡咯化合物。然后將10mg蛋白質(zhì)提取物入射到已用同種緩沖液平衡過的MonoQHR5/5柱上，并用KCl線性梯度(0至0.25M)洗脫蛋白質(zhì)。在0.2MKCl時洗出蛋白質(zhì)COBF。用0.1MTris-HCl(pH7.7)稀釋2位后，過MonoQHR5/5柱進行第二次純化。經(jīng)PAGE-SDS電泳分離并用考馬斯蘭染色顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。該技術(shù)也表明，在經(jīng)過這些純化步驟后，COBF的純度約為95%。按前述方法測知已純化之蛋白質(zhì)的NH2末端序列。兩個NH2末端序列同時顯現(xiàn)在每一降解周期上;即占括號內(nèi)所示比例的各序列序列1(34%豐度)1234567891011AlaGluAlaGlyMetArgLysIleLeuIleIle序列2(66%豐度)1234567891011MetArgLysIleLeuIleIleGlyIleGlySer如果只是按照已說明的規(guī)則(BenBassatetBauer，1989)用甲硫氨酸氨肽酶切除氨基末端甲硫氨酸(Hireletal.，1989)，則序列1相當于圖16所示之蛋白質(zhì)COBF的NH2末端序列。占更多量的序列2相當于同樣的蛋白質(zhì)，但其轉(zhuǎn)譯起始處并不在我們所提到的轉(zhuǎn)譯起始密碼子ATG處，而是在編碼相上游之第5位上圖(16)。事實上，發(fā)現(xiàn)該序列的氨基酸確切地是從見于蛋白質(zhì)COBF序列上的第二個甲硫氨酸(氨基酸序號6)開始的(圖16)。據(jù)此，氨基末端甲硫氨酸未被切除便進一步證實了已述及的規(guī)則(Hireletal.，1989)。在攜帶質(zhì)粒pXL1546的菌株SC510Rif中有兩個轉(zhuǎn)譯起始位點，一方面根據(jù)我們的構(gòu)建，它相當于位于Shine和Delgarno序列之適當距離上的甲硫氨酸密碼子，一方面則相當于可從圖16所示基因cobF之序列上找到的第二個甲硫氨酸密碼子。由此可見，蛋白質(zhì)cobF可能開始于圖16上指出的甲硫氨酸，即見于更遠處第5位氨基酸的甲硫氨酸。無論如何，這一結(jié)果已證明蛋白質(zhì)COBF得到了表達，并且是以長出4個氨基酸的形式被表達的。純化過程中已純化了兩種形式的蛋白質(zhì)。在該實施例中，我們將已純化的蛋白質(zhì)COBF稱為兩種已純化之蛋白質(zhì)的混合物。按已述方法(Blancheetal.，1989)純化脫氮假單胞菌的蛋白質(zhì)COBA。2、SAM的固定按前面實施例6.6a)中所述的方法研究SAM在兩種蛋白質(zhì)上的固定。以牛血清白蛋白和純化的蛋白質(zhì)COBH作為陰性對照。對于蛋白質(zhì)COBA和COBF，當這些蛋白質(zhì)從TSK-125柱中流出時可在柱出口處觀察到放射活性峰(圖20)。在這一實驗中，蛋白質(zhì)COBI具有固SAM的同樣特性。相反地，對于BSA和蛋白質(zhì)COBH則測不到這樣的放射活性峰。這一試驗證明SAM可于體外固定在蛋白質(zhì)COBA、COBI和COBF上。這些結(jié)果還表明COBA、COBI和COBF都是SAM-甲基轉(zhuǎn)移酶。這一結(jié)果與COBA和COBI的活性相符，盡管分別涉及脫氮假單胞菌的SUMT和SP2MT。蛋白質(zhì)COBF有可能是鈷胺素生物合成途徑中的SAM-甲基轉(zhuǎn)移酶。本試驗進一步證明COBF是一種甲基轉(zhuǎn)移酶。6.4.基于序列同源性的研究確定蛋白質(zhì)的活性本實施例說明如何通過比較脫氮假單胞菌之各COB蛋白質(zhì)的序列找出作為鈷胺素生物合成途徑中SAM-甲基轉(zhuǎn)移酶的COB蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)COBI和COBA是生物合成途徑中的兩種SAM-甲基轉(zhuǎn)移酶。依照Kanehisa程序(1984)比較這兩種蛋白質(zhì)。基于這種比較可確定出三個強同源的區(qū)域(圖21)。在其中各個區(qū)域內(nèi)，兩種蛋白質(zhì)間有45%以上嚴格同源性。COBA和CYSG之間同樣存在三個強同源區(qū)域(圖22);其中COBA的同一區(qū)域與COBI存著強同源性。COBA、CYSG和COBI之間的強同源區(qū)域也與其他COB蛋白質(zhì)有同源性。這里涉及的是蛋白質(zhì)COBF、COBJ、COBL和COBM(圖23)。就區(qū)域1而言，與所有Genpro蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)COBF、COBL和COBM具有顯著的同源性，前者是依照Kanehisa的程序(1984)增加編碼部分推測出200個以上氨基酸而得到的Genbak的蛋白質(zhì)抽提部分(譯本59)。對于區(qū)域2來說，與所有Genpro的蛋白質(zhì)(譯本59)相比，蛋白質(zhì)COBJ、COBL和COBM具有顯著的同源性。對于第三個同源區(qū)，與所有Genpro的蛋白質(zhì)(譯本59)相比，COBJ、COBL和COBM顯著的同源性。該序列比較可證明COBF、COBJ、COBL和COBM這四種蛋白質(zhì)間具有顯著的同源性，其同源區(qū)保留了三種類型甲基轉(zhuǎn)移酶COBA、COBI和COBF的序列。蛋白質(zhì)COBG、COBH和COBK跟保留甲基化酶的區(qū)域沒有明顯的同源性。在區(qū)域1中，蛋白質(zhì)COBF跟其他蛋白質(zhì)沒有顯著同源性。上述同源性與所有這些蛋白質(zhì)都是甲基轉(zhuǎn)移酶這一可能性相符合。該結(jié)果可將有關(guān)這些蛋白質(zhì)體外結(jié)合SAM的容量與所述及的COBF的生物化學數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(實施例6.3)。這些同源性一方面可證實COBF是鈷胺素生物合成途徑中的SAM-甲基轉(zhuǎn)移酶，同時還證明COBJ、COBL和COBM也可能是該生物合成途徑中的SAM-甲基轉(zhuǎn)移酶。這些結(jié)果也顯示脫氮假單胞菌COB蛋白質(zhì)與其他微生物的同功能蛋白質(zhì)間存在同源性。實施例7-COB蛋白質(zhì)的表達本實施例說明擴增脫氮假單胞菌中的脫氮假單胞菌COB基因之結(jié)構(gòu)基因而導致COB蛋白質(zhì)活性的放大。1、蛋白質(zhì)COBA的表達質(zhì)粒pXL557相當于其中克隆了5.4kb片段中之2.4kbBglII-EcoRV片段(分別為圖7所示序列的80和2394位)的質(zhì)粒pXL59。該片段含有基因cobA和cobE。質(zhì)粒pXL545只含有基因cobE。其構(gòu)建如實施例4.1中所述。經(jīng)接合轉(zhuǎn)移將這兩個基因引入SC510Rif中。在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株SC510Rif、SC510RifpXL59、SC510RifpXL557和SC510RifpXL545。4天后終止培養(yǎng)，并按已述的標準程序(F.Blancheetal.，1989)檢測SUMT活性。其活性如下表所示。表SC510Rif及其某些衍生株SUMT活性由這些結(jié)果可清楚地看出，SC510Rif中只有質(zhì)粒pXL557可引起SUMT活性的凈增加(50倍)。這種增加導致cobA而不是cobE的擴增，因為質(zhì)粒pXL545只擴增cobE，故不能提高SUMT活性。該結(jié)果進一步證實cobA是脫氮假單胞菌之SUMT的結(jié)構(gòu)基因。結(jié)果還表明可以通過擴增脫氮假單胞菌之SUMT的結(jié)構(gòu)基因來提高脫氮假單胞菌中的SUMT活性。2、蛋白質(zhì)COBI的表達將來自8.7kb之DNA片段的、含有SP2MT之結(jié)構(gòu)基因(cobI)的片段克隆到在革蘭氏陰性菌中擁有廣泛宿主的質(zhì)粒中，然后經(jīng)接合轉(zhuǎn)移將該質(zhì)粒引入脫氮假單胞菌SC510Rif中。與攜帶載體的菌株相比較，檢測該菌株的S-腺苷-L-甲硫氨酸前咕啉-2甲基轉(zhuǎn)移酶活性。由8.7kb片段開始，純化含基因cobH和cobI的1.9kbBamHI-BamHI-SstI-SstI片段。將“接頭”XbaI和EcoRI分別連接到BamHI和SstI位點上，并用噬菌體T4的DNA聚合酶充填之。然后將該片段插入到具有廣泛宿主之質(zhì)粒pXL59的XbaI和EcoRI位點。它具有卡那霉素抗性。如此得到的質(zhì)粒被定名為pXL1148(圖24)。另外構(gòu)建一相似質(zhì)粒由8.7kb片段開始純化只含完整基因cobH和cobI之5′部分的1.5kbBamHI-BamHI-SstI片段。將“接頭”XbaI和EcoRI分別連接到BamHI和SstI位點上，然后用噬菌體T4的DNA聚合酶填充或消化之。再將此片段插入到pXL59的EcoRI和XbaI位點中，得到質(zhì)粒pXL1149。質(zhì)粒pXL1148和pXL1149的差別在于pXL1148上存在含基因cobI之3′末端的0.3kbSstI-SstI片段。與pXL1149相反，質(zhì)粒pXL1148攜帶cobI的完整結(jié)構(gòu)基因。這兩個質(zhì)粒都含有基因cobH。經(jīng)接合轉(zhuǎn)移將這兩個質(zhì)粒引入SC510Rif中。在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株SC510Rif、SC510RifpX59、SC510RifpXL1148和SC510RifpXL1149。培養(yǎng)4天后收獲細胞，并按實施例6.1.3a)中所述方法檢測SP2MT活性。這些定量檢測的結(jié)果連同實施例6.1.3a)中定義的SP2MT活性如下表所示。表脫氮假單胞菌之各衍生株的SP2MT活性試驗中加入500μg粗提物活性以實施例6.1.3a)中限定的百分率表示。只有質(zhì)粒pXL1148帶來SP2MT活性的顯著提高。相反地，質(zhì)粒pXL1149沒有給出與對照組SC510Rif和SC510RifpXL59菌株不同的結(jié)果。pXL1148是唯一含基因cobI的質(zhì)粒，而且只有它放大了SP2MT活性;這一結(jié)果進一步證明脫氮假單胞菌的SP2MT結(jié)構(gòu)基因是基因cobI。此外，如果在變性條件下電泳分離(10%丙烯酰胺，PAGE-SDS)這些不同菌株的整個蛋白質(zhì)，則只在有pXL1148的情況下觀察到相當于分子量為25，000的蛋白質(zhì)(圖15)。該蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)COBI的分子量相符。質(zhì)粒pXL1148可使被轉(zhuǎn)化的脫氮假單胞菌過量產(chǎn)生蛋白質(zhì)COBI。3、COBF的表達當大腸桿菌Ptrp啟動子和λ噬菌體之CII基因的核糖體的固定位點位于基因cobF的上游時才能得以表達。如此得到的表達要比以同樣之多拷貝質(zhì)粒的簡單基因擴增所觀察到的表達水平高得多。純化與pXL1496相近的2kbEcoRI-BamHI-BamHI片段(圖26)。該片段含有大腸桿菌的Ptrp啟動子和在基因cobF上游的λ噬菌體cII基因之核糖體的固定位點。基因cobF的上游有大腸桿菌之rrnB操縱子的終止密碼子。將該片段克隆到質(zhì)粒pKT230的EcoRI-BamHI位點以得到pXL1546(圖26)。pKT230是一個可在幾乎所有革蘭氏陰性菌中復制的不相容性Q組群的質(zhì)粒(Bagdasarianetal.，1981)。該質(zhì)粒具有卡那霉素抗性。通過接合將質(zhì)粒pXL1546和pKT230引入SC510Rif中。按前述方法在PS4培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株SC510RifpKT230和SC510RifpXL1546。培養(yǎng)4天后，用10%的PAGE-SDS電泳分析各不同菌株的總蛋白質(zhì)。如圖27所示，可在SC510RifpXL1546的提取物中觀察到過表達的分子量為32，000的蛋白質(zhì);這種蛋白質(zhì)與由大腸桿菌BpXL1496過表達的蛋白質(zhì)共遷移(實施例7.2.1)。此外，該蛋白質(zhì)只在含pXL1546的菌株SC510Rif中被表達，而在菌株SC510Rif和SC510RifpKT230的總蛋白質(zhì)中則未見有這種蛋白質(zhì)。這種過表達的蛋白質(zhì)即是蛋白質(zhì)COBF。4、COBH的表達本實施例描述含基因cobH之脫氮假單胞菌之DNA片段的擴增。純化該基因編碼的蛋白質(zhì);其涉及也稱為攜帶氫化咕啉酸的蛋白質(zhì)COBH。實施例7.1.2中所述的質(zhì)粒pXL1149，在得到8.7kb片段的DNA插入段上只含有完整的基因cobH。與載體相反，該質(zhì)?？稍赟C510Rif中過表達分子量為22，000的蛋白質(zhì)(圖25)。5、COBV的表達本實施例描述由只攜帶cobV的質(zhì)粒(pXL699，參見圖38)放大磷酸輔酶B12合酶活性。在SC877Rif中借助質(zhì)粒pXL699放大磷酸B12的活性，與攜帶載體pXL453、pXL1303、pXL1324或pKT230的同樣菌株相比，其可高出50倍。該質(zhì)粒在其插入段只含有完整的cobV及ORF18和cobU的5′末端部分?？梢钥隙?，該菌株(SC877RifpXL699)中可過表達蛋白質(zhì)COBV;與菌株SC877Rif相比，該過表達水平高50倍。7.2.在大腸桿菌內(nèi)的表達本實施例說明怎樣在大腸桿菌內(nèi)過量產(chǎn)生脫氮假單胞菌的COB蛋白質(zhì)。1、COBF的表達將大腸桿菌的Ptrp啟動子和λ噬菌體之CII基因的核糖體的固定位點定位在cob基因的上游，從而得以實現(xiàn)過表達。將8.7kbEcoRI片段中的2250pbEcoRI-XhoI片段(即圖8所示序列上0和2250位)克隆到噬菌體M13mp19(Norranderetal.，1983)的EcoRI和SalI位點之間。如此構(gòu)建的質(zhì)粒被定名為pXl1405。經(jīng)定點誘變引入NdeI位點，以使該限制性位點后面的三個堿基(ATG)構(gòu)成基因cobF的轉(zhuǎn)譯起始位點。這涉及修飾基因cobF中ATG前面的三個堿基，即以CAT代替GAA(G在圖8所示序列的第733位)。再純化含基因cobF的NdeI-SphI-SphI片段(圖26)。然后將1.5kb片段克隆到質(zhì)粒pXL694(Denefleetal.，1987)的NdeI-SphI位點中。如此構(gòu)建的質(zhì)粒被定名為pXL1496(圖26)。在基因cobF之前的120pbEcoRI-NdeI片段(來自pXL694)上存在適于大腸桿菌基因表達的調(diào)節(jié)信號。這些信號由大腸桿菌Ptrp啟動子區(qū)域[-40+1]后者接著包含λ噬菌體CII基因之核糖體固定位點的73pb組成(Denefleetal.，1987)。在基因cobF的上游(HindIII-BamHI片段上)有大腸桿菌rrnB操縱子的終止信號。經(jīng)轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pXL1496引入大腸桿菌菌株(MonodetWollman，1947)中。按已述方法(Denefleetal.，1987)，在Ptrp啟動子被抑制(存在色氨酸)或不被抑制(無色氨酸)的條件下研究基因cobF的表達。在需要抑制Ptrp啟動子的情況下，完成表達所用的培養(yǎng)基是添加了0.4%葡萄糖、0.4%酪蛋白氨基酸、10mM硫胺素和40μg/ml色氨酸的M9基本培養(yǎng)基(Miller，1972)。將大腸桿菌BpXL1496菌株于37℃下培養(yǎng)在加有100μg氨芐青霉素的上述培養(yǎng)基中。如圖28所示，當沒有色氨酸時，可誘導分子量為32，000之蛋白質(zhì)的表達。事實上，當用PAGE-SDS分析大腸桿菌BpXL1496的總蛋白提取物時(圖28)，可以很清楚地觀察到分子量32，000D的蛋白質(zhì)約占總蛋白質(zhì)的1-4%。在沒有色氨酸的相似條件下培養(yǎng)大腸桿菌BpXL1496所得到的總蛋白提取物中，這種蛋白質(zhì)的凈含量則不大。在這些條件下表達的蛋白質(zhì)之分子量接近于根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推算的蛋白質(zhì)COBF的分子量(28，927D)(圖16)。如此在大腸桿菌內(nèi)表達的蛋白質(zhì)即為蛋白質(zhì)COBF。2、COBT的表達使cob基因的5′端與lac啟動子及大腸桿菌之lacZ的前三個密碼子融合，得以過量產(chǎn)生目的COB蛋白質(zhì)。在圖32所示之4.8kb片段的序列上，2624位的EcoRI位點處含有基因cobT的第四個密碼子。將pXL837的3.5kbEcoRI-XbaI片段(見圖36)克隆到pTZ18R或pTZ19R(Pharmacia)的EcoRI和XbaI位點中，以分別產(chǎn)生pXL1874或pXL1875;這兩個質(zhì)粒的不同在于被截短的基因cobT與大腸桿菌乳糖操縱子之啟動子(Plac)有相對的取向。Plac在pXL1874上處于cobT的上游，而在pXL1875上則相反。在pTX18R的EcoRI-XbaI位點克隆pXL837的EcoRI-XbaI片段可在大腸桿菌β-半乳糖苷酶的前4個氨基酸與由其第4個密碼子開始的基因cobT之間實現(xiàn)蛋白質(zhì)融合。基因lacZ′cobT的表達是在lacZ之表達信號的控制下進行的。經(jīng)轉(zhuǎn)化作用將質(zhì)粒pXL1874、pXL1875、pTZ18R引入大腸桿菌BL21菌株中。按已述方法(Maniatisetal.，1989)研究了基因cobT的表達。如圖42B所示，用PAGE-SDS方法分析BL21pXL1874的總蛋白提取物，發(fā)現(xiàn)只能由pXL1874表達的分子量為72，000的蛋白質(zhì)占總蛋質(zhì)的1-4%。在這些條件下表達的蛋白質(zhì)的分子量，與根據(jù)圖40所示蛋白質(zhì)COBT之氨基酸序列推算的分子量(70335D)相近。本實驗清楚地表明，由基因cobT第四個密碼子上EcoRI位點開始的開放相可與見于基因cobT開放相協(xié)調(diào)表達。3、被截短之蛋白質(zhì)COBS的表達BamHI位點相應(yīng)于基因COBS之第45個密碼子的位置。由pXL843上切掉含基因cobS之3′部分和該基因之下游序列的1.2kbBamHI-BamHI片段，并將其克隆到質(zhì)粒pEI-3b(Rosenbergetal.，1987)的BamHI位點中，得到pXL1937。使BamHI以一定方式定向，以使基因cobS之被截短的部分與噬菌體T7的主要衣殼蛋白質(zhì)的前12個密碼子或基因10(Rosenbergetal.，1987)相融合。該雜合基因處于噬菌體T7之F10啟動子的控制下。經(jīng)轉(zhuǎn)化作用將質(zhì)粒pXL1937連同pET-3b轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21pLyS(W.Studier，個人通訊)中。在選擇性培養(yǎng)基上再分離后，在L培養(yǎng)液中培養(yǎng)這兩個菌株、直到D0610nm為1;此階段將該培養(yǎng)基調(diào)到IPTG(異丙基-β-半乳糖苷)濃度為1mM，以誘導噬菌體T4之聚合酶的表達(Rosenbergetal.，1987)。將培養(yǎng)物于37℃保溫3小時，然后制備細胞的溶胞產(chǎn)物。在變性條件下經(jīng)PAGE電泳分離如此培養(yǎng)之細菌的總蛋白質(zhì)。如圖12A中所示，只有BL21pLysSpXL1937培養(yǎng)物能特異地過表達分子量為33，000的蛋白質(zhì)。這一分子量與融合蛋白質(zhì)的分子量(33KD)完全相符。該實驗清楚地表明由位于基因cobS之第45個密碼子處的BamHI位點開始的開放相可與見于基因cobS的開放相協(xié)調(diào)表達。實施例8用DNA重組技術(shù)擴大鈷胺素生產(chǎn)8.1.在脫氮假單胞菌中擴增本實施例說明如何通過擴增脫氮假單胞菌SC510的cob基因來改善脫氮假單胞菌SC510Rif菌株中鈷胺素的生產(chǎn)。a)經(jīng)除去鈷胺素生物合成中的限制性步驟來改善脫氮假單胞菌中鈷胺素的產(chǎn)量。本實施例說明如何通過擴增脫氮假單胞菌的cob基因得到以改善脫氧假單胞菌SC510Rif菌株中的鈷胺素產(chǎn)率。這種改善是由除去生物合成途徑中的限制性步驟而導致的。實施例4.2中已描述了質(zhì)粒pXL367(圖13)。該質(zhì)粒相當于其中插入了8.7kb之EcoRI片段的pRK290(Dittaetal.，1981)。質(zhì)粒pXL367可導致菌株SC510Rif中鈷胺素之生物合成能力的改善。按照實施程序中所述的條件，在含PS4培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)菌株SC510Rif、SC510RifpRK290和SC510RifpXL367。結(jié)果可觀察到存在質(zhì)粒pXL367的菌株之生物能力得到了改善。事實上，菌株SC510RifpRT290高30%。這種改善并不是因為脫氮假單胞菌之任何一個基因的擴增，而是由于8.7kbEcoRI片段上的基因得到特異性擴增所致。事實上，圖11中所示的質(zhì)粒pXL723沒有給出任何改善，而且觀察到用該質(zhì)粒與菌株SC510Rif和SC510RifpRK290得有同樣的生產(chǎn)滴度。b)經(jīng)除去鈷胺素生物合成途徑中的兩個限速步驟來改善脫氮假單胞菌中輔酶B12的生產(chǎn)。本實施例說明如何通過擴增脫氮假單胞菌的cob基因來改善脫氮假單胞菌菌株的鈷胺素產(chǎn)率。將得自5.4kb片段(含有基因cobA和cobE)的2.4kbClaI-EcoRV片段，與8.7kbEcoRI片段一起共克隆到有廣泛宿主的質(zhì)粒pXL203上。如此構(gòu)建的質(zhì)粒被定名為pXL525(圖29)。通過接合將該質(zhì)粒引入SC510Rif中。菌株SC510RifpXL525的鈷胺素產(chǎn)率比SC510RifpXL367高20%。擴增基因cobA和cobE得以除去SC510Rif中之鈷胺素生物合成途徑的新的限速步驟。本實施例中，通過相繼除去兩個限制性步驟而改善脫氮假單胞菌的SC510Rif菌株。本實例表明，除去鈷胺素生物合成途徑中的兩個限制性步驟可使產(chǎn)率得到進一步的改善。8.2在根瘤病土壤桿菌中改善的鈷胺素產(chǎn)率本實施例說明通過擴增脫氮假單胞菌的cob基因來改善鈷胺素生產(chǎn)菌的鈷胺素產(chǎn)率。所使用的菌株是革蘭氏陰性菌的菌株;它涉及根瘤病土壤桿菌菌株。通過接合轉(zhuǎn)移，將實施例4.2和8.1中所述的質(zhì)粒pXL367和pXL525，以及載體pRK290(Dittaetal.，1981)和質(zhì)粒pXL369(圖29)引入根瘤病土壤桿菌菌株C58-C9Rif(Cameronetal.，1989)中。按前述方法，在PS4培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)菌株C58-C9Rif、C58-C9RifpRK290、C58-C9RifpXL367、C58-C9RifpXL368和C58-C9RifpXL525。按前述方法定量檢測鈷胺素產(chǎn)率，結(jié)果如下表所示。表不同重組根瘤病土壤桿菌菌株之維生素B12產(chǎn)物的滴度如上表所示，在所利用的根瘤病土壤桿菌菌株中鈷胺素的產(chǎn)率可得以改善。利用pXL367和pXL368這兩個質(zhì)粒改善了根瘤病土壤桿的鈷胺素產(chǎn)率。這兩個質(zhì)粒分別含有8.7kbEcoRI片段(基因cobF至cobM)和2.4kbClaI-EcoRV片段(基因cobE至cobA)。它們分別使根瘤病土壤桿菌C58-C9Rif的鈷胺素產(chǎn)率提高1倍;這些結(jié)果表明，在擴增攜帶脫氮假單胞菌之cob基因的片段時，有可能改善根瘤病土壤桿菌菌株的鈷胺素產(chǎn)率。這種情況可視為異源改善，即借助擴增其他菌株的cob基因來改善某一菌株的鈷胺素生產(chǎn)能力。由含有cob基因的脫氮假單胞菌的不同片段所帶來的鈷胺素產(chǎn)率的改善效果是可以累加的，即是說將分別克隆到pXL367和pXL368上的兩個片段引入同一質(zhì)粒上時，可觀察到附加的改善效果，即質(zhì)粒pXL525在根瘤病土壤桿菌C58-C9Rif中帶來的改善超過了各片段分別克隆到同樣載體中所帶來的改善作用。8.3在苜蓿根瘤菌中改善鈷胺素產(chǎn)率本實施例說明對其他鈷胺素生產(chǎn)菌之鈷胺素生產(chǎn)能力的改善。經(jīng)接合轉(zhuǎn)移將實施例8.2中所述的質(zhì)粒pXL368及載體pRK290(Dittaetal.，1981)引入苜蓿根瘤菌菌株102F34Rif(Leongetal.，1982)中。按已述方法在PS4培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)移接合體102F34Rif、102F34RifpRK290和102F34RifpXL368。按前述方法定量檢測鈷胺素產(chǎn)物，結(jié)果如下表所示。表不同重組苜蓿根瘤菌菌株之鈷胺素產(chǎn)物的滴度從上表可以明顯看出，所使用的苜蓿根瘤菌菌株的鈷胺素產(chǎn)率得到了改善。質(zhì)粒pXL368可改善所使用的苜蓿根瘤菌菌株的鈷胺素產(chǎn)率。該質(zhì)粒含有24kb之ClaI-EcoRV片段(基因cobA至cobE);它使苜蓿根瘤菌菌株102F34Rif的鈷胺素產(chǎn)率提高到2倍。結(jié)果還表明，在擴增攜帶脫氮假單胞菌之cob基因的片段時，可改善苜蓿根瘤菌菌株的鈷胺素產(chǎn)率。就這一情況來說，可以看作是異源改善，即可借助擴增其他菌株的cob基因來改善某菌株的鈷胺素產(chǎn)率。實施例9類咕啉生產(chǎn)菌株之培養(yǎng)液和細胞內(nèi)類咕啉和脫鈷類咕啉的定量檢測本實施例說明如何能夠鑒定與定量檢測不同鈷胺素生產(chǎn)菌株的不同類咕啉和脫鈷類咕啉產(chǎn)物。該定量檢測特別適于檢測輔酶B12。按已述方法(Renz，1971)得到細胞的氰化物處理液(或只是細胞)。離心后，取一份上清液通過DEAE-Sephadex柱并用0.1M磷酸鹽緩沖液洗脫。合并所收集的各部分并在Sep-PakC-18小柱(Waters)上脫鹽。蒸發(fā)并在水中制成懸浮液(按已有類咕啉量，100μl/1ml)后，在NucleosilC-18柱(Macherey-Nagel)上以CLHP法鑒定并定量檢測類咕啉。用含10mMKCN之0.1M磷酸鉀緩沖液中的丙腈梯度(0%-100%)以1ml/分鐘的流速洗脫。借助BertholdLB505型檢測儀檢測371nm的紫外光和/或特異地檢測57Co(如果在有57CoCl2時培養(yǎng))，以顯現(xiàn)類咕啉。還可通過與標準滯留時間相比較來鑒定之。同樣地，可檢測330nm紫外光來顯現(xiàn)“無金屬類咕啉”(氫化咕啉酸、氫化咕啉酸-酰胺和氫化咕啉酸二酰胺)。依靠這一技術(shù)，已分離出下列中間產(chǎn)物鈷啉酸、鈷啉酸-酰胺、鈷啉酸二酰胺、鈷啉酸三酰胺、鈷啉酸四酰胺、鈷啉酸五酰胺、鈷啉胺酸、鈷啉醇酰胺、磷酸鈷啉醇酰胺、GDP-鈷啉醇酰胺、磷酸-B12和維生素B12。也分離了這些產(chǎn)物的腺苷化形式，并用這一技進行了測定。但實施中去掉了氰化的起始步驟，并使用未加KCN的緩沖液洗脫CLHP柱。圖31中給出了由該系統(tǒng)分離并根據(jù)柱洗脫物的紫外吸收鑒定了有不同滯留時間的產(chǎn)物。菌株SC510Rif的樣品已于1990年6月30日保藏在Baarn的CentraalBureauvoorSchimmelcultures(Pays-Bas)，其保藏登記號為CBS103.90。參考文獻目錄AusubelF.M.，BrentR.，KinstonR.E.，MooreD.D.，SeidmanJ.G.andK.Struhl.1987.Currentprotocolsi5biology1987-1988.JohnwilleyandSons，NewYork.Bagdasarian，M.，R.Lurz，B.Rückert，F(xiàn).C.Franklin，M.l.Bagdasarian，J.Frey，andK.Timmis.1981.Specific-purpeplasmidcloningvectors.II.Broadhostrange，highcopynumber，10RSF1010-derivedvectors，andahostvectorsystemforgenecloninginPseudomonas.Gene16237-247.BarrèreG，GenesteB.，SabatierA.，1981.FabricationdelavitamineB121′améliorationd′unprocédé.PourlaScience，49，1556-64.BattersbyA.R.，F(xiàn)ookesC.J.R.，MatchamG.W.J.，MacDonaldE.，1980.Biosynthesisofthepigmentsoflifeformationofthemacrocycle.Nature，285，17-21.20Battersby，A.R.，andE.MacDonald.1982.Biosynthesisofthecorrinmacrocycle.p.107-144.InD.Dolphin(ed.)，B12，vol.l.JohnWilley&Sons，Inc.，New-York.25Beck.，W.S.1982.BiologicalandmedicalaspectsofvitaminB12.p1-30.InD.Dolphin(ed.)，B12，vol.1.JohnWilley&Sons，Inc.，New-York.BenBassatA.，andK.Bauer.1987.Amino-terminalprocessingof30proteins.Nature，326315.BlancheF.，L.Debussche，D.Thibaut，J.CrouzetandB.Cameron.1989.PurificationandCharacterisationofS-Adenosyl-L-MethionineUroporphyrinogenIIImethyltransferasefromPseudomonas35denitrificans.J.Bacteriol.，1714222-4231.BreyR.N.，BannerC.D.B.，WolfJ.B.，1986.CloningofMultipleGenesInvolvedwithCobalamin(VitaminB12)BiosynthesisinBacillusmegaterium.J.Bacteriol.，167，623-630.40CameronB;，K.Briggs，S;Pridmore，G.BrefortandJ.Crouzet，1989.CloningandanalysisofgenesinvolvedincoenzymeB12biosynthesisinPseudomonasdenitrificans.J.Bacteriol，171，547-557.45Casadaban，M.J.，A.Martinez-Arias，S.T.ShapiraandJ.Chou.1983.B-galactosidasegenefusionforanalysinggeneexpressioninEscherichiacoliandYeast.MethodsEnzymol.100，293-308.50DeBruijnF.J.andJ.R.Lupski.1984.TheuseoftransposonTn5mutagenesisintherapidgenerationofcorrelatedphysicalandgeneticmapsofDNAsegmentsclonedintomulticopyplasmids-areview.Gene，27，131-149.55DeGraff，J.，J.H.Crosa，F(xiàn).Heffron，andS.Falkow.1978.ReplicationofthenonconjugativeplasmidRSF1010inEscherichiacoliK-12.J.Bacteriol.146，117-122.DenèfleP.，S.Kovarik，J.-D.Guiton，T.CartwrightandJ.-F.60Mayaux.1987.Chemicalsynthesisfoagenecodingforhumanangiogenin，itsexpressioninEscherichiacoliandconversionoftheproductintoitsactiveform.Gene，56，61-70.DittaG.，SchmidhauserT.，YakobsonE.，LuP.，LiangX.-W.，F(xiàn)inlayD.R.，GuineyD.andD.R.Helinski.1985.PlasmidsrelatedtothebroadhostrangevectorPRK290，usefulforgenecloningandfor5monitoringgeneexpression.Plasmid，13，149-154.Ditta，G.，S.Stanfield，D.Corbin，andD.R.Helinski.1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGram-negativebacteriaConstructionofagenelibraryofRhizobiummelitoti.Proc.Natl.10Acad.Sci.USA77，7347-7351.Escalante-SemerenaJ.C.andJ.R.Roth.1987.RegulationofthecobalaminbiosyntheticoperonsinSalmonellatyphimurium.J.Bacteriol，169，225-2258.15Florent，J.1986.Vitamins.p115-158.InH.-J.RehmandG.Reed(ed.)，Biotechnology，vol.4，VCHVerlagsgesellschaftmbH，Weinheim.20FriedmannH.C.andL.M.Cagen.1970.MicrobialbiosynthesisofB12-likecompounds.Ann.Rev.Microbiol.，24，159-208.FriedmannH.C.，1968.VitaminB12biosynthesis.J.Biol.Chem.，243，2065-2075.25FriedmannH.C.，1975.Biosynthesisofcorrinoids.InBabiorB.M.，Cobalamin，75-110，JohnWileyandSons，NewYork.HenikoffS.1984.Unidirectionaldigestionwithexonucle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ā)明者布蘭克·弗朗西斯,卡么隆·比特利斯,克勞姿·約爾,德布什·勞倫斯,利微-西爾,西泊特·丹尼斯申請人:羅納·布朗克醫(yī)藥公司