專(zhuān)利名稱(chēng)：指示菌法平板快速篩選糖化酶產(chǎn)生菌新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用指示菌平板快速篩選糖化酶產(chǎn)生菌的新方法。
在發(fā)酵工業(yè)中，大量耗用糖化酶，篩選糖化酶產(chǎn)生菌工作相當(dāng)繁雜，因而，妨礙了糖化酶的生產(chǎn)。傳統(tǒng)篩選糖化酶產(chǎn)生菌的方法是利用次亞碘酸鹽法，該方法是化學(xué)測(cè)定法。它除要求發(fā)酵濾液作樣品外，也無(wú)法排除α-淀粉酶和葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的影響，更無(wú)法應(yīng)用于能篩選大量菌株的單菌落瓊脂柱育種。1977年，J.Meyrath創(chuàng)造一種能去除葡糖苷轉(zhuǎn)移酶影響的篩選方法，其本質(zhì)也是化學(xué)檢測(cè)法。流程是菌塊柱(置于平板上) (注入麥芽糖液保溫2小時(shí))/() 反應(yīng)混合液→移到薄板色層分析器 (干燥)/() 顯色→染色→挑出不產(chǎn)葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的菌落。這方法雖可排除葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的干擾，但難以區(qū)分每個(gè)菌落間糖化酶含量的差別，且流程、工序繁雜。
本發(fā)明的目的是提供一種指示菌法快速篩選糖化酶產(chǎn)生菌的新方法。它既能排除α-淀粉酶和葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的影響，又能在平板上區(qū)分大量單菌落瓊脂柱產(chǎn)酶量差別;同時(shí)，設(shè)備簡(jiǎn)單，篩選過(guò)程簡(jiǎn)易快捷。
本發(fā)明的原理是瓊脂柱的體積是相等的，所含營(yíng)養(yǎng)成份也是相同的。當(dāng)生長(zhǎng)在它上面的不同菌株的生產(chǎn)性能不同時(shí)，分泌在瓊脂柱里的糖化酶量也不一樣。因而，檢測(cè)的結(jié)果也不一樣。根據(jù)對(duì)糖化酶敏感的指示菌形成的生長(zhǎng)圈大小與菌落直徑的比值，篩選出較優(yōu)菌株。
本發(fā)明的工藝過(guò)程是單菌落瓊脂柱或菌塊柱 (加入指示菌液)/() 平板檢測(cè)→挑選出最優(yōu)菌落。
具體步驟分述如下一、指示菌的培養(yǎng)指示菌種為產(chǎn)骯假絲酵母(candidautilis)，熱帶假絲酵母(candidatrapicalis)，解脂假絲酵母(candidalipolytica)，乳酒假絲酵母(candidakefyr)，克魯斯假絲酵母(candidakrusei)，郎必克假絲酵母(candidaIambica)。上述菌種的共同特征可在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所“常見(jiàn)與常用真菌編寫(xiě)組”編寫(xiě)的《常見(jiàn)與常用真菌》一書(shū)P146找到。菌種可向中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種室購(gòu)買(mǎi)。
指示菌培養(yǎng)基成份馬鈴薯200克，葡萄糖20克，CaCO30.5克，K2HPO40.05克、MgSO40.05克，蒸餾水1000ml。馬鈴薯去皮煮沸20～30分鐘，加入葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽和20克瓊脂，溶化后調(diào)pH為6.5。每支12×180mm試管裝8ml。1.1公斤壓力滅菌30分鐘后擺斜面，備用。
菌種培養(yǎng)在28℃培養(yǎng)24小時(shí)，菌苔半透明至乳白色。
菌液制備把消毒蒸餾水注入每支試管，每管5～10ml，用接種環(huán)刮洗液倒入消毒過(guò)的三角瓶里，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ摼河?2型分光光度計(jì)(510mm)測(cè)定OD值為0.25～0.26。
二、單菌落瓊脂柱及菌塊柱的制備和檢測(cè)瓊脂柱培養(yǎng)基玉米粉1～5%，黃豆餅粉0.5～2%，麩皮0.1～0.5%，K2HPO40.02～0.1%，瓊脂1.5～2.0%。
單菌落瓊脂柱制備把上述培養(yǎng)基溶化，每個(gè)9cm平皿倒入25ml。把待篩選菌株按常規(guī)法分離，每皿約出現(xiàn)30個(gè)菌落，適溫培養(yǎng)至初見(jiàn)菌落時(shí)，用打孔器打出單菌落瓊脂柱，在95%濕度下適溫培養(yǎng)1～2天，長(zhǎng)出孢子后，即可進(jìn)行檢測(cè)。
菌塊柱制備把上述培養(yǎng)基按每平皿25ml倒好冷卻后，即可用打孔器打出瓊脂柱，然后，在每個(gè)柱面上接種各個(gè)待選菌株，置95%濕度下適溫培養(yǎng)2～4天。
檢測(cè)培養(yǎng)基及檢測(cè)平板制備(NH4)2SO40.1～0.5%，KH2PO40.02～0.1%，MgSO40.01～0.05%，酵母膏0.005～0.02%，天門(mén)冬素0.005～0.015%麥芽糖1～3%，洗過(guò)瓊脂2.5～3.0%。將上述藥物(除麥芽糖和瓊脂外)以蒸餾水配制后，每250ml三角瓶盛100ml，滅菌備用。倒平板前才加麥芽糖和瓊脂溶化，冷至50℃時(shí)加入指示菌液5～10ml，混勻后，立即倒入消毒過(guò)的平板里，100ml/個(gè)，冷凝。
瓊脂柱檢測(cè)篩選取已生長(zhǎng)好的單菌落瓊脂柱或菌塊瓊脂柱置平板上，28℃培養(yǎng)8～18小時(shí)，即可在瓊脂柱四周看到不同直徑的生長(zhǎng)圈，以菌落直徑和生長(zhǎng)圈直徑的比值挑選較優(yōu)者進(jìn)行重復(fù)篩選。復(fù)篩后，為了進(jìn)一步觀察菌株特征，可選擇若干個(gè)較優(yōu)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。
三、發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選法取不同來(lái)源的原料設(shè)計(jì)成不同培養(yǎng)基配方，一般可同時(shí)做50個(gè)組合，接入工廠常規(guī)生產(chǎn)菌種后搖培，取濾液用管碟法在平板上檢測(cè)，一個(gè)平板每次可同時(shí)測(cè)50個(gè)以上樣品，28～32℃，8～18小時(shí)，根據(jù)生長(zhǎng)圈大小厚薄而知不同配方的效果，從中挑選出最優(yōu)者付諸實(shí)用。
本發(fā)明不但能排除α-淀粉酶和葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的影響，而且方法簡(jiǎn)便快捷，在一般情況下兩人操作，1小時(shí)能貼1000個(gè)以上單菌落瓊脂柱，條件最適合時(shí)，6～8小時(shí)即可得到結(jié)果。
實(shí)施例
一、把一支產(chǎn)骯假絲酵母(candidautilis)試管斜面注入5～10ml無(wú)菌水，刮下菌苔后倒入冷至50℃以下的測(cè)試培養(yǎng)基中，傾至28×35cm消毒玻璃平板里，100ml/個(gè)，冷凝后，在它上面貼上50～100個(gè)糖化酶菌AS.3.4309(即UV-11，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所選育的糖化酶產(chǎn)生菌)分離的單菌落瓊脂柱，28～32℃經(jīng)8～18小時(shí)后，即從生產(chǎn)圈大小知道單菌落間的產(chǎn)酶量差異。以有差異菌落進(jìn)行搖培時(shí)，取濾液測(cè)定，其結(jié)果和單菌落瓊脂柱篩選時(shí)的情況是一致的。
二、在加入指示菌測(cè)試培養(yǎng)基平板上，用常規(guī)同化碳源法點(diǎn)上糖化酶，α-淀粉酶，葡糖苷轉(zhuǎn)移酶和蛋白酶粉劑，28°～32℃經(jīng)8～18小時(shí)即見(jiàn)點(diǎn)上糖化酶處有生長(zhǎng)圈出現(xiàn)，點(diǎn)上其他酶的地方都沒(méi)有生長(zhǎng)圈。
權(quán)利要求
1.一種快速篩選糖化酶產(chǎn)生菌的方法，在玻璃平板中貼上單菌落瓊脂柱，其特征在于平板中先注入混有指示菌的測(cè)試培養(yǎng)基，然后檢測(cè)挑選出最優(yōu)糖化酶產(chǎn)生菌最優(yōu)菌落。這些指示菌為產(chǎn)骯假絲酵母(candidautilis)，熱帶假絲酵母(candidatrapicalis)，解脂假絲酵母(candidaLipolytica)，乳酒假絲酵母(candidak-efyr)，克魯斯假絲酵母(candidakrusei)，朗必克假絲酵母(c-andidaIambica)，這些菌種保藏在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
2.按權(quán)利要求1所述的指示菌法篩選糖化酶菌的方法，其特征在于指示菌種的菌液濃度，在72型分光光度計(jì)測(cè)定時(shí)(510mm)，OD值為0.25～0.26。
3.按權(quán)利要求1所述的指示菌法篩選糖化酶產(chǎn)生菌的方法，其特征在于瓊脂柱培養(yǎng)基的組成為玉米粉1～5%，黃豆餅粉0.5～2%，麩皮0.1～0.5%，K2HPO40.02～0.1%，瓊脂1.5～2.0%;
4.按權(quán)利要求1所述的指示菌法篩選糖化酶菌的方法，其特征在于檢測(cè)培養(yǎng)基的組成為(NH4)2SO40.1～0.5%，KH2PO40.02～0.1%，MgSO40.01～0.05%，酵母膏0.005～0.02%，天門(mén)冬素0.005～0.015%，麥芽糖1～3%，洗過(guò)瓊脂2.5～3.0%。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用指示菌法平板快速篩選糖化酶產(chǎn)生菌的新方法。該方法采用產(chǎn)骯假絲酵母等為指示菌種，根據(jù)在等體積、相同養(yǎng)分含量的瓊脂柱上生長(zhǎng)的不同菌株生產(chǎn)性能不同，分泌在瓊脂柱里的糖分酶量也不一樣的原理，由對(duì)糖化酶敏感的指示菌所形成的生長(zhǎng)圈大小與菌落直徑的比值，篩選出優(yōu)秀菌株。該方法能夠在平板上區(qū)別大量單菌落瓊脂柱和檢測(cè)多個(gè)不同配方培養(yǎng)基發(fā)酵液的產(chǎn)酶量，又能排除α-淀粉酶和葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的影響，而且，設(shè)備和技術(shù)簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N1/16GK1039842SQ8810491
公開(kāi)日1990年2月21日 申請(qǐng)日期1988年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月4日
發(fā)明者郭維烈, 郭慶華 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所