本發(fā)明涉及一種菜籽蛋白糖基化修飾改性技術(shù)，尤其涉及一種復(fù)合物理場(chǎng)協(xié)同強(qiáng)化菜籽蛋白糖基化改性的方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界上主要油菜種植國(guó)家之一，每年因加工生產(chǎn)菜籽油而產(chǎn)生大約超過1000萬噸的菜籽餅粕副產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)含量可達(dá)30％～45％。菜籽蛋白的氨基酸組成平衡性好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)功效比值甚至優(yōu)于大豆蛋白，因此可作為一種潛在的優(yōu)良植物蛋白資源而被應(yīng)用于食品加工體系。

目前菜籽蛋白的提取主要采用堿提酸沉法，該法的成本較低，所得蛋白質(zhì)的純度較高，但強(qiáng)堿環(huán)境易使得蛋白質(zhì)變性，影響其功能性質(zhì)；另外菜籽蛋白呈現(xiàn)較為寬廣的等電點(diǎn)區(qū)間，具有兩個(gè)等電點(diǎn)，這也使得菜籽蛋白在較寬pH值范圍內(nèi)的溶解性較差，不利于其在食品加工中的應(yīng)用，因此國(guó)內(nèi)外研究者通過物理法、化學(xué)法和酶法對(duì)菜籽蛋白進(jìn)行改性以期來改善其功能性質(zhì)。從蛋白質(zhì)改性效果、蛋白質(zhì)利用率，產(chǎn)品的安全性及成本等角度來考慮，單一的物理法改性無法顯著改善菜籽蛋白的功能性質(zhì)，化學(xué)法改性存在一定的安全問題，而酶法改性的成本相對(duì)較高，因此選擇一種合適并具有可應(yīng)用前景的改性技術(shù)是擴(kuò)大菜籽蛋白在食品加工中應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。

糖基化改性是基于蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基和糖分子還原末端的羰基之間的羰氨反應(yīng)即美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction)，是一種無化學(xué)試劑，僅加熱即可反應(yīng)的綠色安全的蛋白質(zhì)分子修飾改性方法。蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化改性后，由于糖鏈含有一定量的羥基，同時(shí)空間上也可阻礙蛋白質(zhì)分子的聚集，因而可有效增加蛋白質(zhì)的持水性和溶解性，在一定程度上改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。另外也有研究表明美拉德反應(yīng)能夠產(chǎn)生抗氧化活性物質(zhì)，其抗氧化活性主要體現(xiàn)在還原力、清除自由基、螯合過渡金屬離子等方面，可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品保藏中，因此蛋白質(zhì)-糖接枝物作為一種優(yōu)良的多功能添加劑可廣泛應(yīng)用于多種食品加工體系中。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)分為干熱法和濕熱法，加熱的方式主要為水浴、油浴、加熱套和烘箱等，其能耗較高，反應(yīng)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，一般為幾小時(shí)到幾周，在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)糖基化反應(yīng)不易控制，易于生成Maillard反應(yīng)高級(jí)階段產(chǎn)物，影響產(chǎn)品的色澤。因此開發(fā)新型高效節(jié)能且可控性好的糖基化反應(yīng)技術(shù)是目前蛋白質(zhì)糖接枝修飾改性急需解決的問題。

本發(fā)明即是針對(duì)上述菜籽蛋白應(yīng)用和修飾改性中所存在的問題，以濕熱法糖基化為基礎(chǔ)，利用微波-超聲波復(fù)合物理場(chǎng)的協(xié)同作用對(duì)菜籽蛋白進(jìn)行糖基化修飾改性從而顯著改善菜籽蛋白的功能性質(zhì)，擴(kuò)展其在食品工業(yè)體系中的應(yīng)用范圍。該工藝技術(shù)與國(guó)內(nèi)外改性技術(shù)相比，其糖基化修飾改性的可控性強(qiáng)，可根據(jù)不同食品體系對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的需要進(jìn)行定向分子修飾，另外具有節(jié)能高效，綠色安全，工業(yè)化可行高等特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種復(fù)合物理場(chǎng)協(xié)同強(qiáng)化菜籽蛋白糖基化改性的方法，該改性方法條件溫和，可控性強(qiáng)，成本低廉，工業(yè)化可行性高。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的菜籽蛋白修飾改性的方法包括以下步驟：

1)菜籽蛋白的制備：

稱取菜籽餅粕粉，按1:8～1:15的比例加入去離子水，在55～65℃下攪拌提取1～3h，并保持pH值為9.0～9.5，然后將浸提液在8000～10000rpm下離心20～30min，取上清液用1～2mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0～6.5，經(jīng)離心后可得蛋白質(zhì)沉淀，再將所得上清液繼續(xù)用1～2mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3.5～4.5，離心后再次收集蛋白質(zhì)沉淀。將兩次離心所得蛋白質(zhì)沉淀混勻后加去離子水洗滌，調(diào)節(jié)pH值為7.0進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)冷凍干燥后可得菜籽蛋白。

2)菜籽蛋白溶液的配制：將步驟1)所制得的菜籽蛋白溶解于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 9.0)中配制成濃度為6～10mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，放置過夜，以使得菜籽蛋白充分水化。

3)蛋白質(zhì)-糖混合溶液的配制：按質(zhì)量比為1:(1～3)的比例將糖加入步驟2)所制得的菜籽蛋白溶液中，并在四通圓底燒瓶反應(yīng)器中充分?jǐn)嚢?0～20min，混合均勻。

4)微波-超聲波復(fù)合物理場(chǎng)協(xié)同處理：將步驟3)中所得糖與蛋白質(zhì)的混合液放入微波-超聲波協(xié)同合成反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)微波的功率為200～500W，超聲波的功率為100～300W，控制反應(yīng)體系的溫度在60～70℃，反應(yīng)時(shí)間為6～10min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。

5)離心分離：將經(jīng)步驟4)處理后的蛋白質(zhì)-糖混合溶液在轉(zhuǎn)速3000rpm～5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)和糖。

6)透析與干燥：將步驟5)所得上清液放入截留分子量為10kDa的透析袋中在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)干燥處理后可得糖基化菜籽蛋白產(chǎn)物。

進(jìn)一步地，所述菜籽餅粕粉的粒徑為80目以下。

進(jìn)一步地，所述糖為葡萄糖，乳糖，葡聚糖，麥芽糊精或可溶性淀粉。

進(jìn)一步地，所述步驟6)中的干燥為冷凍干燥，噴霧干燥或冷凍噴霧干燥。

本發(fā)明具有如下的有益效果：

1)通過微波-超聲波復(fù)合物理場(chǎng)的協(xié)同作用，改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與介電特性，降低反應(yīng)活化能，改變化學(xué)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，同時(shí)影響蛋白質(zhì)與糖反應(yīng)的微環(huán)境，從而可在低溫常壓下高效完成菜籽蛋白的糖基化反應(yīng)并顯著改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。

2)在微波-超聲波協(xié)同復(fù)合作用下，利用微波快速加熱效應(yīng)和超聲波的機(jī)械攪拌與加速擴(kuò)散作用，可避免反應(yīng)體系出現(xiàn)局部高溫現(xiàn)象，使糖基化反應(yīng)更為均勻；同時(shí)微波的電磁場(chǎng)與超聲波的空穴作用會(huì)在反應(yīng)體系中形成超臨界高溫與高壓的微環(huán)境及界面濃縮現(xiàn)象，從而有力促進(jìn)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，縮短反應(yīng)時(shí)間，有效控制Maillard反應(yīng)高級(jí)階段產(chǎn)物的生成，從而避免傳統(tǒng)濕熱法下由于長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)高溫作用而產(chǎn)生褐變物質(zhì)，消除了色澤對(duì)產(chǎn)品的影響。但由于蛋白質(zhì)與多糖類大分子物質(zhì)在微波電磁場(chǎng)下會(huì)發(fā)生偏極化排列現(xiàn)象，從而易使得氫鍵，肽鍵等化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，造成蛋白質(zhì)水解而降低其功能特性，因此必須有效控制微波-超聲波復(fù)合物理場(chǎng)的功率與作用時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)可控性糖基化反應(yīng)。

3)本發(fā)明對(duì)蛋白質(zhì)-糖接枝反應(yīng)的可控性較強(qiáng)，可根據(jù)實(shí)際食品體系對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的需求來調(diào)控蛋白質(zhì)的糖接枝程度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定向分子修飾改性。

4)本發(fā)明將有力地促進(jìn)菜籽餅粕資源的開發(fā)利用，對(duì)緩解我國(guó)蛋白質(zhì)資源不足的現(xiàn)狀具有重要作用。

具體實(shí)施方式

圖1為反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)接枝度的影響曲線圖(反應(yīng)條件除了復(fù)合物理場(chǎng)處理時(shí)間不同之外，其余皆同實(shí)施例四)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：

稱取過80目的菜籽餅粕粉按1:10的比例加入去離子水，在60℃下攪拌提取2h，并保持pH值為9.5，然后將浸提液在8000rpm下離心20min，上清液用2M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，在轉(zhuǎn)速8000rpm下離心20min后可得到蛋白質(zhì)沉淀，再將所得上清液用2M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3.5，在轉(zhuǎn)速8000rpm下離心20min，再次收集蛋白質(zhì)沉淀。將兩次離心所得蛋白質(zhì)沉淀混勻后加入去離子水洗滌2次后再調(diào)節(jié)pH值為7.0進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)冷凍干燥后可得菜籽蛋白，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。將菜籽蛋白溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中配制成濃度為6mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅胖眠^夜，以使得菜籽蛋白充分水化。按質(zhì)量比為1:1的比例將葡聚糖加入菜籽蛋白溶液中，充分混合均勻后在60℃下攪拌反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。將處理后的蛋白質(zhì)-糖混合溶液在轉(zhuǎn)速5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)后，取2mL的上清液測(cè)定反應(yīng)后菜籽蛋白的接枝度和褐變程度分別為45.9％和0.926(OA_420nm)，再將上清液放入截留分子量為10kDa的透析袋中(，在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)冷凍干燥處理后可得菜籽蛋白糖基化產(chǎn)物。測(cè)定所得糖基化修飾改性菜籽蛋白的功能性質(zhì)，并與原樣菜籽蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其溶解度由11.4％提高至42.3％，乳化特性由5.31m²/g提高至7.7m²/g，乳化穩(wěn)定性由24.5min提高至30.5min，起泡性由20％提高至42％，泡沫穩(wěn)定性無顯著變化。

實(shí)施例二：

按實(shí)施例一制備菜籽蛋白并溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中配制成濃度為8mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅胖眠^夜，以使得菜籽蛋白充分水化。按質(zhì)量比為1:1的比例將葡聚糖(40kDa)加入菜籽蛋白溶液中，在四通圓底燒瓶中充分?jǐn)嚢?0min混合均勻后放入微波-超聲波協(xié)同合成反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)微波的功率為500W，控制反應(yīng)體系的溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為5min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。將處理后的蛋白質(zhì)-糖混合溶液在轉(zhuǎn)速5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)和糖后，取2mL的上清液測(cè)定反應(yīng)后菜籽蛋白的接枝度和褐變程度分別為54.6％和0.871(OA_420nm)，再將上清液放入透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa)在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)冷凍干燥處理后可得菜籽蛋白糖基化產(chǎn)物。測(cè)定糖基化修飾改性菜籽蛋白的功能性質(zhì)，并與原樣菜籽蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其溶解度由11.4％提高至48.1％，乳化特性由5.31m²/g提高至10.4m²/g，乳化穩(wěn)定性變化不顯著，起泡性由20％提高至44％，泡沫穩(wěn)定性由70％提高至80％。

實(shí)施例三：

按實(shí)施例一制備菜籽蛋白并溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中配制成濃度為8mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅胖眠^夜，以使得菜籽蛋白充分水化。按質(zhì)量比為1:1的比例將葡聚糖(40kDa)加入菜籽蛋白溶液中，在四通圓底燒瓶中充分?jǐn)嚢?0min混合均勻后放入微波-超聲波協(xié)同合成反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)超聲波的功率為300W，控制反應(yīng)體系的溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為30min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。將處理后的蛋白質(zhì)-糖混合溶液在轉(zhuǎn)速5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)和糖后，取2mL的上清液測(cè)定反應(yīng)后菜籽蛋白的接枝度和褐變程度分別為53.8％和0.761(OA_420nm)，再將上清液放入透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa)在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)干燥處理后可得菜籽蛋白糖基化產(chǎn)物。測(cè)定糖基化修飾改性菜籽蛋白的功能性質(zhì)，并與原樣菜籽蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其溶解度由11.4％提高至42.2％，乳化特性由5.31m²/g提高至12.3m²/g，乳化穩(wěn)定性由24.5min提高至25.1min，起泡性由20％提高至40％，泡沫穩(wěn)定性由70％提高至80％。

實(shí)施例四：

按實(shí)施例一制備菜籽蛋白并溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中配制成濃度為8mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，放置過夜，以使得菜籽蛋白充分水化。按質(zhì)量比為1:1的比例將葡聚糖(40kDa)加入菜籽蛋白溶液中，在四通圓底燒瓶中充分?jǐn)嚢?0min混合均勻后放入微波-超聲波協(xié)同合成反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)微波的功率為500W，超聲波的功率為300W，控制反應(yīng)體系的溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為5min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。將處理后的蛋白質(zhì)-糖混合溶液在轉(zhuǎn)速5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)和糖，取2mL的上清液測(cè)定反應(yīng)后菜籽蛋白的接枝度和褐變程度分別為59.6％和0.701(OA_420nm)，再將上清液放入透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa)在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)冷凍干燥處理后可得菜籽蛋白糖基化產(chǎn)物。測(cè)定糖基化修飾改性菜籽蛋白的功能性質(zhì)，并與原樣菜籽蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其溶解度由11.4％提高至50.2％，乳化特性由5.31m²/g提高至11.9m²/g，乳化穩(wěn)定性由24.5min提高至27.6min，起泡性由20％提高至42％，泡沫穩(wěn)定性由70％提高至80％。

實(shí)施例五：

按實(shí)施例一制備菜籽蛋白并溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中配制成濃度為8mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，放置過夜，以使得菜籽蛋白充分水化。按質(zhì)量比為1:1的比例將葡聚糖(40kDa)加入菜籽蛋白溶液中，在四通圓底燒瓶反應(yīng)器中充分?jǐn)嚢?0min混合均勻后放入微波～超聲波協(xié)同合成反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)微波的功率為500W，超聲波的功率為300W，控制反應(yīng)體系的溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為7min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。將處理后的蛋白質(zhì)～糖混合溶液在轉(zhuǎn)速5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)和糖，取2mL的上清液測(cè)定反應(yīng)后菜籽蛋白的接枝度和褐變程度分別為75.5％和0.751(OA_420nm)，再將上清液放入透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa)在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)干燥處理后可得菜籽蛋白糖基化產(chǎn)物。測(cè)定糖基化修飾改性菜籽蛋白的功能性質(zhì)，并與原樣菜籽蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其溶解度由11.4％提高至81.3％，乳化特性由5.31m²/g提高至18.7m²/g，乳化穩(wěn)定性由24.5min提高至30.3min，起泡性有20％提高至45％，泡沫穩(wěn)定性由70％提高至85％。

實(shí)施例六：

按實(shí)施例一制備菜籽蛋白并溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中配制成濃度為8mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，放置過夜，以使得菜籽蛋白充分水化。按質(zhì)量比為1:1的比例將葡聚糖(40kDa)加入菜籽蛋白溶液中，在四通圓底燒瓶反應(yīng)器中充分?jǐn)嚢?0min混合均勻后放入微波～超聲波協(xié)同合成反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)微波的功率為500W，超聲波的功率為300W，控制反應(yīng)體系的溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為10min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫。將處理后的蛋白質(zhì)～糖混合溶液在轉(zhuǎn)速5000rpm下離心以除去不溶性蛋白質(zhì)和糖，取2mL的上清液測(cè)定反應(yīng)后菜籽蛋白的接枝度和褐變程度分別為66.3％和0.831(OA_420nm)，再將上清液放入透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa)在去離子水中透析10～20h以除去無機(jī)鹽，經(jīng)干燥處理后可得菜籽蛋白糖基化產(chǎn)r物。測(cè)定糖基化修飾改性菜籽蛋白的功能性質(zhì)，并與原樣菜籽蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其溶解度由11.4％提高至80％，乳化特性由5.31m²/g提高至10.9m²/g，乳化穩(wěn)定性由24.5min提高至25.2min，起泡性由20％提高至43％，泡沫穩(wěn)定性由70％提高至80％。

從實(shí)施例可以看出，復(fù)合物理場(chǎng)具有較好的協(xié)同效果。從圖1可以看出，復(fù)合物理場(chǎng)的協(xié)同作用跟其作用時(shí)間有關(guān)，在5min以內(nèi)，接枝率隨著作用時(shí)間的增加而降低，在5min后開始隨時(shí)間的增加而顯著增加并在7min時(shí)達(dá)到峰值，超過7min則反而開始降低。