一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開(kāi)了一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒，所述試劑盒包括盒體、盒蓋和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊，所述襯墊上設(shè)有小孔，裝有SatTBTVdF引物的試劑管、裝有TVDVaRNAdF引物的試劑管、裝有SatTBTVdR引物的試劑管、裝有TVDVaRNAdR引物的試劑管、裝有CTAB緩沖液的試劑管、裝有PCR擴(kuò)增試劑的試劑管、裝有瓊脂糖凝膠的試劑管被設(shè)置在所述小孔內(nèi)，盒蓋頂部?jī)?nèi)側(cè)設(shè)有檢測(cè)對(duì)比卡。本實(shí)用新型在對(duì)煙草叢頂病多種病原物復(fù)合侵染煙草和傳毒介體昆蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，具有高效、靈敏、特異且低成本的特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)煙草及傳毒介體昆蟲(chóng)中是否含有SAT-TBTV和TVDVaRNA病原物；本實(shí)用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
【專利說(shuō)明】—種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]煙草叢頂病(tobacco bushy top disease)于1957年在津巴布韋北部的春克旺里煙區(qū)首次發(fā)生，此后爆發(fā)流行并造成很大損失。煙草叢頂病在我國(guó)的云南早有出現(xiàn)，但長(zhǎng)期以來(lái)由于該病僅為零星發(fā)生，未對(duì)煙草生產(chǎn)造成重大損失而被忽視，直到1993年在云南保山、大理等地大面積爆發(fā)流行后才逐漸受到關(guān)注。此后該病在我國(guó)云南中西部煙區(qū)大規(guī)模流行，給部分煙區(qū)造成毀滅性損失，發(fā)病區(qū)域除涉及保山、大理、楚雄3個(gè)州市外，昆明、玉溪、紅河、思茅、文山、西雙版納及怒江等州市也有煙草叢頂病零星發(fā)生。截止2001年，云南省累計(jì)發(fā)病面積達(dá)51300 hm2，其中8700 hm2絕收，1400 hm2改種，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)2.1億元，煙草叢頂病已經(jīng)成為云南省自20世紀(jì)90年代以來(lái)唯一導(dǎo)致大面積絕產(chǎn)的煙草病害。
[0003]煙草叢頂病由幽影病毒屬的煙草叢頂病毒(Tobacco bushy top virus,SAT-TBTV)和黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬的煙草扭脈病毒(TbAacco vein distorting
狀，TVDV)復(fù)合侵染引起。另外在云南煙草叢頂病的感病煙株中常檢測(cè)到一條伴隨TBTV出現(xiàn)且其分子量約為1000 bp的小分子RNA，根據(jù)目前的研究推測(cè)該小分子RNA為TBTV的衛(wèi)星RNA,稱其為煙草叢頂病毒類似衛(wèi)星RNA (Tobacco bushy top virus satellite-likeRNA, Sat-TBTV)0 2010年又從感染煙草叢頂病的植株中檢測(cè)到了大小為3.0kbp與煙草叢頂病相關(guān)的RNA，第九次國(guó)際病毒分類報(bào)告中將其命名為TVDVaRNA (Tobacco veindistorting virus-associated RNA, TVDVaRNA)。TBTV 基因組不含編碼外殼蛋白的基因，它可通過(guò)摩擦接種傳播，在輔助病毒TVDV的幫助下可通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播。目前的研究結(jié)果表明，自然條件下表現(xiàn)典型煙草叢頂病癥狀的煙株，都由上述4種病原物復(fù)合侵染引起，而云南煙草叢頂病發(fā)病區(qū)很多未表現(xiàn)癥狀的煙株，也經(jīng)常能夠檢測(cè)到TVDV及TVDVaRNA。迄今，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特別有效的植物病毒病防治藥劑，因此除了嚴(yán)防蚜蟲(chóng)的傳播外加強(qiáng)煙株及蚜蟲(chóng)中煙草叢頂病病原復(fù)合體的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，對(duì)于準(zhǔn)確診斷病害和防止病毒病的傳播流行具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，是生產(chǎn)上對(duì)煙草叢頂病進(jìn)行綜合治理的重要措施之一。
[0004]通常檢測(cè)鑒定植物病毒的方法有生物學(xué)、電鏡技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)單，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，還受到季節(jié)、環(huán)境以及病毒種類等方面的影響，因此很難用于煙草叢頂病病原物復(fù)合體的準(zhǔn)確診斷。由于TBTV、Sat-TBTV和TVDVaRNA不編碼外殼蛋白，沒(méi)有粒體結(jié)構(gòu)，電鏡技術(shù)和常規(guī)血清學(xué)技術(shù)無(wú)法用于這3種煙草叢頂病病原物的檢測(cè)鑒定；電鏡技術(shù)僅能觀察到病毒的粒體形態(tài)，很難準(zhǔn)確鑒定出病毒種類，且設(shè)備昂貴，不適合作為TVDV檢測(cè)的普通方法。TVDV的基因組能夠編碼外殼蛋白，病毒具有完整的粒體結(jié)構(gòu)，可以用來(lái)作為抗原制備抗血清，但由于TVDV的分布局限于韌皮部，且病毒含量較低，不易直接從病株里提純到病毒粒子，因此目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)TVDV抗血清方面的報(bào)道。分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是RT-PCR技術(shù)不但操作簡(jiǎn)單，而且特異性強(qiáng)、靈敏度高，但普通RT-PCR方法每次只能檢測(cè)一種病毒，對(duì)于多種病原物復(fù)合侵染的情況，則需要針對(duì)每種病毒進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，工作量大，成本高，且效率低。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒,在對(duì)煙草叢頂病多種病原物復(fù)合侵染煙草和傳毒介體昆蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有高效、靈敏、特異且低成本的特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)煙草及傳毒介體昆蟲(chóng)中是否含有SAT-TBTV、TVDVaRNA病原物；本實(shí)用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒，所述試劑盒包括盒體1、盒蓋2和設(shè)置在盒體I內(nèi)的襯墊3，所述襯墊3上設(shè)有小孔，裝有SatTBTVdF引物的試劑管4、裝有TVDVaRNAdF引物的試劑管5、裝有SatTBTVdR引物的試劑管6、裝有TVDVaRNAdR引物的試劑管7、裝有CTAB緩沖液的試劑管8、裝有PCR擴(kuò)增試劑的試劑管9、裝有瓊脂糖凝膠的試劑管10被設(shè)置在所述小孔內(nèi)，盒蓋2頂部?jī)?nèi)側(cè)設(shè)有檢測(cè)對(duì)比卡11。
[0007]所述襯墊3上設(shè)有7個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊3上分成兩排平行排列，一排為4個(gè)小孔，另外一排為3個(gè)小孔。
[0008]其中所述的SatTBTVdF引物為Sat-TBTV的正向引物，引物序列如下:
[0009]SatTBTVdF: 5，-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3，，
[0010]其中所述的TVD VaRNAdF引物為TVDVaRNA的正向引物，引物序列如下:
[0011]TVDVaRNAdF: 5，-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3，，
[0012]其中所述的SatTBTVdR引物為Sat-TBTV的反向引物，引物序列如下:
[0013]SatTBTVdR: 5，-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3，，
[0014]其中所述的TVDVaRNAdR引物為TVDVaRNA的反向引物，引物序列如下:
[0015]TVDVaRNAdR:5’ -TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-S’，其中，TVDVdR:5’ -CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’ 中的 R=A 或 G ;
[0016]CTAB 緩沖液由質(zhì)量百分比為 2% CTAB,2% PVP-40，pH 8.0 的 100 mMTris-HCl,1.4 M NaCl,20mM EDTA組成混合液，最后根據(jù)混合溶液的體積加入0.2%巰基乙醇、
[0017]PCR 擴(kuò)增試劑為 15 KL,由 0.6 M-L 的 PrimeScript I Step Enzyme Mix、7.5 M-L的 2X I Step Buffer、各 0.4μL 的 10 μ M 正反向引物 SatTBTVdF 和 SatTBTVdR、各 0.3μL 的10 μ M正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH20和0.5 μL的RNA模板混合而成。
[0018]瓊脂糖凝膠為1.0%的瓊脂糖凝膠，在配好的凝膠中每100 ml加入5μL Gold View染色劑混勻。
[0019]檢測(cè)對(duì)比卡11的信息如下:
[0020]

【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有SatTBTVdF弓I物的試劑管(4 )、裝有TVDVaRNAdF弓丨物的試劑管(5 )、裝有SatTBTVdR弓丨物的試劑管(6 )、裝有TVDVaRNAdR引物的試劑管(7)、裝有CTAB緩沖液的試劑管(8)、裝有PCR擴(kuò)增試劑的試劑管(9)、裝有瓊脂糖凝膠的試劑管(10)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)，盒蓋(2)頂部?jī)?nèi)側(cè)設(shè)有檢測(cè)對(duì)比卡(11)。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)SAT-TBTV和TVDVaRNA的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(3)上設(shè)有7個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列，一排為4個(gè)小孔，另外一排為3個(gè)小孔。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK203976798SQ201420240794
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】楊櫟, 梁建軍 申請(qǐng)人:楊櫟