一組特異性識(shí)別北京基因型結(jié)核菌株抗原的核酸適配子及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一組能特異結(jié)合結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株表面脂糖——甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖（Mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM）的核酸適配子及其用途。該組適配子是針對(duì)ManLAM的小分子單鏈DNA（ssDNA），其核苷酸序列如SEQ ID No.1-5所示。該小分子單鏈DNA具有與單克隆抗體類(lèi)似功能，能直接并特異結(jié)合ManLAM。采用酶聯(lián)寡核苷酸分析(Enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)法，能在2小時(shí)內(nèi)快速有效地檢測(cè)肺結(jié)核、肺外結(jié)核等病人血清中的ManLAM抗原，并且直接識(shí)別活動(dòng)性肺結(jié)核病人痰液中的ManLAM抗原，對(duì)ManLAM抗原的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.035μg/mL。該適配子制備簡(jiǎn)單，成本低，可作為一種有效的新型結(jié)核早期及潛伏感染的結(jié)核分枝桿菌抗原診斷試劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一組特異性識(shí)別北京基因型結(jié)核菌株抗原的核酸適配子及 其應(yīng)用
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)中的SELEX技術(shù)（指 數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）制備能夠與北京基因型結(jié)核菌株表面脂糖一一甘露糖修飾的 脂阿拉伯甘露聚糖（Mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM)高特異性和高親和力的核 酸適配子，可用于制備診斷北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis)感染機(jī)體所引起的疾病，涉 及到全身多個(gè)臟器。目前，全球約1/3的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年約有200萬(wàn) 人死于結(jié)核感染（Dye C SS，Dolin P PV，Raviglione MC. Consensus statement. Global burden of tuberculosis:estimated incidence, prevalence, and mortality by country. W. H.0.Global Surveillance and Monitoring Project.J Am Med Assoc. 1999. 282:677-686.)，結(jié)核病正嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。目前我國(guó)結(jié)核感染的現(xiàn)狀為： 每年新增結(jié)核病患達(dá)130萬(wàn)之多，每年因結(jié)核死亡的人數(shù)有15萬(wàn)，結(jié)核疫情呈現(xiàn)出患病率 高、死亡率高、耐藥率高、年遞減率低的現(xiàn)狀，疫情嚴(yán)重度僅次于印度（全國(guó)結(jié)核病流行病 學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告.中華結(jié)核和呼吸雜 志? 2002. 25(1) : 3-7.)。
[0003] 能夠引起結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌種類(lèi)很多。結(jié)核分枝桿菌中有一類(lèi)具有相似遺 傳背景的北京基因型菌株。這類(lèi)菌株的分布廣泛，在世界各地都發(fā)現(xiàn)有北京基因型菌株的 流行，并造成多次爆發(fā)流行，人們提出北京基因型菌株可能是傳播更迅速、致病性更強(qiáng)、以 及耐藥形成更容易的一類(lèi)菌株。而中國(guó)是一個(gè)結(jié)核病高發(fā)病率的國(guó)家，也是北京基因型 菌株高比例的地區(qū)。對(duì)北京基因型菌株分布的調(diào)查報(bào)道認(rèn)為，在我國(guó)北方，北京基因型菌 株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，可以達(dá)到70%至80%，國(guó)外甚至報(bào)道北京地區(qū)達(dá)到90% (van Soolingen D，Qian L，de Haas PE,et al. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia. J Clin Microbiol，1995,33,3234-3238.)， 在我國(guó)其他城市北京基因型菌株也有不同程度的流行。例如，寧夏（67%)、上海（89%) (Li WM, Wang SM,Pei XY，et al. [DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, Guangdong and Ningxia]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2003, 24, 381-384. ;Shen GM，Zha J，Xu L，et al. [Evaluation of the mycobacterial interspersed repetitive units typing as a practical approach in molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2005, 28, 292-296.)。因而，在我國(guó)北京基因型菌株的防治研究意義顯得尤為重要。而 對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷是一個(gè)亟待解決的難題。
[0004] 目前國(guó)際上針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)技術(shù)分為三類(lèi)：細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)診 斷、分子生物學(xué)診斷。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，包括痰涂片抗酸染色以及痰 培養(yǎng)，已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用多年，是公認(rèn)的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)性診斷，痰涂片 抗酸染色可能漏診痰涂片陰性的患者，而痰培養(yǎng)又耗時(shí)長(zhǎng)，需2-8周時(shí)間，因而其使用 也受到極大的限制（Martinez A，Balandrano S，Parissi A，et al. Evaluation of new external quality assessment guidelines involving random blinded rechecking of acid-fast bacilli smears in a pilot project setting in Mexico. Int J Tuberc Lung Dis. 2005. 9(3) : 301-305.)。免疫學(xué)診斷結(jié)核分枝桿菌的方法有結(jié)核菌素試驗(yàn)以及特異性 T淋巴細(xì)胞IFN-y釋放試驗(yàn)。這兩者檢測(cè)結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)核菌素試驗(yàn)是利 用純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD)誘導(dǎo)的遲發(fā)型反應(yīng)來(lái)對(duì)T細(xì)胞的功 能進(jìn)行檢測(cè)，但PH)中大多數(shù)蛋白成分是各種分枝桿菌所共有成分，尤其是接種BCG后與感 染結(jié)核分枝桿菌后，這兩者很難區(qū)別，該方法存在特異性差的弊端。所以建立一種新型檢測(cè) 方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分支桿菌早期診斷，對(duì)于控制結(jié)核病疫情意義重大。分子生物學(xué)診斷主要 包括DNA探針?lè)?、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR)、定量PCR、以及近年 發(fā)展的基于PCR的XpertMTB/RIF的方法，具有靈敏和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，其中，PCR的方法主 要針對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因組中一段保守序列，通過(guò)PCR的方法能快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌， 但存在一定假陰性和假陽(yáng)性，如可能因所檢測(cè)的變異而導(dǎo)致假陰性，且成本高，需要較貴儀 器設(shè)備，難以在流行區(qū)或貧困地區(qū)普及，而且無(wú)法區(qū)分是活菌還是死菌，因此不能用于化療 后監(jiān)測(cè)。
[0005] 核酸適配子（aptamer)是一種生物祀分子的人工單鏈寡核苷酸配體，通過(guò) SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)從隨機(jī)單 鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得。核酸適配子篩選的基本步驟如下：設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)單鏈寡核 苷酸文庫(kù)；將文庫(kù)與靶標(biāo)共孵育，使文庫(kù)中能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的寡核苷酸與靶標(biāo)形成復(fù) 合物，分離復(fù)合物并洗脫寡核苷酸，以洗脫的寡核苷酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備成新的單 鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，開(kāi)始下一輪篩選；重復(fù)數(shù)輪孵育_分離-擴(kuò)增，與靶標(biāo)高特異性和高 親和力結(jié)合的核酸序列將留在文庫(kù)中并被指數(shù)富集；對(duì)最后一輪篩選后制備的文庫(kù)進(jìn)行克 隆、測(cè)序，長(zhǎng)度及兩端序列與文庫(kù)相符的單鏈寡核苷酸序列即為核酸適配子；測(cè)定各核酸適 配子與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和力，選出能高特異性和高親和力結(jié)合靶標(biāo)者，即可應(yīng)用于 靶標(biāo)的檢測(cè)分析。
[0006] 核酸適配子的功能與抗體類(lèi)似，但與抗體相比具有許多優(yōu)點(diǎn)：①高特異性和高親 和力：核酸適配子能夠分辨出靶分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差別，親和力可強(qiáng)于天然配體；②靶標(biāo) 廣泛：從有機(jī)小分子、生物大分子到病毒顆粒、完整細(xì)胞等均可作為篩選核酸適配子的靶 標(biāo)；③穩(wěn)定性好：核酸適配子可長(zhǎng)期保存，人工合成而無(wú)批間差異，可在常溫下運(yùn)輸；④改 建和修飾容易：可在核酸適配子的特定部位進(jìn)行精確的標(biāo)記、修飾或核苷酸替換；⑤應(yīng)用 優(yōu)勢(shì)：核酸適配子無(wú)免疫原性，可在體內(nèi)反復(fù)使用；分子小，方便于體內(nèi)影像診斷和治療。 核酸適配子在人類(lèi)疾病的診斷方面顯示出良好的應(yīng)用前景。在微生物檢測(cè)方面，特別是對(duì) 一些致病性細(xì)菌或病毒的研宄，雖然未知其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能及這些物質(zhì)的表位，但也可將其 作為靶物質(zhì)，通過(guò)SELEX過(guò)程篩選到與其對(duì)應(yīng)的適配子，用以檢測(cè)靶物質(zhì)，目前已成為該領(lǐng) 域的研宄探索熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明主要致力于結(jié)核分枝桿菌早期和潛伏感染的ManLAM抗原的檢測(cè)，篩選針 對(duì)結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株表面特異性ManLAM的單鏈DNA(ssDNA)適配子，并用酶聯(lián) 寡核苷酸分析法（Enzyme-linked oligonucleotide assay, ELONA)檢測(cè)血清中的 ManLAM 抗原以及痰液中的結(jié)核桿菌，達(dá)到診斷結(jié)核感染的目的。
[0008] 甘露糖加帽的脂阿拉伯甘露聚糖（mannose-capped lipoarabinom-anan, ManLAM) 是結(jié)核分枝桿菌（包括牛結(jié)核分枝桿菌）和BCG等慢生長(zhǎng)的分枝桿菌細(xì)胞壁表面特 有的月旨糖(Nigou J, Gilleron M, Puzo G. Lipoarabinomannans:from structure to biosynthesis. Biochimie. 2003, 85 (1-2) : 153-166.)。然而 ManLAM 在不同的分枝桿 菌中其結(jié)構(gòu)仍然存在著差異（Rojas M, Barrera LF, Puzo G, Garcia LF. Differential induction of apoptosis by virulent Mycobacterium tuberculosis in resistant and susceptible murine macrophages:role of nitric oxide and mycobacterial products. J Immunol. 1997, 159(3) : 1352-1361.)，針對(duì)不同菌種間ManLAM結(jié)構(gòu)的差異，本發(fā)明設(shè)計(jì)并 篩選出了與臨床上主要流行的結(jié)核分枝桿菌北京株表面的ManLAM特異性結(jié)合的適配子。
[0009] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一組能特異性地、高親和力地結(jié)合結(jié)核分枝 桿菌北京基因型菌株ManLAM抗原（以下簡(jiǎn)稱(chēng)ManLAM)的ssDNA適配子的一級(jí)序列，如SEQ ID No. 1-5 所示。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供在上述DNA適配子5'端或3'端進(jìn)行生物素、FITC 或地高辛化學(xué)修飾的適配子。
[0011] 本發(fā)明的目的還在于提供上述DNA適配子在制備檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌北京基因型 菌株ManLAM抗原診斷試劑以及結(jié)核病感染診斷試劑中的應(yīng)用。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0013] 本發(fā)明通過(guò)隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)以及引物的構(gòu)建、SELEX篩選、PCR擴(kuò)增、親和力測(cè) 定、體外不同細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)等得到具有與結(jié)核分支桿菌ManLAM脂糖抗原的高特異性、高親 和力的DNA適配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1-5所示。通過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該適配子 可以靈敏地檢測(cè)血清或體液中ManLAM脂糖抗原，準(zhǔn)確診斷結(jié)核病。
[0014] 本發(fā)明篩選并制備得到以ManLAM脂糖為靶標(biāo)的ssDNA適配子，該適配子能高親和 力、高特異性地與該蛋白結(jié)合。我們直接將該適配子運(yùn)用于臨床血清樣品和痰液標(biāo)本的檢 測(cè)，結(jié)果表明，無(wú)論是肺內(nèi)結(jié)核還是肺外結(jié)核（腸結(jié)核骨結(jié)核、體腔結(jié)核、腦膜結(jié)核、附睪結(jié) 核、淋巴結(jié)核），運(yùn)用該適配子均能快速有效檢測(cè)。相對(duì)于目前診斷結(jié)核感染的T-SP0T法， 該方法實(shí)施更為簡(jiǎn)單，無(wú)需分離患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC)。同時(shí)，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)上 檢測(cè)結(jié)核病人痰液細(xì)菌的抗酸染色靈敏度低的嚴(yán)重問(wèn)題，也克服了傳統(tǒng)上僅能檢測(cè)結(jié)核病 人血清中抗體，而不能檢測(cè)抗原的局限性，以及不能診斷窗口期早期感染的嚴(yán)重問(wèn)題，該方 法成本較少。此外，核酸適配子的功能與抗體類(lèi)似，因此在制備治療結(jié)核的藥物中也具潛在 的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明采用的基于適配子的EL0NA法與臨床現(xiàn)行結(jié)核診斷方法的不同優(yōu)缺點(diǎn) 比較見(jiàn)表1。
[0015] 表1 EL0NA與臨床現(xiàn)行結(jié)核診斷方法的比較
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 一組特異識(shí)別結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株表面甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖 的核酸適配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1-5所示。
2. 權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株表面甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露 聚糖的核酸適配子，其特征在于其5'端或3'端可以進(jìn)行生物素、FITC或地高辛化學(xué)修飾。
3. 權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株表面甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露 聚糖的核酸適配子在制備結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株表面甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露 聚糖抗原檢測(cè)試劑以及結(jié)核病感染診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK104450724SQ201410798757
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】章曉聯(lián), 唐曉磊 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)