檢測(cè)人類cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)人類CYP2C9和/或VKORC1基因多態(tài)性的試劑盒，包括有：針對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID NO:3所示的熒光檢測(cè)探針、針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID NO:6所示熒光檢測(cè)探針、和/或針對(duì)VKORC1基因G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID NO:9所示的熒光檢測(cè)探針。本發(fā)明采用特異性的引物、熒光探針及優(yōu)化的檢測(cè)體系，既可單獨(dú)也可同步檢測(cè)上述三種基因型，且檢測(cè)線性廣，以25μL檢測(cè)體系可檢測(cè)2ng-600ng人基因組DNA；準(zhǔn)確性高，檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法100％一致。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)人類CYP2C9和VK0RC1基因多態(tài)性的探針及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于一種用于檢測(cè)人類CYP2C9和VKORCl基 因多態(tài)性的探針和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 華法林（Warfarin)屬香豆素類口服抗凝血藥，是用于治療血液栓塞性疾?。ㄈ缧?臟瓣膜置換術(shù)后、心房顫動(dòng)、靜脈血栓形成及肺梗塞等）的一線藥物。CYP2C9是華法林的 主要代謝酶，其SNP的某些基因型會(huì)造成CYP2C9的酶活下降，以致華法林在體內(nèi)的清除減 慢。華法林是通過(guò)抑制維生素環(huán)氧化物還原酶（VKOR)，使維生素 K參與的凝血因子II、W、 IX、X合成受阻，從而發(fā)揮抗凝作用，因此VKOR的一個(gè)重要亞單位基因（VKORCl)的SNP亦 會(huì)造成個(gè)體對(duì)華法林的敏感性存在明顯差異。加之華法林的治療窗較窄，很少的劑量變化 也可能導(dǎo)致血栓或出血，因此在臨床應(yīng)用上，相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)可作為個(gè)性 化治療的給藥依據(jù)。
[0003] 目前，對(duì)基因多態(tài)性的檢測(cè)分析技術(shù)方法主要包括：ARMS熒光PCR法，基因測(cè)序、 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（RFLP)、基因芯片等方法。這些方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，尚 有待改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化。
[0004] 1、ARMS 突光 PCR 法：擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（Amplification refractory mutation system，ARMS)利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理， 設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3'堿基與模板配對(duì)時(shí)才 能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測(cè)出基因突變。
[0005] 2、直接測(cè)序：Sanger測(cè)序法因?yàn)榭梢宰x到DNA每個(gè)堿基的變化，目前被認(rèn)為是檢 測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)方法。缺點(diǎn)是測(cè)序步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高， 檢測(cè)周期長(zhǎng)，多限于在科研單位進(jìn)行，大多數(shù)醫(yī)院都無(wú)法獨(dú)立完成檢測(cè)，較難形成標(biāo)準(zhǔn)化操 作、適合臨床單位應(yīng)用的體外診斷產(chǎn)品。
[0006] 3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（RFLP):該方法成本低，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低，突變 基因的檢出限在5?10%。但是，勞動(dòng)強(qiáng)度稍大、需專業(yè)的技術(shù)人員、不適于高通量檢測(cè)和 大規(guī)模臨床應(yīng)用。
[0007] 4.基因芯片法：該方法是將探針固定于支持物上，如玻片或膜，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增 出靶基因，再通過(guò)雜交手段進(jìn)行芯片雜交，應(yīng)用儀器進(jìn)行結(jié)果判讀。該方法可以進(jìn)行高密度 基因檢測(cè)，但成本高、操作繁瑣、檢測(cè)流程相對(duì)較長(zhǎng)，在市場(chǎng)推廣上將受到一定限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種特異性高的檢測(cè)人類CYP2C9和VKORCl基因多態(tài) 性試劑盒，該試劑盒既能實(shí)現(xiàn)CYP2C9基因*2 (C430T)位點(diǎn)、*3 (A1075C)位點(diǎn)和VKORCl基 因（G-1639A)的基因型的單獨(dú)檢測(cè)，又能實(shí)現(xiàn)上述三個(gè)位點(diǎn)的并行檢測(cè)。
[0009] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0010] 一種檢測(cè)人類CYP2C9和/或VKORCl基因多態(tài)性的試劑盒，包括有：針對(duì)CYP2C9 基因 C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID N0:3所示的熒光檢測(cè)探針、針對(duì)CYP2C9 基因 A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID N0:6所示熒光檢測(cè)探針、和/或針對(duì) VKORCl基因 G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID N0:9所示的熒光檢測(cè)探針。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述針對(duì)CYP2C9基因 C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物的堿基組成如 SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述針對(duì)CYP2C9基因 A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物的堿基組成 如 SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO: 5 所示。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述針對(duì)VKORCl基因擴(kuò)增引物的堿基組成如SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO:8 所示。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有UNG酶。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)人類CYP2C9和/或VK0RC1基因多態(tài)性的試劑盒，包 括有針對(duì)CYP2C9基因 C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2以及堿基組成 如SEQ ID N0:3所示的熒光檢測(cè)探針、針對(duì)CYP2C9基因 A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5以及堿基組成如SEQ ID NO: 6所示熒光檢測(cè)探針、和針對(duì)VK0RC1基因 G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8以及堿基組成如SEQ ID N0:9所示 的熒光檢測(cè)探針。
[0016] 本發(fā)明的另一目的還提供用于檢測(cè)人類CYP2C9和/或VK0RC1基因多態(tài)性的檢測(cè) 探針。
[0017] 具體技術(shù)方案如下。
[0018] 用于檢測(cè)人類CYP2C9和/或VK0RC1基因多態(tài)性的檢測(cè)探針，包括有針對(duì)CYP2C9 基因 C430T位點(diǎn)的堿基組成如SEQ ID NO: 3所示的探針、針對(duì)CYP2C9基因 A1075C位點(diǎn)的堿 基組成如SEQ ID N0:6所示探針、和/或針對(duì)VK0RC1基因 G-1639A位點(diǎn)的堿基組成如SEQ ID N0:9所示的探針。
[0019] 本發(fā)明采用的具體技術(shù)原理是在每個(gè)檢測(cè)靶點(diǎn)的PCR體系中，加入一對(duì)非等量的 特異性引物和一條覆蓋SNP位點(diǎn)的熒光探針。首先通過(guò)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增出含檢測(cè)位點(diǎn)的單 鏈寡核苷酸靶序列，其后運(yùn)行熔解曲線熒光采集程序。從低溫到高溫的熔解過(guò)程中，熒光探 針與單鏈靶序列形成的雜交產(chǎn)物從互補(bǔ)配對(duì)到解鏈變性，期間的熒光值變化記錄為熔解曲 線。將熔解曲線對(duì)溫度作一階負(fù)導(dǎo)數(shù)可獲得雜交產(chǎn)物的熔解峰圖，并計(jì)算出相應(yīng)的熔點(diǎn)（Tm 值）。由于SNP位點(diǎn)的堿基變化不同，導(dǎo)致靶序列與探針的匹配程度不一，因此雜交產(chǎn)物的 溫度穩(wěn)定性及熔解行為各有差異。若單鏈靶序列中只有1種等位基因，并與探針完全匹配， 則只有1個(gè)熔解峰，其Tm值較高；反之，單一熔解峰的Tm值較低；若靶序列含有2種等位基 因，則會(huì)出現(xiàn)2個(gè)熔解峰，Tm值分別與兩種純合等位基因的熔解峰的Tm值一致。通過(guò)對(duì)熔 解峰圖的分析可對(duì)檢測(cè)位點(diǎn)基因型進(jìn)行判讀。
[0020] 本發(fā)明的主要有益效果如下：
[0021] (1)采用特異性的引物、熒光探針及優(yōu)化的檢測(cè)體系，既可單獨(dú)也可同步檢測(cè) CYP2C9基因*2(C430T)位點(diǎn)、*3(A1075C)位點(diǎn)和VK0RC1基因（G-1639A)的基因型，且檢測(cè) 線性廣，以25 μ L檢測(cè)體系可檢測(cè)2ng-600ng人基因組DNA ;準(zhǔn)確性高，檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn) 測(cè)序方法100 %-致。
[0022] (2)閉管操作，檢測(cè)速度快，檢測(cè)過(guò)程只需90分鐘即可完成。
[0023] (3)抗污染，試劑盒中含有UNG酶，可以消除由于PCR產(chǎn)物導(dǎo)致的污染。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為實(shí)施例2對(duì)CYP2C9*2 (C430T)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不同基因型所檢測(cè)結(jié)果示意 圖。
[0025] 圖2為實(shí)施例3對(duì)CYP2C9*3 (A1075C)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不同基因型所檢測(cè)結(jié)果示意 圖。
[0026] 圖3為實(shí)施例4對(duì)VKORCl基因（G-1639A)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不同基因型所檢測(cè)結(jié)果 示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的 實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0028] 除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí) 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"和/或"包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所 列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。
[0029] 實(shí)施例 1CYP2C9 基因 *2 (C430T)位點(diǎn)、*3 (A1075C)位點(diǎn)和 VK0RC1 基因（G-1639A) 檢測(cè)試劑盒
[0030] 本實(shí)施例針對(duì)CYP2C9基因*2 (C430T)位點(diǎn)、*3 (A1075C)位點(diǎn)和VK0RC1基因 (G-1639A)設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，及含有特異性引物和特異性探針的試劑盒。具體組成 如下。
[0031] 表1人類CYP2C9和VK0RC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的引物和探針序列
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)人類CYP2C9和/或VK0RC1基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括有：針 對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID NO: 3所示的熒光檢測(cè)探針、針 對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID NO: 6所示熒光檢測(cè)探針、和/ 或針對(duì)VK0RC1基因G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和堿基組成如SEQ ID N0:9所示的熒光檢測(cè) 探針。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的擴(kuò) 增引物的堿基組成如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò) 增引物的堿基組成如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)VK0RC1基因擴(kuò)增引物的堿基 組成如 SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括有針對(duì)CYP2C9基因 C430T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2以及堿基組成如SEQ ID N0:3所示的 熒光檢測(cè)探針、針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的擴(kuò)增引物SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以 及堿基組成如SEQ ID N0:6所示熒光檢測(cè)探針、和針對(duì)VK0RC1基因G-1639A位點(diǎn)的擴(kuò)增引 物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8以及堿基組成如SEQ ID NO:9所示的熒光檢測(cè)探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，還包括有UNG酶。
7. 用于檢測(cè)人類CYP2C9和/或VK0RC1基因多態(tài)性的檢測(cè)探針，其特征在于，包括有針 對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn)的堿基組成如SEQ ID NO: 3所示的探針、針對(duì)CYP2C9基因A1075C 位點(diǎn)的堿基組成如SEQ ID N0:6所示探針、和/或針對(duì)VK0RC1基因G-1639A位點(diǎn)的堿基組 成如SEQ ID N0:9所示的探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)探針，其特征在于，包括有針對(duì)CYP2C9基因C430T位點(diǎn) 的堿基組成如SEQ ID NO: 3所示的探針、針對(duì)CYP2C9基因A1075C位點(diǎn)的堿基組成如SEQ ID N0:6所示探針、和針對(duì)VK0RC1基因G-1639A位點(diǎn)的堿基組成如SEQ ID N0:9所示的探 針。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104404163SQ201410790374
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】曾慶, 張中滿, 張亞旭, 張穎芬 申請(qǐng)人:廣州好芝生物科技有限公司