用于飼喂黃粉蟲的益生聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于飼喂黃粉蟲的益生聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵劑及其制備方法，本發(fā)明提供了一種用于飼喂黃粉蟲的菌劑，其活性成分為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricu)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。本發(fā)明采用四聯(lián)益生菌飼喂黃粉蟲，通過分析死亡率、體長、頭寬和百蟲重等指標(biāo)，判斷益生菌劑對黃粉蟲生長的促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)四聯(lián)益生菌可以提高存活率，促進(jìn)黃粉蟲生長。
【專利說明】用于飼喂黃粉蟲的益生聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及用于飼喂黃粉蟲的益生聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵劑及其 制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來抗生素濫用引起了社會廣發(fā)關(guān)注，研發(fā)抗生素替代品刻不容緩（ChenY andSchwackW, 2014)。益生菌被認(rèn)為是抗生素理想的替代品。所謂益生菌，是定植于人 體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性 有益微生物的總稱（SylviaHetal.，2013.)。雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)是定 植于人和動物腸道內(nèi)的一類重要生理細(xì)菌，對人和動物機(jī)體發(fā)揮著生物屏障、營養(yǎng)、免疫、 抗腫瘤、改善代謝等多種生理作用；丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum)可抑制腸道有害 菌，促進(jìn)有益菌生長，減少腸內(nèi)氨、胺含量，產(chǎn)生如維生素K等多種維生素；地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)，能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚 糖酶、抗菌肽等蛋白以及一些次級代謝產(chǎn)物。益生菌發(fā)酵物的優(yōu)劣與發(fā)酵所使用的微生物 菌種及發(fā)酵工藝息息相關(guān)。相對于純培養(yǎng)，聯(lián)菌培養(yǎng)更有利于提高活菌數(shù)及達(dá)到益生效果。
[0003] 黃粉蟲（Tenebriomolitor)又叫面包蟲，在昆蟲分類學(xué)上隸屬于鞘翅目，擬步行 蟲科，粉甲蟲屬（擬步行蟲屬），屬于農(nóng)業(yè)倉儲害蟲。隨著倉儲條件的改善，自然發(fā)生的黃粉 蟲害已經(jīng)消失。由于黃粉蟲蛋白質(zhì)含量高,并且富含多種生物活性物質(zhì)，近年來多家企業(yè)啟 動開發(fā)黃粉蟲在飼料、食品和醫(yī)藥保健品等方面的用途。黃粉蟲高密度飼養(yǎng)過程中，易發(fā)生 軟腐病，該病為消化道感染細(xì)菌所致，表現(xiàn)為蟲體發(fā)黑，傳染性強(qiáng)，死亡率高，無有效治療方 法。在飼料中添加抗生素可以降低發(fā)病率。但長期添加抗生素，不僅使耐藥菌株越來越多， 而且影響黃粉蟲體內(nèi)正常菌群，導(dǎo)致免疫功能下降；此外，抗生素殘留也降低黃粉蟲產(chǎn)品質(zhì) 量。益生菌發(fā)酵物可以作為飼料添加劑替代抗生素，是解決上述問題的理想方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于飼喂黃粉蟲的菌劑。
[0005] 本發(fā)明提供的菌劑，其活性成分為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)、丁酸 梭菌（Clostridiumbutyricu)、地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱桿菌 枯草亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)。
[0006] 上述菌劑的有效總活菌數(shù)大于等于108CFU/mL;其中，所述兩歧雙歧桿菌、所述丁 酸梭菌、所述地衣芽孢桿菌和所述枯草芽孢桿菌枯草亞種的有效活菌數(shù)的比例為1 :1. 25 : 1. 25 ： 1. 5〇
[0007]上述菌劑的有效總活菌數(shù)為 10lclCFU/mL、10nCFU/mL、1014CFU/mL或 1015CFU/mL;
[0008]所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)CGMCCNO. 1. 5091、所述丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)為丁 酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)CGMCCNO. 1.336、所述地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis) 為地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis)CGMCCNO. 1.813、所述枯草芽抱桿菌枯草亞 種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)為枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillussubtilis subsp.subtilis)CGMCCNO. 1. 1731。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備菌劑的方法。
[0010] 本發(fā)明提供的方法，為如下1)或2):
[0011] 1)包括如下步驟：將兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)、丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)、地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱桿菌枯草 亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)種子液混勻，接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵 培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到菌劑；
[0012] 所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由固態(tài)基質(zhì)和含有生長因子的MRS液體培養(yǎng)基按照lg: 0. 5mL的比例混合，得到的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0013] 所述固態(tài)基質(zhì)為玉米糠、豆柏、豆渣（榨豆?jié){后的殘渣）或麥麩；所述固態(tài)基質(zhì)具 體為麥麩；
[0014] 所述生長因子為西紅柿汁或低聚果糖；所述生長因子具體為西紅柿汁；
[0015]2)包括如下步驟：將兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)、丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)、地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱桿菌枯草 亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)種子液混勻，接種到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵 培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到菌劑；
[0016] 所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為含有生長因子的MRS液體培養(yǎng)基。
[0017] 上述方法中，所述菌劑的有效總活菌數(shù)大于等于108CFU/mL;其中，所述兩歧雙歧 桿菌、所述丁酸梭菌、所述地衣芽孢桿菌和所述枯草芽孢桿菌枯草亞種的有效活菌數(shù)的比 例為 1 :1. 25 :1. 25 :1. 5。
[0018] 上述方法中，所述菌劑的有效總活菌數(shù)為KTCFU/mUlOUCFU/mUK^CFU/mL或 1015CFU/mL；
[0019] 所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為麥麩和含有西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基按照lg:0. 5mL的 比例混合，得到的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0020] 所述含有西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基由MRS液體培養(yǎng)基和西紅柿汁組成，所述西 紅柿汁在所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為50-100ml/l;所述西紅柿汁在所述液態(tài)發(fā)酵 培養(yǎng)基中的終濃度具體為50mL/L。
[0021] 上述方法中，所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)種子液中菌體含量為 107CFU/mL；
[0022] 所述丁酸梭菌（Clostridiumbutyricu)種子液中菌體含量為107CFU/mL;
[0023] 所述地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)種子液中菌體含量為107CFU/mL;
[0024] 所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)種子液中菌 體含量為107CFU/mL;
[0025] 所述各種子液混勻均為等體積混勻；
[0026] 所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)種子液具體為將所述兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacteriumbifidum)在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液；
[0027] 所述丁酸梭菌（Clostridiumbutyricu)種子液具體為將所述丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液；
[0028] 所述地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)種子液具體為將所述地衣芽孢桿 菌（Bacilluslicheniformis)在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液；
[0029] 所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)種子液具體 為將所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)在MRS液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液。
[0030] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-38°C，時間為18-36小時；
[0031]所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)CGMCCNO. 1. 5091、所述丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)為丁 酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)CGMCCNO. 1.336、所述地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis) 為地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis)CGMCCNO. 1.813、所述枯草芽抱桿菌枯草亞 種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)為枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillussubtilis subsp.subtilis)CGMCCNO. 1. 1731。
[0032] 由上述方法制備的菌劑也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0033] 上述菌劑或上述的菌劑在提高黃粉蟲生物量中和/或降低黃粉蟲死亡率的應(yīng)用 也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0034] 所述提高黃粉蟲生物量具體體現(xiàn)在提高百蟲重。
[0035] 本發(fā)明采用四聯(lián)益生菌飼喂黃粉蟲，通過分析死亡率、體長、頭寬和百蟲重等指 標(biāo)，判斷益生菌劑對黃粉蟲生長的促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)四聯(lián)益生菌可以提高黃粉蟲存活率，促進(jìn) 其生長。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為利用MRS培養(yǎng)基純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)在24小時獲得活菌數(shù)對比
[0037](均值土標(biāo)準(zhǔn)差，單因素方差分析，n= 3, ****P〈0. 0001)
[0038] 圖2為四聯(lián)菌混合培養(yǎng)在PTYG和MRS上生長曲線的對比（三次獨(dú)立重復(fù)，取中值 作圖）
[0039] 圖3為外加生長因子對四聯(lián)菌生長的作用（A:西紅柿汁；B:低聚果糖）（均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤差；單因素方差分析；n= 3 ;*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001，##P〈0. 0001)
[0040] 圖4為固態(tài)基質(zhì)對四聯(lián)菌生長的影響（三次獨(dú)立重復(fù)，取中值作圖）
[0041](中值 土標(biāo)準(zhǔn)誤差；單因素方差分析；n=3 ;*P〈0. 05, **P〈0. 01，***P〈0. 001，** **P〈0. 0001)
[0042] 圖5為不同溫度對四聯(lián)菌存活率的影響（三次獨(dú)立重復(fù)，取中值作圖）
[0043] 圖6為模擬消化液對四聯(lián)菌存活率的影響（均值土標(biāo)準(zhǔn)差；n= 3)
[0044] 圖7為混合益生菌對黃粉蟲存活率和百蟲重的影響（實驗室研究規(guī)模）（均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤差；n= 6 ;非配對t, **p〈0. 01，***p〈0. 001)
[0045] 圖8為混合益生菌對黃粉蟲存活率和百蟲重的影響（工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模）（均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤差；單因素方差分析；n= 3 ;*p〈0. 05)

【具體實施方式】
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，部分如 下：
[0048] 1、菌種
[0049]兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091(Bifidobacteriumbifidum)(購自廣東凱威 生物科技有限公司）；丁酸梭菌CGMCCNO. 1.336(Clostridiumbutyricu)、地衣芽孢 桿菌CGMCCNO. 1. 813(Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱桿菌枯草亞種CGMCC NO. 1. 1731(Bacillussubtilissubsp.subtilis)均購自CGMCC。
[0050] 2、培養(yǎng)基
[0051] MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，肉浸膏5g，酵母提取物10g，K2HP042g，檸檬酸 二胺 2g，乙酸鈉 5g，吐溫-801mL，MgS04 ? 7H20 0? 58g，MnS04 ? 4H20 0? 25g，pH6. 2 ?6. 4,水 1000mL。121°C濕熱滅菌 15min。。
[0052]PTYG培養(yǎng)基：葡萄糖10g，酵母提取物10g，大豆蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，0. 1%刃 天青l(xiāng)mL，吐溫-801mL，鹽溶液40mL，L-半胱氨酸鹽酸0? 5g，PH值6. 8?7. 0,水1000mL。 113°C濕熱滅菌30min。
[0053]無機(jī)鹽溶液：無水CaCl20. 2g，K2HP041. 0g，MgS04. 7H20 0? 48g，KH2P041. 0g， NaHC0310. 0g，NaCl2. 0g，水 1000mL。
[0054] 3、模擬動物消化道液
[0055] 模擬胃液：濃鹽酸16. 4mL，胃蛋白酶10g，加水?dāng)噭蚝蠖ㄈ葜?000mL，PH值1. 2,過 濾除菌。
[0056] 模擬腸液：磷酸二氫鉀6. 8g，加水500mL溶解；另取胰酶10g加水溶解，將兩液混 合，加水定容至lOOOmL，PH值6. 8,過濾除菌。
[0057] 模擬膽汁溶液：7號膽鹽溶于蒸餾水中，濃度為1% (g/mL)，過濾除菌。
[0058] 實施例1、四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物的制備
[0059] -、培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化
[0060] 1、混合培養(yǎng)和純培養(yǎng)
[0061] 大多數(shù)微生物發(fā)酵采用采用純培養(yǎng)技術(shù)，但這不一定是獲得高活菌數(shù)最佳的方 法。本研究采用MRS液體培養(yǎng)基，通過測量活菌數(shù)（NLB)對比了四聯(lián)菌混合培養(yǎng)和純培養(yǎng) 得到的活菌數(shù)。
[0062] 活化：兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢桿菌 CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢桿菌枯草亞種CGMCCNO. 1. 1731分別按接種量1% (v/v)接種 于10mL無菌MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)36h，分別得到各菌種子液（107CFU/mL)。
[0063] 混合培養(yǎng)：將上述單菌種活化兩代后種子液各取lmL混合，按接種量1 % (v/v)接 種于30mLMRS液體培養(yǎng)基中，37 °C厭氧培養(yǎng)24h，收集四聯(lián)菌培養(yǎng)液。
[0064] 純培養(yǎng)：將上述單菌種活化兩代后各自按照接種量1 % (v/v)接種于30mL無菌 PTYG培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，分別收集各種菌的培養(yǎng)液。
[0065] 采用傾注法結(jié)合雙層平板計數(shù)法檢測四聯(lián)菌培養(yǎng)液和各種菌單獨(dú)培養(yǎng)培養(yǎng)液中 活菌數(shù)（NLB)，結(jié)果如圖1所示，純培養(yǎng)獲得活菌數(shù)均約為107CFU/mL，聯(lián)菌混合培養(yǎng)獲得總 活菌數(shù)為l〇8CFU/mL。
[0066] 因此，與純培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)可以獲得更高的活菌數(shù)。.
[0067] 2、培養(yǎng)基優(yōu)化
[0068]PTYG和MRS是兩種常用的益生菌培養(yǎng)基，接下來本研究對比了兩種培養(yǎng)基在四聯(lián) 菌混合發(fā)酵中的效果，選擇獲得高活菌數(shù)的培養(yǎng)基用于后繼優(yōu)化研究。
[0069] 活化：兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢桿菌 CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢桿菌枯草亞種CGMCCNO. 1. 1731分別按接種量1% (v/v)接 種于10mL無菌PTYG(或MRS)液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)36h，得到各菌種子液（107CFU/ mL)。
[0070] 混合培養(yǎng)：將上述單菌種活化兩代后種子液各取lmL混合，按接種量1 % (v/v)分 別接種于30mL無菌PTYG(或MRS)液體培養(yǎng)基中，37 °C厭氧培養(yǎng)，分別收集四聯(lián)菌培養(yǎng)液 (PTYG)和四聯(lián)菌培養(yǎng)液（MRS)。
[0071] 繪制72小時生長曲線，結(jié)果如圖2所示，四聯(lián)菌在MRS培養(yǎng)基上取得了活菌數(shù) 3. 32*109CFU/mL，相當(dāng)于在PTYG培養(yǎng)基上的活菌數(shù)的兩倍。不僅如此，四聯(lián)菌在MRS培養(yǎng) 基上的延遲期僅為4小時，穩(wěn)定期達(dá)到10小時；而在PTYG培養(yǎng)基延遲期為8小時，而穩(wěn)定 期僅為6小時，這些數(shù)據(jù)說明MRS培養(yǎng)基更適合于四聯(lián)菌混合培養(yǎng)。
[0072]3、液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
[0073] 西紅柿汁：熟透的西紅柿（普通西紅柿）洗凈后用榨汁機(jī)打成西紅柿汁，液體用雙 層紗布過濾。
[0074] 含有西紅柿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入西紅柿汁，得到含有西紅 柿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，且西紅柿汁在含有西紅柿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度分別為0、20、30、 50、70、100mL/L;
[0075] 含有低聚果糖的發(fā)酵培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入低聚果糖（鄭州誠旺化工 責(zé)任有限公司EINECS號：200-333-3)到含有低聚果糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，且低聚果糖在含有低 聚果糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度分別為〇、2. 5、5、7. 5、10、15g/L;
[0076] 將兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢桿菌 CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢桿菌枯草亞種CGMCCNO. 1. 1731種子液（107CFU/mL)各取lmL 混合，按接種量1 % (v/v)分別接種于30mL含有西紅柿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基和含有低聚果糖的 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)，分別收集四聯(lián)菌培養(yǎng)液（西紅柿）和四聯(lián)菌培養(yǎng)液（MRS)，即 為四聯(lián)益生菌劑。
[0077] 其中，四聯(lián)菌培養(yǎng)液（西紅柿）和四聯(lián)菌培養(yǎng)液（MRS)中兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacteriumbifidum)CGMCCN0. 1.5091、丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)CGMCC NO. 1. 336、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)CGMCCNO. 1.813 和枯草芽孢桿菌枯 草亞種（Bacillussubtilissubsp.subtilis)CGMCCNO. 1. 1731 的有效活菌數(shù)配比為 1 : 1. 25:1. 25:1. 5。
[0078] 檢測四聯(lián)菌培養(yǎng)液中活菌數(shù)（NLB)，結(jié)果如圖3所示，可以看出，與不添加西紅柿 和低聚果糖的MRS培養(yǎng)基相比，添加這些物質(zhì)均可促進(jìn)益生菌生長，添加后，四聯(lián)菌活菌數(shù) 達(dá)到101(lCFU/mL，比對照組增加了 10倍（109CFU/mL)，認(rèn)為西紅柿和低聚果糖可作為益生菌 生長的生長因子。
[0079] 進(jìn)一步分析能獲得最高活菌數(shù)的最低的添加量，當(dāng)西紅柿汁添加量為70mL/L，獲 得最高活菌數(shù)5. 31*101(lCFU/mL;低聚果糖添加量10g/L，取得最高活菌數(shù)1. 02*101(lCFU/mL。 所以西紅柿汁效果優(yōu)于低聚果糖。
[0080] 另外，還將西紅柿汁和低聚果糖混合添加在MRS液體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別 為70mL/L和10g/L，接種四聯(lián)菌，培養(yǎng)，獲得的活菌數(shù)結(jié)果與單獨(dú)西紅柿汁添加量為70mL/L 無顯著差異。
[0081] 因此，選擇西紅柿汁用作促生長因子，用于四聯(lián)菌培養(yǎng)。
[0082] 西紅柿汁添加量50、70和100mL/L，活菌數(shù)差異不顯著，所以為了節(jié)省工業(yè)化生產(chǎn) 成本，50mL/L西紅柿汁添加到MRS培養(yǎng)基用于四聯(lián)菌混合發(fā)酵為最優(yōu)的添加量。
[0083] 因此，最佳的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為含有50mL/l西紅柿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0084]4、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
[0085] 含有玉米糠的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將玉米糠為固態(tài)基質(zhì)，按照lg固態(tài)基質(zhì)/0. 5mL液 體培養(yǎng)基的比例向固態(tài)基質(zhì)上澆注含有50mL/L西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基，使固態(tài)基質(zhì)濕 潤但無液體流出，得到含有玉米糠的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0086] 含有麥麩的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將麥麩為固態(tài)基質(zhì)，按照lg固態(tài)基質(zhì)/〇. 5mL液體培 養(yǎng)基的比例向固態(tài)基質(zhì)上澆注含有50mL/L西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基，使固態(tài)基質(zhì)濕潤但 無液體流出，得到含有麥麩的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0087] 含有豆柏的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將豆柏為固態(tài)基質(zhì)，按照lg固態(tài)基質(zhì)/0. 5mL液體培 養(yǎng)基的比例向固態(tài)基質(zhì)上澆注含有50mL/L西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基，使固態(tài)基質(zhì)濕潤但 無液體流出，得到含有豆柏的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0088] 含有豆渣的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將豆渣為固態(tài)基質(zhì)，按照lg固態(tài)基質(zhì)/0. 5mL液體培 養(yǎng)基的比例向固態(tài)基質(zhì)上澆注含有50mL/L西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基，使固態(tài)基質(zhì)濕潤但 無液體流出，得到含有豆渣的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0089] 各取2mL兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢桿 菌CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢桿菌枯草亞種CGMCCNO. 1. 1731種子液（菌的含量107CFU/ mL)混合后均勻，按照0. 5% (v/w)接種在20g上述各種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，37°C厭氧培養(yǎng) 24h。以含有50mL/L西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基液態(tài)發(fā)酵為對照。
[0090] 結(jié)果如圖4所示，所有的固態(tài)發(fā)酵均取得了優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵的結(jié)果，對照得到的 活菌數(shù)為3. 63*101(1 ;四種基質(zhì)分別取得了活菌數(shù)如下：含有玉米糠基質(zhì)獲得的活菌數(shù) 為2. 31*1014CFU/g(g是基質(zhì)，即每g基質(zhì)獲得多少活菌）、含有豆柏基質(zhì)獲得的活菌數(shù)為 1. 28*10nCFU/g、含有豆渣基質(zhì)獲得的活菌數(shù)為1. 64*1015CFU/g、含有麥麩基質(zhì)獲得的活菌 數(shù)為3.93*1014CFU/g。四種固態(tài)基質(zhì)取得了活菌數(shù)差異顯著，說明不同的基質(zhì)對四聯(lián)菌發(fā)酵 效果不同。豆渣取得了最高活菌數(shù)，但由于很難購買，所以不適合作為工業(yè)化生產(chǎn)的原料。 玉米糠和麥麩取得了類似結(jié)果，但麥麩價格低于玉米糠。所以麥麩被選用作為固態(tài)發(fā)酵基 質(zhì)。
[0091] 因此，最佳的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為含有麥麩的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0092] 二、四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物的制備
[0093] 通過上述一的實驗，采用最佳的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵四聯(lián)菌，具體如下：
[0094] 各取3mL兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢 桿菌CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢桿菌枯草亞種CGMCCNO. 1. 1731的種子液（含活菌數(shù)約 107CFU/mL，等體積混合）混合后，取lOmL均勻接種在200g含有麥麩的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上 (即接種量〇. 5%v/w)，37°C厭氧培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)產(chǎn)物（培養(yǎng)皿中的全部物質(zhì)），即為四 聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物，即為四聯(lián)益生菌劑。
[0095] 檢測四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物的總活菌數(shù)，為6.12*1013CFU/g。
[0096] 四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物中兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)CGMCCNO. 1. 5091、 丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)CGMCCNO. 1.336、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)CGMCCNO. 1.813 和枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillussubtilissubsp. subtilis)CGMCCNO. 1. 1731 的有效活菌數(shù)配比為 1:1. 25:1. 25:1. 5。
[0097] 三、四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物性質(zhì)的檢測
[0098] 1、四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物的熱穩(wěn)定性及儲藏穩(wěn)定性
[0099] 將200g上述二制備的活菌數(shù)為6. 12*1013CFU/g四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物裝入真空塑料 袋。分別放入4°C，25°C和30°C，每個溫度放入三袋，放置30天。每六天取樣測量活菌數(shù)。 活菌數(shù)的三個重復(fù)值的中間值用于分析作圖。
[0100] 結(jié)果如圖5所示，第30天的活菌數(shù)如下：保存于4°C1.75*10nCFU/g，保存于 25°C4. 53*109CFU/g，保存于30°C9. 26*106CFU/g。雖然經(jīng)過30天的保存，三個溫度下活菌 數(shù)都有所下降，但4°C下活菌數(shù)僅降低了兩個數(shù)量級，說明四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物可以在4°C下 長時間保存。
[0101] 益生菌制劑標(biāo)準(zhǔn)為活菌數(shù)高于l〇6CFU/g，所以獲得的四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物在25°C下 保存30天，還高于上述標(biāo)準(zhǔn)。而四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物在30°C下，活菌數(shù)迅速下降至106。
[0102] 基于以上數(shù)據(jù)，四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物可以在低于25°C條件下運(yùn)輸和儲存30天，與 4 °C相比，這極大的降低了運(yùn)輸和儲存成本。
[0103] 2、四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物在模擬動物胃腸環(huán)境中性質(zhì)檢測
[0104] 將上述二制備的70g活菌數(shù)為1. 45*1014CFU/g四聯(lián)菌固態(tài)發(fā)酵物置于200mL無 菌水中，容器為三角瓶（內(nèi)含玻璃珠），180r/min搖床處理，30min，37°C，制備成四聯(lián)菌菌懸 液，分別按①、②、③、④處理后，14000g離心5min，棄上清，分別對菌體進(jìn)行活菌計數(shù)：
[0105] ①10mL菌懸液注入40mL模擬胃液，180r/min搖床處理，lh，37°C。
[0106] ②10mL菌懸液注入40mL模擬膽汁溶液，180r/min搖床處理，30min，37°C。
[0107] ③10mL菌懸液注入40mL模擬腸液，180r/min搖床處理，45min，37°C。
[0108] ④10mL菌懸液注入40mL模擬胃液，180r/min搖床處理比，，371：，1400(^離心 5min，棄上清；沉淀溶于10mL無菌水，注入40mL模擬膽汁溶液，180r/min搖床處理30min， 同上離心；沉淀溶于10mL無菌水，注入40mL模擬腸液中，180r/min搖床處理45min，同上離 心。
[0109] 結(jié)果如圖6所示，采用不同的模擬消化液處理四聯(lián)菌后，存活率差別很大；當(dāng)采 用模擬胃液處理1小時后，四聯(lián)菌活菌數(shù)降至4. 3*109CFU/g;模擬膽汁溶液處理30min 后，活菌數(shù)下降到3. 15X10nCFU/g;模擬腸液處理45min后，活菌數(shù)有所上升，達(dá)到 2. 29X1014CFU/g;經(jīng)過消化道模擬實驗，即先后經(jīng)過模擬胃液處理1小時、模擬膽汁溶液處 理30分鐘，最后模擬腸液處理45分鐘，活菌數(shù)為9. 17*1012CFU/g，高于菌劑要求106CFU/g。
[0110] 以上數(shù)據(jù)說明，四聯(lián)益生菌劑在達(dá)到動物腸道后，仍然保持活性，可以發(fā)揮作用。
[0111] 實施例2、四聯(lián)益生菌劑在提高黃粉蟲（Tenebriomolitoris)生物量中的應(yīng)用
[0112] 1、實驗室規(guī)模研究方法
[0113] 黃粉蟲為河北科技師范保存，本研究使用2400條五齡幼蟲（孵出后約25天），分 成12組，每組200頭，每組總重量基本一致，約7g。培養(yǎng)于15cm培養(yǎng)皿中。溫度25°C，相 對濕度55-65%。
[0114] 12組隨機(jī)編號為1-12:
[0115] 四聯(lián)菌組：1_6組飼喂四聯(lián)菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，將四聯(lián)菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物重懸于10mL 無菌水中，均勻噴灑于飼養(yǎng)黃粉蟲的培養(yǎng)皿內(nèi)，每四天一次。
[0116] 對照組：7_12組飼喂等劑量無菌水作為對照。
[0117] 四聯(lián)菌液體發(fā)酵產(chǎn)物制備：將2mL兩歧雙歧桿菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭 菌CGMCCN0. 1.336、地衣芽孢桿菌CGMCCN0. 1.813和枯草芽孢桿菌枯草亞種CGMCC NO. 1. 1731的種子液（接種量1% (v/v))混合后，接種在100mL含有50mL/L西紅柿汁的MRS 液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵24小時，收集發(fā)酵產(chǎn)物，離心，收集沉淀，得到四聯(lián)菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。用 10mL無菌水懸起沉淀，均勻噴灑黃粉蟲，每四天一次。
[0118] 發(fā)現(xiàn)病蟲或死蟲，撿出。20天后，測量死亡率、蟲體長、頭寬和百蟲重指標(biāo)。計算方 法如下
[0119] 發(fā)現(xiàn)病蟲或死蟲，撿出。20天后，測量死亡率、蟲體長、頭寬和百蟲重指標(biāo)。
[0120] 死亡率=(200-皿中剩余蟲頭數(shù)）/200*100% ;
[0121] 蟲體長和頭寬，將水域預(yù)熱至65°C，黃粉蟲迅速放入水中殺死，使用游標(biāo)卡尺測量 蟲體長和頭寬，每組隨機(jī)選取十頭黃粉蟲，測量后均值用于分析。
[0122] 百蟲重：由于黃粉蟲個體體重較輕，所以稱取100頭黃粉蟲總質(zhì)量來反應(yīng)其生長 情況，隨機(jī)選取100頭，使用天平進(jìn)行稱重，每組重復(fù)三次取平均值用于分析。
[0123] 實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。
[0124] 結(jié)果如表1和圖7所示，經(jīng)過20天的飼喂后，黃粉蟲死亡率從4. 75% (對照組） 降低至1. 17% (四聯(lián)菌組），體長和頭寬沒有顯著變化，但百蟲重增加了 0. 5g(四聯(lián)菌組為 9. 02g)。不僅如此，干物質(zhì)（指除去全部水分后物質(zhì)的重量）增加了近0.83%。以上數(shù)據(jù) 表明，飼喂四聯(lián)益生菌可以提高黃粉蟲生物量。
[0125] 表1為黃粉蟲作為動物飼料原料的關(guān)鍵營養(yǎng)成分分析
[0126]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于飼喂黃粉蟲的菌劑，其活性成分為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricu)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)和 枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的菌劑，其特征在于：所述菌劑的有效總活菌數(shù)大于等于 108CFU/mL;其中，所述兩歧雙歧桿菌、所述丁酸梭菌、所述地衣芽孢桿菌和所述枯草芽孢桿 菌枯草亞種的有效活菌數(shù)的比例為1 :1. 25 :1. 25 :1. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的菌劑，其特征在于：所述兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)CGMCC NO. 1.5091、 所述丁 酸梭菌（Clostridium butyricu)為丁 酸梭菌（Clostridium butyricu)CGMCC NO. 1.336、所述地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)為地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)CGMCC NO. 1.813、所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)為枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)CGMCC NO. 1. 1731。
4. 一種制備權(quán)利要求1-3中任一所述的菌劑的方法，為如下1)或2): 1) 將兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricu)、 地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)和枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)種子液混勻，接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到 菌劑； 所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由固態(tài)基質(zhì)和含有生長因子的MRS液體培養(yǎng)基按照lg :0. 5mL的 比例混合，得到的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基； 所述固態(tài)基質(zhì)為玉米糠、豆柏、豆渣或麥麩；所述固態(tài)基質(zhì)具體為麥麩； 所述生長因子為西紅柿汁或低聚果糖；所述生長因子具體為西紅柿汁； 2) 將兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricu)、 地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)和枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)種子液混勻，接種到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到 菌劑； 所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為含有生長因子的MRS液體培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于： 所述菌劑的有效總活菌數(shù)大于等于108CFU/mL;其中，所述兩歧雙歧桿菌、所述丁酸 梭菌、所述地衣芽孢桿菌和所述枯草芽孢桿菌枯草亞種的有效活菌數(shù)的比例為1 :1. 25 :1. 25 ： 1. 5〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于： 所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為麥麩和含有西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基按照lg :0. 5mL的比例 混合，得到的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基； 所述含有西紅柿汁的MRS液體培養(yǎng)基由MRS液體培養(yǎng)基和西紅柿汁組成，所述西紅柿 汁在所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為50-100mL/L ;所述西紅柿汁在所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 基中的終濃度具體為50mL/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)種子液中菌體含量為107CFU/mL ; 所述丁酸梭菌（Clostridium butyricu)種子液中菌體含量為107CFU/mL ; 所述地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)種子液中菌體含量為107CFU/mL; 所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)種子液中菌體含 量為 107CFU/mL ; 所述各種子液混勻均為等體積混勻； 所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)種子液具體為將所述兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液； 所述丁酸梭菌（Clostridium butyricu)種子液具體為將所述丁酸梭菌（Clostridium butyricu)在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液； 所述地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)種子液具體為將所述地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液； 所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)種子液具體為將 所述枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)在MRS液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，得到種子液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于： 所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-38°C，時間為18-36小時； 所述兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum) CGMCC NO. 1. 5091、所述丁 酸梭菌（Clostridium butyricu)為丁 酸梭菌 (Clostridium butyricu)CGMCC NO. 1.336、所述地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis) 為地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)CGMCC NO. 1.813、所述枯草芽抱桿菌枯草亞 種（Bacillus subtilis subsp. subtilis)為枯草芽抱桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis)CGMCC NO. 1. 1731。
9. 由權(quán)利要求4-8中任一所述方法制備的菌劑。
10. 權(quán)利要求1-3中任一所述菌劑或權(quán)利要求9所述的菌劑在提高黃粉蟲生物量中和 /或降低黃粉蟲死亡率的應(yīng)用。 所述提商黃粉蟲生物量具體體現(xiàn)在提商百蟲重。
【文檔編號】C12N1/20GK104342391SQ201410586164
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】張瑾, 張帆, 李紅強(qiáng), 胡鐵鋒 申請人:河北科技師范學(xué)院