用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組和試劑盒。本發(fā)明的引物探針組的核酸序列如SEQ ID NO：1-12所示。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒包括主反應(yīng)液混合物和引物探針組，其核酸序列如SEQ ID NO：1-6所示，其中，SEQ ID NO：1-2所示的序列作為公共引物，用于對(duì)瘧原蟲的檢測(cè)，SEQ ID NO：3-6所示的序列作為探針，分別用于對(duì)惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲進(jìn)行分型檢測(cè)。本發(fā)明的試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)條件高度一致，大大提高檢測(cè)效率，保證了單重、雙重、三重、四重的反應(yīng)環(huán)境更均一、更穩(wěn)定、更高效，能簡(jiǎn)便快速對(duì)惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲分型鑒別。
【專利說明】用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物 探針組和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前瘧疾診斷的主要方法以鏡檢和膠體金為主。鏡檢不但需要操作者具有豐富的 經(jīng)驗(yàn)，而且有一定的局限性。當(dāng)原蟲密度較低（〈50個(gè)/μ 1血）時(shí)，靠鏡檢難以查到原蟲， 容易出現(xiàn)漏診；由于國內(nèi)少見三日瘧和卵形瘧，容易將兩者誤判為形態(tài)和臨床癥狀相似的 間日瘧和惡性瘧；當(dāng)發(fā)生瘧原蟲混合感染時(shí)，鏡檢不易將惡性瘧的環(huán)狀體或早期滋養(yǎng)體與 間日瘧的環(huán)狀體區(qū)分開，特別是用藥后蟲體形態(tài)發(fā)生變化，蟲種鑒別較難，容易出現(xiàn)誤診， 并只按單一瘧原蟲感染進(jìn)行治療，影響治療效果；鏡檢耗時(shí)，不適用于大量人群的篩查。因 此，傳統(tǒng)的"金標(biāo)準(zhǔn)"鏡檢法已不是瘧疾評(píng)價(jià)效率較高的診斷方法。瘧疾的膠體金雖然快速， 但對(duì)原蟲密度低的血樣也易漏診，而且僅能判斷惡性瘧感染，不能區(qū)分間日瘧、三日瘧和卵 形瘧感染以及混合感染。為了配合衛(wèi)生部和檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)等多部委制定的"中國消除瘧疾 行動(dòng)計(jì)劃（2010-2020年）"，有效控制輸入性瘧疾尤其是惡性瘧的傳入，檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)必須 在口岸加強(qiáng)對(duì)自東南亞、非洲等瘧疾高流行區(qū)返鄉(xiāng)人員瘧疾的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，迫切需要建立 瘧疾新型的快速、準(zhǔn)確和高效的檢測(cè)方法。
[0003] 多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是將PCR技術(shù)和多色熒光標(biāo)記探針相結(jié)合的先進(jìn)技術(shù)，該 方法具有快速、特異、靈敏、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，結(jié)合防污染技術(shù)處理，特別適合于大規(guī) 模、快速診斷的需求。該技術(shù)采用多色熒光對(duì)多條種特異性探針進(jìn)行標(biāo)記，配合多重PCR技 術(shù)，可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中對(duì)多個(gè)病原體同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，各色熒光的增長(zhǎng)信號(hào)與相應(yīng) PCR產(chǎn)物的增長(zhǎng)量成等比關(guān)系，并被自動(dòng)化熒光檢測(cè)儀收集，最后可通過分析熒光增長(zhǎng)曲線 達(dá)到診斷病毒類型的目的；反應(yīng)時(shí)間快，整個(gè)反應(yīng)約〇. 5小時(shí)-1小時(shí)完成；不需要檢測(cè)后 的電泳操作，減少了實(shí)驗(yàn)室污染。但目前尚未見多重?zé)晒釶CR用于瘧原蟲分型檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組 和試劑盒。該引物探針組和試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形 瘧原蟲快速簡(jiǎn)便的分型檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明的瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組，其核酸序列如SEQ ID NO :1-12 所示。所述分型包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型別。
[0006] 本發(fā)明的用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)試劑盒，包括主反應(yīng)液混合物，還包括引 物探針組，所述引物探針組的核酸序列如SEQ ID NO :1-6所示，所述核酸序列如SEQ ID NO: 1-2所示的序列作為公共引物，用于對(duì)瘧原蟲的檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ ID NO :3-6所示 的序列作為探針，分別用于對(duì)惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲進(jìn)行分型 檢測(cè)。
[0007] 具體如下：
[0008] SEQ ID NO :1 5'-TGTTGCAGTTAAAACGCTCG-3'
[0009] SEQ ID NO :2 5'-TCAATTTTGTTATTCCATGCTGT-3'
[0010] 惡性瘧原蟲（PF)的探針5端標(biāo)記FAM、3端標(biāo)記BHQ1，擴(kuò)增長(zhǎng)度為289bp，探針的 核酸序列如下：
[0011] SEQ ID NO :3PF-P 5'-FAM-CCGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGG-BHQl-3'
[0012] 間日瘧原蟲（PV)的探針5端標(biāo)記VIC，3端標(biāo)記BHQ2,擴(kuò)增長(zhǎng)度為264bp，探針的 核酸序列如下：
[0013] SEQ ID NO:4PV-P 5'-VIC-TGATACTTCGTATCGACTTTGTGCGCAT-BHQ2-3'
[0014] 三日瘧原蟲（PM)的探針5端標(biāo)記ROX，3端標(biāo)記BHQ2,擴(kuò)增長(zhǎng)度為300bp，探針的 核酸序列如下：
[0015] SEQ ID NO:5PM-P 5'-R0X AGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTG-BHQ2-3'
[0016] 卵形瘧原蟲（PO)的探針5端標(biāo)記CY5,3端標(biāo)記BHQ2,擴(kuò)增長(zhǎng)度為290bp，探針的 核酸序列如下：
[0017] SEQ ID NO:6P0 5'-CY5-ACAACGTATCTGTTCTTTGCATTCCTTATG-BHQ2-3'
[0018] 利用本發(fā)明的瘧原蟲多重?zé)晒鈾z測(cè)試劑盒按如下方法檢測(cè)，多重?zé)晒釶CR反應(yīng)選 用的QPCR主反應(yīng)液混合物為試劑盒HR Qpcr Master Mix(中國CYbio公司產(chǎn)品）中的主 反應(yīng)液混合物，每個(gè)反應(yīng)管的反應(yīng)體系如下：
[0019] 2 X QPCR 主反應(yīng)混合物：12. 5 μ 1 ;
[0020] 10μΜ 正向引物：1· 25μ 1 ;
[0021] 10μΜ 反向引物：1· 25μ 1 ;
[0022] 10μΜ 探針：0· 625μ 1 ;
[0023] 模板DNA:5yl;
[0024] 超純水補(bǔ)足到反應(yīng)總體積25 μ L。
[0025] 擴(kuò)增和檢測(cè)選用ABI7500HT Fast熒光定量PCR儀器上進(jìn)行。
[0026] 瘧原蟲多重?zé)晒釶CR反應(yīng)程序如下：95°C 5min，95°C 10秒一58°C 45秒，40次循 環(huán)，在58°C收集熒光。熒光檢測(cè)通道在FAM、VIC、CY5和R0X。
[0027] 本試劑盒在陰性對(duì)照和陽性對(duì)照成立的前提下，根據(jù)以下條件進(jìn)行結(jié)果判定：
[0028] (1)某種種類瘧原蟲探針對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)樣本無明顯擴(kuò)增曲線，且檢測(cè)不到Ct值時(shí)， 判斷為該種類瘧原蟲熒光PCR檢測(cè)陰性；
[0029] (2)某種種類瘧原蟲探針對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)樣本Ct值< 35,并有明顯擴(kuò)增曲線，判斷為 該種類瘧原蟲熒光PCR檢測(cè)陽性；
[0030] (3)某種種類瘧原蟲探針對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)樣本Ct值大于35且小于40的標(biāo)本應(yīng)重做。
[0031] 若重做結(jié)果仍然有明顯擴(kuò)增曲線，則判斷為該種類瘧原蟲熒光PCR檢測(cè)陽性，否 則為陰性。
[0032] 本發(fā)明的惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲的多色定量PCR檢測(cè) (Q-PCR)試劑盒使用一對(duì)通用的"公共引物"與四條具備分型能力的"特異探針"，且擴(kuò)增反 應(yīng)條件也高度一致，大大提高檢測(cè)效率，保證了單重、雙重、三重、四重的反應(yīng)環(huán)境更均一、 更穩(wěn)定、更1?效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是惡性瘧原蟲（PF)的單重?zé)晒釶CR反應(yīng)與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應(yīng)的結(jié)果比較圖；其中，虛線是PF單色，實(shí) 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0034] 圖2是間日瘧原蟲（PV)的單重?zé)晒釶CR反應(yīng)與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應(yīng)的結(jié)果比較圖；其中，虛線是PV單色，實(shí) 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0035] 圖3是卵形瘧原蟲（PO)的單重?zé)晒釶CR反應(yīng)與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應(yīng)的結(jié)果比較圖；其中，虛線是PO單色，實(shí) 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0036] 圖4是三日瘧原蟲（PM)的單重?zé)晒釶CR反應(yīng)與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應(yīng)的結(jié)果比較圖；其中，虛線是PM單色，實(shí) 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0037] 圖5為瘧原蟲多重?zé)晒釶CR的特異性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0039] 本發(fā)明所用的試劑來源情況如下：
[0040] 痕原蟲核酸提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Extraction Minikit):購自德國 Qiagen 公司；
[0041] SYBR 熒光 PCR 試劑（QuantiTect SYBR Green PCR Kit):購自德國 Qiagen 公司；
[0042] 探針法熒光PCR試劑（TaqMan? Fast Universal PCR Master Mix)購自美國 ABI 公司；
[0043] HR Qpcr Master Mix 購自中國 CYbio 公司；
[0044] PCR 試劑盒 HotStarTaq PCR Master Mix 購自德國 QIAGEN 公司；
[0045] LAMP檢測(cè)試劑購自廣州迪澳公司；
[0046] 吉氏染色液購自珠海貝索生物公司。
[0047] 實(shí)施例1 :用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組的設(shè)計(jì)
[0048] 本發(fā)明中的PCR檢測(cè)引物和探針由發(fā)明人設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)公共引物實(shí)現(xiàn)對(duì)瘧原蟲的檢 測(cè)，通過四個(gè)特異性探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型 別的分型檢測(cè)。引物探針委托廣州裒源生物公司合成。
[0049] 引物探針組序列見表1。
[0050] 表 1
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的引物探針組，其特征在于， 所述分型包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型別； 所述引物探針組的核酸序列如SEQ ID N0:l-6所示。
2. 用于瘧原蟲多重?zé)晒夥中蜋z測(cè)的試劑盒，包括主反應(yīng)液混合物，其特征在于，還包括 引物探針組，所述引物探針組的核酸序列如SEQ ID NO :1-6所示， 所述核酸序列如SEQ ID NO :1-2所示的引物用于瘧原蟲的檢測(cè)； 所述核酸序列如SEQ ID NO :3所示的探針用于惡性瘧原蟲的檢測(cè)； 所述核酸序列如SEQ ID NO :4所示的探針用于間日瘧原蟲的檢測(cè)； 所述核酸序列如SEQ ID NO :5所示的探針用于三日瘧原蟲的檢測(cè)； 所述核酸序列如SEQ ID NO :6所示的探針用于卵形瘧原蟲的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263847SQ201410583682
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】師永霞, 黃吉城, 李燕, 李小波, 蘇錦坤, 鄭夔, 方盛藩, 馮慶文 申請(qǐng)人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心