鹽藻的收集與保種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鹽藻的收集與保種方法，屬水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。鹽藻收集傳統(tǒng)上采用離心法獲得，該法易打碎細(xì)胞，胞液外流，造成損失，設(shè)備昂貴且運(yùn)行費(fèi)用高。本發(fā)明提供的利用甲殼素、聚丙烯酰胺和小蘇打作凝絮劑來凝聚藻細(xì)胞方法，操作簡便，費(fèi)用少，設(shè)備簡單且對細(xì)胞沒有傷害，細(xì)胞獲得率高，沒有污染，效益高。鹽藻保種傳統(tǒng)上采用低溫、低光照液體保存法，操作麻煩，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，保種時(shí)間短，易污染，死亡率高，技術(shù)要求高，易失敗。本發(fā)明公開的低溫冰凍保種法，保種時(shí)間長，操作方便，不易污染且花錢少，冰凍時(shí)添加了冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞成活率從原來的21％提高到92％，經(jīng)濟(jì)效益高，具有推廣價(jià)值。
【專利說明】鹽藻的收集與保種方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種鹽藻的收集與保種方法。

【背景技術(shù)】
[0002]鹽藻Dunaliella salina是一種單細(xì)胞真核藻類,屬綠藻門、綠藻綱、杜氏藻目、杜氏藻科、杜氏藻屬，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最耐鹽真核生物之一，屬高鹽逆境生物，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖快，自然生活環(huán)境多為鹽池、鹽湖等高鹽水域，特殊的環(huán)境造就了獨(dú)特的生長機(jī)制。藻體卵圓、橢圓或梨形，長18-28 μ m，寬9.5_14 μ m，因沒有纖維質(zhì)細(xì)胞壁，外形在不同鹽度、光照、溫度等環(huán)境下變化較大，蛋白核及淀粉粒也隨環(huán)境不同。細(xì)胞前部一般凹陷，在凹陷處生出兩條等長鞭毛，比細(xì)胞長約1/3 ;體內(nèi)有一杯狀色素體，主要是葉綠素和類胡蘿卜素(以胡蘿卜素為主)。早期細(xì)胞呈草綠色，條件不良時(shí)產(chǎn)生胡蘿卜素，藻體呈紅色。其獨(dú)特的顏色會把湖水染成紅色，在西非塞內(nèi)加爾首都以北35公里的瑞特巴湖，因鹽藻作用，湖水呈粉紅色，獲得“玫瑰湖”外號。鹽藻屬光合自養(yǎng)生物，富含β_胡蘿卜素，最高可達(dá)干重14%，遠(yuǎn)高于其它動植物，是β -胡蘿卜素最好的天然產(chǎn)源，具有很大開發(fā)價(jià)值。鹽藻含有70多種人體所需物質(zhì)和微量元素，比例與人體的體液、細(xì)胞漿液相吻合,能改善身體機(jī)能，保護(hù)DNA，增強(qiáng)免疫力。用現(xiàn)代科技手段從鹽藻中提取、濃縮、精制而成的多種營養(yǎng)成分稱為“鹽藻素”，中國中醫(yī)科學(xué)院的研究和臨床試驗(yàn)表明，鹽藻素對調(diào)節(jié)血壓、降低血脂、降血糖、糖尿病有顯著預(yù)防和輔助治療作用；鹽藻素中富含的類胡蘿卜素直接抑制癌細(xì)胞生長，可有效治療化學(xué)致癌劑誘發(fā)的腫瘤，減輕化療、放療的疼痛和不適癥狀并可降低癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)率；鹽藻素對酒精肝和脂肪肝有明顯改善作用；鹽藻中類胡蘿卜素能保持、修復(fù)上皮組織，尤其對胃部常見病胃潰瘍、胃炎和萎縮性潰瘍及上呼吸道炎癥和口腔潰瘍均有很好彌合作用；鹽藻素能明顯提高機(jī)體免疫力，防治白內(nèi)障，改善視力，對夜盲癥、干眼病也有較好治療效果。
[0003]鹽藻收集傳統(tǒng)上采用離心機(jī)來離心藻液，最后得到牙膏狀的藻泥。該方法優(yōu)點(diǎn)是沒有污染和雜質(zhì)，獲得率較高，但缺點(diǎn)是由于離心力作用，易打碎細(xì)胞，胞液外流，造成損失，更大的缺點(diǎn)是離心設(shè)備昂貴，即使一臺每小時(shí)處理0.5立方米藻液的離心設(shè)備也需要120萬元，而且運(yùn)行費(fèi)用高，即離心所用電費(fèi)太高，占整個微藻培養(yǎng)工藝流程支出的80 %以上，嚴(yán)重限制著鹽藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了解決這個難題，我發(fā)明了一種利用黃泥巴和小蘇打來凝聚藻細(xì)胞的方法，該法不僅操作簡便，費(fèi)用少，設(shè)備簡陋而且對細(xì)胞沒有傷害，簡單易行，沒有污染，效益高，可規(guī)?；a(chǎn)。
[0004]關(guān)于鹽藻保種方法，傳統(tǒng)上采用低溫、低光照液體保存法，也就是在低溫、低光照條件下，降低藻細(xì)胞新陳代謝和活動性，每隔15-25天更換一次培養(yǎng)液。該法操作麻煩，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，保種時(shí)間短，易污染，細(xì)胞死亡率高，技術(shù)要求高，弄不好易導(dǎo)致保種失敗。為了克服這個缺點(diǎn)，我發(fā)明了一種低溫冰凍保種法，不僅保種時(shí)間長，操作方便，不易污染，而且花錢少，冰凍時(shí)添加了甘油、二甲亞砜等冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞成活率從原來的21%提高到92%，經(jīng)濟(jì)效益高，具有推廣價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鹽藻的收集與保種方法，方法如下:
[0006]一種鹽藻的收集與保種方法，步驟如下:
[0007]將培養(yǎng)完畢的鹽藻液，按I升藻液加入100暈克甲殼素和50暈克聚丙烯酰胺的量加入甲殼素和聚丙烯酰胺，攪拌30分鐘，再按I升藻液加入80毫克小蘇打(即碳酸氫鈉)的量加入小蘇打，再攪拌30分鐘，后將藻液置于黑暗中靜置、沉淀24小時(shí)，可見底部有牙膏狀沉淀物，即為目的產(chǎn)物藻泥，棄去上清液可得；因上清液中還有少量鹽藻細(xì)胞，將上清液攪拌20分鐘，再沉淀24小時(shí)，再取牙膏狀沉淀物即可；
[0008]鹽藻保種用的培養(yǎng)液，配方如下:
[0009]硝酸銨4毫克，磷酸二氫鈉7毫克，脯氨酸2毫克，丙酮酸鹽5毫克，檸檬酸鉀2毫克，甘氨酸甜菜堿12毫克，谷氨酸鈉4毫克，乙酸鈉4毫克，甘露醇6毫克，葡萄糖9毫克，人尿1.5毫升，甘油3毫克，二甲亞砜0.5毫克，鏈霉素0.1毫克，煮沸冷卻后的海水1000
毫升;
[0010]用一個150毫升的三角燒瓶，裝入上述培養(yǎng)液100毫升，取生長旺盛、無污染的鹽藻接種至密度達(dá)到每毫升40萬個細(xì)胞，塑料薄膜封口，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，溫度240C，光照強(qiáng)度4500lux，然后用報(bào)紙包裹三角燒瓶，轉(zhuǎn)入4°C冰箱，放置12小時(shí)，再轉(zhuǎn)入(TC冰箱，放置12小時(shí)，轉(zhuǎn)入-10°C冰箱，放置12小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-16°C冰箱，長期黑暗放置保種，最多可保種24個月，后取出解凍，按-16°C、-10°C、(TC、4°C、24°C依次放置12小時(shí)的順序依次逐漸解凍和升溫，后加入50毫升新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞可在48小時(shí)后恢復(fù)活力，依靠鞭毛自由游動。
[0011]有益結(jié)果:
[0012]鹽藻收集傳統(tǒng)上采用離心機(jī)離心藻液獲得，該方法優(yōu)點(diǎn)是離心徹底，藻細(xì)胞采集率較高且沒有污染和雜質(zhì)，但缺點(diǎn)明顯:由于離心力作用，易打碎細(xì)胞，胞液外流，造成損失，更大的缺點(diǎn)是離心設(shè)備昂貴，即使一臺每小時(shí)處理0.5立方米藻液的離心設(shè)備也需要120萬元，而且運(yùn)行費(fèi)用高，即離心機(jī)工作時(shí)所用的電費(fèi)太高，占整個微藻培養(yǎng)工藝流程支出的80%以上，嚴(yán)重限制著鹽藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了解決這個難題，我發(fā)明了一種利用黃泥巴和小蘇打作凝絮劑來凝聚藻細(xì)胞的方法，該方法不僅操作簡便，費(fèi)用少，設(shè)備簡陋而且對細(xì)胞沒有傷害，簡單易行，細(xì)胞獲得率高，沒有污染，效益高，可規(guī)?；a(chǎn)。關(guān)于鹽藻細(xì)胞的保種方法，傳統(tǒng)上采用低溫、低光照液體保存法，也就是在較低溫度、較低光照條件下培養(yǎng)細(xì)胞，降低藻細(xì)胞新陳代謝和活動性，每隔15-25天更換一次培養(yǎng)液。該法操作麻煩，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，保種時(shí)間短，容易污染，細(xì)胞死亡率高，技術(shù)要求高，易失敗。為了克服這個缺點(diǎn)，我發(fā)明了一種低溫冰凍保種法，不僅保種時(shí)間長達(dá)24個月，操作方便，不易污染，而且花錢少，冰凍時(shí)添加了甘油、二甲亞砜等冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞成活率從原來的21%提高到92%，經(jīng)濟(jì)效益高，具有推廣價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為顯微鏡下觀察到的積累β -胡蘿卜素后的鹽藻(不經(jīng)染色處理，鞭毛難以看清)；
[0014]圖2為鹽藻形態(tài)結(jié)構(gòu)圖；
[0015]其中附圖標(biāo)記為:1紅色眼點(diǎn)，2蛋白核，3色素體，4鞭毛。

【具體實(shí)施方式】
[0016]一種鹽藻的收集與保種方法，步驟如下:
[0017]將培養(yǎng)完畢的鹽藻液，按I升藻液加入100暈克甲殼素和50暈克聚丙烯酰胺的量加入甲殼素和聚丙烯酰胺，攪拌30分鐘，再按I升藻液加入80毫克小蘇打(即碳酸氫鈉)的量加入小蘇打，再攪拌30分鐘，后將藻液置于黑暗中靜置、沉淀24小時(shí)，可見底部有牙膏狀沉淀物，即為目的產(chǎn)物藻泥，棄去上清液可得；因上清液中還有少量鹽藻細(xì)胞，將上清液攪拌20分鐘，再沉淀24小時(shí)，再取牙膏狀沉淀物即可；
[0018]鹽藻保種用的培養(yǎng)液，配方如下:
[0019]硝酸銨4毫克，磷酸二氫鈉7毫克，脯氨酸2毫克，丙酮酸鹽5毫克，檸檬酸鉀2毫克，甘氨酸甜菜堿12毫克，谷氨酸鈉4毫克，乙酸鈉4毫克，甘露醇6毫克，葡萄糖9毫克，人尿1.5毫升，甘油3毫克，二甲亞砜0.5毫克，鏈霉素0.1毫克，煮沸冷卻后的海水1000
毫升;
[0020]用一個150毫升的三角燒瓶，裝入上述培養(yǎng)液100毫升，取生長旺盛、無污染的鹽藻接種至密度達(dá)到每毫升40萬個細(xì)胞，塑料薄膜封口，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，溫度240C，光照強(qiáng)度4500lux，然后用報(bào)紙包裹三角燒瓶，轉(zhuǎn)入4°C冰箱，放置12小時(shí)，再轉(zhuǎn)入(TC冰箱，放置12小時(shí)，轉(zhuǎn)入-10°C冰箱，放置12小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-16°C冰箱，長期黑暗放置保種，最多可保種24個月，后取出解凍，按-16°C、-10°C、(TC、4°C、24°C依次放置12小時(shí)的順序依次逐漸解凍和升溫，后加入50毫升新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞可在48小時(shí)后恢復(fù)活力，依靠鞭毛自由游動。
[0021]在冷凍保種過程中，至少要制作10個樣品瓶，以免因瓶子打碎或其它意外原因?qū)е卤７N失敗。
[0022]冷凍保種過程中，根據(jù)需要，可用冰柜和冷庫代替冰箱。
[0023]人尿制備方法:取人尿1000毫升，燒瓶煮沸15分鐘后，冷卻、沉淀24小時(shí)，棄沉渣，取上清液，裝入棕色磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用。
[0024]鹽藻保種用的培養(yǎng)液配方中各種營養(yǎng)鹽要按配方中提供的順序依次加入，同時(shí)不斷攪拌，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
[0025]所用化學(xué)藥品純度均需化學(xué)純級別。
[0026]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種鹽藻的收集與保種方法，其特征在于步驟如下: 將培養(yǎng)完畢的鹽藻液，按1升藻液加入100暈克甲殼素和50暈克聚丙烯酰胺的量加入甲殼素和聚丙烯酰胺，攪拌30分鐘，再按1升藻液加入80毫克小蘇打(即碳酸氫鈉)的量加入小蘇打，再攪拌30分鐘，后將藻液置于黑暗中靜置、沉淀24小時(shí)，可見底部有牙膏狀沉淀物，即為目的產(chǎn)物藻泥，棄去上清液可得；因上清液中還有少量鹽藻細(xì)胞，將上清液攪拌20分鐘，再沉淀24小時(shí)，再取牙膏狀沉淀物即可； 鹽藻保種用的培養(yǎng)液，配方如下: 硝酸銨4毫克，磷酸二氫鈉7毫克，脯氨酸2毫克，丙酮酸鹽5毫克，檸檬酸鉀2毫克，甘氨酸甜菜堿12毫克，谷氨酸鈉4毫克，乙酸鈉4毫克，甘露醇6毫克，葡萄糖9毫克，人尿1.5暈升，甘油3暈克，二甲亞砜0.5暈克,鏈霉素0.1暈克，煮沸冷卻后的海水1000暈升；用一個150毫升的三角燒瓶，裝入上述培養(yǎng)液100毫升，取生長旺盛、無污染的鹽藻接種至密度達(dá)到每毫升40萬個細(xì)胞，塑料薄膜封口，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，溫度24°C，光照強(qiáng)度4500lux，然后用報(bào)紙包裹三角燒瓶，轉(zhuǎn)入4°C冰箱，放置12小時(shí)，再轉(zhuǎn)入0°C冰箱，放置12小時(shí)，轉(zhuǎn)入-10°C冰箱，放置12小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-16°C冰箱，長期黑暗放置保種，最多可保種24個月，后取出解凍，按-16°C、-10°C、0°C、4°C、24°C依次放置12小時(shí)的順序依次逐漸解凍和升溫，后加入50毫升新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞可在48小時(shí)后恢復(fù)活力，依靠鞭毛自由游動。
【文檔編號】C12N1/04GK104312923SQ201410563145
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】王培磊 申請人:臨沂大學(xué)