將引物或引物、探針固定于固相載具用于pcr的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及PCR反應(yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）實(shí)驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法。將引物或引物、探針按相關(guān)主題，溶解好以后，按一定的比例，在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室里加入到固相載具的PCR反應(yīng)管（孔）內(nèi)，然后放入烘箱中，將加入的液體水分蒸干，同時(shí)保留并貼壁固定引物或引物、探針，即形成固化的引物或引物、探針?lè)磻?yīng)層，最后用膜將固相載具密閉，4℃保存，以待備用。本發(fā)明的固相載具帶有引物層或引物、探針混合層，使用時(shí)只需加入酶混合液、滅菌水和模板，不需再加入PCR引物和探針，降低了加孔出錯(cuò)率；能很快完成實(shí)驗(yàn)操作，縮短檢測(cè)周期；PCR反應(yīng)的引物、探針已固定在PCR管內(nèi)，運(yùn)輸與儲(chǔ)存非常方便。
【專(zhuān)利說(shuō)明】將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及PCR反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，一種用于 體外擴(kuò)增核酸片段的技術(shù)）實(shí)驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種將引物或引物、探針固定于固相載具 用于PCR的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] PCR板是普通PCR試驗(yàn)或熒光定量PCR試驗(yàn)中常用的分子生物學(xué)耗材，分為48孔 PCR板、96孔PCR板、384孔PCR板、8聯(lián)管和單孔PCR反應(yīng)管。PCR板的使用方法是通過(guò)加 入PCR反應(yīng)引物、探針、酶混液（DNA聚合酶與緩沖液的混合液或DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶與緩 沖液的混合液)、水和模板核酸（DNA、RNA)，混合后放入PCR儀或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn) 行PCR反應(yīng)。這種方法的不足之處在于：1、檢測(cè)或擴(kuò)增同一個(gè)基因、進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)， 需要向多個(gè)PCR反應(yīng)管(孔）內(nèi)重復(fù)加入相同的引物和探針；2、檢測(cè)或擴(kuò)增不同的基因、進(jìn) 行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)，需要向不同的PCR反應(yīng)管(孔)內(nèi)加入不同的引物和探針。這樣，既耗費(fèi) 實(shí)驗(yàn)人員時(shí)間，工作量大，工作效率低，又容易出錯(cuò)，引物或探針加錯(cuò)孔位，從而直接影響實(shí) 驗(yàn)結(jié)果的及時(shí)性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性。例如：1、檢測(cè)60份標(biāo)本中的乙肝病毒基因，就需要重復(fù) 60次向60個(gè)PCR反應(yīng)管(孔）內(nèi)加入乙肝病毒基因的引物和探針，工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，工作 效率低，實(shí)驗(yàn)人員也很辛苦；2、同時(shí)檢測(cè)30份標(biāo)本中的乙肝病毒基因和丙肝病毒基因，就 需要重復(fù)30次向30個(gè)PCR反應(yīng)管(孔)內(nèi)加入乙肝病毒基因的引物和探針，再重復(fù)30次向 30個(gè)PCR反應(yīng)管(孔）內(nèi)加入丙肝病毒基因的引物和探針，不僅工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，還有可能 加錯(cuò)管(孔）位，得出錯(cuò)誤的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有的技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種將引物或引物、探針固定于固相 載具用于PCR的方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種將引物或引物、探針固定于固 相載具用于PCR的方法，其方法如下： 步驟一、引物或引物、探針按相關(guān)主題溶解：引物、探針合成后，按引物、探針終濃度IOOuM的需要量，加入緩沖液，短暫離心使加入的緩沖液全部沉積到PCR管或孔底部，保證 引物、探針充分溶解到緩沖液中，室溫放置lh，形成母液； 步驟二、在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室里，將上下游引物、探針?lè)謩e從步驟一的IOOuM母液中取出IOul分裝，再加入10-90ul緩沖液稀釋到10-50uM，形成使用液，4°C保存?zhèn)溆?。根?jù)進(jìn)行的單重 或者多重PCR反應(yīng)需要，將該使用液加入固相載具的PCR反應(yīng)管或孔中； 步驟三、將已加入引物或引物、探針的固相載具放入烘箱中，直至將加入的液體水分蒸 干，加入的引物或引物、探針即被貼壁固定，此時(shí)即形成固化的引物層或引物、探針層； 步驟四、將帶有固化的引物層或引物、探針層的固相載具用封板膜封板，4°C保存，以待 備用。
[0005] 本方案可將引物層或引物、探針層很好地固定于固相載具上，解決現(xiàn)有技術(shù)的工 作量大、工作效率低、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、容易出現(xiàn)加孔錯(cuò)位等問(wèn)題。其中，固定的引物或引物、探 針可以是1對(duì)引物，多對(duì)引物，1對(duì)引物探針，或多對(duì)引物探針等，此處不應(yīng)當(dāng)受到限制。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，進(jìn)一步包括，所述步驟三中將已加入引物或引物、探 針的固相載具放入烘箱中，該烘箱為普通烘箱或其它形式的加熱烘干器具。本方案中使用 的烘箱應(yīng)當(dāng)不受限制，其目的是為將引物或引物、探針烘干固化。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，進(jìn)一步包括，所述步驟三中將已加入引物或引物、探 針的固相載具放入烘箱中，烘干溫度在35°C至95°C溫度范圍內(nèi)，烘干時(shí)間為5分鐘至3小 時(shí)（固相載具可用的溫度所對(duì)應(yīng)的烘干時(shí)間如下表)。其中，優(yōu)選的烘干溫度為50°C，烘干時(shí) 間為2小時(shí)。

【權(quán)利要求】
1. 一種將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法，其方法如下： 步驟一、引物或引物、探針按相關(guān)主題溶解：引物、探針合成后，按引物、探針終濃度 lOOuM的需要量，加入緩沖液，短暫離心使加入的緩沖液全部沉積到PCR管(孔）底部，保證 引物、探針充分溶解到緩沖液中，室溫放置lh，形成母液； 步驟二、在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室里，將上下游引物分別從步驟一的lOOuM母液中取出10ul分裝， 再加入10-90ul緩沖液稀釋到10-50UM，形成使用液，4°C保存?zhèn)溆?，根?jù)進(jìn)行的單重或者 多重PCR反應(yīng)需要，將該使用液加入固相載具的PCR反應(yīng)管(孔）中； 其特征是： 步驟三、將已加入引物或引物、探針的固相載具放入烘箱中，直至將加入的液體水分蒸 干，加入的引物或引物、探針即被貼壁固定，此時(shí)即形成固化的引物層或引物、探針層； 步驟四、將帶有固化的引物層或引物、探針層的固相載具用膜封板，4°C保存，以待備 用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法，其特 征是，所述步驟三中將已加入引物或引物、探針的固相載具放入烘箱中，該烘箱為普通烘箱 或其它形式的加熱烘干器具。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法，其特 征是，所述步驟三中將已加入引物或引物、探針的固相載具放入烘箱中，烘干溫度在35°C至 95°C溫度范圍內(nèi)，烘干時(shí)間為5分鐘至3小時(shí)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法，其特 征是，所述烘干溫度優(yōu)選為50°C，烘干時(shí)間優(yōu)選為2小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法，其特征 是，所述固相載具為48孔PCR板、96孔PCR板、384孔PCR板、8聯(lián)管或單個(gè)PCR反應(yīng)管。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的將引物或引物、探針固定于固相載具用于PCR的方法，其特征 是，所述固相載具的各個(gè)PCR反應(yīng)管(孔）內(nèi)可以添加不同或相同的引物層或引物、探針層。
7. -種固相載具，其特征是，使用上述權(quán)利要求1所制造的帶有固化的引物層或引物、 探針層的固相載具。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK104263640SQ201410543747
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王蕾 申請(qǐng)人:常州百代生物科技有限公司