一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物內(nèi)生菌分離與微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法。通過選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后對粗榧共生菌按照菌種不同進行分離并分別培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后進行檢測以確定其是否為可代謝粗榧生物堿菌株。本發(fā)明在發(fā)酵液的制備過程中待菌種產(chǎn)生代謝生物后再接入第二批菌種，利用前批菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為第二批菌種提供營養(yǎng)物質(zhì)，大大促進了第二批菌種的生長，同時提高了其生物活性，從而產(chǎn)生大量發(fā)酵液，在便于菌種篩選的同時提高其準(zhǔn)確性。
【專利說明】一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物內(nèi)生菌分離與微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]粗榧是我國特有的一種植物，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，粗榧生物堿是粗榧的重要有效成分之一，具有防癌等功效，常用于藥物中。目前粗榧資源稀少，且該樹種生長緩慢，粗榧生物堿產(chǎn)量低下，難以滿足人們的生活需求，同時也造成了涉及粗榧生物堿類藥物的價格昂貴。因此提高粗榧生物堿的產(chǎn)量成為人們長久以來的渴望。
[0003]生物發(fā)酵工程是20世紀(jì)70年代初開始興起的一門新興的綜合性應(yīng)用學(xué)科，通過利用微生物發(fā)酵可以實現(xiàn)代謝產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。因此找到一種快速、準(zhǔn)確分離可代謝粗榧生物堿的菌株，再通過生物發(fā)酵獲得大量粗榧生物堿成為研究的熱點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的的是提供一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，能夠快速、準(zhǔn)確的分離出可代謝粗榧生物堿的菌株。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后對粗榧共生菌按照菌種不同進行分離并分別培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后進行檢測以確定其是否為可代謝粗榧生物堿菌株，所述培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將粗榧共生菌活化后放入溫度為26°C的環(huán)境中培養(yǎng)48h，根據(jù)不同菌種的菌落特征鑒定出各菌種，再將各菌種分別接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為28°C的搖床上培養(yǎng)5d,收集各菌種的發(fā)酵液即可；
所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將各菌種的發(fā)酵液分別放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-50°C、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將各菌種的濃縮液分別放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)即可。
[0006]所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、KH2P04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS040.05%，KH2P04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的pH=7 ；
所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為95-100°C的鍋中蒸煮20-30min，取出后過100-200目篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。
[0007]有益效果一、本發(fā)明在發(fā)酵液的制備過程中待菌種產(chǎn)生代謝生物后再接入第二批菌種，利用前批菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為第二批菌種提供營養(yǎng)物質(zhì)，大大促進了第二批菌種的生長，同時提高了其生物活性，從而產(chǎn)生大量發(fā)酵液，在便于菌種篩選的同時提高其準(zhǔn)確性。
[0008]二、本發(fā)明通過將發(fā)酵液離心，取出上清液后再次離心，然后進行濃縮，消除了篩選過程中的不利因素，使得篩選結(jié)果高效、準(zhǔn)確。
[0009]三、通過將第二批菌種接種到本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，使得菌種生長迅速，代謝旺盛，縮短了篩選所需的時間，且大大提高了發(fā)酵液的產(chǎn)量，便于菌種的篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明篩選過程中培養(yǎng)的沒有分生孢子的菌絲；
圖2為本發(fā)明篩選過程中培養(yǎng)的有分生孢子的菌絲。

【具體實施方式】
[0011]一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后對粗榧共生菌按照菌種不同進行分離并分別培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后進行檢測以確定其是否為可代謝粗榧生物堿菌株，所述培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將粗榧共生菌活化后放入溫度為26°C的環(huán)境中培養(yǎng)48h，根據(jù)不同菌種的菌落特征鑒定出各菌種，再將各菌種分別接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為28°C的搖床上培養(yǎng)5d，收集各菌種的發(fā)酵液即可；
所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將各菌種的發(fā)酵液分別放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-50°C、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將各菌種的濃縮液分別放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)即可。
[0012]所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、KH2P04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS040.05%，ΚΗ2Ρ04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的pH=7 ；
所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為95-100°C的鍋中蒸煮20-30min，取出后過100-200目篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。
[0013]實施例1
一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，包括以下步驟:
步驟一、外植體的選擇和處理
選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，用流水將外植體清洗干凈，再將根切成長為5-6cm的長塊，除去莖上的老皮和枝葉，備用；
步驟二、外植體的滅菌
將處理好的外植體放入超凈工作臺內(nèi)，先用體積濃度為75%的酒精滅菌5min，再用質(zhì)量濃度為0.1%的升汞滅菌12min，無菌水洗4遍后，把處理好的外植體放入無菌水中，備用；
步驟三、粗榧菌種的純化分離
把滅菌后的外植體分別接入裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，把接有外植體的培養(yǎng)瓶放置到溫度為25°C的培養(yǎng)架上進行培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中長出菌種后，從中分離出粗榧共生菌，備用；
步驟四、培養(yǎng)發(fā)酵
將粗榧共生菌活化后放入溫度為26°C的環(huán)境中培養(yǎng)48h，根據(jù)不同菌種的菌落特征鑒定出各菌種，再將各菌種分別接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為28°C的搖床上培養(yǎng)5d，收集各菌種的發(fā)酵液，備用；
步驟五、發(fā)酵液的濃縮
將各菌種的發(fā)酵液分別放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，把再次離心后的上清液放入溫度為40V、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將各菌種的濃縮液分別放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)，備用；
步驟六、篩選
向各菌種的濃縮液中分別加入NaOH溶液直至pH=8，析出混合物，用高效色譜分析儀檢測混合物中是否有粗榧生物堿生成；若有粗榧生物堿生成，則該菌種可代謝粗榧生物堿，采用普通瓊脂斜面保存法保存或溫度為-20°C的甘油管內(nèi)保存即可；若沒有粗榧生物堿生成，則該菌種不可代謝粗榧生物堿。
[0014]步驟四所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、ΚΗ2Ρ04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS04 0.05%, MgS04、KH2P04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的 pH=7 ；
所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為95°C的鍋中蒸煮20min，取出后過100目篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80目篩，收集濾液制得。
[0015]實施例2
一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，包括以下步驟:
步驟一、外植體的選擇和處理
選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，用流水將外植體清洗干凈，再將根切成長為5-6cm的長塊，除去莖上的老皮和枝葉，備用；
步驟二、外植體的滅菌
將處理好的外植體放入超凈工作臺內(nèi)，先用體積濃度為75%的酒精滅菌5min，再用質(zhì)量濃度為0.1%的升汞滅菌12min，無菌水洗5遍后，把處理好的外植體放入無菌水中，備用；
步驟三、粗榧菌種的純化分離把滅菌后的外植體分別接入裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，把接有外植體的培養(yǎng)瓶放置到溫度為25°C的培養(yǎng)架上進行培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中長出菌種后，從中分離出粗榧共生菌，備用；
步驟四、培養(yǎng)發(fā)酵
將粗榧共生菌活化后放入溫度為26°C的環(huán)境中培養(yǎng)48h，根據(jù)不同菌種的菌落特征鑒定出各菌種，再將各菌種分別接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為28°C的搖床上培養(yǎng)5d，收集各菌種的發(fā)酵液，備用；
步驟五、發(fā)酵液的濃縮
將各菌種的發(fā)酵液分別放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，把再次離心后的上清液放入溫度為50°C、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將各菌種的濃縮液分別放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)，備用；
步驟六、篩選
向各菌種的濃縮液中分別加入NaOH溶液直至pH=9，析出混合物，用高效色譜分析儀檢測混合物中是否有粗榧生物堿生成；若有粗榧生物堿生成，則該菌種可代謝粗榧生物堿，采用普通瓊脂斜面保存法保存或溫度為-80°C的甘油管內(nèi)保存即可；若沒有粗榧生物堿生成，則該菌種不可代謝粗榧生物堿。
[0016]步驟四所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、ΚΗ2Ρ04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS04 0.05%, MgS04、KH2P04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的 pH=7。
[0017]所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為100°C的鍋中蒸煮30min，取出后過200目篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過100目篩，收集濾液制得。
【權(quán)利要求】
1.一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后對粗榧共生菌按照菌種不同進行分離并分別培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后進行檢測以確定其是否為可代謝粗榧生物堿菌株，其特征在于:所述培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將粗榧共生菌活化后放入溫度為26°c的環(huán)境中培養(yǎng)48h，根據(jù)不同菌種的菌落特征鑒定出各菌種，再將各菌種分別接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為28°C的搖床上培養(yǎng)5d，收集各菌種的發(fā)酵液即可； 所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將各菌種的發(fā)酵液分別放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-50°C、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將各菌種的濃縮液分別放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離可代謝粗榧生物堿菌株的方法，其特征在于:所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgSO4, KH2PO4和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgSO4 0.05%,KH2PO4 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的pH=7 ； 所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為95-100°C的鍋中蒸煮20-30min，取出后過100-200目篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。
【文檔編號】C12N1/00GK104357325SQ201410543328
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王祖華, 王安亭, 李永程, 楊瑞先, 黃向東, 王佳偉 申請人:洛陽理工學(xué)院