專利名稱：抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素的制備新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大分子肽類抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素的制備新方法。
力達(dá)霉素產(chǎn)生菌C-1027是從我國(guó)湖南省潛江縣土壤中分離得到的鏈霉菌屬菌株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所菌種保藏室提供)，用精原細(xì)胞法為向?qū)В⑸飳W(xué)方法追蹤，從2000株放線菌的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)，它不僅具有較強(qiáng)的抗瘤活性，還具有抗革藍(lán)氏陽性菌及革藍(lán)氏陰性菌的作用(C-1027物質(zhì)1987年申請(qǐng)了日本專利，特愿昭62-160279，又于1987年申請(qǐng)了中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?8102750.6)。由該菌株分離得到的抗腫瘤活性物質(zhì)力達(dá)霉素由一個(gè)蛋白肽和一個(gè)發(fā)色團(tuán)以非共價(jià)鍵結(jié)合而成，二者可以拆分，發(fā)色團(tuán)為其主要活性部位，但容易失活，蛋白肽對(duì)發(fā)色團(tuán)活性具有保護(hù)作用。然而，現(xiàn)有的力達(dá)霉素制備技術(shù)比較復(fù)雜，工藝流程較長(zhǎng)，用堿性離子交換樹脂分離，力達(dá)霉素在分離過程中容易失活，且產(chǎn)量低，直接影響了該物質(zhì)的抗腫瘤功效。
本發(fā)明之目的是，通過改進(jìn)制備工藝，以獲得穩(wěn)定性好、純度較高、療效更佳的抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素。
本發(fā)明之內(nèi)容與要點(diǎn)一、菌種生物學(xué)特征鑒別力達(dá)霉素產(chǎn)生菌C-1027菌株通常在鏈霉菌分類用的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。
其形態(tài)特征是孢子絲直至波曲(

圖1)，成熟的孢子絲鏈有10-30個(gè)或更多的孢子，孢子呈柱形，表面光滑(圖2)；其培養(yǎng)特征是在各種合成的或有機(jī)的培養(yǎng)基上，往往有淺粉軟皮色乃至榛子色彩，基內(nèi)菌絲一般無色，日久稍變?nèi)橹瑹o可溶性色素，亦不產(chǎn)生黑色素；其生理特征是產(chǎn)H2S、明膠液化、牛乳凝固及胨化、硝酸還原均為陽性反應(yīng)，溫度在28-32℃時(shí)豐茂，生長(zhǎng)迅速，45℃不生長(zhǎng)；其碳原利用情況L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、D-半乳糖等均能促進(jìn)生長(zhǎng)良好；蔗糖、肌醇、乳糖、纖維素、衛(wèi)茅醇、棉籽糖等對(duì)生長(zhǎng)不起作用。二、發(fā)酵培養(yǎng)將力達(dá)霉素產(chǎn)生菌冷干管中加0.7ml無鹽水，使之形成菌懸液，用白金耳接種于高氏1號(hào)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，28℃，7-10天，表面生長(zhǎng)白色氣生菌絲，取一小塊接種一級(jí)種子100ml/500ml三角瓶(發(fā)酵培養(yǎng)基成分可以為；淀粉1％，玉米漿0.5％，血胨0.5％，葡萄糖0.5％，無水硫酸鎂0.02％，碘化鉀0.06％，玉米面1.5％，碳酸鈣0.4％，自來水配制，pH7.0，15磅消毒)，28℃，旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)種5％于1000ml/5000ml立瓶中，為二級(jí)種子，發(fā)酵培養(yǎng)基同一級(jí)種子，28℃，往返搖床培養(yǎng)18小時(shí)，上200L發(fā)酵罐，裝量100L，接種量2％，加0.03％泡敵為消沫劑，罐壓0.04，28℃，攪拌400轉(zhuǎn)/分，氣流1/1，pH6.5-7.0，發(fā)酵96小時(shí)，得到所需要的發(fā)酵液。
發(fā)酵液生物學(xué)活性檢測(cè)，八疊球菌為檢定菌，采用杯碟法(單層培養(yǎng)基10ml)，抑菌圈直徑20-24mm，精原細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果，X10000(發(fā)酵液稀釋一萬倍)仍為陽性。三、分離提取由上述發(fā)酵液產(chǎn)生的活性物質(zhì)力達(dá)霉素，其分離提取新工藝主要采用羥基磷灰石柱層析，凝膠過濾層析方法進(jìn)行。本發(fā)明采用羥基磷灰石柱層析，主要考慮到力達(dá)霉素是一個(gè)不穩(wěn)定的化合物，對(duì)紫外光、熱等敏感，在水溶液室溫條件下其活性易丟失。由于力達(dá)霉素蛋白肽與發(fā)色團(tuán)以非共價(jià)鍵結(jié)合，外界條件如有機(jī)溶媒、pH、離子強(qiáng)度和離子交換劑等影響它們的結(jié)合并引起發(fā)色團(tuán)的失活。羥基磷灰石層析是通過多因素分離蛋白的羥基磷灰石鈣離子對(duì)蛋白質(zhì)的親和力、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、三維結(jié)構(gòu)的差異、洗脫劑的離子特性、蛋白質(zhì)極性基團(tuán)和羥基磷灰石極性位點(diǎn)的相互作用等，這些綜合因素使羥基磷灰石具有不同于離子交換層析的特殊分離效果而不影響力達(dá)霉素的活性。本發(fā)明同時(shí)簡(jiǎn)化操作流程，盡可能減少了活性物質(zhì)力達(dá)霉素在水溶液中的滯留時(shí)間，避光操作，以免失活。
具體步驟是將存在于發(fā)酵液中力達(dá)霉素物質(zhì)離心去菌絲，取上清液加硫酸銨鹽析，然后將含有力達(dá)霉素的沉淀物離心分離。將離心沉淀物溶于水或磷酸緩沖液，用透析或超濾脫鹽，進(jìn)一步用羥基磷灰石進(jìn)行吸附，然后再洗脫除去雜質(zhì)。洗脫液經(jīng)冷凍干燥或超濾濃縮后，再經(jīng)Sephadex G-75柱層析，進(jìn)一步除去雜質(zhì)，以獲得高純度的力達(dá)霉素。
其制備方法如工藝流程(圖3)所示。
鑒別上述方法得到的力達(dá)霉素精制液冷凍干燥后，得到力達(dá)霉素的白色粉末。
本發(fā)明所得到的力達(dá)霉素為單一物質(zhì)，SDS-聚丙烯凝膠電泳顯示單一帶(圖4)，高壓液相色譜為單一峰(圖5)，此外，毛細(xì)管電泳色譜也為單一峰(圖6)，均可得到證實(shí)。
本發(fā)明所得到的力達(dá)霉素物質(zhì)，其理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道的力達(dá)霉素物質(zhì)一致。四、活性測(cè)定精原細(xì)胞法測(cè)定，選用雄性昆明小鼠，睪丸內(nèi)注射不同劑量的力達(dá)霉素，注射3天后處死動(dòng)物，取標(biāo)本，固定，包埋，切片，染色，最后在顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，力達(dá)霉素對(duì)精原細(xì)胞有強(qiáng)烈抑制作用，最低有效濃度為0.001μg/ml，比文獻(xiàn)報(bào)道的力達(dá)霉素(0.0039μg/ml)強(qiáng)3.9倍。
體外克隆生成測(cè)定法檢測(cè)，取腫瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔50個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后加不同濃度的力達(dá)霉素處理，7天后倒置顯微鏡下數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。結(jié)果顯示，力達(dá)霉素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用，殺傷力在10-16mol/L水平，包括人鼻咽癌KB細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞、人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞和人胃癌BGC-823細(xì)胞等(見表一)。本發(fā)明制備的力達(dá)霉素比文獻(xiàn)報(bào)道的力達(dá)霉素具有更強(qiáng)力的抗腫瘤活性，如對(duì)KB細(xì)胞，本發(fā)明的半數(shù)抑制濃度為2.6×10-16mol/L，文獻(xiàn)報(bào)道的為1.0×10-12mol/L(0.0001μg/ml)，對(duì)HT-29細(xì)胞，本發(fā)明的半數(shù)抑制濃度為1.1×10-16mol／L，文獻(xiàn)報(bào)道的為1.3×10-11mol/L，比本發(fā)明均大3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。
表一、力達(dá)霉素的體外抗腫瘤活性(克隆形成法測(cè)定)
體內(nèi)小鼠移植性結(jié)腸癌的療效實(shí)驗(yàn)，使用BALB/c小鼠，在腋窩皮下接種結(jié)腸癌26的瘤組織小塊，接種24小時(shí)后靜脈內(nèi)注射不同劑量的力達(dá)霉素，1次或3次，間隔3天，接種腫瘤10天后處死動(dòng)物，取腫瘤塊，稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明力達(dá)霉素對(duì)小鼠結(jié)腸癌有非常明顯的療效，一次給藥，0.15mg/kg劑量，腫瘤抑制率為84％，三次給藥，0.1mg/kg劑量，腫瘤抑制率為94％。采用等毒性劑量(1/4半數(shù)致死量LD50或1/8 LD50)，單次靜脈內(nèi)注射給藥的治療方案進(jìn)行比較，在相當(dāng)于1/4 LD50或1/8 LD50劑量時(shí)，力達(dá)霉素的腫瘤抑制率明顯高于臨床常用的抗腫瘤藥物表阿霉素和絲裂霉素C(見表二)。
表二、力達(dá)霉素、表阿霉素和絲裂霉素C對(duì)小鼠結(jié)腸癌C26的影響
藥效學(xué)與急性毒性研究，結(jié)果表明力達(dá)霉素對(duì)小鼠H22肝癌與Lewis肺癌均有高度療效。靜脈注射力達(dá)霉素的急性毒性LD50為0.4mg/kg，力達(dá)霉素對(duì)H22肝癌的ED50(50％抑瘤率)為0.013mg/kg，化療指數(shù)為31；靜脈注射絲裂霉素的LD50為5mg/kg，絲裂霉素對(duì)H22肝癌的ED50為0.78mg/kg，化療指數(shù)為6.4。力達(dá)霉素的化療指數(shù)明顯高于絲裂霉素。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是制備流程短，比文獻(xiàn)報(bào)道少四個(gè)步驟；產(chǎn)品穩(wěn)定性好，純度產(chǎn)率高，14.5mg／每升發(fā)酵液，比文獻(xiàn)報(bào)道的6.2mg/每升發(fā)酵液提高1.3倍；成本低，短流程和高產(chǎn)率減少了生產(chǎn)材料；產(chǎn)品活性強(qiáng)，比文獻(xiàn)報(bào)道的力達(dá)霉素強(qiáng)1000倍以上(克隆生成半數(shù)抑制濃度)，精原細(xì)胞法顯示，力達(dá)霉素對(duì)精原細(xì)胞的抑制率比現(xiàn)有技術(shù)制備的強(qiáng)3.9倍。
力達(dá)霉素物質(zhì)制備新方法實(shí)施例如下將力達(dá)霉素產(chǎn)生菌冷干管中加0.7ml無鹽水，使之形成菌懸液，用白金耳接種于高氏1號(hào)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，28℃，7-10天，表面生長(zhǎng)白色氣生菌絲，取一小塊接種一級(jí)種子100ml/500ml三角瓶(發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉1％，玉米漿0.5％，血胨0.5％，葡萄糖0.5％，無水硫酸鎂0.02％，碘化鉀0.06％，玉米面1.5％，碳酸鈣0.4％，自來水配制，pH7.0，15磅消毒)，28℃，旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)種5％于1000ml/5000ml立瓶中，為二級(jí)種子，發(fā)酵培養(yǎng)基同一級(jí)種子，28℃，往返搖床培養(yǎng)18小時(shí)，上200L發(fā)酵罐，裝量100L，接種量2％，加0.03％泡敵為消沫劑，罐壓0.04，28℃，攪拌400轉(zhuǎn)/分，氣流1/1，pH6.5-7.0，發(fā)酵96小時(shí)，得到所需要的發(fā)酵液。
取發(fā)酵液10L，離心，取上清液，用HCl調(diào)pH4.0，加硫酸銨4.5Kg，8℃攪拌3小時(shí)，析出的力達(dá)霉素離心分離(4℃，8000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，沉淀物加200冷水溶解，透析，離心除去不溶物，上清液經(jīng)羥基磷灰石柱吸附，0.001M磷酸緩沖液(pH6.8)洗脫，活性部分冷凍干燥，得粗制品1500mg。粗制品溶于水，經(jīng)Sephadex G-75柱層析，活性部分冷凍干燥，得到145mg抗腫瘤高活性力達(dá)霉素白色粉末精制品，其理化性質(zhì)及生物學(xué)特征如前所述。
權(quán)利要求
1．抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素的制備新方法，其特征是將力達(dá)霉素產(chǎn)生菌鏈霉菌C-1027在中性條件下振蕩培養(yǎng)發(fā)酵，其活性物質(zhì)經(jīng)羥基磷灰石和SephadexG-75分離、純化得到成品。
2．按照權(quán)利要求1所述的抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素的制備新方法，其特征是力達(dá)霉素產(chǎn)生菌在高氏1號(hào)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，28℃，7-10天，取一小塊接種一級(jí)種子(發(fā)酵培養(yǎng)基成分包含淀粉，玉米漿，血胨，葡萄糖，無水硫酸鎂，碘化鉀，玉米面，碳酸鈣等，pH7．0)，28℃，旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)種為二級(jí)種子，發(fā)酵培養(yǎng)基同一級(jí)種子，28℃，往返搖床培養(yǎng)18小時(shí)，上發(fā)酵罐，28℃，攪拌400轉(zhuǎn)/分，pH6.5-7.0，發(fā)酵96小時(shí)，得到所需要的發(fā)酵液。
3．按照權(quán)利要求1所述的抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素的制備新方法，其特征是將力達(dá)霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)硫酸銨沉淀，透析或超濾脫鹽，羥基磷灰石柱吸附，洗脫除雜質(zhì)，Sephadex G-75柱層析分離，進(jìn)一步洗脫除雜質(zhì)，冷凍干燥得到抗腫瘤高活性力達(dá)霉素白色粉末精制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大分子肽類抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素的制造新方法,由于力達(dá)霉素分子中肽與發(fā)色團(tuán)以非共價(jià)鍵結(jié)合,外界條件如有機(jī)溶煤、pH、洗脫劑離子特性、光和熱等因素影響其結(jié)合并易引起發(fā)色團(tuán)失活,采用羥基磷灰石柱吸附工藝,縮短流程,避光操作,可產(chǎn)生不同于一般離子交換層析的特殊分離效果,既提高了制品純度,也增強(qiáng)了它的穩(wěn)定性,生物活性實(shí)驗(yàn)證明,采用精原細(xì)胞法和克隆形成法檢測(cè)其活性明顯優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果,體內(nèi)對(duì)小鼠H22肝癌、Lewis肺癌、C26結(jié)腸癌有顯著療效。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1284566SQ0012152
公開日2001年2月21日 申請(qǐng)日期2000年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月10日
發(fā)明者邵榮光, 甄永蘇, 李電東, 胡繼蘭, 金蓮舫 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所