一種黃顙魚微衛(wèi)星家系鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃顙魚微衛(wèi)星家系鑒定方法，它包括黃顙魚親本和子代基因組DNA提取、多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成、微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型及家系鑒定等步驟，本發(fā)明采用了6對(duì)微衛(wèi)星引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1－12所示。本發(fā)明首次在黃顙魚上利用熒光標(biāo)記的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記建立了親子鑒定平臺(tái)，其鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到了98.9％，能快速、高效地鑒別黃顙魚不同家系，為黃顙魚的選育和繁殖配組提供了依據(jù)。本發(fā)明選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)目較多，多態(tài)性高，可以用于黃顙魚的群體遺傳學(xué)評(píng)價(jià)、系譜認(rèn)證、親子鑒定，也能夠用于分子標(biāo)記輔助家系管理和分子標(biāo)記輔助親本選擇。
【專利說明】一種黃顙魚微衛(wèi)星家系鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚類遺傳育種的分子標(biāo)記輔助技術(shù)，具體涉及一種利用熒光微衛(wèi)星標(biāo) 記鑒定黃顙魚家系的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃顙魚是我國江河、湖泊中的一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類，對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，廣泛 分布于我國淡水水體中。因其具有肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，含肉率高，除脊刺外沒有肌間刺等 優(yōu)點(diǎn)，頗受廣大消費(fèi)者歡迎。近年來，由于商品黃顙魚主要靠天然捕撈，濫捕現(xiàn)象日益嚴(yán)重。 加之湖泊河流受農(nóng)藥、工業(yè)廢水等污染程度加劇之因素，黃顙魚自然受到一定程度的破壞， 保護(hù)黃顙魚資源及相關(guān)的研究勢在必行。黃顙魚繁殖親本主要是野生捕撈或培養(yǎng)數(shù)代的種 群，沒有經(jīng)過人工選育，其生長速度、抗病能力和其它養(yǎng)殖性能等還未達(dá)到良種化的程度， 適應(yīng)集約化養(yǎng)殖能力較弱。因此，盡快開展黃顙魚良種選育工作對(duì)于黃顙魚種群保護(hù)和滿 足當(dāng)前健康養(yǎng)殖業(yè)的迫切需要具有極其重要的意義。
[0003] 在魚類遺傳育種研究中，清晰的系譜信息對(duì)于家系的選育和親本的管理至關(guān)重 要。傳統(tǒng)的水產(chǎn)動(dòng)物選擇育種中，養(yǎng)殖單位需要對(duì)不同的家系進(jìn)行分養(yǎng)來維持家系信息，所 需水體大且不便管理。尤其需要考慮的是，每個(gè)分養(yǎng)池之間在環(huán)境因子上會(huì)存在一些差異， 不同的環(huán)境因素會(huì)使育種相關(guān)的遺傳參數(shù)估計(jì)產(chǎn)生偏差。此時(shí)可以把不同家系混養(yǎng)在一 起，但是需對(duì)所有家系進(jìn)行非常復(fù)雜的標(biāo)記。在混合養(yǎng)殖群體中保持家系信息，大多數(shù)畜 牧上的研究以物理標(biāo)記為手段，而物理標(biāo)記對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物存在操作繁瑣、對(duì)生長有一定影 響及對(duì)幼體傷害較大等局限性。此外，黃顙魚等無鱗魚類受到物理標(biāo)記損傷后容易發(fā)病而 死亡。分子標(biāo)記的出現(xiàn)使得混養(yǎng)親緣關(guān)系的鑒定成為可能，以微衛(wèi)星分型為基礎(chǔ)的親子鑒 定技術(shù)是目前水產(chǎn)動(dòng)物系譜確認(rèn)中應(yīng)用最廣泛最可靠的手段之一。已應(yīng)用到羅非魚、大菱 鲆、凡納濱對(duì)蝦、牙鲆和鱖魚等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物育種中。目前，尚未見將微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于黃 顙魚家系鑒定的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種黃顙魚微衛(wèi)星家系鑒定方法，以減少在黃顙魚群體選育 中存在的近親繁殖現(xiàn)象。
[0005] 該方法包括以下步驟：
[0006] 1)黃顙魚親本和子代基因組DNA提取
[0007] 剪取用于構(gòu)建家系的黃顙魚親本的鰭條組織，以及將子代全魚去頭和內(nèi)臟，采用 醋酸銨法提取親本和子代的基因組DNA，檢測質(zhì)量和濃度后，稀釋至lOOng/μ1 ;
[0008] 2)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成
[0009] 選取6對(duì)微衛(wèi)星引物，按照片段大小分為2組，在正向引物的5'端分別用FAM(藍(lán) 色）、HEX(綠色）、TAMRA(黃色）三種不同的熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾，用于PCR分析；
[0010] 3)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型及家系鑒定
[0011] 采用熒光PCR反應(yīng)對(duì)親本及子代的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按照步驟2) 中所選微衛(wèi)星引物分組的方法進(jìn)行混合，作為上機(jī)檢測的樣品，樣品在ABI3730XL基因分 析儀上進(jìn)行分型，用GS-500作為內(nèi)參，用GeneMarkerVI. 5軟件讀取每個(gè)樣品的基因型，采 用CERVUS3. 0軟件對(duì)親本基因型和子代基因型進(jìn)行分析，判定子代個(gè)體的父母本，
[0012] 所述的6對(duì)微衛(wèi)星引物的核苷酸序列分別為：
[0013] 第1對(duì)：正向引物如SEQIDNO. 1所示；反向引物如SEQIDNO. 2所示；
[0014] 第2對(duì)：正向引物如SEQIDNO. 3所示；反向引物如SEQIDNO. 4所示；
[0015] 第3對(duì)：正向引物如SEQIDNO. 5所示；反向引物如SEQIDNO. 6所示；
[0016] 第4對(duì)：正向引物如SEQIDNO. 7所示；反向引物如SEQIDNO. 8所示；
[0017] 第5對(duì)：正向引物如SEQIDNO. 9所示；反向引物如SEQIDNO. 10所示；
[0018] 第6對(duì)：正向引物如SEQIDNO. 11所示；反向引物如SEQIDNO. 12所示；
[0019] 其中，第1、2、4對(duì)為一組，第3、5、6對(duì)為另一組；第1、3對(duì)采用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行 修飾；第2、5對(duì)采用HEX熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾；第4、6對(duì)采用TAMRA熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾。
[0020] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1)首次在黃顙魚上利用熒光標(biāo)記的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記建立了親子鑒定平臺(tái)，其鑒定 準(zhǔn)確率達(dá)到了 98. 9%。本發(fā)明能快速、有效地鑒別黃顙魚不同家系，為黃顙魚的選育和繁殖 配組提供了依據(jù)。
[0022] 2)本發(fā)明按照微衛(wèi)星熒光標(biāo)記的顏色不同進(jìn)行分組，將每組的3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)產(chǎn) 物混合在一起上樣，比正常PCR檢測方法提高了 3倍效率，同時(shí)節(jié)約了成本和時(shí)間。
[0023] 3)本發(fā)明可應(yīng)用于黃顙魚混養(yǎng)家系的鑒定，在生產(chǎn)中不需要將各家系子代分開飼 養(yǎng)，節(jié)約了水體和人工管理，降低了成本，同時(shí)克服了環(huán)境因素所造成的誤差，使得親子鑒 定技術(shù)可以在生產(chǎn)中大力推廣。
[0024] 4)本發(fā)明選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)目較多，多態(tài)性高，可以用于黃顙魚的群 體遺傳學(xué)評(píng)價(jià)、系譜認(rèn)證、親子鑒定，也能夠用于分子標(biāo)記輔助家系管理和分子標(biāo)記輔助親 本選擇。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。
[0026] 1)黃顙魚家系的建立
[0027] 從洪湖、洞庭湖、鐘祥南湖和長湖四個(gè)湖泊中收集野生黃顙魚親本進(jìn)行雜交繁殖， 后代Fl群體中隨機(jī)選取雌雄各18尾，進(jìn)行人工催產(chǎn)繁殖，雌雄配比1: 1，建立18個(gè)全同胞 家系。剪取每個(gè)家系親本的鰭條組織放于無水乙醇內(nèi)，并做好家系信息記錄，于_2〇°C保存 備用。將18個(gè)家系分別放于18個(gè)塑料水箱中分養(yǎng)，待魚苗孵出30天后，從每個(gè)家系中隨 機(jī)選取10尾魚左右，用無水乙醇固定，作為家系鑒定的樣本。
[0028] 2)黃顙魚親本和子代基因組DNA提??；
[0029] 將親本個(gè)體的鰭條組織和子代全魚去頭和內(nèi)臟分別放于2ml的離心管中，用剪刀 將組織剪碎，加入 600μL的細(xì)胞裂解液（Tris-HCllOOmM，pH8. 0;EDTA50mm/L，pH8. 0; SDS1%，ρΗ8.0;NaCl125mM)，在每個(gè)管中加入濃度為20mg/mL的蛋白酶K9yL，放入 60°C水浴鍋中水浴2-4h，每隔半小時(shí)搖動(dòng)下離心管，直到組織充分裂解。將離心管冷卻至 室溫，加入200μL7. 5M的醋酸銨，充分搖勻，放置于4°C冰箱內(nèi)冷卻5min，12,OOOrpm4°C離心IOmin,取500ml上清液至新I. 5ml離心管。加入600ml異丙醇，充分混勻，室溫下沉 淀l-2min，12,000rpm4°C離心IOmin,棄去異丙醇。加入70%的酒精洗漆DNA，12,000rpm 4°C離心5min，棄去70%的酒精。加入無水乙醇，12,OOOrpm4°C離心5min，棄去無水乙醇， 反復(fù)幾次，室溫干燥約30min,加入100μL雙蒸水溶解DNA。用NanoDropND-1000紫外分 光光度計(jì)檢測DNA濃度和質(zhì)量，將各DNA樣品稀釋至IOOng/μL。
[0030] 3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和反應(yīng)體系：
[0031] 從轉(zhuǎn)錄組測序中的微衛(wèi)星引物進(jìn)行篩選，最終選擇6對(duì)條帶清晰，多態(tài)性高的引 物作為家系鑒定的引物。在每組微衛(wèi)星引物的正向引物5'端分別用FAM、HEX、TAMRA三種 不同的熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾（見表1)，引物在北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。PCR反 應(yīng)體系為1〇μL:含有3. 5μL雙蒸水，正、反引物各0. 5μ1(10μπι/υ，5μLMIX酶，0. 5μL DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)在C1000DNAEngineThermalCycler上完成，PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min;95°C變性30s，Ta退火30s，72°C延伸45min，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C再延伸 7min。Ta值見表1。
[0032] 表1.用于黃顙魚家系鑒定的微衛(wèi)星引物序列信息和反應(yīng)條件
[0033] 1\. I V,/WJ ΙΛ. I V.A..；V I IA.. V.. IV.IV.I

【權(quán)利要求】
1. 一種黃顙魚微衛(wèi)星家系鑒定方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 黃顙魚親本和子代基因組DNA提取 剪取用于構(gòu)建家系的黃顙魚親本的鰭條組織，以及將子代全魚去頭和內(nèi)臟，采用醋酸 銨法提取親本和子代的基因組DNA，檢測質(zhì)量和濃度后，稀釋至lOOng/yl ; 2) 多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成 選取6對(duì)微衛(wèi)星引物，按照片段大小分為2組，在正向引物的5'端分別用FAM、HEX、 TAMRA三種不同的熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾，用于PCR分析； 3) 微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型及家系鑒定 采用熒光PCR反應(yīng)對(duì)親本及子代的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按照步驟2)中 所選微衛(wèi)星引物分組的方法進(jìn)行混合，作為上機(jī)檢測的樣品，樣品在ABI3730XL基因分析 儀上進(jìn)行分型，用GS-500作為內(nèi)參，用GeneMarker VI. 5軟件讀取每個(gè)樣品的基因型，采用 CERVUS 3. 0軟件對(duì)親本基因型和子代基因型進(jìn)行分析，判定子代個(gè)體的父母本， 所述的6對(duì)微衛(wèi)星引物的核苷酸序列分別為： 第1對(duì)：正向引物如SEQ ID NO. 1所示；反向引物如SEQ ID NO. 2所示； 第2對(duì)：正向引物如SEQ ID NO. 3所示；反向引物如SEQ ID NO. 4所示； 第3對(duì)：正向引物如SEQ ID NO. 5所示；反向引物如SEQ ID NO. 6所示； 第4對(duì)：正向引物如SEQ ID NO. 7所示；反向引物如SEQ ID NO. 8所示； 第5對(duì)：正向引物如SEQ ID NO. 9所示；反向引物如SEQ ID NO. 10所示； 第6對(duì)：正向引物如SEQ ID NO. 11所示；反向引物如SEQ ID NO. 12所示； 其中，第1、2、4對(duì)為一組，第3、5、6對(duì)為另一組；第1、3對(duì)采用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾； 第2、5對(duì)采用HEX熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾；第4、6對(duì)采用TAMRA熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104357553SQ201410543076
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月14日
【發(fā)明者】梅潔, 張晉, 馬文閣, 趙曉含, 靖靜, 吳俊頡, 王衛(wèi)民, 桂建芳 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)