一種骨質疏松斑馬魚模型的構建方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術領域】，具體涉及一種骨質疏松斑馬魚模型的構建方法及其應用。本發(fā)明通過應用tol2-gateway技術，在獲得成骨細胞特異性轉錄因子的啟動子后，構建出骨骼報告綠色熒光的轉基因斑馬魚，并用該品系斑馬魚建造糖皮質激素誘導的骨質疏松斑馬魚模型，同時應用壯骨補腎中藥淫羊藿總黃酮對其進行評估。采用本發(fā)明的方法構建的骨質疏松模型方便、可行、有效，與傳統(tǒng)的化學染色方法相比更加穩(wěn)定、省時、高效，適合抗骨質疏松藥物的高通量篩選。
【專利說明】一種骨質疏松斑馬魚模型的構建方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術領域】，具體涉及一種骨質疏松斑馬魚模型的構建方法及其應用。

【背景技術】
[0002]骨質疏松癥(Osteoporosis，0P)是以骨量減少、骨的微觀結構退化和骨折危險為特征的一類疾病。其引起的危害逐漸受到人們的關注，積極開發(fā)防治骨質疏松藥物也慢慢成為醫(yī)學界活躍的領域之一。對于藥物的研發(fā)，實驗模型顯得尤為重要。細胞模型，其作用環(huán)節(jié)單一，難以體現藥物整體觀，也無法評估藥物在體情況；傳統(tǒng)的動物如小鼠等作為藥物篩選模型因費用高，造模時間長，無法對其在體觀察和定位等缺陷，局限了藥物高通量篩選的應用。
[0003]斑馬魚，一種熱帶鯉科魚。由于它具有體積小，繁殖周期快、胚胎透明、骨骼發(fā)育迅速、與人類相關基因和信號通路有高度同源性等特點，而逐漸被應用于骨骼疾病模型的研究。臨床上，經?；虼罅渴褂锰瞧べ|激素治療的病人會出現骨質疏松副作用，小鼠等動物應用糖皮質激素也可導致骨質疏松。從魚類到哺乳動物，糖皮質激素系統(tǒng)具有高度的保守性，因此，糖皮質激素也被應用于斑馬魚骨質疏松模型的建立。骨骼染色是對骨骼最基本的研究方法，傳統(tǒng)的染色試劑有韓黃綠素(calcein),槲皮素(quercetin)和菌素紅(Alizarinred)等。其中，茜素紅染色主要是與鈣離子形成螯合物，是目前研究斑馬魚骨礦化情況的主要方法。但該方法存在實驗步驟繁瑣，花費時間長，染色效果不穩(wěn)定等缺陷。
[0004]轉基因技術是近年來應用于斑馬魚進行疾病模型或基因分子水平研究的新方法。傳統(tǒng)轉基因斑馬魚技術是通過顯微注射將外源DNA如報告基因GFP(green fluorescentprotein)或(RFP, red fluorescent protein)注射到受精卵中，以便其整合到斑馬魚基因組中并在特定組織和器官中表達。這種方法存在轉基因效率低，并且親代遺傳率也低的缺點。


【發(fā)明內容】

[0005]為了解決以上問題,本發(fā)明通過應用tol2_gateway技術(它利用Tol2轉座子特性，在構建組織特異性啟動子帶報告基因如GFP或RFP的表達載體后，將該質粒和體外合成的相應轉座酶mRNA共注射到單細胞期的斑馬魚胚胎中?；谵D座子的特性，便可形成高效的基因轉移和遺傳，大大提高了初代注射成功率及傳代穩(wěn)定性。)構建了骨骼報告綠色熒光的轉基因斑馬魚，并用該品系斑馬魚構建了糖皮質激素誘導的骨質疏松斑馬魚模型，進而將該模型應用于抗骨質疏松藥物的高通量篩選中。
[0006]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其包括以下步驟:
[0007]1、斑馬魚的繁殖；
[0008]2、轉基因斑馬魚的構建；
[0009]3、采用藥物對轉基因斑馬魚進行造模；
[0010]其中，在步驟2所述的轉基因斑馬魚的構建過程中，應用tol2-gateway轉基因技術分別構建質粒 5’Entry clone:p5E_0sterix, Middle Entry clone:pME-nIs EGFP 和3’Entry clone:p3E-Poly A,并將上述質粒進行三片段LR反應,獲得表達質粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA,最后將所述表達質粒與Tol2mRNA混合，顯微注射到斑馬魚胚胎細胞中。
[0011]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，步驟2中所述的表達質粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA 的結構如附圖1 所不。
[0012]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，步驟3中所采用的藥物為地塞米松DEX，其最佳濃度為 10 μ M。
[0013]在本發(fā)明的技術方案中，還進一步包括對骨質疏松斑馬魚模型進行評估驗證的步驟。
[0014]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的評估驗證包括藥物評估驗證、骨礦化定量分析、行為學分析和骨相關因子水平變化監(jiān)測。
[0015]在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，藥物評估驗證所采用的藥物分別為地塞米松DEX和淫羊藿黃酮FE，其中淫羊藿黃酮FE的最佳拯救濃度為I μ g/ml。
[0016]本發(fā)明再一方面還提供了本發(fā)明所述的骨質疏松斑馬魚模型在篩選抗骨質疏松藥物中的應用。
[0017]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述藥物分別為骨吸收抑制劑類藥物、骨形成促進類藥物、骨礦化促進類藥物以及中藥類藥物。
[0018]在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述的骨吸收抑制劑類藥物為雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素、雌激素受體調節(jié)劑和依普黃酮，骨形成促進類藥物為氟制劑、甲狀旁腺激素制劑、活性維生素D制劑，骨礦化促進類藥物為鈣劑、維生素D及其活性代謝物。
[0019]在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述的中藥類藥物為淫羊藿、熟地、杜仲、丹參、黃芪和蛇床子。
[0020]本發(fā)明通過應用tol2_gateway技術,在獲得成骨細胞特異性轉錄因子(Osterix)的啟動子后，構建出骨骼報告綠色熒光的轉基因斑馬魚，并用該品系斑馬魚建造糖皮質激素誘導的骨質疏松斑馬魚模型，同時應用壯骨補腎中藥淫羊藿總黃酮來進行評估，結果證明該方法構建的模型方便、可行、有效，與傳統(tǒng)的骨骼固定染色方法相比更加穩(wěn)定、省時、高效，適合抗骨質疏松藥物的高通量篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1 為表達質粒 pDestTol2CG2_osterix-nls-EGFP-pA 的結構不意圖。
[0022]圖2為構建骨骼帶綠色熒光標記轉基因斑馬魚發(fā)育變化示意圖。
[0023]圖3為不同劑量地塞米松DEX誘導斑馬魚骨質疏松導致骨量丟失示意圖。
[0024]a:茜素紅染色骨量丟失情況示意圖；
[0025]b:熒光顯示骨量丟失情況示意圖；
[0026]c:放大顯示b圖DMSO組長方形方框成骨細胞示意圖；
[0027]d:放大b圖10 μ M DEX組長方形方框成骨細胞減少示意圖。
[0028]圖4為對圖3中兩種方法圖片骨礦化情況進行量化示意圖。
[0029]a:菌素紅染色面積量化示意圖；
[0030]b:突光面積量化不意圖；
[0031]c:熒光積分光密度1D量化示意圖。
[0032]圖5為不同劑量地塞米松DEX處理后,斑馬魚行為學分析示意圖。
[0033]a:斑馬魚游泳路線示意圖；
[0034]b:游泳路線量化示意圖。
[0035]圖6淫羊藿總黃酮FE對兩種方法的斑馬魚骨質疏松防治效果示意圖。
[0036]a:FE對野生型斑馬魚骨質疏松骨量丟失防治作用示意圖；
[0037]b:FE對熒光斑馬魚骨質疏松骨量丟失防治作用示意圖；
[0038]圖7為淫羊藿總黃酮FE對兩種方法的斑馬魚骨質疏松防治效果進行量化示意圖。
[0039]a:茜素紅染色面積量化示意圖；
[0040]b:突光面積量化示意圖；
[0041]c:熒光積分光密度1D量化示意圖。
[0042]圖8為淫羊藿總黃酮FE對斑馬魚骨質疏松防治效果行為學分析示意圖。
[0043]a:FE對斑馬魚游泳能力影響示意圖；
[0044]b:游泳路線量化示意圖。
[0045]圖9為骨相關因子水平變化情況示意圖。

【具體實施方式】
[0046]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應當指出，對于本領域技術人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護范圍之內。
[0047]實施例1斑馬魚的繁殖
[0048]斑馬魚(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院斑馬魚模式動物平臺提供)喂養(yǎng)于專門的魚缸中，控制日照周期(光照14小時，黑夜10小時)。前一天傍晚將雄魚與雌魚(1:2)放于繁殖缸中，第二天收集受精卵，置于培養(yǎng)皿中，同時加入胚胎水(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mMCaCl2, 0.33mM MgSO4)，28.5°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。斑馬魚胚胎一般7天內不用喂食。
[0049]實施例2轉基因斑馬魚的構建
[0050]一、實驗方法
[0051]應用tol2_gateway 轉基因技術構建質粒 5’ Entry clone:p5E-0sterix, MiddleEntry clone:pME-nIs EGFP 和 3’Entry clone:p3E-Poly A。將上述三個質粒進行三片段LR 反應,獲得表達質粒 pDestTol2CG2-osterix-nls_EGFP-pA。
[0052]早上，收集受精卵胚胎后，將其固定于放有瓊脂凝膠的平皿中，把表達質粒pDestTol2CG2-osterix-nls_EGFP-pA 與 Tol2mRNA 混合(最終濃度為 50ng/ μ I),顯微注射入一個細胞期的斑馬魚胚胎細胞中。隔天，熒光顯微鏡下進行篩選報告綠色熒光的魚，培養(yǎng)至成魚為H)代。之后用H)代與野生型雜交得Fl代，如此循環(huán)，F3代開始用于實驗。
[0053]二、實驗結論
[0054]表達質粒pDestTol2CG2-osterix_nls EGFP-pA示意圖如附圖1所示,將表達質粒與Tol2mRNA —起混合，注射入一個細胞期的斑馬魚胚胎細胞中，由于有Tol2跳躍基因的幫助，會大大提高初代注射轉基因的成功率，隨后進行篩選，便可得到骨骼報告綠色熒光的轉基因斑馬魚，具體參見附圖2。最初，可發(fā)現綠色熒光出現在頭部和環(huán)繞身體尾鰭部分(第I天)，之后頭部熒光明顯增加(第8天)，到中期，熒光會在脊椎及鰭中表現(第15天)，后期熒光覆蓋整個身體的骨骼(第30天)，甚至鱗片(第42天)。這樣骨骼有熒光標記的斑馬魚對于骨骼的發(fā)育與骨骼疾病的研究相當直觀，也相當方便。
[0055]實施例3不同劑量DEX對野生型與轉基因斑馬魚骨骼的影響(Glucocorticoid-1nduced osteoporosis, G1P 模型的構建)
[0056]一、實驗方法
[0057]1、骨質疏松模型的設計
[0058]取受精后3天的野生型與轉基因斑馬魚胚胎放入盛有胚胎水(野生型需加入PTU，N-Phenylth1urea用來抑制色素形成，以免影響染色結果)的12孔培養(yǎng)板中，每孔放6_8條幼魚，實驗分DMSO陰性對照組和地塞米松DEX (Dexamethasone，MP公司)模型組。地塞米松模型組設5，10，20μΜ三個濃度以便選取最佳的造模濃度。實驗最少重復3次以上，保證科學性和可靠性。每孔加入2mL (含溶媒或是藥物)的胚胎水，28.5°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天進行半量換液，連續(xù)培養(yǎng)5天，結束實驗。
[0059]2、骨礦化定量分析
[0060]實驗結束，將斑馬魚置于MS-222 (sigma)中麻醉致死，去除MS-222麻醉劑，PBS清洗一遍，后將幼魚固定于4%多聚甲醛中。野生型斑馬魚用茜素紅(Alizarin red，MP)對其進行染色。轉基因斑馬魚直接用I %低熔點瓊脂糖凝膠固定于共聚焦玻底皿中，于激光共聚焦顯微鏡掃描3D熒光圖片。
[0061]3、行為學分析
[0062]實驗結束當天，在實施例三和四實驗的各分組中隨機挑出I條斑馬魚放于6孔板中，觀察其游泳能力。實驗前，先把斑馬魚靜置15-30分鐘，讓其安靜、穩(wěn)定，后放入Noldus (Holland)行為學分析系統(tǒng)觀察箱中進行5分鐘的游泳能力行為學觀察，包括I分鐘準備，2次I分鐘光照和I分鐘黑暗，同時應用Ethovis1n XT (VIS1N 11)軟件對實驗過程進行監(jiān)測和數據處理。其中6孔板中每孔直徑設置為5cm。
[0063]4、數據處理與統(tǒng)計學計算
[0064]茜素紅染色的斑馬魚用體視顯微鏡(Leica)對其捕獲采集圖像，轉基因斑馬魚則采用激光共聚焦顯微鏡掃描3D熒光圖片，所有的圖像均統(tǒng)一采用相同拍攝參數包括，體位、放大倍數、光強度、吸收度和曝光設置等，以確保可比性。然后采用圖像分析軟件ImagePro Plus 6.0分別計算染色面積和熒光面積及熒光積分光密度。數值用平均值土標準偏差表示。統(tǒng)計學分析采用Excel軟件(Microsoft Office)中的雙尾t檢驗，P〈0.05認為組間差異有統(tǒng)計學意義。
[0065]二、實驗結論
[0066]顯微成像表明，茜素紅染色與熒光轉基因斑馬魚結果基本一致，與陰性對照組相t匕，5、10和20 μ M的DEX模型組茜素紅染色面積及熒光面積明顯減少，具體參見附圖3中a, b 圖。
[0067]應用IPP6圖像軟件對DEX誘導斑馬魚骨丟失程度進行量化，具體參見附圖4。5 μ MDEX組的斑馬魚骨骼礦化量與陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，當劑量增加至10、20μΜ時，差異也具有統(tǒng)計學意義(Ρ〈0.01)。說明DEX對斑馬魚骨礦化程度影響呈濃度依賴性，濃度越高礦化面積減少越明顯；這在茜素紅染色和轉基因斑馬魚是一致，具體參見附圖4中a，b圖。但對于轉基因斑馬魚，熒光1D在一定程度上還可以代表斑馬魚骨礦化(骨密度)程度的變化。從附圖4中c圖數據可以看出，DEX對1D的影響也呈濃度依賴性，DEX作用濃度越高骨密度減少越明顯(P〈0.05)。另外，轉基因斑馬魚的另一個優(yōu)勢是，它還能清楚直接觀察到骨細胞等的變化，參見附圖3中c與d圖。(η = 5-6)
[0068]行為學游泳實驗表明，具體參見附圖5a。相對于DMSO組，DEX 3個濃度組斑馬魚的游泳能力明顯下降，也呈劑量依賴性。數據統(tǒng)計分析見附圖5b，與陰性對照組相比5 μ M DEX組的斑馬魚游泳能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計學意義(Ρ〈0.05)，當劑量增加至10、20 μ M時，差異也具有統(tǒng)計學意義，且更加明顯(Ρ〈0.01)。(η = 5)
[0069]以上說明，DEX既能引起斑馬魚的骨量丟失，還減少斑馬魚的游泳活動能力，能成功誘導斑馬魚造成骨質疏松。下述的所有實驗中我們選取10 μ M的DEX作為造模濃度。
[0070]實施例4淫羊藿總黃酮對斑馬魚骨質疏松的防治作用
[0071]一、實驗方法
[0072]1、藥物對模型評估驗證的設計
[0073]取受精后3天的野生型與轉基因斑馬魚胚胎放入盛有胚胎水(野生型加入PTU)的12孔培養(yǎng)板中，每孔放6-8條幼魚，分DMSO陰性對照組、地塞米松造模組和地塞米松造模組 + 淫羊藿黃酮 FE (Flavonoids derived from Epimedium,純度 >90% )藥物組，同樣 FE設1，0.5,0.1 μ g/ml三個濃度以便選取最佳藥物拯救濃度。實驗最少重復3次以上,每天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)5天，結束實驗。
[0074]2、骨礦化定量分析
[0075]具體實驗方法與實施例三中相同。
[0076]3、行為學分析
[0077]具體實驗方法與實施例三中相同。
[0078]4、數據處理與統(tǒng)計學計算
[0079]具體實驗方法與實施例三中相同。
[0080]二、實驗結論
[0081]為了評估模型的效果，我們選取了傳統(tǒng)的補腎壯骨中藥提取物FE來驗證。從附圖6a，b，可以看出與DEX模型組相比，應用FE作用的藥物組骨礦化面積及骨礦化密度有明顯的增加趨勢。數據量化統(tǒng)計分析見附圖7，與DEX模型組相比，當FE濃度為0.1 μ g/ml時無顯著性差異，而劑量增至0.5、I μ g/ml時，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。說明FE能預防DEX誘導的斑馬魚骨量丟失，促進斑馬魚骨礦化面積和骨密度的增加。(η = 5-6)
[0082]行為學游泳實驗同樣表明，具體參見附圖8a，相對于DEX模型組，FE藥物組斑馬魚的游泳能力有所提高。數據統(tǒng)計分析見附圖8b，FE濃度為lyg/ml組能改善DEX造成斑馬魚游泳能力的下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。(η = 7)
[0083]實施例5骨相關因子水平變化情況的研究
[0084]一、實驗方法
[0085]在上述實驗結束時，分別收集陰性對照組、最佳造模組和最佳藥物拯救組斑馬魚12-15條，應用trizol法進行總RNA的提取，去基因組DNA后反轉錄為cDNA，實時熒光定量 PCR 檢測成骨因子 Osterix, osteocalcin, osteopontin 和破骨因子 tracp (TartrateResistant Acid Phosphatase),及 eGFP 等基因的水平變化。
[0086]二、實驗結論
[0087]為了觀察斑馬魚骨骼基因水平的變化情況，本發(fā)明選擇了 DMSO陰性對照組，10 μ M DEX造模組和I μ g/ml FE藥物預防組,檢測其成骨因子Osterix, osteocalcin和osteopontin,破骨因子tracp及熒光報告基因eGFP等的水平變化。熒光定量PCR結果顯不見附圖9,與DMSO陰性對照相比,DEX模型組下調Osterix, osteocalcin和osteopontin等成骨因子水平，而上調tracp破骨因子水平，具有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)。與DEX模型組相比，FE藥物預防組上調Osterix, osteocalcin和osteopontin等成骨因子水平,具有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)，但對tracp破骨因子水平沒有影響，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？紤]到eGFP作為轉基因斑馬魚骨骼的一個重要報告基因，我們也對其進行了分子水平上變化的檢測。結果表明，其與圖片顯示結果相符，與DMSO組比，DEX模型組使其水平降低；而FE藥物預防組則能使其水平顯著升高，都具有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)，相對于DEX模型組。(η = 4)
【權利要求】
1.一種骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其包括以下步驟: (1)斑馬魚的繁殖； (2)轉基因斑馬魚的構建； (3)采用藥物對轉基因斑馬魚進行造模； 其特征在于，在步驟(2)所述的轉基因斑馬魚的構建過程中，應用tol2-gateWay轉基因技術分別構建質粒5’Entry clone:p5E-0sterix,Middle Entry clone:pME-nIs EGFP和3’Entry clone:p3E-Poly A,并將上述質粒進行三片段LR反應,獲得表達質粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA，最后將所述表達質粒與Tol2mRNA混合，顯微注射到斑馬魚胚胎細胞中。
2.根據權利要求1所述的骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其中步驟(2)中所述的表達質粒 pDestTol2CG2_osterix-nls-EGFP-pA 的結構如圖1 所不。
3.根據權利要求1所述的骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其中步驟(3)中所采用的藥物為地塞米松DEX，其最佳濃度為10 μ M。
4.根據權利要求1所述的骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其中還進一步包括對骨質疏松斑馬魚模型進行評估驗證的步驟。
5.根據權利要求4所述的骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其中所述的評估驗證包括藥物評估驗證、骨礦化定量分析、行為學分析和骨相關因子水平變化監(jiān)測。
6.根據權利要求5所述的骨質疏松斑馬魚模型的構建方法，其中藥物評估驗證所采用的藥物分別為地塞米松DEX和淫羊藿黃酮FE，其中淫羊藿黃酮FE的最佳拯救濃度為I μ g/ml ο
7.權利要求1-6所述的骨質疏松斑馬魚模型在篩選抗骨質疏松藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其中所述藥物分別為骨吸收抑制劑類藥物、骨形成促進類藥物、骨礦化促進類藥物以及中藥類藥物。
9.根據權利要求8所述的應用，其中所述的骨吸收抑制劑類藥物為雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素、雌激素受體調節(jié)劑和依普黃酮，骨形成促進類藥物為氟制劑、甲狀旁腺激素制劑、活性維生素D制劑，骨礦化促進類藥物為鈣劑、維生素D及其活性代謝物。
10.根據權利要求7所述的應用，其中所述的中藥類藥物為淫羊藿、熟地、杜仲、丹參、黃芪和蛇床子。
【文檔編號】C12N15/63GK104313043SQ201410515404
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權日:2014年9月29日
【發(fā)明者】張晶晶, 黃洪新, 蕭崇德, 曾榮 申請人:廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院