用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法，該試劑盒包括盒體，其盒體內(nèi)設有一個9孔磁力架(1)，用于置放所述9孔磁力架和多瓶試劑的下凹位，以及成型紙盒(8)和盒內(nèi)擋板(7)。采用本發(fā)明，可準確選擇吸附位置，快捷、高效地提取植物寄生線蟲核酸，并簡化其操作過程。
【專利說明】用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及檢驗檢疫技術，尤其涉及一種用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法。

【背景技術】
[0002]植物寄生線蟲是一種體型微小，通常肉眼不可見的蠕蟲形動物。傳統(tǒng)分類方法是將線蟲列入線形動物門中線蟲綱。植物寄生線蟲主要通過取食植物根系，造成植物根系畸形、養(yǎng)分吸收困難甚至腐爛，從而影響作物產(chǎn)量。
[0003]據(jù)統(tǒng)計，因線蟲危害全球每年糧食和纖維作物損失高達800億美元，歷史上甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)、馬鈴薯金線蟲(Globodera rostocheinsis),溫暖地區(qū)的根結線蟲(Meloidogyne spp)等都引起嚴重的植物線蟲病害。東北和黃淮地區(qū)的大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、鱗球莖莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)都一直造成生產(chǎn)上的嚴重損失。近年來松材線蟲(Bursaphelenchus Xylophilus)在江蘇、安徽、廣西、云南等省蔓延引起一些松樹樹種的毀滅性危害?？梢姡参锛纳€蟲病害-直受到人門的重視，一直以來都是口岸檢驗檢疫工作中，需要檢測的一類植物有害生物。
[0004]近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，多種線蟲分子生物學檢測技術不斷建立，例如:實時熒光PCR技術、RFLP技術和LAMP技術，這些技術均建立在線蟲核酸提取的基礎上，但目前大多數(shù)線蟲核酸提取的方法存在諸多問題，諸如提取效率低、不穩(wěn)定、包含一些有毒有害物質等，這些問題都影響了對這類有害生物檢測方法的建立和應用。因此線蟲核酸的穩(wěn)定提取成為限制這些技術進一步推廣完善的重要因素。國內(nèi)一些學者也發(fā)表文章開始提供一些線蟲核酸分離的方法，常用的蠕蟲裂解法，對線蟲核酸的裂解提取效果較好，但其操作時間較長，新近一些學者發(fā)表的冷凍-酶解法針對一些體形較大體壁較薄的線蟲種類效果較好，但其基于變溫形成的裂解力效率較低，適用范圍較窄，且穩(wěn)定性較差。
[0005]由于線蟲體型微小，肉眼不可見，對其核酸的有效提取和富集是對其進行分子檢測的關鍵。基于納米富集技術的有害生物核酸提取方法在近幾年發(fā)展迅速，已經(jīng)在植物病毒、植物真菌、植物細菌等領域出現(xiàn)較多研究和方法的建立，但尚未應用到植物線蟲研究領域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法，以快捷、高效地提取植物寄生線蟲核酸，并簡化其操作過程。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的:
[0008]一種用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，包括盒體；該盒體內(nèi)設有一個9孔磁力架1，用于置放所述9孔磁力架和多瓶試劑的下凹位，以及成型紙盒8和盒內(nèi)擋板7。
[0009]其中，所述9孔磁力架，設有分列兩排的9個圓形孔；具體為:一排設有3個供1.5ml離心管適用的孔；另一排設有6個供0.2ml離心管適用的孔。
[0010]所述分列兩排的9個圓形孔之間，設有可上下移動的磁力板11，所述磁力板11通過調節(jié)鈕13沿磁力板調節(jié)道12上下移動。
[0011]所述試劑盒進一步包括一個用于存放試劑盒說明書的槽位6。
[0012]所述多瓶試劑，具體為:線蟲核酸裂解液2、線蟲核酸富集液3、線蟲核酸洗滌液4和線蟲核酸釋放液5。
[0013]所述線蟲核酸裂解液2，包含:20mmol/L醋酸鉀，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.3M鹽酸胍，0.2mM檸檬酸鈉，0.1mM硫酸，0.1mM蛋白酶K。
[0014]所述線蟲核酸富集液3，主要由粒徑為200nm的磁珠和緩沖液組成，所述緩沖液，具體為:2%PEG 2000,0.lmol/L NaCl，0.001mol/L KC1，0.01mol/LNa2HP04，0.002mol/LKH2P04, pH7.2 ?7.4。
[0015]所述線蟲核酸洗滌液4，包含:2mM乙二胺四乙酸和2mMTris_HCL。
[0016]所述線蟲核酸釋放液5為20%乙醇溶液。
[0017]一種用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒的使用方法，該方法包括:
[0018]步驟一:向0.2mlpcr管里加入1ul滅菌水，將多條或單條線蟲，挑取或吸取放入該管中，向管中加入2ul線蟲核酸裂解液，56度水浴中保存30分鐘；
[0019]步驟二:向上述步驟一中的per管中加入3ul線蟲核酸富集液，充分混勻后，靜置5分鐘，此時形成磁珠-核酸復合體；
[0020]步驟三:將上述步驟二中的per管置于磁力架上，調節(jié)磁力板位置，使吸附點位于per管底部，待磁珠-核酸復合體充分被吸附到per管底部后，使用移液器將上清液全部吸出棄掉；
[0021]步驟四:將上述步驟三的per管從磁力架上取下，向其中加入1ul線蟲核酸洗滌液，使用移液器輕吹打散磁珠-核酸復合體，靜置5分鐘后，重復步驟三，再次吸附磁珠-核酸復合體，棄上清液；
[0022]步驟五:將上述步驟四per管從磁力架上取下，向其中加入1ul線蟲核酸釋放液，使用移液器輕吹打散磁珠-核酸復合體，靜置5分鐘后，再次將per管置于磁力架上，此時核酸已釋放于上清液中，小心吸取上清液，直接用于后續(xù)檢測或_20°C冷凍保存待用。
[0023]本發(fā)明所提供的用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法，具有以下優(yōu)占-
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[0024]使用本發(fā)明的用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒和采用其使用方法，經(jīng)過富集可提高核酸濃度，從而提高檢測靈敏度和準確性。該試劑盒還具有使用簡便、操作步驟少、提取核酸用時較短的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒的俯視圖；
[0026]圖2為圖1所示試劑盒含磁力架的結構示意圖；
[0027]圖3為用普通PCR驗證通用引物檢驗示意圖；
[0028]圖4為實時熒光PCR驗證顯示結果示意圖。
[0029]【主要部件/組件符號說明】
[0030]I:9孔磁力架
[0031]11:可調節(jié)磁力板
[0032]12:磁力板調節(jié)道
[0033]13:調節(jié)鈕
[0034]2:線蟲核酸裂解液
[0035]3:線蟲核酸富集液
[0036]4:線蟲核酸洗滌液
[0037]5:線蟲核酸釋放液
[0038]6:槽位
[0039]7:盒內(nèi)檔板
[0040]8:成型紙盒。

【具體實施方式】
[0041]下面結合附圖及本發(fā)明的實施例對本發(fā)明的用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒及其使用方法作進一步詳細的說明。
[0042]圖1為本發(fā)明用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒的俯視圖，圖2為圖1所示試劑盒含磁力架的結構示意圖。
[0043]如圖1所示，該試劑盒主要包括盒體、盒內(nèi)設置有一個9孔磁力架、多瓶試劑和置放所述試劑以及所述9孔磁力架的下凹位。所述下凹位，用于配合固定所述9孔磁力架和穩(wěn)定裝有試劑的試管/瓶位置。較佳地，還可設一個用于存放所述試劑盒說明書的槽位6。該試劑盒說明書中列明有該試劑盒的使用說明，包括試劑盒的詳細使用步驟、使用注意事項等內(nèi)容。
[0044]如圖1所示，該試劑盒內(nèi)設置的9孔磁力架I,所述多瓶試劑,具體為:線蟲核酸裂解液2、線蟲核酸富集液3、線蟲核酸洗滌液4和線蟲核酸釋放液5。此外，該試劑盒還包括成型紙盒8，以及設有的盒內(nèi)檔板7。成型紙盒8與置放有多瓶試劑的區(qū)域，通過所述擋板7隔離。
[0045]如圖2所示，所述9孔磁力架I進一步包括可調節(jié)磁力板11、磁力板調節(jié)道12和調節(jié)鈕13三個部件。
[0046]所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒中，9孔磁力架1，其支架主體由聚乙烯樹脂鑄成，上表面開設有9個圓形孔，這些圓形孔分為并列兩排，其中一排設有3個供1.5ml離心管適用的孔，另一排設有6個供0.2ml離心管適用的孔。該兩排孔之間設有可上下移動的磁力板(圖1未示出)，如圖2所示，所述磁力板11可通過調節(jié)鈕13沿磁力板調節(jié)道12上下移動。
[0047]其中，所述試劑盒的線蟲核酸裂解液2、線蟲核酸富集液3、線蟲核酸洗滌液4和線蟲核酸釋放液5，分別由以下組成成分構成:
[0048]所述線蟲核酸裂解液2，包含:20mmol/L醋酸鉀，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.3M鹽酸胍，0.2mM檸檬酸鈉，0.1mM硫酸，0.1mM蛋白酶K。
[0049]所述線蟲核酸富集液3，主要由緩沖液(2% PEG 2000,0.lmol/L NaCl, 0.0Olmol/L KCl,0.01mol/L Na2HP04,0.002mol/L KH2P04, ρΗ7.2 ?7.4)和粒徑為 200nm 的磁珠組成。
[0050]所述線蟲核酸洗滌液4，包含:2mM乙二胺四乙酸和2mMTris_HCL。
[0051]所述線蟲核酸釋放液5，為20%乙醇溶液。
[0052]采用本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)點在于，9孔磁力架配置了 2種規(guī)格的孔徑，可調節(jié)的磁力板可更準確的選擇吸附位置。線蟲核酸裂解液可有效破解線蟲細胞膜，但不破壞核酸，經(jīng)過蛋白酶酶解后，高效釋放線蟲核酸。采用粒徑為200nm的納米磁珠，在緩沖液條件下高效吸附線蟲核酸。本發(fā)明不需要加入氯仿等有毒物質，且提取時間為60分鐘左右，安全高效。
[0053]本發(fā)明的植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒的使用方法，主要包括如下步驟:
[0054]步驟一:向0.2mlpcr管里加入1ul滅菌水，將多條或單條線蟲，挑取或吸取放入該管中，向管中加入2ul線蟲核酸裂解液，56度水浴中保存30分鐘。
[0055]步驟二:向上述步驟一中的per管中加入3ul線蟲核酸富集液，充分混勻后，靜置5分鐘，此時形成磁珠-核酸復合體。
[0056]步驟三:將上述步驟二中的per管置于磁力架上，調節(jié)磁力板位置，使吸附點位于per管底部，待磁珠-核酸復合體充分被吸附到per管底部后，使用移液器將上清液全部吸出棄掉。
[0057]步驟四:將上述步驟三的per管從磁力架上取下，向其中加入1ul線蟲核酸洗滌液，使用移液器輕吹打散磁珠-核酸復合體，靜置5分鐘后，重復步驟三，再次吸附磁珠-核酸復合體，棄上清液。
[0058]步驟五:將上述步驟四per管從磁力架上取下，向其中加入1ul線蟲線蟲核酸釋放液，使用移液器輕吹打散磁珠-核酸復合體，靜置5分鐘后，再次將per管置于磁力架上，此時核酸已釋放于上清液中，小心吸取上清液，直接用于后續(xù)檢測或_20°C冷凍保存待用。
[0059]上述使用方法的優(yōu)點在于，操作步驟簡便，用時較短，經(jīng)過富集核酸濃度提高，從而提高了檢測靈敏度和準確性。
[0060]【結果判定方法】
[0061]I)用普通PCR驗證通用引物，如圖3所示。用M13通用引物及MSP119C引物做PCR鑒定，結果顯示，分別在500bp?750bp之間及750bp?100bp之間出現(xiàn)兩條特異性條帶。
[0062]將各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應參數(shù)設計35個循環(huán)。待反應結束后，電泳鑒定擴增片斷，結果顯示出現(xiàn)與預期大小一致的DNA條帶同時切膠回收目的片斷。
[0063]2)用實時熒光PCR驗證，如圖4所示，顯示了革蘭氏陽性和革蘭氏陰性探針的一個管中的兩條曲線。陽性(向上)曲線表示檢測約1.3 X 104個細胞的革蘭氏陽性模板的革蘭氏陽性探針，和平緩曲線反映了革蘭氏陰性探針采用相同的模板，無假陽性檢測顯示。
[0064]顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【權利要求】
1.用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，包括盒體；其特征在于，該盒體內(nèi)設有一個9孔磁力架(I)，用于置放所述9孔磁力架和多瓶試劑的下凹位，以及成型紙盒(8)和盒內(nèi)擋板⑵。
2.根據(jù)權利要求1所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述9孔磁力架，設有分列兩排的9個圓形孔；其中，一排設有3個供1.5ml離心管適用的孔；另一排設有6個供0.2ml離心管適用的孔。
3.根據(jù)權利要求2所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述分列兩排的9個圓形孔之間，設有可上下移動的磁力板(11)，所述磁力板11通過調節(jié)鈕(13)沿磁力板調節(jié)道(12)上下移動。
4.根據(jù)權利要求1?3任一所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括一個用于存放試劑盒說明書的槽位(6)。
5.根據(jù)權利要求1所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述多瓶試劑，具體為:線蟲核酸裂解液(2)、線蟲核酸富集液(3)、線蟲核酸洗滌液(4)和線蟲核酸釋放液(5)。
6.根據(jù)權利要求5所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述線蟲核酸裂解液(2)，包含:20mmol/L醋酸鉀，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.3M鹽酸胍，0.2mM檸檬酸鈉，0.1mM硫酸，0.1mM蛋白酶K。
7.根據(jù)權利要求5所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述線蟲核酸富集液(3)，主要由粒徑為200nm的磁珠和緩沖液組成，所述緩沖液，具體為:2% PEG2000，0.lmol/L NaCl,0.001mol/L KCl，0.01mol/LNa2HP04,0.002mol/L KH2P04, ρΗ7.2 ?7.4。
8.根據(jù)權利要求5所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述線蟲核酸洗滌液(4)，包含:2mM乙二胺四乙酸和2mMTris-HCL。
9.根據(jù)權利要求5所述用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述線蟲核酸釋放液(5)為20%乙醇溶液。
10.用于植物寄生線蟲核酸提取的試劑盒的使用方法，其特征在于，該方法包括: 步驟一:向0.2mlpcr管里加入1ul滅菌水，將多條或單條線蟲，挑取或吸取放入該管中，向管中加入2ul線蟲核酸裂解液，56度水浴中保存30分鐘； 步驟二:向上述步驟一中的per管中加入3ul線蟲核酸富集液，充分混勻后，靜置5分鐘，此時形成磁珠-核酸復合體； 步驟三:將上述步驟二中的per管置于磁力架上，調節(jié)磁力板位置，使吸附點位于per管底部，待磁珠-核酸復合體充分被吸附到per管底部后，使用移液器將上清液全部吸出棄掉； 步驟四:將上述步驟三的per管從磁力架上取下，向其中加入1ul線蟲核酸洗滌液，使用移液器輕吹打散磁珠-核酸復合體，靜置5分鐘后，重復步驟三，再次吸附磁珠-核酸復合體，棄上清液； 步驟五:將上述步驟四per管從磁力架上取下，向其中加入1ul線蟲核酸釋放液，使用移液器輕吹打散磁珠-核酸復合體，靜置5分鐘后,再次將per管置于磁力架上,此時核酸已釋放于上清液中，小心吸取上清液，直接用于后續(xù)檢測或-20°C冷凍保存待用。
【文檔編號】C12N15/10GK104232482SQ201410510760
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權日:2014年9月28日
【發(fā)明者】江麗輝, 邊勇, 鄧叢良, 劉若思, 鄭春生, 駱衛(wèi)峰 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局