一種逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干預叢生蛋白基因轉(zhuǎn)錄來逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，其創(chuàng)新點在于：包括以下四條shRNA模板序列中的任一條或一條以上任意組合：CLU-shRNA1：5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’；CLU-shRNA2：5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’；CLU-shRNA3：5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’；CLU-shRNA4：5’-GCGAAGACCAGTACTATCT-3’；將本發(fā)明的四條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈的shRNA模板，能夠高效抑制人HepG2/ADM細胞株CLU基因轉(zhuǎn)錄及CLU蛋白表達。能夠明顯降低化療藥物IC50值，對靶向或抗癌藥物治療具有增敏作用。通過促凋亡機制使得阿霉素誘導的肝癌細胞發(fā)生的凋亡數(shù)明顯高于對照組及陰性組。
【專利說明】-種逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA及其應用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，尤其是涉及一種干預叢生蛋白 基因轉(zhuǎn)錄來逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，屬于分子生物學與生物醫(yī)藥領域。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，每年有 超過60萬的新增肝癌患者，位列腫瘤相關死因的第三位。HCC的發(fā)生發(fā)展是多病因、多基 因、多步驟及多因子協(xié)同的復雜過程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及(或）胚胎期某些 癌基因重新復活等多信號通路和基因調(diào)控。
[0003] 目前，多藥耐藥（multiple drug resistance, MDR)產(chǎn)生是肝癌化療失敗主要原 因，已發(fā)現(xiàn)肝癌細胞耐受的抗腫瘤藥物有多柔比星、順鉬、紫杉醇和依托泊苷等，因此尋找 特異有效分子靶點逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥，已是肝癌治療的研究重點。
[0004] 叢生蛋白（Clusterin，CLU)又名高爾基體硫酸化糖蛋白-2、叢生蛋白或載脂蛋白 J。CLU具有多種生物學功能，如脂轉(zhuǎn)運、膜循環(huán)、細胞粘附、細胞凋亡和補體級聯(lián)等。其基因 位于染色體8p21?pl2,由8個內(nèi)含子和9個外顯子組成。它廣泛存在于哺乳動物組織，種 屬間高度保守。經(jīng)選擇性剪切最終形成兩種蛋白：核型叢生蛋白（nCLU)和分泌型叢生蛋白 (sCLU)。研究發(fā)現(xiàn)，sCLU可阻止細胞凋亡，而nCLU則促進細胞凋亡。
[0005] 通常在60kDa處可發(fā)現(xiàn)分泌前叢生蛋白（psCLU)，由mRNA直接翻譯而成；經(jīng)選擇 性剪切，PsCLU在Arg227和Ser228間裂解為反相平行的α鏈和β鏈，構(gòu)成成熟的異二聚 體糖蛋白sCLU，分子量為75 - 80kDa ;nCLU分子量大小為45-55kDa，無靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導肽， 不裂解為雙鏈，通過核內(nèi)信號區(qū)（nuclear localization signals, NLSs)介導，在特定條 件下由胞質(zhì)進入胞核。
[0006] 研究發(fā)現(xiàn)，由于晚期高侵襲腫瘤組織中促凋亡蛋白nCLU轉(zhuǎn)化為抗凋亡蛋白SCLU， 兩亞型相互轉(zhuǎn)變對腫瘤進展具重要調(diào)節(jié)作用。提高nCLU/sCLU比值可增加對腫瘤細胞的化 療敏感性，間接反映 nCLU和sCLU相互拮抗凋亡相關的生物特性。肝細胞惡性轉(zhuǎn)變和癌變 過程中CLU異常活化，過表達的CLU既可作為肝癌早期診斷的標志，又可作為肝癌靶向治療 的新靶點，具有開發(fā)與應用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種干預叢生蛋白基因轉(zhuǎn)錄來逆 轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，干預CLU基因轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA能高效抑 制CLU基因的表達，對靶向或抗癌藥物治療具有優(yōu)秀的增敏作用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種干預叢生蛋白基因轉(zhuǎn)錄來 逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的ShRNA，其創(chuàng)新點在于：包括以下四條ShRNA模板序列中的任一條 或一條以上的任意組合： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3,； CLU-shRNA2 :5, -GGGAATCAGAGACAAAGCT-3,； CLU-shRNA3 :5, -CAGTGGAAGATGCTCAACA-3,； CLU-shRNA4 :5' -GCGAAGACCAGTACTATCT-3'。
[0009] 進一步，包括以下三條shRNA模板序列中的任一條或一條以上的任意組合： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3,； CLU-shRNA2 :5, -GGGAATCAGAGACAAAGCT-3,； CLU-shRNA3 :5, -CAGTGGAAGATGCTCAACA-3，。
[0010] 進一步，包括以下兩條ShRNA模板序列中的任一條或兩條組合物： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3,； CLU-shRNA2 :5, -GGGAATCAGAGACAAAGCT-3，。
[0011] 進一步，所述ShRNA模板序列為： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3，。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種干預叢生蛋白基因轉(zhuǎn)錄來逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐 藥的shRNA的應用，具體為用于制備抗肝癌的藥物。
[0013] 本發(fā)明的有益效果如下： (1)將本發(fā)明的四條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈的ShRNA模板，能夠高效抑制人H印G2/ ADM細胞株CLU基因轉(zhuǎn)錄，及CLU蛋白表達。
[0014] (2)用MTT法分析得出雙鏈的shRNA能夠明顯降低化療藥物IC50值，對靶向或抗 癌藥物治療具有增敏作用。
[0015] (3)通過熒光顯微鏡檢測得出雙鏈的shRNA干擾人肝癌H印G2/ADM細胞CLU表達 后，通過促凋亡機制使得阿霉素誘導的肝癌細胞發(fā)生的凋亡數(shù)明顯高于對照組及陰性組。
[0016] (4)通過流式細胞儀分析，雙鏈的shRNA能干擾!fepG2/ADM細胞株P-gp介導的藥 物外排機制； (5)通過蛋白及基因分析，雙鏈的shRNA使肝癌耐藥細胞多藥耐藥基因 MDRl及P-糖 蛋白受到明顯抑制，并且下調(diào)β-catenin及其下游基因 CyclinDl表達水平。
[0017] (6)本發(fā)明的干預CLU基因轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA能高效抑制CLU 基因的表達，對靶向或抗癌藥物治療具有優(yōu)秀的增敏作用。
[0018] (7)本發(fā)明的shRNA序列對于開發(fā)新的抗肝癌藥物，逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥和提 高肝癌的治療效果有重要的意義，其具有很大的開發(fā)與應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】作進一步的說明。
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例中Western blotting測HCC細胞的CLU蛋白表達。
[0021] 圖2為柱狀圖顯示圖1中CLU與GAPDH灰度值比值。
[0022] 圖3為Western blotting測HepG2耐藥株HepG2/ADM與親本株中CLU蛋白表達。
[0023] 圖4為柱狀圖顯示圖3中CLU與GAPDH灰度值比值。
[0024] 圖5為轉(zhuǎn)染細胞普通光（X 100)。
[0025] 圖6為轉(zhuǎn)染細胞綠色熒光（X 100)。
[0026] 圖 7 為 Western blotting 測 shRNA 抑制 CLU 蛋白效率。
[0027] 圖 8 為 RT-PCR 測各組細胞 CLU-mRNA。
[0028] 圖9為伊立替康處理后細胞生存曲線。
[0029] 圖10為吉西他濱處理后細胞生存曲線。
[0030] 圖11為順鉬處理后細胞生存曲線。
[0031] 圖12為阿霉素處理后細胞生存曲線。
[0032] 圖13為圖9-12中四種藥IC50。
[0033] 圖14為陰性對照組NC-shRNA藍色熒光（X 100)。
[0034] 圖15為陰性對照組NC-shRNA紅色熒光（X 100)。
[0035] 圖 16 為圖 9、10 合并圖（X100)。
[0036] 圖17為CLU干擾組shRNA-Ι藍色熒光（X 100)。
[0037] 圖18為CLU干擾組shRNA-Ι紅色熒光（X 100)。
[0038] 圖 19 為圖 12、13 合并圖（X100)。
[0039] 圖20為空白對照組Control流式峰值圖。
[0040] 圖21為陰性對照組NC-shRNA流式峰值圖。
[0041] 圖22為CLU干擾組shRNA-Ι流式峰值圖。
[0042] 圖23各組細胞Rhl23滯留相對值。
[0043] 圖24為各組細胞中P-gp蛋白表達。
[0044] 圖25為各組細胞MDRl基因表達 圖26為各組細胞i3-catenin、GSK_3i3和Cyclin Dl蛋白表達。
[0045] 圖27為圖26中各組基因表達。

【具體實施方式】
[0046] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細說明。
[0047] 本實施例為本發(fā)明的干預CLU基因轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的shRNA的設計及驗證 步驟。
[0048] 1、細胞培養(yǎng)：人肝癌細胞株H印3B、PLC、！fepG2及耐藥株H印G2/ADM在10%FCS DMEM 培養(yǎng)基（含 1% 雙抗）中培養(yǎng)。BEL7404、SUN739、97H、SMMC7721 和 L02 細胞在 10%FCS RPMI-1640培養(yǎng)基（含1%雙抗）中培養(yǎng)。各細胞株培養(yǎng)在5%C02,37°C培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)。
[0049] 2、轉(zhuǎn)染shRNA :根據(jù)人Clusterin序列（NCBI :NM_001831. 3)設計四條干擾序列及 陰性對照序列NC-shRNA (如表1所示）并構(gòu)建質(zhì)粒載體pRNAT-U6. 1/Neo-shRNA。將H印G2/ ADM細胞接種于六孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。當細胞密度長至全孔80%，依照轉(zhuǎn)染試劑Genjet? (Ver II for H印G2)說明書，分別將干擾組shRNA和陰性對照NC-shRNA轉(zhuǎn)入!fepG2/ADM細 胞，并設空白對照孔。12h后換原培液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。
[0050] 具體如圖5-6所不：圖5為人肝癌HepG2/ADM細胞普通光學顯微鏡圖；圖6為同一 視野熒光顯微鏡細胞圖，帶熒光的細胞即為轉(zhuǎn)染成功的HepG2/ADM細胞。
[0051] 四條寡核苷酸鏈及陰性對照shRNA (Negative-shRNA)的序列見表1: 表1

【權(quán)利要求】
1. 一種逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，其特征在于：包括以下四條shRNA模板序列中 的任一條或一條以上的任意組合： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3,； CLU-shRNA2 :5, -GGGAATCAGAGACAAAGCT-3,； CLU-shRNA3 :5, -CAGTGGAAGATGCTCAACA-3,； CLU-shRNA4 :5' -GCGAAGACCAGTACTATCT-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，其特征在于：包括以下三條 shRNA模板序列中的任一條或一條以上的任意組合： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3,； CLU-shRNA2 :5, -GGGAATCAGAGACAAAGCT-3,； CLU-shRNA3 :5, -CAGTGGAAGATGCTCAACA-3，。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，其特征在于：包括以下 兩條shRNA模板序列中的任一條或兩條組合： CLU-shRNAl :5, -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3,； CLU-shRNA2 :5, -GGGAATCAGAGACAAAGCT-3，。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA，其特征在于：所述 shRNA 模板序列為 CLU-shRNAl :5' -GTAAGTACGTCAATAAGGA-3'。
5. -種權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥的shRNA應用于制備抗肝癌的藥物領 域。
【文檔編號】C12N15/113GK104480111SQ201410477059
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】鄭文杰, 姚登福, 賽文莉, 吳瑋, 姚敏 申請人:南通大學附屬醫(yī)院