來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突變體，所述脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示，所述脂肪酶突變體是將SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的絲氨酸突變成蘇氨酸，或者將第83位的絲氨酸突變成蘇氨酸的同時(shí)將第58位的絲氨酸突變成蛋氨酸；本發(fā)明提供的嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶突變體較親本活力2～5倍，可用于工業(yè)化生產(chǎn)(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于進(jìn)一步合成普瑞巴林。
【專利說明】來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體及應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及脂肪酶編碼基因的克隆和利用基因突變技術(shù)制備脂肪酶突變體的方 法，所獲得的突變體及其在普瑞巴林手性中間體（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制 備中的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（lipase，EC 3. I. 1. 3)，系統(tǒng)名稱為三脂酰甘油?；饷?(triacylglycerol acylhydrolase)，是一類既能催化酯水解，又具有催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、 氨解、醇解等反應(yīng)的酶，在食品、洗滌、飼料、有機(jī)合成和生物能源等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛（ Curr. Opin. Biotech. 2002, 13:390-397)。脂肪酶催化的反應(yīng)除具有選擇性高、副反應(yīng)少，產(chǎn)物光 學(xué)純度高等特點(diǎn)外，還具有催化反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。這使得脂肪酶在光學(xué)純化 合物特別是手性藥物的制備中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已成為制備光學(xué)純手性藥物的重要技術(shù)手 段（Coord. Chem. Rev. 2008, 252:659-701.)。
[0003] 普瑞巴林（Pregabalin)是一種新型Y-氨基丁酸（GABA)受體激動(dòng)劑，能有效阻 斷電壓依賴性鈣通道，減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，具有良好的抗焦慮和神經(jīng)痛治療效果（Angew. Chem. Int. Edit. 2008, 47:3500-3504)。由于療效顯著和適應(yīng)癥的擴(kuò)大，普瑞巴林的銷售額 逐年遞增，2013年達(dá)到45. 95億美元，列全球最暢銷藥物榜第13位，市場(chǎng)潛力巨大。2-羧 乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（CNDE)被脂肪酶/酯酶選擇性水解，其產(chǎn)物（3S)-2-羧 乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制備普瑞巴林的重要手性中間體。該中間體經(jīng)脫羧、堿性水 解、氫化即得到普瑞巴林（〇rg. Process Res. Dev. 2008,12:392-398)。但目前只有來源于 Novozymes公司的Lipo丨ase''，即商品化Thermomyces Ianuginosus脂肪酶能滿足工業(yè)化生 產(chǎn)的需要。因此，開發(fā)能夠高效拆分CNDE的新催化劑具有重要意義。
[0004] 熱穩(wěn)定酶一般具有較強(qiáng)的溶劑穩(wěn)定性，具有很好的生物技術(shù)和工業(yè)應(yīng)用潛力 (Environ. Technol. 2010, 31:1159-1167)。近年來，從嗜熱菌中獲得熱穩(wěn)定酶已成為學(xué)術(shù)和 工業(yè)界的研究熱點(diǎn)。嗜熱踝節(jié)菌（Talaromyces thermophilus)是一類分布廣泛，生長(zhǎng)溫度 上限較高的嗜熱真菌，已成為具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值熱穩(wěn)定酶的重要來源。
[0005] 隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用分子改造的手段對(duì)酶分子進(jìn)行改 造已成為當(dāng)前酶工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。到目前為止，這項(xiàng)技術(shù)已被成功用于改造各種各樣 的酶，取得了令人矚目的進(jìn)展（Curr. Opin. Struct. Biol. 2011，21:473-480)。分子改造廣泛 應(yīng)用于脂肪酶催化活力、底物特異性、熱穩(wěn)定性和對(duì)映體選擇性等性質(zhì)的改造。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于通過定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶進(jìn)行改造，提供脂 肪酶突變體，其對(duì)2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的水解活力明顯提高，從而有利于 該脂肪酶在普瑞巴林中間體制備中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的還在于提供含有編碼本發(fā)明 所述的脂肪酶突變體的氨基酸序列。本發(fā)明的再一目的在于將本發(fā)明的突變體應(yīng)用于選擇 性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（CNDE)制備普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體 (3S) _2_羧乙基_3_氰基-5-甲基己酸。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明通過對(duì)來源于T.thermophilus ATCC 20186脂肪酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)， 利用全質(zhì)粒PCR技術(shù)對(duì)含有脂肪酶基因的表達(dá)載體進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，構(gòu)建突變文庫(kù)， 利用基于真實(shí)底物的96孔板高通量篩選方法進(jìn)行篩選，獲得了一系列對(duì)CNDE活力明 顯提高且對(duì)映體選擇性嚴(yán)格的脂肪酶突變體，這些突變體能以外消旋2-羧乙基-3-氰 基-5-甲基己酸乙酯為底物，在室溫和較高的溫度下高效生物催化生產(chǎn)普瑞巴林關(guān)鍵手 性中間體（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。最終本發(fā)明提供一種來源于嗜熱踝 節(jié)菌（Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突變體，所述來源于嗜熱踝節(jié)菌 (T. therm〇philus)ATCC 20186的脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示，核苷酸序列為 SEQ ID No. 1所示，所述脂肪酶突變體是將SEQ ID No. 2所示氨基酸序列第83位的絲氨酸 突變成蘇氨酸（氨基酸序列為SEQ ID No. 4所示，核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示），或者 將第83位的絲氨酸突變成蘇氨酸的同時(shí)將第58位的絲氨酸突變成蛋氨酸（氨基酸序列為 SEQ ID No. 6所示，核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示），優(yōu)選所述脂肪酶突變體是將SEQ ID No. 2所示氨基酸序列將第83位的絲氨酸突變成蘇氨酸的同時(shí)將第58位的絲氨酸突變成蛋 氨酸（氨基酸序列為SEQ ID No. 6所示，核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示）。
[0009] 本發(fā)明還涉及一種所述來源于嗜熱踝節(jié)菌ATCC 20186的脂肪酶突變體在制備普 瑞巴林關(guān)鍵手性中間體中應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用以脂肪酶突變體工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的 培養(yǎng)液離心獲得的濕菌體或者濕菌體分離提取的酶作為酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰 基-5-甲基己酸乙酯為底物，以Ca (OAc) 2為螯合劑（用于解除產(chǎn)物抑制劑），以水或緩沖液 (優(yōu)選Tris-HCl緩沖液）為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成pH值為6. 0?8. 0 (優(yōu)選pH值為7. 0)的轉(zhuǎn)化 體系，30?60°C、150?500r/min條件下（優(yōu)選40°C、500r/min)進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束 后，取反應(yīng)液分離純化，獲得（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始濃度 為0. 1?3. Omol/L轉(zhuǎn)化體系（優(yōu)選lmol/L)，所述催化劑的用量以濕菌體質(zhì)量計(jì)，終濃度為 10?50g/L轉(zhuǎn)化體系（優(yōu)選50g/L), Ca (OAc) 2終濃度為50?180mmol/L轉(zhuǎn)化體系（優(yōu)選 150mmol/L)〇
[0010] 本發(fā)明所述濕菌體按如下方法制備：將含脂肪酶突變體編碼基因的工程菌接種到 含有終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150r/min培養(yǎng)12h，再以體積濃度 1 %接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含有終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體 濃度OD6tltl為0. 4?0. 8,再向培養(yǎng)液中加入終濃度為0. 1?I. OmM(優(yōu)選0. ImM)的IPTG， 28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，取培養(yǎng)物離心，收集沉淀即獲得濕菌體。LB液體培養(yǎng)基組成為（g/L):蛋 白胨10,酵母提取物5, NaCl 10,溶劑為去離子水，pH值為7. 0 ;LB平板培養(yǎng)基組成為（g/ U :蛋白胨1〇,酵母提取物5, NaCl 10,瓊脂15,溶劑為去離子水，pH值為7.0。
[0011] 本發(fā)明所述分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心除去菌體，取上清液 減壓蒸餾至原1/3體積，將濃縮物離心后收集上清液并加入1/3體積的甲苯進(jìn)行萃?。ǔ?去殘留底物），取萃取層減壓蒸餾至干（去除殘留甲苯和水），得到目標(biāo)產(chǎn)物（3S)-2-羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸。
[0012] 本發(fā)明所述的脂肪酶突變體可以以工程菌全細(xì)胞形式使用，也可以是未經(jīng)純化的 粗酶形式使用，也可以是經(jīng)部分純化的或完全純化的酶的形式使用。如果需要，還可以利用 本領(lǐng)域已知的固定化技術(shù)將本發(fā)明的脂肪酶突變體制成固定化酶或者固定化細(xì)胞形式的 固化酶。
[0013] 此外，本發(fā)明的突變體較親本活力大幅提高，即使使用該酶的粗提物或者工程菌 全細(xì)胞，反應(yīng)也會(huì)以較高的速率進(jìn)行。此外，本發(fā)明的突變體可以在相對(duì)較高的溫度例如 40-60°C下用于工業(yè)化生產(chǎn)（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，從而進(jìn)一步合成普瑞巴 林。
[0014] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供的嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶突變體較親本活 力提高2?5倍，可用于工業(yè)化生產(chǎn)（3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于進(jìn)一步合 成普瑞巴林。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為實(shí)施例4中工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析；其中泳道M為蛋白質(zhì)分子 量 Marker，泳道 1 ?3 分別為未誘導(dǎo)的 E. coli BL21(DE3)/pET28-TTL，E. coli BL21(DE3)/ PET28-S83T 和 E. coli BL21 (DE3)/pET28-S58T/S83T，泳道 4 ?6 為 IPTG 誘導(dǎo)的 E. coli BL21(DE3)/pET28-TTL，E. coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E. coli BL21(DE3)/pET28-S58T/ S83T。
[0016] 圖2為實(shí)施例6中脂肪酶突變體S63M/S83T全細(xì)胞催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲 基己酸乙酯（I. 0M)制備（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸反應(yīng)進(jìn)程曲線圖。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0018] 實(shí)施例1 :親本基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建
[0019] 米用 RT-PCR 的方法從 Talaromyces thermophilus ATCC 20186 (購(gòu)自美國(guó)典型 微生物菌種保藏中心，American Type Culture Collection)中獲得脂肪酶基因。根據(jù) 文獻(xiàn)報(bào)道的 Talaromyce thermophilus CTM10. 103 脂肪酶基因序列（GenBank accession no. JF414585)設(shè)計(jì)引物 TTL-F 和 ITL-R(見表 1)，采用 RT-PCR 的方法從 T. thermophilus ATCC 20186 中分離脂肪酶基因。采用 TRIzol 法提取 T. thermophilus ATCC 20186 總 RNA， 使用Promega公司的GoScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的的制備，反應(yīng)體系及條件 均參照試劑盒的使用說明。以cDNA第一鏈為模板，在引物TTL-F和TTL-R作用下，利用PCR 方法擴(kuò)增脂肪酶cDNA序列。PCR反應(yīng)體系各組分加入量（總體積IOOiiL) :10XPfu DNA polymerase buffer 10 ii L，IOmM dNTP mixture (dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM) I ii L， 濃度為50 ii M的引物TTL-F和TTL-R各0? 5 ii L，cDNA I ii L，Pfu DNA聚合酶2 ii L，無核酸 水 85 ii L。采用 Biometra 的 TProfessional PCR 儀，PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94°C 3min，然 后進(jìn)入溫度循環(huán)941：3〇8,581：3〇8,721：1111111，共30個(gè)循環(huán)，最后721：延伸1〇111111。0.9% 瓊脂糖凝膠電泳表明PCR產(chǎn)物大小約800bp。利用Axygen的PCR Cleanup Kit回收該 PCR產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶酶切處理的表達(dá) 載體pET-28b (+)連接，構(gòu)建含有脂肪酶基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28-TTL，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 E. coli BL21(DE3)，涂布于含有終濃度50mg/L卡那霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑 取10個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取一個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序證實(shí)。經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)，確 定該被克隆的親本脂肪酶的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID No. 1，相應(yīng)的氨基酸序列為 序列表中的SEQ ID No. 2,獲得脂肪酶工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28-TTL。
[0020] 實(shí)施例2 :脂肪酶位點(diǎn)83的定點(diǎn)飽和突變
[0021] 定點(diǎn)飽和突變技術(shù)參考（Current Protocols in Protein Science26.6. 1-26.6. 10,2011 ；Appl.Microbiol. BiotechnoI. 2014, 98:2473-2483) 的描述，陽(yáng)性突變子的高通量篩選技術(shù)參考（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98:2473-2483)的描述。具體過程如下：
[0022] 為了將親本氨基酸序列中的第83位點(diǎn)的Ser進(jìn)行飽和突變，設(shè)計(jì)突變引物S83-F 和S83-R (見表1)，以實(shí)施例1構(gòu)建的質(zhì)粒pET28-TTL為模板，進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。PCR擴(kuò)增體 系為：5XPS buffer lOiiL，dNTP(2.5mM each)4iiL，突變引物 S83-F 和 S83-R 各 0.5iiL， 質(zhì)粒 PET28-ITL 0.5 iiL，PrimeSTAR DNA 聚合酶 0.5 iiL，補(bǔ)水至 50 iiL。PCR 條件為 98°C預(yù) 變性 2min，25 個(gè)循環(huán)：98°C 10s，65°C 10s，72°C6min，最后 72°C lOmin。經(jīng) 0.9%瓊脂糖凝 膠電泳分析PCR為陽(yáng)性后，取PCR反應(yīng)液20 ii L，加入I ii L Dpn I，37°C酶切2h去除模板質(zhì) 粒DNA，65°C滅活10min，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21(DE3)，涂布含終濃度50mg/L卡那霉 素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，獲得約500個(gè)克隆的突變體庫(kù)。挑取單菌落于裝有LB培養(yǎng)基 的96孔培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)至OD 6tltl約為0. 6,加入終濃度0. ImM IPTG，28°C誘導(dǎo)10h。96孔 板離心機(jī)上4, 000g，15min離心，棄上清，加入100 ii L磷酸鉀緩沖液（pH 7. 2, IOmM)重懸菌 體。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，以0. 01 %溴百里香酚藍(lán)為指示 齊U，以突變前的工程菌細(xì)胞為參照，在96孔板上初篩活力提高的陽(yáng)性克隆，根據(jù)反應(yīng)體系 顏色變化（藍(lán)色一黃色）的速度進(jìn)行粗篩，篩選出變色速度快于對(duì)照菌株的克隆。篩選出 的陽(yáng)性克隆再經(jīng)活力測(cè)定驗(yàn)證，從陽(yáng)性克隆中抽提質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序確定引入的點(diǎn)突變，活 力最高的陽(yáng)性克隆DNA測(cè)序顯示83位的Ser突變成了 Thr (S83T)，獲得脂肪酶突變體工程 菌E. coli BL21(DE3)/pET28-S83T。突變體S83T的氨基酸序列見序列表中的SEQ ID No. 3， 其中一種編碼基因序列見序列表中的SEQ ID No. 4。
[0023] 實(shí)施例3 :對(duì)脂肪酶突變體S83T位點(diǎn)58的定點(diǎn)飽和突變
[0024] 定點(diǎn)飽和突變技術(shù)參考（Current Protocols in Protein Science26.6. 1-26.6. 10,2011 ；Appl.Microbiol. BiotechnoI. 2014, 98:2473-2483) 的描述，陽(yáng)性突變子的高通量篩選技術(shù)參考（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98:2473-2483)的描述。具體過程如下：
[0025] 在脂肪酶突變體S83T的基礎(chǔ)上對(duì)位點(diǎn)58的Ser進(jìn)行飽和突變，設(shè)計(jì)突變引物 S58-F和S58-R (見表1)，以質(zhì)粒pET28-S83T為模板（見實(shí)施例2)，進(jìn)行全質(zhì)粒擴(kuò)增。PCR 體系為：5XPS buffer 10iiL，dNTP(2.5mM each)4iiL，突變引物 S58-F 和 S58-R 各 0.5iiL， 質(zhì)粒 PET28-S83T 0? 5 ii L，PrimeSTAR DNA 聚合酶 0? 5 ii L，補(bǔ)水至 50 ii L。PCR 條件為 98°C 預(yù)變性21^11，25個(gè)循環(huán)：981：1〇8,651：1〇8,721：6111111，最后721：1〇111111。經(jīng)0.9%瓊脂糖 凝膠電泳分析PCR為陽(yáng)性后，取PCR溶液20 ii L，加入I ii L Dpn I，37 °C酶切2h去除模板 質(zhì)粒DNA，65°C滅活10min，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素（終濃度 50 ii g/ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，獲得約500個(gè)克隆的突變體庫(kù)。位點(diǎn)58的飽和突變 庫(kù)的篩選同實(shí)施例2,不同是所用對(duì)照為實(shí)施例2獲得的S83T突變體細(xì)胞。篩選出的陽(yáng)性 克隆再經(jīng)活力測(cè)定證實(shí)后從陽(yáng)性克隆中抽提質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序確定引入的點(diǎn)突變，活力最 高的陽(yáng)性克隆DNA測(cè)序顯示58位的Ser突變成了 Met (S58M)，獲得脂肪酶突變體工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET28-S58T/S83T。突變體S58M/S83T的氨基酸序列見序列表中的SEQ ID No. 5,其編碼基因序列見序列表中的SEQ ID No. 6。
[0026] 表1:引物
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種來源于嗜熱踝節(jié)菌（Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突變 體，所述脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示，其特征在于所述脂肪酶突變體是將SEQ ID No. 2所示氨基酸序列第83位的絲氨酸突變成蘇氨酸，或者將第83位的絲氨酸突變成蘇 氨酸的同時(shí)將第58位的絲氨酸突變成蛋氨酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的脂肪酶突變體，其特征在于所述脂肪酶突變體是將SEQ ID No. 2所示氨基酸序列第83位的絲氨酸突變成蘇氨酸的同時(shí)將第58位的絲氨酸突變成蛋氨 酸。
3. -種權(quán)利要求1或2所述來源于嗜熱踝節(jié)菌ATCC 20186的脂肪酶突變體在制備 普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體中應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用以脂肪酶突變體工程菌經(jīng)發(fā)酵 培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心獲得的濕菌體或者濕菌體分離提取的酶作為酶源，以外消旋2-羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，以Ca(0Ac) 2為螯合劑，以水或緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu) 成pH值為6. 0?8. 0的轉(zhuǎn)化體系，30?60°C、150?500r/min條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng) 結(jié)束后，取反應(yīng)液分離純化，獲得（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物的初始濃度為0. 1?3. Omol/L反應(yīng) 體系，所述催化劑的用量以濕菌體質(zhì)量計(jì)，終濃度為10?50g/L反應(yīng)體系，Ca (OAc) 2終濃度 為50?180mmol/L反應(yīng)體系。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備：將含脂肪酶 突變體編碼基因的工程菌接種到含有終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 150r/min培養(yǎng)12h，再以體積濃度1%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含有終濃度50mg/L卡那霉素 的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體濃度0D_為0. 4?0. 8,再向培養(yǎng)液中加入終濃度為 0. 1?ImM的IPTG，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，取培養(yǎng)物離心，收集沉淀即獲得濕菌體。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng) 液離心，取上清液減壓蒸餾至原1/3體積，將濃縮物離心后收集上清液并加入1/3體積的甲 苯進(jìn)行萃取，取萃取層減壓蒸餾至干，得到目標(biāo)產(chǎn)物（3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己 酸。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104293744SQ201410409072
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】鄭裕國(guó), 鄭仁朝, 黎小軍, 吳欣瑋, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)