一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法
【專利摘要】一種茄子品種對黃萎病抗性的苗期快速測定方法。其主要操作是，將保藏登記號為CGMCC?NO.8959的大麗輪枝菌(Verticillium?dahiae)菌株EV8，通過PDA斜面培養(yǎng)基及米飯培養(yǎng)基的兩步培養(yǎng)，得接種體；將待測茄子品種的種子通過室內(nèi)培育成二葉一心的茄苗，再剪掉長度0.7～2.0cm的根尖。隨后將接種體調(diào)節(jié)成孢子濃度(3.0～10.0)×107個/ml的孢子懸浮液，再將茄苗根部用孢子懸浮液浸泡8～15秒，然后將茄苗重新置入營養(yǎng)缽，并向營養(yǎng)缽灌入孢子懸浮液10～15ml；最后茄苗培養(yǎng)15～20天，進行病情指數(shù)測定及抗性型確定。該法操作簡便、易于掌握、測定快速，結(jié)果準確、一致性好。
【專利說明】一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及茄子黃萎病抗性測定方法，尤其涉及茄子黃萎病的苗期快速抗性測定 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 茄子是我國乃至世界廣泛種植的蔬菜作物。隨著種植面積逐年增加，茄子病害也 呈明顯上升趨勢，病害已成為制約茄子栽培中優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的關(guān)鍵因素。茄子黃萎病是生產(chǎn)上 的主要病害，由大麗輪枝孢（Verticillium dahliae Kleb)引起，為一種世界性土傳性維管 束病害。常年造成的產(chǎn)量損失在20%左右，重者可達70%，甚至絕收，嚴重影響了茄子的產(chǎn) 量和品質(zhì)。對茄子黃萎病的防治，常用的化學防治方法不但效果不理想，還造成嚴重的農(nóng)殘 污染。張軍民等（2004年）報道了采用嫁接可以在一定程度上減輕茄子黃萎病的發(fā)生，但 嫁接費工、費時。生產(chǎn)實踐證明，選育和種植抗病品種是防治茄子黃萎病經(jīng)濟、有效、安全的 措施。而茄子品種的抗病性測定是選育抗病品種必不可少的關(guān)鍵技術(shù)，準確測定不同茄子 品種的抗病性有助于更好地利用現(xiàn)有茄子品種，對篩選抗源材料、選育抗病品種具有重要 意義。
[0003] 作物病害的抗性測定評價方法有自然感病病圃測定和人工接種病圃測定兩種。自 然感病病圃測定不需要人工接菌，具有操作方法簡便的優(yōu)點，但病圃一般發(fā)病不均勻、測定 所需時間長；人工接種測定以其具有方法標準、發(fā)病快速、測定時間短、測定結(jié)果準確等特 點，被育種者和植保工作者廣泛采用。茄子黃萎病的侵染源主要有帶菌土壤、病殘體，病原 菌從茄子的根部傷口、幼根表皮及根毛侵入。根據(jù)該特點，近年有人分別采用苗期孢子懸浮 液浸泡幼苗根系接種測定、土壤接菌測定方法進行茄子黃萎病抗性測定，但前者因需將浸 染苗放入裝有孢子懸浮液的三角瓶中，造成測定成本高、僅適合少量材料的測定；后者雖然 能大批量篩選測定材料，但由于整個測定過程均在田間進行，茄苗的發(fā)病程度易受大田氣 候環(huán)境的影響，測定結(jié)果誤差大，重復性、一致性差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種茄子黃萎病的苗期快速抗性測定方法。該方法操作簡 便、易于掌握、測定快速，適宜進行大量茄子材料的黃萎病抗性的測定篩選；且對茄子黃萎 病抗性的測定結(jié)果準確、一致性好。
[0005] 本發(fā)明實現(xiàn)其發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是，一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定 方法，其步驟依次為：
[0006] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0007] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7?10天；再轉(zhuǎn)移到 米飯培養(yǎng)基中，25?28°C恒溫振蕩培養(yǎng)8?10天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎 病接種體。
[0008] B、茄苗的培育
[0009] B1、種子處理
[0010] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將50?55°C清水倒入容器淹沒種子，將種 子浸泡10?20分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡9?10小時；隨后，取出種子，用濕布包 好，放置在25?28°C的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。
[0011] B2、茄苗培育
[0012] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為（7?10) cmX (7?10)cm ;將營養(yǎng)缽置于溫度為25?28°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個 營養(yǎng)缽中長出一株二葉一心的茄苗。
[0013] C、病原菌接種
[0014] C1、傷根處理
[0015] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度〇. 7?2. 0cm。
[0016] C2、接種
[0017] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 (3. 0 ?10. 0) X107 個/ml。
[0018] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡8?15 秒，隨后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗；并向每一營 養(yǎng)缽的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液10?15ml，即完成病原菌的接種。
[0019] D、病情指數(shù)的測定
[0020] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于18?28°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)15?20天，根 據(jù)茄苗的黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0021] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75 %以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死。
[0022] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X4] X 100。
[0023] E、抗性型的確定
[0024] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待試茄子品種的抗性型，即：
[0025] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0026] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0027] 10. 00 <病情指數(shù)彡20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0028] 20. 00 <病情指數(shù)彡35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0029] 35. 00 <病情指數(shù)彡50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0030] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0031] 上述的A步中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯200?210份、瓊 脂17?25份、水1000?1300份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水800? 1200 份。
[0032] 其中，PDA斜面培養(yǎng)基制備方法為：將馬鈴薯去皮切成薄片加入水中煮沸30min， 用雙層紗布過濾，向濾液中加入蔗糖和瓊脂，倒入試管后加塞，在103. 4kPa(l. 05kg/cm2)蒸 汽壓、溫度達到121. 3°C，維持25?30分鐘，取出放在超凈工作臺上倒成斜面即得。米飯 培養(yǎng)基的制備方法為：將米和水裝于三角瓶中，加塞后在103. 4kPa(l. 05kg/cm2)蒸汽壓、 121. 3°C的溫度下，蒸煮25?30分鐘，即得。
[0033] 上述的B1步的營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石5?6份、沙土 5?4 份。
[0034] 本發(fā)明方法中使用的大麗輪枝菌（Verticillium dahiae)菌株EV8,是 申請人:從 四川省成都市郫縣采集到的茄子感病植株，利用普通維管束病害的病原菌分離方法分離純 化而來。即將茄子病株的枝條切段，在超凈工作臺中先用無菌水清洗2?3次，再用70%酒 精進行表面消毒，用無菌水清洗3次后，用剪刀剪成小塊放入PDA培養(yǎng)基中，25°C恒溫培養(yǎng) 4d，進行病原菌測定，選取大麗輪枝菌株純化培養(yǎng)而得。
[0035] 本發(fā)明方法中使用的大麗輪枝菌（Verticillium dahiae)菌株EV8,具有以下微 生物學特性：
[0036] 1、培養(yǎng)學特性：菌落在PDA平板上生長較慢，菌絲致密，為絨毛狀或棉絮狀。菌落 中間白色，周圍均為黑色，菌落呈心圓狀或輻射狀，產(chǎn)生大量黑色微菌核。
[0037] 2、形態(tài)學特性：分生抱子梗較細、直立，基部無色，孢子梗上有1?5個輪枝層，每 層3?4枝輪枝。分生抱子較小，通常為3?6X 1. 5 μ m，富含黑色的微菌核。
[0038] 該大麗輪枝菌（verticillium dahiae)菌株EV8已于2014年03月14日，在中國 微生物菌種管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏登記號為CGMCC N0. 8959。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0040] 一、侵染效果好、發(fā)病充分：由于采用了傷根與土壤接種相互結(jié)合的接菌方法，利 于茄子黃萎病的發(fā)生，選擇的茄子黃萎病菌株在米飯培養(yǎng)基中繁殖迅速、選用了適宜的孢 子濃度；因此不但侵染效果好，而且接種后的茄苗成活率高，發(fā)病迅速。
[0041] 二、測定結(jié)果準確可靠：試驗爺苗選擇的是在營養(yǎng)缽內(nèi)培育到二葉一心的爺苗，爺 苗的大小和長勢一致，且傷根采用的是逐株相同的方式傷根、逐株蘸菌進行接種，從而達到 傷根程度和接菌量一致；全部操作均在可控、一致的環(huán)境中進行，避免了大田環(huán)境變化對茄 苗生長和發(fā)病和生長的不確定影響，其茄子黃萎病抗性測定結(jié)果準確、誤差小，重復性、一 致性好。
[0042] 三、操作簡便、易于掌握：茄苗的培育選擇在營養(yǎng)缽內(nèi)進行，茄苗的接菌侵染采用 剪刀進行傷根，接種病原菌后的茄苗放入日光溫室培育，整個過程均不需特殊設(shè)施設(shè)備，也 不需特別工藝，操作簡便、易于掌握。
[0043]四、可進行大量材料的測定篩選：由于茄苗的培育選擇在營養(yǎng)缽內(nèi)進行，而接種病 原菌后的茄苗放入日光溫室培育，適宜進行大量茄子材料的黃萎病抗性的測定篩選。
[0044] 測定試驗也證明本發(fā)明方法的測定結(jié)果準確、誤差小，重復性、一致性好：對已知 黃萎病抗性分別為抗、中抗和感的蛘埠長青茄、蓉雜茄和紫圓茄三個品種，采用本發(fā)明方法 進行測定，測出的病情指數(shù)分別為14. 56?15. 68、21. 67?22. 50和42. 32?44. 46,確定 出其黃萎病抗性分別為抗、中抗和感。測定結(jié)果與三個品種的已知抗性完全一致。
[0045] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。

【具體實施方式】
[0046] 實施例一
[0047] -種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為：
[0048] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0049] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天；再轉(zhuǎn)移到米飯 培養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)10天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體；
[0050] 本例中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯200份、瓊脂20份、蔗 糖20份、水1000份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水1000份。
[0051] B、茄苗的培育
[0052] B1、種子處理
[0053] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將50°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡20分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡10小時；隨后，取出種子，用濕布包好，放置在25°C 的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。
[0054] B2、茄苗培育
[0055] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為 7cmX7cm;將營養(yǎng)缽置于溫度為25°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個營養(yǎng)缽中長 出一株二葉一心的爺苗。
[0056] 本例中營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石6份，沙土 4份。
[0057] C、病原菌接種
[0058] C1、傷根處理
[0059] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度1. 〇cm ;
[0060] C2、接種
[0061] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 5· 0X107 個/ml。
[0062] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡8秒，隨后 將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗，并向每一營養(yǎng)缽的 孔內(nèi)灌入孢子懸浮液l〇ml ;即完成病原菌的接種。
[0063] D、病情指數(shù)的計算
[0064] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于25°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)20天，根據(jù)爺苗的 黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0065] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75 %以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死。
[0066] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X 4] X 100 ;
[0067] E、抗性型的確定
[0068] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即：
[0069] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0070] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0071] 10. 00 <病情指數(shù)彡20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0072] 20. 00 <病情指數(shù)彡35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0073] 35. 00 <病情指數(shù)彡50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0074] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0075] 采用本例的方法對蓉雜茄品種的黃萎病抗性進行測定，測出其病情指數(shù)為21. 67， 確定其黃萎病抗性為中抗；測定結(jié)果與該品種已知的黃萎病抗性一致。
[0076] 實施例二
[0077] 一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為：
[0078] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0079] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天；再轉(zhuǎn)移到米飯 培養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)8天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體。
[0080] 本例中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯210份、瓊脂23份、蔗 糖20份、水1300份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水800份。
[0081] B、茄苗的培育
[0082] B1、種子處理
[0083] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將55°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡15分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡9小時；隨后，取出種子，用濕布包好，放置在25°C 的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。
[0084] B2、茄苗培育
[0085] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為 lOcmXIOcm;將營養(yǎng)缽置于溫度為28°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個營養(yǎng)缽中 長出一株二葉一心的爺苗。
[0086] 本例中營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石5份，沙土 5份。
[0087] C、病原菌接種
[0088] C1、傷根處理
[0089] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度2. 0cm。
[0090] C2、接種
[0091] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 10. ΟX107 個/ml。
[0092] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡15秒，隨 后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗，并向每一營養(yǎng)缽 的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液15ml ;即完成病原菌的接種。
[0093] D、病情指數(shù)的計算
[0094] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于25°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)15天，根據(jù)爺苗的 黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0095] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75 %以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死。
[0096] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X4] X 100。
[0097] E、抗性型的確定
[0098] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即：
[0099] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0100] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0101] 10. 〇〇 <病情指數(shù)< 20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0102] 20. 00 <病情指數(shù)< 35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0103] 35. 00 <病情指數(shù)< 50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0104] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0105] 采用本例的方法對蓉雜茄品種的黃萎病抗性進行測定，測出其病情指數(shù)為22. 50， 確定其黃萎病抗性為中抗。與該品種的黃萎病已知抗性一致。
[0106] 實施例三
[0107] 一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為：
[0108] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0109] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9天；再轉(zhuǎn)移到米飯 培養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)9天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體。
[0110] 本例中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯205份、瓊脂17份、蔗 糖20份、水1000份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水1200份。
[0111] B、茄苗的培育
[0112] B1、種子處理
[0113] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將53°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡15分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡9. 5小時；隨后，取出種子，用濕布包好，放置在 27°C的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。
[0114] B2、茄苗培育
[0115] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為 8cmX8Cm;將營養(yǎng)缽置于溫度為27°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個營養(yǎng)缽中長 出一株二葉一心的爺苗。
[0116] 本例中營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石5. 5份，沙土 4. 5份。
[0117] C、病原菌接種
[0118] C1、傷根處理
[0119] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度〇. 7cm ;
[0120] C2、接種
[0121] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 3· 0X107 個/ml。
[0122] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡12秒，隨 后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗，并向每一營養(yǎng)缽 的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液12ml ;即完成病原菌的接種。
[0123] D、病情指數(shù)的計算
[0124] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于18°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)19天，根據(jù)爺苗的 黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0125] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75 %以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死。
[0126] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X4] X 100。
[0127] E、抗性型的確定
[0128] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即：
[0129] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0130] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0131] 10. 00 <病情指數(shù)< 20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0132] 20. 00 <病情指數(shù)彡35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0133] 35. 00 <病情指數(shù)< 50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0134] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0135] 采用本例的方法對蛘埠長青茄品種的黃萎病抗性進行測定，測出其病情指數(shù)為 14. 56,確定其黃萎病抗性為抗。與該品種的黃萎病已知抗性一致。
[0136] 實施例四
[0137] 一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為：
[0138] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0139] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（verticillium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天；再轉(zhuǎn)移到米飯 培養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)8天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體。
[0140] 本例中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯200份、瓊脂22份、蔗 糖20份、水1100份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水1000份。
[0141] B、茄苗的培育
[0142] B1、種子處理
[0143] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將50°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡20分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡10小時；隨后，取出種子，用濕布包好，放置在26°C 的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。
[0144] B2、茄苗培育
[0145] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為 9cmX9Cm;將營養(yǎng)缽置于溫度為26°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個營養(yǎng)缽中長 出一株二葉一心的爺苗。
[0146] 本例中營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石6份，沙土 4份。
[0147] C、病原菌接種
[0148] C1、傷根處理
[0149] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度1. 8cm ;
[0150] C2、接種
[0151] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 8· 0X107 個/ml。
[0152] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡10秒，隨 后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗，并向每一營養(yǎng)缽 的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液l〇ml ;即完成病原菌的接種。
[0153] D、病情指數(shù)的計算
[0154] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于25°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)16天，根據(jù)爺苗的 黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0155] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75 %以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死。
[0156] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X4] X 100。
[0157] E、抗性型的確定
[0158] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即：
[0159] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0160] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0161] 10. 00 <病情指數(shù)< 20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0162] 20. 00 <病情指數(shù)< 35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0163] 35. 00 <病情指數(shù)< 50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0164] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0165] 采用本例的方法對蛘埠長青茄品種的黃萎病抗性進行測定，測出其病情指數(shù)為 15. 68,確定其黃萎病抗性為抗。與該品種的黃萎病已知抗性一致。
[0166] 實施例五
[0167] 一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為：
[0168] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0169] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天；再轉(zhuǎn)移到米飯 培養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)10天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體。
[0170] 本例中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯210份、瓊脂20份、蔗 糖20份、水1000份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水950份。
[0171] B、茄苗的培育
[0172] B1、種子處理
[0173] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將55°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡20分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡9小時；隨后，取出種子，用濕布包好，放置在25°C 的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。
[0174] B2、茄苗培育
[0175] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為 7cmX7cm;將營養(yǎng)缽置于溫度為25°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個營養(yǎng)缽中長 出一株二葉一心的爺苗。
[0176] 本例中營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石6份，沙土 4份。
[0177] C、病原菌接種
[0178] C1、傷根處理
[0179] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度1. 2cm ;
[0180] C2、接種
[0181] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 5· 0X107 個/ml。
[0182] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡12秒，隨 后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗，并向每一營養(yǎng)缽 的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液l〇ml，即完成病原菌的接種。
[0183] D、病情指數(shù)的計算
[0184] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于20°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)18天，根據(jù)爺苗的 黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0185] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50 %?75%以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死。
[0186] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X 4] X 100 ;
[0187] E、抗性型的確定
[0188] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即：
[0189] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0190] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0191] 10. 00 <病情指數(shù)< 20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0192] 20. 00 <病情指數(shù)< 35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0193] 35. 00 <病情指數(shù)< 50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0194] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0195] 采用本例的方法對紫圓茄品種的黃萎病抗性進行測定，測出其病情指數(shù)為42. 32， 確定其黃萎病抗性為感，與該品種的黃萎病已知抗性一致。
[0196] 實施例六
[0197] 一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為：
[0198] A、茄子黃萎病接種體的制備
[0199] 將分離純化的保藏登記號為CGMCC N0. 8959的大麗輪枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天；再轉(zhuǎn)移到米飯 培養(yǎng)基中，27°C恒溫振蕩培養(yǎng)9天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體；
[0200] 本例中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯208份、瓊脂25份、蔗 糖20份、水1050份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水1000份。
[0201] B、茄苗的培育
[0202] B1、種子處理
[0203] 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將52°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡16分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡9小時；隨后，取出種子，用濕布包好，放置在28°C 的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白；
[0204] B2、茄苗培育
[0205] 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為 7cmX7cm;將營養(yǎng)缽置于溫度為28°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個營養(yǎng)缽中長 出一株二葉一心的爺苗；
[0206] 本例中營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石5份，沙土 5份。
[0207] C、病原菌接種
[0208] C1、傷根處理
[0209] 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀將剪掉根尖，剪掉 的根尖長度1. 6cm ;
[0210] C2、接種
[0211] 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用 血球計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至 6· 0X107 個/ml ;
[0212] 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡15秒，隨 后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗，并向每一營養(yǎng)缽 的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液12ml，即完成病原菌的接種；
[0213] D、病情指數(shù)的計算
[0214] 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于20°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)17天，根據(jù)爺苗的 黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級：
[0215] 0級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變 黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃 色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75 %以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋 落；4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株 枯死；
[0216] 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)= [Σ (各級病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X 4] X 100 ;
[0217] E、抗性型的確定
[0218] 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即：
[0219] 病情指數(shù)=0,則待測茄子品種的抗性型為免疫；
[0220] 0 <病情指數(shù)彡10. 00,則待測茄子品種的抗性型為高抗；
[0221] 10. 00 <病情指數(shù)< 20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗；
[0222] 20. 00 <病情指數(shù)彡35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗；
[0223] 35. 00 <病情指數(shù)< 50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感；
[0224] 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
[0225] 采用本例的方法對紫圓茄品種的黃萎病抗性進行測定，測出其病情指數(shù)為44. 46， 確定其黃萎病抗性為感。與該品種的黃萎病已知抗性一致。
【權(quán)利要求】
1. 一種茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其步驟依次為： A、 茄子黃萎病接種體的制備 將分離純化的保藏登記號為CGMCC NO. 8959的大麗輪枝菌（verticillium dahiae)菌 株EV8,轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7?10天；再轉(zhuǎn)移到米飯培養(yǎng)基 中，25?28°C恒溫振蕩培養(yǎng)8?10天，即得含大麗輪枝菌EV8孢子的茄子黃萎病接種體； B、 茄苗的培育 B1、種子處理 將待測茄子品種的種子放入容器內(nèi)，再將50?55°C清水倒入容器淹沒種子，將種子浸 泡10?20分鐘，再用溫度為30°C的溫水浸泡9?10小時；隨后，取出種子，用濕布包好， 放置在25?28°C的培養(yǎng)箱中催芽至種子露白； B2、茄苗培育 將B1步得到的種子播種于基質(zhì)中含有蛭石的營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽的規(guī)格為（7?10) cmX (7?10) cm ;將營養(yǎng)缽置于溫度為25?28°C、自然光照下的溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，使一個 營養(yǎng)缽中長出一株二葉一心的爺苗； C、 病原菌接種 C1、傷根處理 將B2步的茄苗從營養(yǎng)缽內(nèi)連同基質(zhì)一并取出，用已消毒的剪刀剪掉根尖，剪掉的根尖 長度0· 7?2. 0cm ; C2、接種 將A步得到的接種體用已消毒的雙層紗布過濾，得到的孢子懸浮液在顯微鏡下用血球 計數(shù)板統(tǒng)計大麗輪枝菌EV8的孢子數(shù)量，并用無菌水將孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)至（3. 0? 10. 0) X 107 個 /ml ; 再將Cl步傷根處理后的茄苗根部連同基質(zhì)一并放入孢子懸浮液中浸泡8?15秒，隨 后將爺苗連同基質(zhì)重新置入營養(yǎng)缽中，一個營養(yǎng)缽內(nèi)置入爺苗一株爺苗；并向每一營養(yǎng)缽 的孔內(nèi)灌入孢子懸浮液10?15ml，即完成病原菌的接種； D、 病情指數(shù)的計算 將接種病原菌后的爺苗及營養(yǎng)缽置于18?28°C的日光溫室內(nèi)培養(yǎng)15?20天，根據(jù)爺 苗的黃萎病發(fā)生情況，按以下分級標準逐株確定發(fā)病等級： 〇級：健株，葉片無癥狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變黃或 呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：病株葉片25%?50%顯癥狀，病斑顏色大部分變成黃色或 黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級：病株葉片50%?75%以上表現(xiàn)癥狀，有少數(shù)葉片凋落； 4級：病株葉片75%以上表現(xiàn)癥狀，多為褐色掌狀枯斑，葉片有的脫落成光桿，以致整株枯 死； 再根據(jù)各株茄苗的發(fā)病等級計算出待測茄子品種的病情指數(shù)，病情指數(shù)=[Σ (各級 病株數(shù)X相應病級數(shù)）/總株數(shù)X 4] X 100 ; E、 抗性型的確定 根據(jù)D步得到的病情指數(shù)，確定出待測茄子品種的抗性型，即： 病情指數(shù)=〇,則待測茄子品種的抗性型為免疫； 〇 <病情指數(shù)< 10. 〇〇,則待測茄子品種的抗性型為高抗； 10. 00 <病情指數(shù)< 20. 00,則待測茄子品種的抗性型為抗； 20. 00 <病情指數(shù)< 35. 00,則待測茄子品種的抗性型為中抗； 35. 00 <病情指數(shù)< 50. 00,則待測茄子品種的抗性型為感； 50 <病情指數(shù)，則待測茄子品種的抗性型為高感。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其特征在于：所述的A 步中的PDA斜面培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為馬鈴薯200?210份、瓊脂17?25g、蔗 糖20份、水1000?1300份；米飯培養(yǎng)基的原料組成及質(zhì)量配比為米50份，水800?1200 份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茄子黃萎病苗期快速抗性測定方法，其特征在于：所述的B1 步的營養(yǎng)缽的基質(zhì)的原料組成及質(zhì)量配比為蛭石5?6份、沙土 5?4份。
【文檔編號】C12Q1/18GK104152534SQ201410387803
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】曾華蘭, 葉鵬盛, 何煉, 劉朝輝, 韋樹谷, 張騫方, 蔣秋平, 李瓊英 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物育種栽培研究所