一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開具有高特異性和高親和力的糖化血紅蛋白GHb的核酸適體及其制備方法。糖化血紅蛋白GHb核酸適體的核苷酸序列包括有SEQIDNO:1~SEQIDNO:4中的任意一條序列。糖化血紅蛋白GHb的核酸適體制備方法包括：構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫、制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物、初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物、制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫、篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體。制備獲得的核酸適體無毒性，分子量小，易于合成與標(biāo)記，只特異性識別糖化血紅蛋白GHb，對其他同源非糖化血紅蛋白Hb不識別結(jié)合，可成為檢測糖化血紅蛋白GHb含量的分子信標(biāo)。
【專利說明】—種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法
[0001]本申請是“一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法”的分案申請，該原申請的申請日為2012年11月14日、申請?zhí)枮?012104568467、發(fā)明創(chuàng)造名稱“一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法”。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于蛋白檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和力的糖化血紅蛋白GHb的核酸適體及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0003]糖尿病是人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥是至殘至死的主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。傳統(tǒng)的糖尿病診斷和治療監(jiān)測采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)等，但是血糖參數(shù)僅代表抽血時(shí)的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白(GHb)作為反映長期血糖水平的金標(biāo)準(zhǔn)，也是監(jiān)測糖尿病治療的重要指標(biāo)。GHb是紅細(xì)胞中血紅蛋白與葡萄糖緩慢、持續(xù)且不可逆地進(jìn)行非酶促蛋白糖化反應(yīng)的產(chǎn)物。形成兩周后不易分開。當(dāng)血液中葡萄糖濃度較高時(shí)，人體所形成的GHb含量也會(huì)相對較高.正常生理?xiàng)l件下，非酶促糖化反應(yīng)產(chǎn)物的生成量與反應(yīng)物的濃度成正t匕。由于蛋白質(zhì)濃度保持相對穩(wěn)定，糖化水平主要決定于葡萄糖濃度，也與蛋白質(zhì)與葡萄糖接觸的時(shí)間長短有關(guān)。GHb可以反映最近2~3個(gè)月的平均血糖水平。2002年美國糖尿病協(xié)會(huì)已明確規(guī)定應(yīng)定期檢測GHb，并將其作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標(biāo)。普及糖尿病知識，更新治療理念，監(jiān)測并保持GHb達(dá)標(biāo)，更早、更合理地使用胰島素等藥物治療，對于控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展尤為重要。
[0004]目前常用的糖化血紅蛋白的檢測方法有兩大類:高壓液相方法(HPLC)和免疫方法。高壓液相方法(HPLC)所使用的儀器昂貴，難以在比較基層的醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室普及；微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時(shí)間和微柱的質(zhì)量不易控制，易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差，重復(fù)性欠佳；而且干擾因素很多，尤其對pH值和溫度的變化敏感，HbF及變異血紅蛋白(HbS、HbC、HbE等)對結(jié)果干擾，干擾程度根據(jù)柱的分離能力而定，且要仔細(xì)觀察圖譜，所以該法得不到普遍采用。免疫法測定糖化血紅蛋白其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺，測定受高濃度葡萄糖、高三酰甘油、高膽紅素等物質(zhì)的干擾，由于樣本的濁度會(huì)使光度計(jì)測定產(chǎn)生錯(cuò)誤。另外，抗體由動(dòng)物免疫獲得，成本高且篩選周期長，批與批之間存在差異；抗體對溫度濕度敏感，易變性難保存等缺點(diǎn)，也得不到廣泛使用。
[0005] 核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識別分子，近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報(bào)道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子，國內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識體或核酸適配體等。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成)文庫，通過施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程)，并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù)，經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集，獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25飛O個(gè)核苷酸。
[0006]核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性，使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景，盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少，但應(yīng)用適體檢測靶蛋白的研究卻不斷增多，基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。專利CN201010580661.8，名稱為蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸適體及其制備方法，公布了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸適體的序列特征，通過設(shè)計(jì)合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫、篩選目的寡核苷酸序列、流式分析鑒定等步驟制備出蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸適體。專利CN201110148431.9和專利CN201110148603.2，公布了 HCV E1E2蛋白的和HCV NS5A蛋白核酸適體及其衍生物、篩選方法和應(yīng)用，其中核苷酸適體衍生物包括取代后的RNA核酸適體、骨架改造后的衍生物、改造為肽核酸后的衍生物以及連接上放射性分子后的衍生物。專利CN201210214996.7，公布了可用于檢測肌紅蛋白的核酸適體、篩選用微流控芯片及其篩選方法和應(yīng)用，公開了一種用前述微流控芯片篩選所述核酸適體的篩選方法，包括優(yōu)化核酸文庫、初篩、純化、循環(huán)幾個(gè)主要步驟，該發(fā)明的檢測方法具有高親和力和高特異性的優(yōu)點(diǎn)。
[0007]由上可知，核酸適體由于其獨(dú)特的化學(xué)抗體特性成為新一代針對特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測其特異性識別的靶分子物質(zhì)。但是目前基于核酸適體的針對于糖化血紅蛋白GHb的高效特異性識別研究還很缺乏，且針對于糖化血紅蛋白GHb的核酸適體及其篩選制備方法尚未見有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的糖化血紅蛋白檢測技術(shù)的不足，填補(bǔ)還未見糖化血紅蛋白GHb的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種糖化血紅蛋白GHb核酸適體及其制備方法，本發(fā)明所提供的核酸適體為SEQ ID NO:Tseq id no:4所示，分別命名GHbl、GHb2、GHb3、GHb4。
[0009]本發(fā)明的方案是通過這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種糖化血紅蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列為有SEQ IDNO:3中DNA片段序列，命名為GHb3，其序列為:
SEQ ID NO:3:gggaggcatg agacctatgg cgttgcattg gttggaaccc。
[0010]一種制備以上任一所述的糖化血紅蛋白核酸適體方法，其特征在于包括以下步驟:
(O構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫:人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫容量為1516的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫包括的DNA序列為:
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~6(1-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6(i和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N25~6(i為25~60個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)；
(2) 制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物:將有活化氨基的微磁珠與糖化血紅蛋白按照0.05、.2ml:1mg的比例在偶聯(lián)緩沖液中混合，再加入10(T200ul偶聯(lián)劑溶液，25° C反應(yīng)條件下輕混20-30小時(shí)，使糖化血紅蛋白C末端共價(jià)連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物；
(3)初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物:將2~5nmol單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫溶于結(jié)合緩沖液，進(jìn)行加熱處理，單鏈DNA文庫與沒有結(jié)合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的液體；將步驟2)糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物與熱處理后收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫在結(jié)合緩沖液中37° C溫育15~40min，用洗脫緩沖液洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物，除去不與糖化血紅蛋白結(jié)合的和非特異結(jié)合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物在洗脫緩沖液中92° C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液。
[0011](4)制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫:將步驟3)中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選。
[0012](5)篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體:將步驟4)所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經(jīng)過12~20輪鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)分離篩選，獲得目標(biāo)寡核酸序列，克隆并測序所述目標(biāo)寡核酸序列，通過酶聯(lián)核酸適體吸附測定法鑒定其與糖化血紅蛋白結(jié)合的特異性和親和力。
[0013]以上所述的一種制備糖化血紅蛋白核酸適體方法，所述的PCR擴(kuò)增用到的PCR引物序列為:
引物 1:5’ -ATACCAGCTTATTCAATT-3’
引物 2:5’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3’
所述的PCR擴(kuò)增引物2的5’端含生物素標(biāo)記；
所述PCR擴(kuò)增工藝條件為:94°C預(yù)變性5 min，94°C 30s, 47°C lmin, 72°C lmin,擴(kuò)增10~25個(gè)循環(huán)，最終延伸反應(yīng)為72°C 1min0
[0014]以上所述的一種制備糖化血紅蛋白核酸適體方法，所述的偶聯(lián)緩沖液為含20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl，ImM DTT, pH 5.5 ;所述偶聯(lián)劑溶液為含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；所述結(jié)合緩沖液為含100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6，2 mMMgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2,0.02% Tween 20, I mM DTT ;所述熱處理為 90 °C 加熱lOmin，置于冰上lOmin，然后溫度放置5min ;所述洗脫緩沖液為含20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mM NaCl，10 mM EDTA。
[0015]以上所述的糖化血紅蛋白核酸適體或者所述的制備得到的糖化血紅蛋白核酸適體，其特征在于，所述的核酸適體用于識別、檢測糖化血紅蛋白，或者用于制備檢測糖化血紅蛋白的試劑盒中。
[0016]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種以上任一所述糖化血紅蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種:
(1)將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；
(2)權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；
(3)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸；(4)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。
[0017]以上所述的一種糖化血紅蛋白核酸適體衍生物，其特征在于，所述的核酸適體或者其衍生物用于識別、檢測糖化血紅蛋白，或者用于制備檢測糖化血紅蛋白的試劑盒中。
[0018]本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步是:(I)所篩選到的核酸適體分子量小，無毒性，有利于分子探針的設(shè)計(jì)，易于合成與標(biāo)記；(2)核酸適體只特異的識別糖化血紅蛋白，不結(jié)合非糖化血紅蛋白和其它糖化蛋白質(zhì)分子，結(jié)合糖化血紅蛋白的能力是結(jié)合非糖化血紅蛋白Hb的能力的20-80倍，可以成為鑒別糖化血紅蛋白的試劑，提高檢測方法的特異性和靈敏度，簡化檢測方法，降低成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1.酶聯(lián)核酸適體吸附測定法檢測核酸適體GHbl與糖化血紅蛋白的結(jié)合能力曲線。圖1中橫坐標(biāo)為核酸適體DNA濃度，縱坐標(biāo)為OD相對值，.代表核酸適體GHbl與糖化血紅蛋白的結(jié)合曲線代表核酸適體GHbl與非糖化血紅蛋白Hb的結(jié)合曲線。
[0020]圖2.酶聯(lián)核酸適體吸附測定法檢測核酸適體GHb2與糖化血紅蛋白的結(jié)合能力曲線。圖2中橫坐標(biāo)為核酸適體DNA濃度，縱坐標(biāo)為OD相對值，.代表核酸適體GHb2與糖化血紅蛋白的結(jié)合曲線，.代表核酸適體GHb2與非糖化血紅蛋白Hb的結(jié)合曲線。
[0021]圖3.酶聯(lián)核酸適體吸附測定法檢測核酸適體GHb3與糖化血紅蛋白的結(jié)合能力曲線。圖3中橫坐標(biāo)為核酸適體DNA濃度，縱坐標(biāo)為OD相對值，.代表核酸適體GHb3與糖化血紅蛋白的結(jié)合曲線，.代表核酸適體GHb3與非糖化血紅蛋白Hb的結(jié)合曲線。
[0022]圖4.酶聯(lián)核酸適體吸附測定法檢測核酸適體GHb4與糖化血紅蛋白的結(jié)合能力曲線。圖4中橫坐標(biāo)為核酸適體DNA濃度，縱坐標(biāo)為OD相對值，.代表核酸適體GHb4與糖化血紅蛋白的結(jié)合曲線，.代表核酸適體GHb4與非糖化血紅蛋白Hb的結(jié)合曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可以從商業(yè)途徑中得到。
[0024]實(shí)施例1糖化血紅蛋白特異結(jié)合的核酸適體GHbl的制備
(O構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫:人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫容量為IXlO5的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫包括的DNA序列為:
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~4(1-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6(i和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N25~4(i為25~40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)；
(2)制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物:將0.25ml帶有活化氨基的微磁珠與5mg糖化血紅蛋白在偶聯(lián)緩沖液(20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, ImM DTT, pH 5.5)中混合，加入10ul偶聯(lián)劑溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反應(yīng)條件下輕混20小時(shí)，使糖化血紅蛋白C末端共價(jià)連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物。
[0025](3)初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物:將2nmol單鏈DNA文庫溶于結(jié)合緩沖液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2, 0.02% Tween 20，
I mM DTT)，進(jìn)行加熱處理，90 ° C加熱lOmin，置于冰上lOmin，然后溫度放置5min，單鏈DNA文庫于沒有結(jié)合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的液體；將步驟2)糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物與熱處理后收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫在結(jié)合緩沖液中37°C溫育30min，用洗脫緩沖液(20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物，除去不與糖化血紅蛋白結(jié)合的和非特異結(jié)合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物在洗脫緩沖液中92°C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液。
[0026](4)制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫:將步驟3)中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選；PCR 擴(kuò)增工藝條件為:94°C 預(yù)變性 5 min，94°C 30s, 47° C lmin, 72° C lmin,擴(kuò)增 16個(gè)循環(huán)，最終延伸反應(yīng)為72° C 1min,引物1:5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2:5’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素標(biāo)記。
[0027](5)篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體:將步驟4)所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經(jīng)過15輪鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)分離篩選，獲得目標(biāo)寡核酸序列，克隆并測序所述目標(biāo)寡核酸序列，目標(biāo)寡核酸序列為SEQ ID勵(lì):1，命名為6!*1。
[0028]本實(shí)施例的上述核酸適體可衍生出以下可用于檢測糖化血紅蛋白的核酸適體衍生物:將本實(shí)施例的核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；本實(shí)施例的核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本實(shí)施例的核酸適體改造成的肽核酸；本實(shí)施例的核酸適體改造成的鎖核酸。
[0029]實(shí)施例2糖化血紅蛋白特異結(jié)合的核酸適體GHb2的制備
(O構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫:人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫容量為3X105的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫包括的DNA序列為:
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N3tr45-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6(i和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N3tr45為30-45個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)；
(2)制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物:將1.0ml帶有活化氨基的微磁珠與5mg糖化血紅蛋白在偶聯(lián)緩沖液(20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, ImM DTT, pH 5.5)中混合，加入120ul偶聯(lián)劑溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反應(yīng)條件下輕混25小時(shí)，使糖化血紅蛋白C末端共價(jià)連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物。
[0030] (3)初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物:將5nmol單鏈DNA文庫溶于結(jié)合緩沖液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6，2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaC12, 0.02% Tween 20，I mM DTT)，進(jìn)行加熱處理，90 ° C加熱lOmin，置于冰上lOmin，然后溫度放置5min，單鏈DNA文庫于沒有結(jié)合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的液體；將步驟2)糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物與熱處理后收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫在結(jié)合緩沖液中37°C溫育40min，用洗脫緩沖液(20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物，除去不與糖化血紅蛋白結(jié)合的和非特異結(jié)合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物在洗脫緩沖液中92°C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液。
[0031](4)制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫:將步驟3)中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選；PCR 擴(kuò)增工藝條件為:94°C 預(yù)變性 5 min，94°C 30s, 47° C lmin, 72° C lmin,擴(kuò)增 12個(gè)循環(huán)，最終延伸反應(yīng)為72° C 1min,引物1:5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2:5’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素標(biāo)記。
[0032](5)篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體:將步驟4)所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經(jīng)過10輪鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)分離篩選，獲得目標(biāo)寡核酸序列，克隆并測序所述目標(biāo)寡核酸序列，目標(biāo)寡核酸序列為SEQ ID N0:2，命名為GHb2。
[0033]本實(shí)施例的上述核酸適體可衍生出以下可用于檢測糖化血紅蛋白的核酸適體衍生物:將本實(shí)施例的核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；本實(shí)施例的核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本實(shí)施例的核酸適體改造成的肽核酸；本實(shí)施例的核酸適體改造成的鎖核酸。
[0034]實(shí)施例3糖化血紅蛋白特異結(jié)合的核酸適體GHb3的制備
(O構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫:人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫容量為IXlO6的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫包括的DNA序列為:
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N35~6(1-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6(i和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N35~6(i為35~60個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)；
(2)制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物:將0.5ml帶有活化氨基的微磁珠與5mg糖化血紅蛋白在偶聯(lián)緩沖液(20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, ImM DTT, pH 5.5)中混合，加入160ul偶聯(lián)劑溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反應(yīng)條件下輕混28小時(shí)，使糖化血紅蛋白C末端共價(jià)連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物。
[0035](3)初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物:將3nmol單鏈DNA文庫溶于結(jié)合緩沖液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2, 0.02% Tween 20，
I mM DTT)，進(jìn)行加熱處理，90 ° C加熱lOmin，置于冰上lOmin，然后溫度放置5min，單鏈DNA
文庫于沒有結(jié)合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的液體；將步驟2)糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物與熱處理后收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫在結(jié)合緩沖液中37°C溫育20min，用洗脫緩沖液(20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物，除去不與糖化血紅蛋白結(jié)合的和非特異結(jié)合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物在洗脫緩沖液中92°C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液。
[0036](4)制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫:將步驟3)中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選；PCR 擴(kuò)增工藝條件為:94°C 預(yù)變性 5 min，94°C 30s, 47° C lmin, 72° C lmin,擴(kuò)增 18個(gè)循環(huán)，最終延伸反應(yīng)為72° C 1min,引物1:5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2:5’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素標(biāo)記。
[0037](5)篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體:將步驟4)所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經(jīng)過20輪鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)分離篩選，獲得目標(biāo)寡核酸序列，克隆并測序所述目標(biāo)寡核酸序列，目標(biāo)寡核酸序列為SEQ ID N0:3，命名為GHb3。
[0038]本實(shí)施例的上述核酸適體可衍生出以下可用于檢測糖化血紅蛋白的核酸適體衍生物:將本實(shí)施例的核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；本實(shí)施例的核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本實(shí)施例的核酸適體改造成的肽核酸；本實(shí)施例的核酸適體改造成的鎖核酸。
[0039]實(shí)施例4糖化血紅蛋白特異結(jié)合的核酸適體GHb4的制備
(O構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫:人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫容量為7X105的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫包括的DNA序列為:
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N3cr5(l-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6(i和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N3tr5tl為30-50個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)；
(2)制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物:將0.75ml帶有活化氨基的微磁珠與5mg糖化血紅蛋白在偶聯(lián)緩沖液(20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, ImM DTT, pH 5.5)中混合，加入200ul偶聯(lián)劑溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反應(yīng)條件下輕混30小時(shí)，使糖化血紅蛋白C末端共價(jià)連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物。
[0040](3)初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物:將4nmol單鏈DNA文庫溶于結(jié)合緩沖液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2, 0.02% Tween 20，
I mM DTT)，進(jìn)行加熱處理，90 ° C加熱lOmin，置于冰上lOmin，然后溫度放置5min，單鏈DNA文庫于沒有結(jié)合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的液體；將步驟2)糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物與熱處理后收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫在結(jié)合緩沖液中37°C溫育15min，用洗脫緩沖液(20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物，除去不與糖化血紅蛋白結(jié)合的和非特異結(jié)合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物在洗脫緩沖液中92°C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液。
[0041](4)制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫:將步驟3)中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選；PCR 擴(kuò)增工藝條件為:94°C 預(yù)變性 5 min，94°C 30s,47°C lmin, 72°C lmin,擴(kuò)增 20個(gè)循環(huán)，最終延伸反應(yīng)為72° C 1min,引物1:5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2:5’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素標(biāo)記。
[0042](5)篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體:將步驟4)所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經(jīng)過25輪鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)分離篩選，獲得目標(biāo)寡核酸序列，克隆并測序所述目標(biāo)寡核酸序列，目標(biāo)寡核酸序列為SEQ ID N0:4，命名為GHb4。
[0043]本實(shí)施例的上述核酸適體可衍生出以下可用于檢測糖化血紅蛋白的核酸適體衍生物:將本實(shí)施例的核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；本實(shí)施例的核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本實(shí)施例的核酸適體改造成的肽核酸；本實(shí)施例的核酸適體改造成的鎖核酸。
[0044]實(shí)施例5酶聯(lián)核酸適體吸附測定法檢測核酸適體GHbl、GHb2、GHb3、GHb4與糖化血紅蛋白的結(jié)合能力
O體外合成帶有5’端生物素標(biāo)記的糖化血紅蛋白核酸適體。
[0045]2)在96孔ELISA板上加入帶有0.lmg/ml糖化血紅蛋白和血紅蛋白對照的包被液(Na2C03 15mM,NaHC03 35mM,NaCl 0.2M)，每孔 100 μ L，設(shè)定 PBS 孔為調(diào)零孔，4°C孵育過夜。
[0046]3)用磷酸洗脫液洗滌ELISA板，然后封閉液包被96孔ELISA板，每孔100 μ L，37°C封閉I小時(shí)后用洗脫液(PBS pH 7.4，0.05% Tween)洗滌。
[0047]4)將生物素標(biāo)記的核酸適體用磷酸緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為O nml/L，5nml/L, 10 nml/L, 20 nml/L, 50 nml/L, lOOnml/L, 200 nml/L,將 100 μ L 稀釋的核酸適體非別接入包被有糖化血紅蛋白和血紅蛋白的96孔ELISA板中，25°C孵育30min。
[0048]5)用洗脫液洗脫ELISA板后，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素用PBS按1:1000稀釋后每孔加入100yL，37°C孵育30min。
[0049]6)用洗脫液洗滌ELISA板，然后每孔加入辣根過氧化物酶顯色底物TMB(3，3’，5，5’ -tetramethybenzidine) 80yLM62min，終止反應(yīng)后在 OD 值為 450 nm 波長下檢測吸光度。
[0050]7)使用Sigma plot軟件作圖，計(jì)算出所篩選到的核酸適體與糖化血紅蛋白相互作用的解離常數(shù)(kd)。
[0051]檢測到的核酸適體6他1、6他2、6他3、6他4與糖化血紅蛋白的結(jié)合能力如圖f 4所
/Jn ο
【權(quán)利要求】
1.一種糖化血紅蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列為有SEQ IDNO: 3中DNA片段序列，其序列為:
SEQ ID NO:3:gggaggcatg agacctatgg cgttgcattg gttggaaccc。
2.一種制備權(quán)利要求1任一所述糖化血紅蛋白核酸適體的方法，其特征在于，包括以下步驟: (O構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫:人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫容量為1516的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫包括的DNA序列為:
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~6(1-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3， 所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6(i和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N25~6(i為25~60個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)； (2)制備糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物:將有活化氨基的微磁珠與糖化血紅蛋白按照0.05、.2ml:1mg的比例在偶聯(lián)緩沖液中混合，再加入10(T200ul偶聯(lián)劑溶液，25° C反應(yīng)條件下輕混20-30小時(shí)，使糖化血紅蛋白C末端共價(jià)連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物； (3)初次篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物:將2~5nmol單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫溶于結(jié)合緩沖液，進(jìn)行加熱處理， 單鏈DNA文庫與沒有結(jié)合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的液體；將步驟2)糖化血紅蛋白-微磁珠復(fù)合物與熱處理后收集不結(jié)合磁珠的DNA隨機(jī)寡核苷酸庫在結(jié)合緩沖液中37° C溫育15~40min，用洗脫緩沖液洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物，除去不與糖化血紅蛋白結(jié)合的和非特異結(jié)合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復(fù)合物在洗脫緩沖液中92° C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液； (4)制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫:將步驟3)中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選； (5)篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體:將步驟4)所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經(jīng)過12~20輪鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)分離篩選，獲得目標(biāo)寡核酸序列，克隆并測序所述目標(biāo)寡核酸序列，通過酶聯(lián)核酸適體吸附測定法鑒定其與糖化血紅蛋白結(jié)合的特異性和親和力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備糖化血紅蛋白核酸適體的方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增用到的PCR引物序列為:
引物 1:5’ -ATACCAGCTTATTCAATT-3’
引物 2:5’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3’ 所述的PCR擴(kuò)增引物2的5’端含生物素標(biāo)記； 所述PCR擴(kuò)增工藝條件為:94°C預(yù)變性5 min，94°C 30s, 47°C lmin，72°C lmin,擴(kuò)增10~25個(gè)循環(huán)，最終延伸反應(yīng)為72°C 1min0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備糖化血紅蛋白核酸適體的方法，所述的偶聯(lián)緩沖液為含20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, ImM DTT, pH 5.5 ;所述偶聯(lián)劑溶液為含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；所述結(jié)合緩沖液為含100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6，2mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2,0.02% Tween 20, I mM DTT;所述熱處理為90 °C加熱lOmin，置于冰上lOmin，然后溫度放置5min ;所述洗脫緩沖液為含20 mM Tris-HCl pH7.6，200mM NaCl，10 mM EDTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中任一所述的糖化血紅蛋白核酸適體或者權(quán)利要求2~4所述方法制備得到的糖化血紅蛋白核酸適體，其特征在于，所述的核酸適體用于識別、檢測糖化血紅蛋白，或者用于制備檢測糖化血紅蛋白的試劑盒。
6.一種權(quán)利要求1中任一所述糖化血紅蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種: (1)將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物； (2)權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸； (4)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。
7.—種權(quán)利要求2~4中任一所述制備得到的糖化血紅蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種: (1)將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物； (2)權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸； (4)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種糖化血紅蛋白核酸適體衍生物，其特征在于，所述的核酸適體或者其衍生物用于識別、檢測糖化血紅蛋白，或者用于制備檢測糖化血紅蛋白的試劑盒。
【文檔編號】C12N15/115GK104164436SQ201410263985
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月14日
【發(fā)明者】李壽東, 胡建紅, 李戈強(qiáng), 李朝君, 謝志峰, 李朝志 申請人:廣西安仁欣生物科技有限公司