茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYB1及其重組表達載體和在培育紫色番茄中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYB1及其重組表達載體和在培育紫色番茄中的應(yīng)用，茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYB1的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，將該基因構(gòu)建為重組表達載體然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄，獲得轉(zhuǎn)基因番茄，獲得轉(zhuǎn)基因番茄的花瓣，柱頭，花藥，果實，根，莖及葉片表型為紫色，可以作為觀賞植物栽培，并且轉(zhuǎn)基因番茄的果實中花色苷含量較高，可以降低罹患癌癥和心血管疾病的風(fēng)險，具有很好的觀賞和食用價值。
【專利說明】茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBI及其重組表達載體和在培育紫色番茄中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl和含有該基因的重組表達載體，還涉及該基因在培育紫色番茄中的應(yīng)用和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番茄作為一種世界范圍內(nèi)廣泛栽培的農(nóng)作物，其果實一直是廣受大眾所喜愛的蔬菜和水果?；ㄉ兆鳛橐环N廣泛存在于植物體內(nèi)的水溶性類黃酮類色素，越來越多的研究證明花色苷不僅在植物應(yīng)對不良環(huán)境(紫外照射、低溫、干旱及病原菌入侵)時發(fā)揮積極作用，同時花色苷也對人類大量的慢性疾病(心血管病和腫瘤)的治療有一定的幫助作用。大量資料證實，規(guī)律性的食用花色苷含量較高的食物對于人體的保健有著重要的價值。番茄作為一種在人們餐桌上出現(xiàn)頻率較高的水果或蔬菜，自然栽培的番茄果實中的花色苷含量卻微乎其微。通過基因工程的方法，我們將調(diào)控茄子果實花色苷合成的轉(zhuǎn)錄因子異源表達于與番茄中，獲得了紫色的番茄植株及果實。番茄果實的色澤一直是育種工作者關(guān)注的重要問題，我們通過異源表達外源基因的方法，不僅改變了整個番茄植株的顏色，同時還改變了果實的顏色。傳統(tǒng)的育種方法周期長、耗資多且效果不穩(wěn)定。近年來，隨著基因工程的迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益完善，基因工程技術(shù)在培育優(yōu)良作物品種方面顯示了極大的潛力?；蚬こ碳夹g(shù)勢必會越來越廣泛的應(yīng)用于番茄品種的改良和育種當中。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl ;本發(fā)明的目的之二在于提供含有茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl的重組表達載體；本發(fā)明的目的之三載體提供含有重組表達載體的微生物轉(zhuǎn)化體；本發(fā)明的目的之四在于提供茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl在培育紫色番茄品種中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提供茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl在提高番茄果實中花色苷中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之六在于提供培育紫色番茄品種的方法。
[0004]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0005]1.茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0006]2.含有權(quán)利要求1所述茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl的重組表達載體。
[0007]優(yōu)選的，所述重組表達載體是在pBI121載體的Sac I和Xba I酶切位點之間連入如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列ο
[0008]3.含有所述重組表達載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
[0009]優(yōu)選的，所述微生物轉(zhuǎn)化體為根癌農(nóng)桿菌LBA4404，也可以選擇其他的農(nóng)桿菌。
[0010]4.所述茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl在培育紫色番茄品種中的應(yīng)用。
[0011]5.所述茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl在提高番茄果實花色苷含量中的應(yīng)用。
[0012]6.培育紫色番茄品種的方法，包括如下步驟:[0013]a.構(gòu)建含如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的重組表達載體，然后轉(zhuǎn)化微生物轉(zhuǎn)化體，制得工程菌；
[0014]b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化番茄外植體，然后在含30g/L的蔗糖、lmg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中于25 ±2°C、黑暗下共培養(yǎng)48小時；再轉(zhuǎn)入含有30g/L的鹿糖、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧節(jié)青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強度1000_20001x條件下培養(yǎng)至長出再生芽；待芽長至2-3cm時切下再生芽，轉(zhuǎn)入含有30g/L的蔗糖、250mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強度1000-20001x條件下培養(yǎng)至生根，即得紫色番茄品種。
[0015]優(yōu)選的，所述重組表達載體的的構(gòu)建方法為:用SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示序列為引物克隆攜帶酶切位點的茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBlJf Sac I和Xba I酶切后再與經(jīng)同樣雙酶切的PBI121載體連接。
[0016]優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化微生物轉(zhuǎn)化體的方法如下:將根癌農(nóng)桿菌LBA4404、含有游動質(zhì)粒Prk2013的大腸桿菌和含有重組表達載體的大腸桿菌DH5 α單菌落依次重疊均勻涂在ΡΗ7.2的YEB固體培養(yǎng)基中央直徑為Icm的圓圈中，28±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)至長出菌團，用接種環(huán)挑取菌團，在含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB固體培養(yǎng)基中劃線，然后在28±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-2.5天至長出單菌落，挑取單菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素、50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB液體培養(yǎng)基在28 ±2°C、黑暗、200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌液OD6c?為1.8-2.0，提取質(zhì)粒，用Sac I和Xba I進行雙酶切鑒 ，陽性克隆為微生物轉(zhuǎn)化體。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明獲得了茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl，并將茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl的編碼區(qū)重組表達載體，將該載體轉(zhuǎn)入番茄后所得轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中SmMYBl基因較非轉(zhuǎn)基因植株有顯著的表達，且整個番茄植株呈現(xiàn)紫色和紫色的番茄果實；與傳統(tǒng)育種方法通過雜交等方法相比，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，高效并可穩(wěn)定遺傳地增加了番茄植株的花色苷含量，為番茄的品種改良作出了積極的探索，也為觀賞植物的花色育種提供了參考和借鑒，具有良好的市場前景和經(jīng)濟價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中:
[0019]圖1為茄子SmMYBl基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標準(Maker)。
[0020]圖2為番茄轉(zhuǎn)基因組織培養(yǎng)過程(A:番茄愈傷組織分化；B:番茄抗性植株的產(chǎn)生)。
[0021]圖3為PCR檢測NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達(M為Maker，CK-為陰性對照，CK+為陽性對照，CK-為空白對照，1-4為轉(zhuǎn)基因番茄植株)。
[0022]圖4為SmMYBl基因在轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中的表達量(WT為非轉(zhuǎn)基因番茄，τ#1, 2，3，4為不同的轉(zhuǎn)基因番茄陽性株系)。
[0023]圖5為轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株表型。[0024]圖6為轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實表型。
[0025]圖7為檢測轉(zhuǎn)基因番茄花色苷含量結(jié)果。
【具體實施方式】
[0026]以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第雙版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0027]本發(fā)明實施例中使用的番爺品種為“Solanum lycopersicon Mill.cv.AilsaCraig”,為本實驗室留種。pGEM-T Easy載體為Promega公司產(chǎn)品，pBI121載體、大腸桿菌DH5a、含有游動質(zhì)粒PRK2013的大腸桿菌“協(xié)助”菌(簡稱helper)和根癌農(nóng)桿菌LBA4404由本實驗室保存；RNA提取試劑盒、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒、DNA提取試劑盒 Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、連接試劑盒 DNA Ligation KitVer.2.0(T4DNA連接酶/Solution〗)、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA純化試劑盒(離心柱型)為TIANGEN公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純試劑。
[0028]一、獲得茄子SmMYBl基因全長序列
[0029]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中爺子(Solanum melongena L.)花青素合成相關(guān)基因SmMYBl基因部分核酸序列(FS084890)、番茄ANTl基因(ΝΜ_001247488)以及辣椒花青素合成相關(guān)基因CaMYB2 (AJ608992)序列，設(shè)計克隆SmMYBl基因的全長引物，分別為SmMYBl-F和SmMYBl-R，引物序列如下:
[0030]SmMYBl-F:5，_aataaaatgaataatcctcc_3，(SEQ ID N0.1)；
[0031]SmMYBl-R:5，-cgaaaacagacaatattacta-3，(SEQ ID N0.2)；
[0032]提取茄子果實表皮總RNA，根據(jù)RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒說明合成cDNA，再以cDNA為模板，分別以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.1為引物，擴增SmMYBl基因全長，PCR反應(yīng)體系為:ddH2016.5 μ L、10 XPCR Buffer2.5 μ L、25mM MgCl22.5 μ L、dNTP (10 μ M) 1.0 μ L、100 μ M 的上、下游引物各 0.5 μ L、cDNA 模板 1.0 μ L、Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，共 25 μ L ；PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C后延伸10分鐘。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，擴增獲得約SOObp的目的條帶，然后將擴增產(chǎn)物采用DNA純化試劑盒進行回收純化，將純化的SmMYBl基因全長片段與pGEM-T Easy載體連接，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T::SmMYBl。將上述重組質(zhì)粒委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序，結(jié)果顯示，SmMYBl基因全長為825bp，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0033]二、構(gòu)建含茄子SmMYBl基因的重組表達載體 [0034]根據(jù)pBI121載體的多克隆位點和SmMYBl基因核苷酸序列，設(shè)計構(gòu)建含SmMYBl編碼區(qū)的表達載體的引物，具體為:
[0035]SmMYB I ~oF:5’ -gcgatctagaaataaaatgaataatcctcc-3’ (SEQ ID N0.4),下劃直線部分為Xba I酶切位點。
[0036]SmMYB 1-O R:5’ -gactgagctccgaaaacagacaatattacta-3’ (SEQ ID N0.5),下劃直線部分為Sac I酶切位點。[0037]以重組質(zhì)粒pGEM-T::SmMYBl 為模板，以 SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5 為引物，進行 PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系為:ddH2016 μ LUOXPrimeSTAR Buffer (含 MgCl2) 2.5 μ L、dNTP (2.5 μ Μ) 4.0 μ L、上下游引物各 0.5 μ L、質(zhì)粒模板 1.0 μ L、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶
0.5 μ L，共25 μ L，PCR反應(yīng)條件為:98°C變性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸1.5分鐘，共40個循環(huán)；最后72°C后延伸10分鐘，擴增獲得兩側(cè)帶Sac I和Xba I酶切位點的SmMYBl基因片段；純化后用Sac I和Xba I雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的pBI121載體在T4DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒PBI121: =SmMYBl。
[0038]三、將重組質(zhì)粒pBI121: =SmMYBl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0039]將根癌農(nóng)桿菌LBA4404在含有1.2% (w/w)瓊脂、50mg/L利福平和500mg/L鏈霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28 ±2 °C黑暗條件下培養(yǎng)2-2.5天至長出單菌落；同時分別將含有重組質(zhì)粒pBI121: =SmMYBl的大腸桿菌DH5 α和含有游動質(zhì)粒Prk2013的大腸桿菌在含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37±2°C條件下倒置培養(yǎng)14-16小時至長出單菌落；將根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落、含有游動質(zhì)粒Prk2013的大腸桿菌單菌落和含有重組質(zhì)粒PBI121: =SmMYBl的大腸桿菌DH5a單菌落依次重疊均勻涂在含有1.2 % (w/w)瓊脂的YEB固體培養(yǎng)基(PH7.2)中央直徑為Icm的圓圈中，28±2°C黑暗條件下倒置共培養(yǎng)24小時至長出菌團，用接種環(huán)挑取菌團適量，在含有質(zhì)量分數(shù)為1.2%的瓊脂、50!^/1利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基(pH7.2)中劃線，28 ±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-2.5天至長出單菌落，挑取3-4個單菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基(pH7.2)，在28±2°C、黑暗、200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)1.5天至菌液均勻且OD6tltl為1.8-2.0，提取重組質(zhì)粒，用Sac I和Xba I進行雙酶切鑒定，陽性重組子即 為pBI121: =SmMYBl農(nóng)桿菌工程菌株，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0040]四、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的含爺子SmMYBl基因的表達載體轉(zhuǎn)化番爺
[0041]將含有PBI121: =SmMYBl的農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有質(zhì)量分數(shù)為1.2%的瓊脂、50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH為7.2的YEB固體培養(yǎng)基上，在28±2°C黑暗條件下活化2-3天至長出單菌落，挑取單菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH為7.2的YEB液體培養(yǎng)基20mL，在28±2°C、200rpm條件下擴大培養(yǎng)1.5天，再將所得菌液按體積比為1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH為7.2的YEB液體培養(yǎng)基中，在28±2°C、200rpm條件下擴大培養(yǎng)至0D_為1.8~2.0，然后28±2°C離心棄上清，菌體用新鮮的YEB液體培養(yǎng)基洗滌，再用含有質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖、pH為5.8的MS培養(yǎng)基IOOmL重懸，制得農(nóng)桿菌工程菌液。
[0042]用體積分數(shù)為75%的酒精浸泡番茄種子2min，無菌水沖洗3次；滅過菌的飽和Na3PO4浸泡種子20min，并不時劇烈振蕩，無菌水沖洗3次；I % (V/V)的NaClO水溶液浸泡種子lOmin，無菌水沖洗7次；無菌水浸泡種子4h，播種在MS固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱260C (16h光照)/18°C (8h黑暗)培養(yǎng)直至子葉展平，切取已展平的子葉即得番茄外植體。將番茄外植體的子葉切下，在MS液體培養(yǎng)基中浸泡lh，濾紙吸干殘留液體培養(yǎng)基并放置在質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂、lmg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH為
5.8的MS固體培養(yǎng)基中，26°C (16h光照)/18°C (8h黑暗)預(yù)培養(yǎng)Id后置于農(nóng)桿菌工程菌液中浸染15分鐘后，放回質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂、lmg/L吲哚乙酸、
1.75mg/L玉米素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C黑暗條件下共培養(yǎng)48小時，再轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25 ±2°C、光周期16h/d、光照強度1000-20001x條件下培養(yǎng)至長出愈傷組織及抗性芽；將長2-3cm的抗性芽切下，轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂、250mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強度1000-20001x條件下培養(yǎng)至生根，即得轉(zhuǎn)基因番茄植株，如圖2所示。
[0043]五、轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株的篩選
[0044]1.PCR檢測NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達
[0045]根據(jù)載體pBI 121: =SmMYBl中的NPTII報告基因序列，設(shè)計如下特異檢測引物:
[0046]NPTI1-F:5，-gacaatcggctgctctga-3，(SEQ ID N0.6)； [0047]NPTI1-R:5’-aactccagcatgagatcc-3’ (SEQ ID N0.7)。
[0048]分別取轉(zhuǎn)基因番茄植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株，提取基因組DNA，再以所得基因組DNA為模板、SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示序列為引物進行PCR擴增，檢測NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖3所示，陽性轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR產(chǎn)物在900bp位置出現(xiàn)目標DNA條帶，經(jīng)測序證明與NPTII報告基因片段序列一致，證實這些植株為轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株。
[0049]2.qPCR檢測SmMYBl基因在轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中的表達
[0050]根據(jù)SmMYBl基因序列和番茄內(nèi)參基因GAPDH序列，設(shè)計如下引物:
[0051]qSmMYBl-F:5，-caagtgacaagcaaactaccg-3，(SEQ ID N0.8)；
[0052]qSmMYBl-R:5，_tcttctccttcaacagcgtc_3，(SEQ ID N0.9)；
[0053]qSmGAPDH-F:5’-gtacgacaacgaatggggtta-3’ (SEQ ID N0.10)；
[0054]qSmGAPDH-R:5，-tcatatcagcagcaccagca-3，(SEQ ID N0.11)。
[0055]分別取轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株的幼葉，提取總RNAdfS RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以所得cDNA為模板，分別以qSmMYBl_F和qSmMYBl-R，qSmGAPDH-F和qSmGAPDH-R為引物進行qPCR，檢測SmMYBl基因在轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中的表達量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中SmMYBl基因都有明顯的表達。
[0056]六、轉(zhuǎn)基因番爺陽性植株的表型分析
[0057]將上述篩選出的轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株按常規(guī)方法培育，觀察分析轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株的表型特征，結(jié)果如圖5-7所示。由圖5可知，轉(zhuǎn)基因番茄的整個植株包括花瓣，柱頭，花藥，果實，根，莖及葉片都有明顯的花色苷積累并呈現(xiàn)紫色；由圖6可知，轉(zhuǎn)基因番茄的番茄果實果皮和果肉內(nèi)部都有明顯的花色苷積累并呈現(xiàn)紫黑色特征。通過高效液相色譜的方法對轉(zhuǎn)基因和野生型番茄果實進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果肉花色苷最高含量可達0.45mg/g鮮重(圖7)。由以上結(jié)果可知，該轉(zhuǎn)基因番茄獲得的方法不僅對于觀賞類植物栽培育種還是生產(chǎn)具有食療價值的功能性番茄果實都有明顯的應(yīng)用價值。
[0058]最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl，其核苷酸序列如SEQID N0.3所示。
2.含有權(quán)利要求1所述茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl的重組表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體是在PBI121載體的Sac I和Xba I酶切位點之間連入如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述重組表達載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物轉(zhuǎn)化體，其特征在于:所述微生物轉(zhuǎn)化體為根癌農(nóng)桿菌 LBA4404。
6.權(quán)利要求1所述茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl在培育紫色番茄品種中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl在提高番茄果實花色苷含量中的應(yīng)用。
8.培育紫色番茄品種的方法，其特征在于，包括如下步驟: a.構(gòu)建含如SEQID N0.3所示核苷酸序列的重組表達載體，然后轉(zhuǎn)化微生物轉(zhuǎn)化體，制得工程菌； b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化番茄外植體，然后在含30g/L的蔗糖、lmg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中于25±2°C、黑暗下共培養(yǎng)48小時；再轉(zhuǎn)入含有30g/L的鹿糖、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧節(jié)青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強度1000_20001x條件下培養(yǎng)至長出再生芽；待芽長至2-3cm時切下再生芽，轉(zhuǎn)入含有30g/L的蔗糖、250mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在25 ±2°C、光周期16h/d、光照強度1000-20001x條件下培養(yǎng)至生根，即得紫色番茄品種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述重組表達載體按如下方法制備:用SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示序列為引物克隆攜帶酶切位點的茄子花青素合成相關(guān)基因SmMYBl JfSac I和Xba I酶切后再與經(jīng)同樣雙酶切的pBI121載體連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化微生物轉(zhuǎn)化體的方法如下:將根癌農(nóng)桿菌LBA4404、含有游動質(zhì)粒Prk2013的大腸桿菌和含有重組表達載體的大腸桿菌DH5a單菌落依次重疊均勻涂在pH7.2的YEB固體培養(yǎng)基中央直徑為Icm的圓圈中，28±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)至長出菌團，用接種環(huán)挑取菌團，在含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB固體培養(yǎng)基中劃線，然后在28±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-2.5天至長出單菌落，挑取單菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素、50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB液體培養(yǎng)基在28±2°C、黑暗、200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌液OD6tltl為1.8-2.0，提取質(zhì)粒，用Sac I和Xba I進行雙酶切鑒定，陽性克隆為微生物轉(zhuǎn)化體。
【文檔編號】C12N15/29GK103966235SQ201410230344
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】胡宗利, 張彥杰, 陳國平, 王蘇蘇, 劉霞, 褚桂花 申請人:重慶大學(xué)